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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

वैकल्पिक इन विट्रो तरीके वायरल कैप्सिड संरचनात्मक अखंडता के निर्धारण के लिए

Published: November 16, 2017 doi: 10.3791/56444
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

Summary

नियमित पहचान वायरल जीनोम प्रवर्धन का उपयोग तरीके उनके गैर संक्रामक कणों से संक्रामक भेदभाव करने में असमर्थता से सीमित हैं । इस लेख का उद्देश्य aptamer बाध्यकारी, गतिशील प्रकाश बिखरने, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संक्रामक नोरोवायरस कणों के भेदभाव में सहायता करने के लिए वैकल्पिक तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए है ।

Abstract

मानव नोरोवायरस काफी सार्वजनिक स्वास्थ्य और आर्थिक नुकसान दुनिया भर में सटीक । इन विट्रो में उभरते खेती अग्रिम अभी तक वायरस की दिनचर्या का पता लगाने के लिए लागू नहीं कर रहे हैं । वर्तमान पता लगाने और ठहराव तकनीक है, जो न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन पर मुख्य रूप से निर्भर करते हैं, गैर संक्रामक वायरल कणों से संक्रामक भेदभाव नहीं है । इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए एक साथ इस्तेमाल किया तकनीक में हाल के अग्रिमों पर विशिष्ट विवरण मौजूद है ताकि वायरल कणों के infectivity स्थिति पर और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए । एक तकनीक capsids के लिए एक नोरोवायरस ssDNA aptamer के बंधन का आकलन शामिल है । Aptamers आसानी से संश्लेषित और संशोधित किया जा रहा है का लाभ है, और सस्ती और स्थिर हैं । एक अंय तकनीक, गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS), समाधान में कैप्सिड व्यवहार देख के लाभ है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वायरल capsids के संरचनात्मक अखंडता के दृश्य के लिए अनुमति देता है । हालांकि वादा किया है, वहां एक तकनीक के लिए कुछ कमियां हैं, जैसे गैर विशिष्ट aptamer नमूना मैट्रिक्स से अणुओं के आरोप को बाध्यकारी, DLS के लिए शुद्ध कैप्सिड की आवश्यकता है, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए गरीब संवेदनशीलता । फिर भी, जब इन तकनीकों के संयोजन में उपयोग किया जाता है, डेटा का उत्पादन शरीर नोरोवायरस कैप्सिड अखंडता पर अधिक व्यापक जानकारी प्रदान करता है कि infectivity अनुमान, जानकारी है जो सटीक मूल्यांकन के लिए आवश्यक है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निष्क्रियता तरीकों या वायरस का पता लगाने की व्याख्या । यह आलेख इन विधियों में भेदभाव संक्रामक मानव नोरोवायरस कणों का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।

Introduction

मानव नोरोवायरस एक काफी सार्वजनिक स्वास्थ्य के बोझ के लिए दुनिया भर में जिंमेदार है, के बारे में ६८५,०००,००० बीमारियों और २१२,००० की मृत्यु प्रतिवर्ष1, डॉलर के अरबों में एक लागत पर2,3। आज, नोरोवायरस का पता लगाने और ठहराव जीनोम प्रवर्धन और/या ligand आधारित प्लेटफार्मों शामिल है । पूर्व आम तौर पर पसंद किया जाता है के रूप में यह अधिक संवेदनशील है, मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है, और आम तौर पर झूठी सकारात्मक परिणाम के कम जोखिम है4। सबसे आम नोरोवायरस डिटेक्शन और ठहराव जीनोम प्रवर्धन तकनीक रिवर्स transcriptase मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) है । क्योंकि यह लक्ष्य और मानव नोरोवायरस जीनोम के एक छोटे से खंड प्रवर्धित, RT-अकेले qPCR संक्रामक और गैर संक्रामक कणों के बीच भेदभाव करने में सक्षम नहीं है, मुक्त जीनोमिक आरएनए के रूप में, क्षतिग्रस्त capsids युक्त जीनोम, और capsids के साथ घातक रूपांतरित/छोटे जीनोम अभी भी RT-qPCR द्वारा परिलक्षित किया जा सकता है । जबकि दो नए इन विट्रो खेती तकनीक मानव नोरोवायरस के लिए5,6 हाल ही में सूचित किया गया है, दोनों अभी भी qPCR पर निर्भर वायरस ठहराव के लिए और अभी तक व्यवहार्य तरीके नियमित नैदानिक के लिए नहीं कर रहे है/ मानव noroviruses के लिए परीक्षण । इस प्रकार, RT-qPCR नैदानिक/पर्यावरणीय परीक्षण के लिए स्वर्ण मानक रहता है ।

अन्य इन विट्रो विधियों में एक बेहतर नोरोवायरस कणों की infectivity स्थिति का अनुमान लगाने के प्रयास में विकसित किया गया है. इन तरीकों आम तौर पर उन है कि नोरोवायरस कैप्सिड की अखंडता का पता और जीनोम अखंडता का मूल्यांकन उन के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है । पूर्व दृष्टिकोण अधिक लोकप्रिय है । एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया विधि वायरल जीनोमिक आरएनए के निष्कर्षण से पहले RNase है, लेकिन यह वायरल कणों कि बरकरार रहने के लिए खाता नहीं है, लेकिन मेजबान रिसेप्टर्स/सह कारकों, साथ ही वायरल कणों कि घातक रूप से रूपांतरित किया है बांध करने की क्षमता का अभाव है या काट दिया है या मामूली क्षतिग्रस्त जीनोम7। कैप्सिड अखंडता भी मानव नोरोवायरस सह रिसेप्टर/सह कारकों, जो histo-रक्त समूह एंटीजन (HBGAs) के रूप में जाना जाता है कार्बोहाइड्रेट के लिए बाइंड करने के लिए वायरस की क्षमता के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है । HBGAs (कई अन्य ऊतकों के बीच) नच या glycolipids के भाग के रूप में मेजबान आंत्र उपकला कोशिकाओं में मौजूद हैं और लार की तरह शारीरिक तरल पदार्थ में स्रावित किया जा सकता है । अपनी सतहों पर HBGA पदार्थों से युक्त प्रवेश बैक्टीरिया भी मानव नोरोवायरस8,9,10बांध दिखाया गया है, और इस तरह की बातचीत नोरोवायरस संक्रमण5को बढ़ावा कर सकते हैं । HBGA बाध्यकारी के उपयोग की मूल अवधारणा यह है कि केवल वायरल कणों ख्यात रिसेप्टर बाध्यकारी/सह कारक कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम होगा । एकाधिक अध्ययनों से पता चलता है कि मनका आधारित HBGA बंधन पूर्ववर्ती न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन infectivity भेदभाव के लिए एक होनहार विधि है11,12,13,14, 15,16. HBGAs के संबंध में एक प्रमुख चुनौती यह है कि कोई भी HBGA प्रकार सभी मानव नोरोवायरस पादी बाँध सकता है. यह पता करने के लिए, सुअर गैस्ट्रिक mucin, जो HBGAs शामिल हैं, संश्लेषण, स्थिरता, और कम लागत की आसानी के हित में शुद्ध HBGA कार्बोहाइड्रेट के स्थान पर इस्तेमाल किया गया है.

मूर एट अल द्वारा हाल ही में एक प्रकाशन । 17 मानव नोरोवायरस कैप्सिड अखंडता का आकलन करने के लिए नई तकनीकों का एक सेट पेश किया । HBGAs, मूर एट अल के स्थान पर । 17 एक मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील न्यूक्लिक अम्ल aptamer (M6-2)18 और मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (NS14)19 को हीट-इलाज GII. 4 सिडनी नोरोवायरस capsids (वायरस की तरह कणों या VLPs) की जांच की बाध्यकारी और इस तुलना में सिंथेटिक HBGAs करने के लिए बाध्यकारी करने के लिए । न्यूक्लिक एसिड aptamers कम कर रहे है (~ 20-80 nt) एकल असहाय न्यूक्लिक एसिड (ssDNA या आरएनए) है कि उनके अनुक्रम का एक परिणाम के रूप में अद्वितीय तीन आयामी संरचनाओं में गुना और एक लक्ष्य बांध । क्योंकि वे न्यूक्लिक एसिड होते हैं, वे कम महंगा है; आसानी से रासायनिक संश्लेषित, शुद्ध, और संशोधित; और स्थिर करने के लिए गर्मी । noroviruses के खिलाफ उत्पंन aptamers की कई रिपोर्टों मौजूद हैं, उनमें से कुछ उपभेदों18,20,21,22की एक किस्म के लिए व्यापक जेट दिखा । उदाहरण के माध्यम से, मूर एट अल । 17 का प्रदर्शन किया है कि aptamer M6-2 को शुद्ध, इकट्ठे मानव नोरोवायरस capsids (VLPs) और वायरल HBGA पर निर्भरता में कैप्सिड करने के लिए उच्च क्रम (उदा, माध्यमिक और तृतीयक) प्रोटीन संरचना बनाए रखने के लिए इसी तरह व्यवहार किया होने के लिए बाध्य । दूसरी ओर, नोरोवायरस VLP के एक महत्वपूर्ण अनुपात एंटीबॉडी NS14 के लिए बाध्यकारी capsids के बाद बने रहे थे पूरी तरह से विकृत । नोरोवायरस का मूल्यांकन मूर एट अल द्वारा अध्ययन में बाध्यकारी । 17 एक सरल, प्लेट-आधारित एलिसा के समान विधि का उपयोग किया गया था, अपवाद है कि aptamers एंटीबॉडी के स्थान पर उपयोग किया जाता है के साथ (इसलिए विधि ELASA कहा जाता था) । इस उच्च प्रवाह प्रयोगात्मक विधि नोरोवायरस कैप्सिड, काम है कि शारीरिक या रासायनिक तनाव के संपर्क पर वायरल निष्क्रियता के तंत्र को समझने के लिए मूल्यवान है पर विभिंन उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, इस विधि के लिए एक दोष कम संवेदनशीलता और मैट्रिक्स के लिए सहिष्णुता की कमी है, उच्च स्तर पर जुड़े संदूषणों कि कारण गैर aptamers द्वारा विशेष बाध्यकारी ।

मूर एट अल । 17 एक और विधि, गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS), गर्मी उपचार के जवाब में वायरल कणों के एकत्रीकरण की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया । DLS आमतौर पर nanoparticle सस्पेंशन के आकार का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और प्रोटीन के लिए विस्तारित किया गया है23,24 और वायरस25,26,27. कण आकार के एक समारोह के रूप में हल में कणों से बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता, प्रसार गुणांक की गणना के लिए अनुमति देता है और फिर कण व्यास अच्छी तरह से स्थापित सूत्र का उपयोग कर । DLS तकनीक फैलाया कणों के hydrodynamic व्यास नीचे नेनो, जो फैलाया वायरस, व्यक्तिगत कैप्सिड प्रोटीन या dimers का पता लगाने की अनुमति देता है, और वायरस समुच्चय आकार27के आधार पर भेद कर सकते हैं । वायरस एकत्रीकरण, कण आकार में वृद्धि के द्वारा प्रतिनिधित्व किया, कैप्सिड अखंडता की हानि का संकेत है । के रूप में कैप्सिड विकृत और उसकी संरचना बाधित है, hydrophobic अवशेषों को उजागर हो और कणों के साथ रहना और समुच्चय के रूप में पैदा होता है । DLS एक निर्दिष्ट उपचार या वास्तविक समय17,28में एकत्रीकरण के कैनेटीक्स के बाद कण आकार को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि समाधान में कैप्सिड व्यवहार के अवलोकन की अनुमति देने का लाभ है, लेकिन शुद्ध कैप्सिड की उच्च सांद्रता की आवश्यकता है, जो पूरी तरह से अपने प्राकृतिक राज्य में वायरस के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है ।

अंतिम मूर एट अल द्वारा उपयोग विधि । 17 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) था । हालांकि इस विधि संवेदनशीलता का अभाव है और मात्रात्मक डेटा का उत्पादन नहीं करता है, यह वायरल कैप्सिड संरचना पर विभिन्न उपचार के प्रभाव के दृश्य के लिए अनुमति देता है । हालांकि नैदानिक/पर्यावरण सेटिंग्स के लिए अभी तक आदर्श नहीं, संयोजन में इन तरीकों का उपयोग मानव नोरोवायरस निष्क्रियता को समझने में मूल्यवान है । इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए थाली के लिए गहराई प्रोटोकॉल में प्रदान करना है बाध्यकारी परख (ELASA), DLS, और उनि तैयारी के लिए उपचार के संदर्भ में नोरोवायरस कैप्सिड पर गर्मी उपचार के प्रभाव की जांच तरीकों का इस्तेमाल किया कैप्सिड पर प्रभाव अखंडता के रूप में मूर एट अल में प्रस्तुत किया । 17.

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. उच्च क्रम के नुकसान के मूल्यांकन के लिए प्लेट आधारित बाध्यकारी परख नोरोवायरस कैप्सिड संरचना

< p class = "jove_content" > नोट: यहाँ प्रस्तुत किए गए एक बहुत ही ELASA प्रोटोकॉल को प्रकाशित किया गया है < सुप class = "xref" > 29 , और इसी तरह की ELASA परख को पहले कहीं शोध लेखों के भाग के रूप में सूचित किया गया है < सुप क्लास = "xref" > 17 , < सुप class = "xref" > 18 , < सुप class = "xref" > 22 .

मानव नोरोवायरस GII के
  1. हीट ट्रीटमेंट. ४ सिडनी capsids
    1. प्राप्त शुद्ध मानव नोरोवायरस प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन (VP1) च्या GII. ४ सिडनी (सेस: JX459908) capsids.
      में इकट्ठे नोट: अध्ययन में Capsids आर अतमार के सौजंय से प्राप्त किया गया (Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन, ह्यूस्टन, TX) ।
    2. पतला capsids करने के लिए ५० & #181; छ/एमएल 1x फास्फेट में बफर खारा (पंजाब, पीएच ७.२) की अधिकतम मात्रा के लिए 15 & #181; L व्यक्तिगत छाया में पीसीआर ट्यूबों । यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब कैप्सिड के एनजी कम से ६०० में शामिल हैं । सुनिश्चित करें कि वहां ६०० उपचार प्रति कैप्सिड के एनजी-ligand संयोजन है ।
    3. हीट थर्मल साइकिल चालक वांछित गर्मी उपचार के लिए ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, ६८ पर उपचार & #176; C अलग समय के लिए (0-25 min) चुना गया था.
    4. एक अतिरिक्त थर्मल साइकिल चालक के लिए 4 & #176; C तत्काल ठंडा करने के लिए । वांछित समय के लिए थर्मल साइकिल चालक के लिए कैप्सिड समाधान के साथ ट्यूबों जोड़ें । तुरंत पूर्व कूल्ड 4 & #176 के लिए स्थानांतरण; सी साइकिल चालक हीटिंग के बाद 5 मिनट के लिए ।
      1. में शामिल ९५ & #176; ग 5 मिन उपचार के लिए एक विकृत कैप्सिड नियंत्रण के रूप में । शामिल अनुपचारित (23 & #176; ग) कैप्सिड समाधान एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में । एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई कैप्सिड के साथ पंजाबियों को शामिल करें ।
    5. संक्षेप में नीचे स्पिन एक केंद्रापसारक में ट्यूब के नीचे करने के लिए सभी बूंदों को पाने के लिए और पंजाब में इलाज कैप्सिड समाधान पतला करने के लिए 3 & #181; g/mL । सुनिश्चित करें कि इसमें कम से २०० & #181; l पतला, स्वास्थ्यकर्मी कैप्सिड (१०० & #181; l/
  2. गू १०० & #181; कैप्सिड के एल. ए. के. प्रत्येक कुआं का समाधान सुनिश्चित करना, उपचार के अनुसार कम से दो कुओं का होना । इसके अतिरिक्त, प्रत्येक ligand के लिए १०० & #181; L पंजाबियों के साथ 2 नियंत्रण कुओं को शामिल करें; यह परख के पृष्ठभूमि अवशोषक प्रदान करता है । एक ढक्कन के साथ प्लेट को कवर, तेल फिल्म के साथ किनारों सील वाष्पीकरण को कम करने के लिए, और 4 & #176 पर एक मिलाते हुए मशीन पर रात भर छोड़ दो, सी या कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ।
  3. 5% बनाने के द्वारा अवरुद्ध बफर तैयार ०.०५% के बीच 20 (PBST) के साथ पंजाब में दूध के ठोस (डब्ल्यू/
  4. प्लेट से स्वास्थ्यकर्मी कैप्सिड समाधान निकालें । Add २०० & #181; एल/ कमरे के तापमान या रात भर में 2 ज के लिए मशीन, 4 पर सील & #176; C.
  5. के लिए ligand बाइंडिंग समाधान तैयार करें biotinylated aptamer M6-2 < सुप वर्ग = "xref" > 18 , < सुप क्लास = "xref" > 29 आणि biotinylated सिंथेटिक HBGA रक्त प्रकार A या biotinylated type H.
    1. पतला करने के biotinylated aptamer को 1 & #181; M म nuclease-नि िि । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक उपचार के लिए २०० & #181; L कुल के लिए पर्याप्त समाधान है । पतला चुने हुए biotinylated HBGA को 30 & #181; g/mL को ब्लॉकिंग बफ़र में । सुनिश्चित करें कि २०० & #181 के लिए पर्याप्त समाधान है; L प्रत्येक उपचार के लिए कुल मात्रा.
      नोट: कम HBGA का उपयोग करने के लिए, 10 & #181; g/HBGA की एमएल में ०.२५% स्किम मिल्क-PBST को प्रतिस्थापित किया जा सकता है । दोनों biotinylated M6-2 और HBGA के लिए सांद्रता पहले अनुकूलित और रिपोर्ट किया गया है ।
  6. ब्लॉकिंग बफ़र निकालें और प्लेटें धो लें 3 बार के साथ २०० & #181; L/well PBST. पॅट प्लेट ऊपर बाँझ कागज तौलिए पर नीचे अवशिष्ट नमी सूखी ।
  7. Add १०० & #181; L/ligand बाध्यकारी समाधान के ठीक है, सुनिश्चित करना है कि वहां गर्मी उपचार के प्रति 2 कुओं-ligand संयोजन कर रहे हैं । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के बारे में ६० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर एक ढक्कन के साथ कवर थाली मशीन ।
    नोट: एक ligand के रूप में क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए 2 कुओं अनुपचारित capsids और पूरी तरह से विकृत capsids के प्रत्येक शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें । साथ ही, 2 & #34 शामिल करें; कोई कैप्सिड & #34; वेल्स प्रत्येक ligand के लिए प्लेट पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में ।
  8. ligand समाधान निकालें और कुओं को धोकर 3 बार २०० & #181; L/अच्छी तरह से PBST । पॅट प्लेट ऊपर बाँझ कागज तौलिए पर नीचे अवशिष्ट नमी सूखी ।
  9. Add १०० & #181; के हल का L/०.२ & #181; g/मब streptavidin-सहिजन peroxidase में पंजाबियों. एक कक्षीय शेखर पर कोमल मिलाते के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: अलग streptavidin-सहिजन peroxidase conjugates अलग सांद्रता होगा । उपयोगकर्ता के लिए परामर्श & #39; एस एंजाइम की एलिसा अनुप्रयोगों के लिए सांद्रता की आदर्श सीमा के लिए मैनुअल और सुनिश्चित करें कि यह इष्टतम है ।
  10. निकालें संयुग्म समाधान । धोकर 3 बार २०० & #181; L/अच्छी तरह से PBST । पॅट प्लेट ऊपर बाँझ कागज तौलिए पर नीचे अवशिष्ट नमी सूखी ।
  11. Add १०० & #181; L/खैर 3, 3 & #39;, 5, 5 & #39;-tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट, और रंग के लिए विकसित करने की अनुमति 5-15 min. किसी भी रंग के लिए नकारात्मक नियंत्रण कुओं का निरीक्षण और लगातार प्लेटें दोहराने के बीच एक ही समय के लिए विकसित करने के लिए सुनिश्चित हो । प्लेट रीडर इस्तेमाल किया, के रूप में अच्छी तरह से अवशोषित रेंज के बारे में पता होना ।
    नोट: विकासशील समय लाइगैंडों/
    12. उपयोग की गुणवत्ता के आधार पर अलग हो सकता है ।
  12. के साथ प्रतिक्रिया के विकास को रोकने के १०० & #181; L/अच्छी तरह से 1m फॉस्फोरस एसिड । तुरंत ४५० एनएम पर थाली पढ़ें । डेटा सहेजें.
    नोट: एसिड का परिचय आम तौर पर प्रतिक्रिया काफी धीमा कर देता है लेकिन पूरी तरह से इसे बंद नहीं करता है । अवशोषक पढ़ने से पहले समय की एक विस्तारित राशि के लिए बंद कर दिया थाली मत छोड़ो ।
< p class = "jove_title" > 2. प्लेट के विश्लेषण परख परिणाम पर आधारित

  1. किसी स्प्रेडशीट प्रोग्राम में raw अवशोषक डेटा सहेजें । विशिष्ट उपचार और ligand के साथ एक अच्छी जोड़ी के लिए औसत absorbances का उत्पादन । बाद के सभी विश्लेषणों के लिए इन औसत का उपयोग करें ।
    नोट: कुओं के कोई जोड़े काफी अलग मूल्यों है कि यह सुनिश्चित करने के लिए दोनों अच्छी तरह से absorbances तुलना.
  2. निरपेक्ष कैप्सिड वफ़ादारी (all binding) का विश्लेषण करने के लिए, के कच्चे अवशोषण को घटाना & #34; कोई कैप्सिड & #34; हर दूसरे नमूना अवशोषक मान से नियंत्रण ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, उच्च क्रम (माध्यमिक, तृतीयक, चतुर्धातुक) संरचना की हानि के कारण बाध्यकारी की हानि सीधे विश्लेषण किया जा सकता है । इसके बजाय नकारात्मक (कोई कैप्सिड) नियंत्रण के अवशोषण को घटाकर, पूरी तरह से विकृत कैप्सिड नियंत्रण के मूल्य घटाना । यह कैप्सिड अनुक्रम के कारण बाइंडिंग के साथ ही उपकरण के लिए विशिष्ट बाइंडिंग के कारण सभी बाइंडिंग संकेत निकालता है । HBGA और aptamer M6-2 प्रदर्शन थोड़ा पूरी तरह विकृत कैप्सिड के लिए बाध्यकारी है, तो या तो विधि इसी तरह के परिणाम पैदा करता है । झूठी सकारात्मक संकेत विशिष्ट aptamer बाइंडिंग के लिए जिंमेदार ठहराया जब चुनने जो विश्लेषण का उपयोग करने के लिए माना जाना चाहिए ।
    3. नकारात्मक या विकृत नियंत्रण के साथ
  3. -समायोजित absorbances, उनके संबंधित सकारात्मक (कोई उपचार) नियंत्रण absorbances द्वारा उपचार absorbances विभाजन और १०० से गुणा । यह अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष इलाज कैप्सिड के संकेत का प्रतिशत प्रदान करता है ।
  4. कैप्सिड अनुक्रम के लिए प्रत्येक ligand के लिए बाध्यकारी संकेत की डिग्री का अनुमान लगाने के लिए, & #34 घटाना; कोई कैप्सिड & #34; प्रारंभिक absorbances से नकारात्मक नियंत्रण, और विकृत कैप्सिड के समायोजित अवशोषक ले । सकारात्मक नियंत्रण संकेत के समायोजित अवशोषित द्वारा इस विभाजित है, और यह १०० से गुणा । यह विकृत कैप्सिड/कैप्सिड अनुक्रम के लिए बाध्यकारी ligand के कारण संकेत का स्पष्ट प्रतिशत देता है ।
< p class = "jove_title" > 3. हीट ट्रीटमेंट के बाद वायरस एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए DLS

< p class = "jove_content" > NOTE: नीचे दिए गए कदम सॉफ्टवेयर और साधन इस्तेमाल के लिए विशिष्ट हो सकता है, लेकिन अनुकूलित और इसी तरह के उपकरणों के लिए लागू किया जा सकता है ।

  1. का उपयोग कर DLS साधन सॉफ्टवेयर में एक नया आकार शराबी बनाएँ: सामग्री = प्रोटीन, disperser = पंजाब, तापमान = 25 & #176; C, Equilibration समय = 0 सेकंड, सेल प्रकार = डिस्पोजेबल cuvette (छोटी मात्रा, ZEN0040), माप कोण = १७३ & #176; Backscatter, माप अवधि = स्वचालित, माप की संख्या = 3, माप के बीच देरी = 0 सेकंड, डेटा प्रोसेसिंग: विश्लेषण मॉडल = सामान्य प्रयोजन (सामान्य संकल्प). अंय सभी पैरामीटर्स के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें ।
  2. सॉफ्टवेयर के भीतर ग्रीन भागो तीर का चयन करें, और नमूना नाम.
  3. 1.1.4 के माध्यम से VLPs.
    4. की गर्मी के उपचार के लिए 1.1.1 चरणों का पालन करें
  4. 5 & #181; g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए 1x पंजाब में VLPs 1:10 इलाज गर्मी कमजोर । वैकल्पिक) एक 1 & #181 के साथ नमूना फ़िल्टर; मीटर ताकना आकार धूल कणों को दूर करने के लिए; DLS बहुत धूल के प्रति संवेदनशील है, के रूप में बड़े कणों छोटे कणों से ज्यादा रोशनी तितर बितर ।
  5. अंतरण ५० & #181; क L पतला VLPs की एक छोटी मात्रा डिस्पोजेबल cuvette. उपकरण के नमूने कक्ष में cuvette डालें.
  6. प्रारंभ करें, और उपयोग & #39; Correlogram & #39;, & #39; Cumulants Fit & #39;, व & #39; विशेषज्ञ सलाह & #39; टैब डेटा गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए । चलाने के दौरान
    1. , जांच करें कि polydispersity अनुक्रमणिका मान ०.३ से कम है, गुणवत्ता माप का प्रतिनिधित्व करता है । & #160; म & #8216; बहु-दृ & #8217; टैब पर, सुनिश्चित करें कि सहसंबंध गुणांक स्थिर है और बंद है, लेकिन 1 से अधिक नहीं, कम समय में, और एक बाद के समय में तेजी से 0 से गिरता है, कण आकार की विशेषता । मापन के दौरान डेटा गुणवत्ता पर प्रतिक्रिया के लिए & #8216; विशेषज्ञ सलाह & #8217; टैब का उपयोग करें
    2. माप के पूरा होने के बाद, polydispersity अनुक्रमणिका मान ०.३ से कम है कि पुन: जाँच करें । सुनिश्चित करें कि cumulants फ़िट लाइन डेटा बिंदुओं को बारीकी से अनुसरण करता है & #8216; cumulants फिट & #8217; tab.
  7. प्रत्येक नमूने के कण आकार के रूप में प्रत्येक माप के लिए रिपोर्ट की Z-औसत कण व्यास का औसत ले लो । प् लॉट में व्यास का प्लाट बनाम तापमान में & #176; C.
< p class = "jove_title" > 4. वास्तविक समय में वायरस एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए DLS

< p class = "jove_content" > नोट: नीचे दिए गए चरणों का उपयोग सॉफ़्टवेयर और उपकरण के लिए विशिष्ट हो सकता है, लेकिन इसे समान डिवाइसेज़ पर रूपांतरित और लागू किया जा सकता है.

  1. का उपयोग कर DLS साधन सॉफ्टवेयर में एक नया आकार शराबी बनाएं: सामग्री = प्रोटीन, disperser = पंजाब, तापमान = के रूप में वांछित, Equilibration समय = 0 सेकंड, सेल प्रकार क्वार्ट्ज cuvette, माप कोण = १७३ & #176; Backscatter, माप अवधि = स्वचालित, माप की संख्या = ५० (एकत्रीकरण दर के आधार पर बढ़ाया या कम किया जा सकता है), माप के बीच देरी = 0 सेकंड, डेटा प्रोसेसिंग: विश्लेषण मॉडल = एकाधिक संकीर्ण मोड (उच्च संकल्प) । अंय सभी पैरामीटर्स के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें ।
  2. खोलने के लिए और एक नया नमूना नाम के लिए सॉफ्टवेयर के भीतर रन तीर का चयन करें, और साधन तापमान संतुलन तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. सस्पेंड इन VLPs 1x & #160 में;P बी एस ए microcentrifuge ट्यूब में 5 & #181; g/mL और २००-५०० & #181 के बीच का एक आयतन; L. भंवर निलंबन.
  4. के लिए VLP निलंबन नीचे स्पिन एक तालिका में 5-10 एस के लिए de-गैस के लिए केंद्रापसारक । इस गर्मी उपचार है कि आकार माप के साथ हस्तक्षेप के दौरान बुलबुला गठन को रोकने में मदद करता है ।
  5. एक छोटी सी मात्रा क्वार्ट्ज करने के लिए VLP निलंबन स्थानांतरण cuvette-बुलबुले से बचें और पिपेट धीरे cuvette की दीवार के खिलाफ । साधन के बाद तापमान संतुलन तक पहुँच गया है, नमूना कक्ष में cuvette डालें.
  6. equilibrate करने के लिए नमूना तापमान के लिए 10 एस रुको, तो रन शुरू करते हैं । चलाएं के प्रारंभ में कोई टाइमर प्रारंभ करें । प्रथम माप के अंत में टाइमर रोकें । इस समय को पहली बार प्वाइंट के रूप में लें । सॉफ़्टवेयर द्वारा रिकॉर्ड किए गए माप समय से क्रमिक समय बिंदुओं को प्राप्त करें ।
  7. प्रारंभ करें, और मॉनिटर correlogram, वितरण फ़िट, और विशेषज्ञ सलाह डेटा गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए ।
    नोट: PDI आवश्यक नहीं होगा कम ०.३ से इन माप के लिए के रूप में नमूना एग्रीगेट के दौरान polydisperse किया जा करने के लिए अपेक्षित है ।
    1. सुनिश्चित करें कि सहसंबंध गुणांक स्थिर है और बंद है, लेकिन कम समय में 1 से अधिक नहीं है, और एक या अधिक बाद के समय में तेज़ी से गिरता है, कण आकार की विशेषता ।
    2. सुनिश्चित करें कि वितरण फ़िट लाइन डेटा बिंदुओं का निकटता से अनुसरण करती है ।
  8. आकार डेटा का विश्लेषण करें.
    1. प्रत्येक माप और प्रारंभिक समय बिंदु के बीच समय में अंतर से प्रत्येक समय बिंदु निर्धारित करें । माप की अवधि बिल्कुल समान नहीं हैं ।
    2. एक तीव्रता वितरण का उपयोग कर, प्रत्येक माप के लिए सबसे बड़ा क्षेत्रों के साथ चोटियों के आकार रिकॉर्ड/
    3. मिनट में समुद्री मील की चोटी के व्यास की साजिश
      4. में बनाम समय
< p class = "jove_title" > 5. उनि नमुना वडा

  1. प्राप्त कार्बन सहायता फिल्म (निकेल) के लिए डिजाइन ग्रिड उनि.
    नोट: अनुशंसित एजेंट और सुविधा माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए उनके हैंडलिंग पर कोर सुविधा के साथ परामर्श करें । हो एक जलशुष्कक या एक वैक्यूम चैंबर युक्त बॉक्स में ग्रिड की दुकान यकीन है कि नमी के लिए जोखिम को कम करने के लिए ।
  2. आंसू लगभग 5 सेमी x 5 सेमी फिल्टर कागज के टुकड़े । कांच पेट्री व्यंजन और माइक्रोस्कोपी में उपयोग के लिए डिजाइन उचित आत्म समापन रिवर्स चिमटी प्राप्त करें ।
  3. तेल फिल्म के लगभग २.५ सेमी एक्स 5 सेमी टुकड़ा कट । benchtop.
    4. पर जगह
  4. हीट ट्रीटमेंट ऑफ नोरोवायरस GII. ४ सिडनी capsids
    1. गर्मी उपचार प्रक्रिया का पालन बिल्कुल के रूप में ऊपर बताए गए चरणों में 1.1.1-1.1.5 छोड़कर: उपयोग 10 मिमी HEPES (पीएच ७.४) के बजाय पंजाब के उपचार के लिए और आगे पतला नहीं है capsids उपचार के बाद (५० & #181; g/mL) पर समाधान रखें । पिपेट पूरे ~ 15 & #181; म L छोड़ स्वास्थ्यकर्मी कैप्सिड समाधान पर आयल फिल्म.
  5. चिमटी के साथ ग्रिड किनारे ले लो, उंहें किनारे पर बंद करने के लिए ग्रिड पकड़, और जगह ग्रिड कार्बन साइड-इलाज समाधान की बूंद के ऊपर से नीचे की अनुमति । 10 मिनट के लिए मशीन चलो कैप्सिड ग्रिड को संलग्न करने की अनुमति है ।
    1. कैप्सिड तैयारी की शुद्धता पर निर्भर करता है, 10 मिमी HEPES समाधान के धो जोड़ें अगर 10-15 के रूप में जरूरत & #181; एल बूंदों इलाज के बाद लाइन में रखा कैप्सिड छोटी बूंद.
    2. 10 मिनट के बाद, छोटी बूंद के साथ ग्रिड उठाओ । फिल्टर कागज का एक टुकड़ा दूर छोटी बूंद बाती के लिए लगभग सीधा ग्रिड प्लेस । 10-15 & #181 की छोटी बूंद उठाओ; L HEPES ग्रिड के साथ बफर, 30 एस के लिए पकड़ है, तो फिल्टर कागज का एक और टुकड़ा के साथ दूर बाती धोने के लिए ।
  6. जगह a 15 & #181; L छोटी बूंद की 2% uranyl एसीटेट एक खाली क्षेत्र में तेल फिल्म पर समाधान ।
    1. ग्रिड के साथ uranyl एसीटेट की छोटी बूंद उठाओ और ४५ एस दूर uranyl एसीटेट के लिए पकड़, समाधान के सबसे दूर करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है । ग्रिड कार्बन-साइड को फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर रखें, सावधान किया जा रहा है कि ग्रिड नहीं & #34; स्टिक & #34; को चिमटी पर नमी के लिए । एक खुले गिलास पेट्री डिश में उस पर ग्रिड के साथ फिल्टर कागज प्लेस ।
      नोट: प्लास्टिक पेट्री व्यंजन का उपयोग नहीं करते हैं, के रूप में ग्रिड electrostatically होगा उंहें आकर्षित किया जाएगा और डिश के लिए अटक जाते हैं ।
  7. सभी उपचार के लिए दोहराएँ । एक desiccator में ग्रिड के साथ पेट्री पकवान आधा प्लेस रात सूखी को उनि के साथ देख पहले ।
  8. तैयार ग्रिड को चौकस करने के संबंध में संबंधित संस्था में माइक्रोस्कोपिक सुविधा से परामर्श करें । कुछ सुविधाएं उपयोगकर्ता को उनकी सुविधा & #39; s लिखत के प्रचालन पर प्रशिक्षित करने की अनुमति देती है । एक विशिष्ट माइक्रोस्कोप के सेटअप और अवलोकन के बारे में विशिष्ट विवरण बी हैइस आलेख के क्षेत्र eyond ।

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Representative Results

मानव नोरोवायरस GII .4 सिडनी capsids (VLPs) के संरचनात्मक अखंडता के रूप में मूर एट अल द्वारा प्रस्तुत कई उपंयास तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था । 17. सबसे पहले, एक प्रयोग किया गया था जिसमें उनकी क्षमता के एक समारोह के रूप में capsids की अखंडता के लिए एक ख्यात रिसेप्टर बाँध/सह-कारक (HBGA) या ssDNA aptamer (M6-2) की तुलना में थे (चित्रा 1). परिणाम प्रदर्शित पहले मूर एट अल द्वारा प्रस्तुत किया गया है । 17, और प्रदर्शित करता है कि aptamer M6-2-कैप्सिड बाध्यकारी व्यवहार के समान था वायरस-HBGA विभिन्न जोखिम समय के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस गर्मी उपचार के लिए जोखिम पर बाध्यकारी. जबकि HBGA बाध्यकारी संकेत aptamer M6-2 की तुलना में थोड़ा पहले खो गया था, M6-2 के बाद VLPs ६५ डिग्री सेल्सियस और ६८ डिग्री सेल्सियस के लिए विभिन्न समय अंक (टेबल 1)17के लिए उजागर किया गया संकेत हानि की एक समान दर प्रदर्शित । यह पता चलता है कि दोनों HBGA और aptamer M6-2 बाध्यकारी एक समान तरीके से समाप्त किया गया था ।

DLS माप का प्रदर्शन किया है कि प्रोटीन विकार की वजह से एकत्रीकरण की संभावना ligand बाध्यकारी संकेत (चित्रा 2) के नुकसान से मेल खाती है, के रूप में एक hydrodynamic व्यास से अधिक १०० एनएम के बारे में ६८ डिग्री सेल्सियस पर उपचार के बारे में 18 मिनट के बाद मनाया गया था । ये वे परिस्थितियां थीं, जिन पर HBGA बाइंडिंग का पूरा नुकसान हुआ और aptamer M6-2 के लिए बाइंडिंग सिग्नल की लगभग सभी हानियां (& #62; ८०%) (चित्र 1)17। उनि परिणाम रूपात्मक परिवर्तन और capsids के झुरमुट के रूप में इन टिप्पणियों का समर्थन तेजी से स्पष्ट हो गया के रूप में तापमान ६० डिग्री सेल्सियस और ८० डिग्री सेल्सियस 1 मिनट (चित्रा 3) के बीच वृद्धि हुई थी । इसी तरह की घटना को 25 मिनट के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस पर capsids हीटिंग के बाद मनाया गया था, लेकिन उनि का संकल्प कम स्पष्ट (चित्र 3 बी)17था ।

Figure 1
चित्र 1: नोरोवायरस GII के लिए दो भिन्न लाइगैंडों के अनुरूप-निर्भर बाइंडिंग. 4 सिडनी capsids हीट ट्रीटमेंट के अधीन । शुद्ध GII. 4 सिडनी capsids (VLPs) समय की विभिंन मात्रा के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस पर उपचार गर्मी के अधीन थे, और रक्त प्रकार एक HBGA और aptamer M6-2 के लिए बाध्यकारी एक थाली का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया ELASA बाध्यकारी परख आधारित है । Y-अक्ष एक अनुपचारित कैप्सिड नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में एक उपचार (एक्सपोज़र समय) के लिए स्वीकार्य अवशोषक संकेत प्रदर्शित करता है । यह आंकड़ा पहले से प्रस्तुत किया गया है और यह आंकड़ा मूर एट अल से संशोधित किया गया है । 17 त्रुटि पट्टियां% संकेत की ± 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । डेटा के लिए कर रहे है ंयूनतम तीन दोहराने प्लेटें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: हीट-इलाज नोरोवायरस GII. 4 सिडनी के लिए उदाहरण DLS डेटा capsids दिखा आदर्श और अस्पष्ट/ Capsids (VLPs) ६५ डिग्री सेल्सियस और ६८ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी उपचार के अधीन थे, और उनके आकार वास्तविक समय में नजर रखी थी । पैनल (a) किसी उच्च गुणवत्ता, स्पष्ट सहसंबंध गुणांक माप से मेल खाती है; और (b) किसी निंन गुणवत्ता के लिए, अस्पष्ट सहसंबंध गुणांक माप । पैनल (ग) ६८ डिग्री सेल्सियस पर इलाज capsids के लिए एक स्पष्ट एकत्रीकरण प्रोफ़ाइल दिखा रहा है, कण आकार डेटा प्रदर्शित करता है; और (d) हीट-इलाज capsids के लिए अस्पष्ट कण आकार डेटा दिखाता है । इन आंकड़ों में से कुछ प्रस्तुत कर रहे हैं, और इस प्रकार इस छवि को मूर एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: नोरोवायरस GII के उनि. 4 सिडनी capsids अलग गर्मी उपचार के अधीन । शुद्ध capsids (VLPs) विभिंन गर्मी उपचार के अधीन थे और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया । पैनल (एक) capsids के लिए डेटा दिखाता है अलग तापमान पर गरम (६०, ६५, ७०, ७५, और ८० ° c) के लिए 1 min. पैनल (b) से पता चलता है capsids के लिए ६८ ° c उपचार के अधीन है 0-25 मिनट दाएँ हाथ तस्वीरें पर (पट्टी) १०० एनएम का प्रतिनिधित्व करता है. इन छवियों को मूर एट अल में प्रस्तुत कर रहे हैं । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घातीय क्षय दर (% संकेत/
तापमान ६५ ° c ६८ ° c
Ligand
HBGA प्रकार A २.५० ± ०.२४ १३.३० ± १.१५
Aptamer M6-2 २.४७ ± ०.६६ १३.१८ ± ०.४७

तालिका 1: घातीय नोरोवायरस GII. 4 सिडनी capsids के लिए क्षय दर ६५ ° c और ६८ डिग्री सेल्सियस पर इलाज किया । Capsids को ६५ डिग्री सेल्सियस और ६८ डिग्री सेल्सियस पर विभिंन बार के लिए उपचार गर्मी के अधीन थे, 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा, और उनके सिंथेटिक HBGA या aptamer बांधने की क्षमता का मूल्यांकन किया । समय के साथ संकेत हानि की दर (क्षय दर) तो प्रत्येक तापमान के लिए प्रत्येक ligand के साथ गणना की गई थी. इन आंकड़ों को पहले मूर एट अल में प्रस्तुत किया गया है । 17 डेटा% सिग्नल के% संकेत के रूप में प्रस्तुत कर रहे है/

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Discussion

प्रोटोकॉल और तकनीक यहां वर्णित मानव नोरोवायरस कैप्सिड अखंडता का आकलन करने का एक साधन प्रदान/ इन तरीकों वायरस के खिलाफ निष्क्रियता उपचार के प्रभाव में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संभावित रूप से अधिक पारंपरिक निष्क्रियता मूल्यांकन तरीकों जैसे आर टी-qPCR या पट्टिका परख के पूरक कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, रासायनिक या शारीरिक निष्क्रियता के मूल्यांकन अकेले पट्टिका परख वायरस निष्क्रियता की डिग्री का एक उपाय है लेकिन नहीं है कि निष्क्रियता के अंतर्निहित तंत्र प्रदान करता है । इसके अलावा, वायरस एकत्रीकरण titer के आकलन में परिणाम कर सकते हैं और इसलिए उपचार प्रभावकारिता30अनुमान लगाने. इन तरीकों को आगे नोरोवायरस कैप्सिड की अखंडता पर एक इलाज के प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान करके इस तरह के एक अध्ययन को सूचित कर सकते हैं । हाल ही में, मानव नोरोवायरस के लिए इन विट्रो (कोशिका संस्कृति) खेती विधियों में से दो की सूचना दी गई है5,6; ये अभी भी वायरस गणन के लिए पीसीआर पर भरोसा है, हालांकि सैद्धांतिक रूप से enteroid प्रस्तुत मॉडल रिश्तेदार कमी दृढ़ संकल्प के लिए धुंधला एंटीबॉडी का उपयोग TCID50 के लिए उपयोग किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत तरीकों बस गर्मी उपचार से परे उपचार के कई विभिंन प्रकार के लिए वायरल निष्क्रियता का पूरा तंत्र को समझने के लिए उपयोगिता हो सकती है । उदाहरण के लिए, थाली आधारित ligand बंधन और उनि उपकरण के रूप में उपयोग किया गया था पर नोरोवायरस निष्क्रियता के तंत्र का निर्धारण करने में आर टी qPCR और पट्टिका परख डेटा31सतहों,३२, रजत dihydrogen के लिए जोखिम पर साइट्रेट३३, और उच्च हीड्रास्टाटिक दबाव उपचार14।

इन प्रोटोकॉल जिसमें ध्यान methodological विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण है में कई कदम उठाए हैं । विशेष रूप से, प्लेट परख के लिए, महान ध्यान बाध्यकारी के लिए ligand को पतला करने के लिए इस्तेमाल किया बफर के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । Aptamer M6-2, और सामांय में ssDNA aptamers, नमक सांद्रता और बफर शर्तों के प्रति संवेदनशील हैं । aptamer के साथ एक गैर-इष्टतम बफ़र का उपयोग कर ablate बाइंडिंग हो सकता है । हालांकि aptamer M6-2 सफलतापूर्वक मानव मल पतला में इस्तेमाल किया गया है, बहुत ज्यादा मल/मैट्रिक्स हस्तक्षेप बाध्यकारी है, जो अंय मानव नोरोवायरस aptamers के लिए टिप्पणियों के साथ संगत है के साथ हस्तक्षेप कर सकते है18,22। इस कारण एक प्रमुख कारक यह है कि aptamers सकारात्मक आरोप अणुओं के लिए विशिष्ट बाध्यकारी की एक डिग्री प्रदर्शित कर सकते हैं । इस प्रकार, इस परख में झूठी सकारात्मक संकेत के कुछ हद तक ले जा सकता है यहां वर्णित है । यह एक नकारात्मक नियंत्रण है कि या तो वायरस या एक असंबंधित प्रोटीन के बिना एक जटिल मैट्रिक्स है का चयन करके के लिए हिसाब किया जा सकता है । इसी तरह, HBGA एकाग्रता और मलाई उतारा दूध बाध्यकारी बफर में इस्तेमाल किया ठोस की राशि काफी सकारात्मक और पृष्ठभूमि संकेतों को प्रभावित कर सकते हैं । ध्यान दें कि विभिंन HBGAs मानव नोरोवायरस के विभिंन उपभेदों के लिए अपनत्व की डिग्री बदलती है, इसलिए बाध्यकारी बफ़र्स HBGA प्रकार के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है14,31,३३। समान विचार streptavidin-सहिजन peroxidase संयुग्म के लिए इस्तेमाल किया बफर के लिए दिया जाना चाहिए, के रूप में विभिन्न निर्माताओं से सांद्रता अलग कर सकते हैं; हालांकि, बहुत कम परिवर्तनशीलता streptavidin के उच्च समानता-बायोटिन इंटरेक्शन३४दिया उम्मीद होगी । इस प्लेट-आधारित विधि के अनुकूलन क्षमता के उच्च स्तर के कारण, समस्या निवारण उप-श्रेष्ठतम परिणाम अपेक्षाकृत सरल है । उदाहरण के लिए, उच्च पृष्ठभूमि संकेत के मामले में, स्किम दूध एकाग्रता में वृद्धि और ligand एकाग्रता को कम करने के अनुकूलन की जांच की जा सकती है, और कम सकारात्मक संकेतों के साथ प्लेटों के लिए प्रतिकूल । उनि के लिए, सबसे महत्वपूर्ण बातों में से एक गैर स्थैतिक सामग्री (कांच की तरह) का उपयोग जब भंडारण/हैंडलिंग ग्रिड, के रूप में ग्रिड अत्यंत डिस्पोजेबल पेट्री व्यंजन के रूप में सामग्री के आसपास संभाल मुश्किल हो रहा है । यदि ऐसी सामग्री का उपयोग किया जाता है, ग्रिड "कूद" और सामग्री के लिए छड़ी करते हैं । इसके अतिरिक्त, बहुत देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि वहां ग्रिड पर कोई अवशिष्ट नमी है लिया जाना चाहिए । आदर्श रूप में, एक निर्वात desiccator अगर उपलब्ध किया जाना चाहिए ।

DLS का उपयोग करते हुए प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, नमूना की शुद्धता एक बहुत ही महत्वपूर्ण विचार है । व्यास करने के लिए प्रकाश बिखरने तीव्रता में परिवर्तन सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया कार्यों monomodal या संकीर्ण multimodal कण वितरण होने पर निर्भर करते हैं । नेनो के लिए नीचे दोष, प्रोटीन सहित, polydispersity परिचय और आकार गणना में परिवर्तन । इसके अलावा, प्रकाश की तीव्रता बिखरे हुए व्यास के लिए आनुपातिक है 6 की एक शक्ति को उठाया, इतना बड़ा कण जैसे धूल के रूप में काफी माप के साथ हस्तक्षेप । बुलबुला गठन के दौरान वास्तविक समय गर्मी उपचार अतर्कसंगत परिणामों में परिणाम प्रकाश के अस्थिर बुलबुले द्वारा बिखरे हुए के कारण । कैप्सिड (VLP) एकाग्रता भी DLS का उपयोग करते समय विचार किया जाना चाहिए. नमूना सांद्रता पर्याप्त संकेत और कई तितर बितर से बचने के लिए काफी कम उत्पादन करने के लिए काफी उच्च होना चाहिए । यह भी महत्वपूर्ण महत्व का सही सामग्री और dispersing गुण इनपुट करने के लिए है, के रूप में इन मूल्यों के आकार की गणना के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा उपयोग किया जाता है । विशेष रूप से, फैलाव चिपचिपापन तापमान का एक समारोह है और गर्मी उपचार के दौरान तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया पानी के तापमान पर निर्भर viscosities में बनाया गया है) ।

हालांकि तरीकों यहां वर्णित कैप्सिड अखंडता का आकलन करने के लिए बेहतर तरीके के लिए कई अवसर प्रदान करते हैं, वे सही नहीं हैं । क्योंकि इन तरीकों वायरस के बहुत उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है, वे शुद्ध, इकट्ठे capsids के बजाय देशी संक्रामक वायरस के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यहां इस्तेमाल VLPs मानव नोरोवायरस (VP1) के प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन से मिलकर बनता है, जो वायरल नोरोवायरस एसिड के बिना कैप्सिड न्यूक्लिक में इक्ट्ठा होता है । हालांकि इन VLPs प्रदर्शन संक्रामक वायरस capsids के लिए समान व्यवहार antigenically, वे और अधिक निष्क्रियता के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है । इसके अलावा, VLPs के लिए उत्पादन और शुद्ध और कई जांचकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है मुश्किल हैं । शुद्ध मानव नोरोवायरस का उपयोग (जैसे, ultracentrifugation का उपयोग कर) संभव है, लेकिन नोरोवायरस-सकारात्मक मानव मल नमूनों की उपलब्धता सीमित है और यहां तक कि शुद्धि के साथ, वायरस titers पर्याप्त उच्च नहीं हो सकता है तरीकों को समायोजित करने के लिए यहां बताई । अर्द्ध शुद्ध मल में संक्रामक वायरस के उपयोग के लिए परख के अनुकूलन पर भविष्य में काम वर्तमान में चल रहा है । वास्तव में, यह पहले से ही प्लेट परख18,22के लिए प्रदर्शन किया गया है, लेकिन निस्संदेह DLS के लिए और अधिक जटिल होगा । यह भी इन विधियों केवल कैप्सिड को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है जो किसी भौतिक (ऊष्मा) निष्क्रियण approach के अनुप्रयोग के बाद कैप्सिड अक्षतता का मूल्यांकन करने के लिए लागू किए गए थे कि ध्यान दिया जाना चाहिए । परिणाम अधिक अस्पष्ट हो सकता है इन तकनीकों को कैप्सिड अंय निष्क्रियता दृष्टिकोण का उपयोग कर अखंडता का मूल्यांकन करते थे, ऐसे रासायनिक एजेंटों या तरीकों कि ज्यादातर वायरल जीनोम के विनाश के लक्ष्य के रूप में । हालांकि, कुछ रिपोर्टों ने अनुकूल रासायनिक निष्क्रियण31,३३,३५,३६,३७के मूल्यांकन के लिए HBGA बाइंडिंग के प्रदर्शन का प्रदर्शन किया । वर्तमान समय में, प्रोटोकॉल यहां की सूचना दी सबसे अच्छा आरटी-qPCR और pl की तरह पारंपरिक तकनीक (ओं) के साथ संगीत कार्यक्रम में प्रयोग किया जाता हैकिराए के वायरस के साथ aque परख ।

इन प्रोटोकॉल एक सरल वैकल्पिक साधन है जिसके द्वारा मानव नोरोवायरस पर एक शारीरिक वायरस निष्क्रियण विधि (गर्मी) के प्रभाव को समझने के लिए प्रदान करते हैं । इन पद्धतियों की संभावना अंय गैर-लिफाफा वायरस (जैसे, हेपेटाइटिस ए और ई वायरस) के साथ उपयोग के लिए विस्तार किया जा सकता है, उच्च आदेश प्रोटीन संरचना की हानि का पता लगाने के समग्र सिद्धांत के रूप में एक ही है । साथ ही, व्यवहार और कैप्सिड अखंडता की हानि का संकेत के लिए अंय लाइगैंडों के संभावित उपयोग का मूल्यांकन किया जाना चाहिए । और अधिक जटिल नमूना मैट्रिक्स के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन, और उनकी विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता (खोज सीमा) में सुधार भी एक तार्किक भविष्य की दिशा है । कुल मिलाकर, यहां वर्णित तरीकों मानव नोरोवायरस कैप्सिड अखंडता का निर्धारण और इस महत्वपूर्ण रोगज़नक़ के खिलाफ निष्क्रियता उपचार के प्रभाव में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का एक और अधिक सुलभ साधन प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को कृषि एवं खाद्य अनुसंधान पहल प्रतियोगी अनुदान सं 2011-68003-30395 द्वारा संयुक्त राज्य कृषि विभाग, राष्ट्रीय खाद्य एवं कृषि संस्थान, NoroCORE परियोजना के माध्यम से समर्थित किया गया । संयुक्त राज्य कृषि विभाग द्वारा ओपन एक्सेस चार्ज के लिए फंडिंग प्रदान की गई । हम रॉबर्ट अतमार (चिकित्सा, ह्यूस्टन, TX के Baylor कॉलेज) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा के लिए कृपया हमें शुद्ध capsids और वैलेरी Lapham के साथ उसकी सहायता के लिए उपलब्ध कराने के उनि छवियां । हम भी हमें प्रस्तुत प्रयोगों शुरू करने में मदद करने के लिए फ्रैंक एन बैरी शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate Fisher (Costar) 07-200-36
Lid for 96-well plate Thermo Fisher 3098
Paraffin film (Parafilm) Thermo Fisher PM999
1x PBS (pH 7.2) Life Technologies 20012-050
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 N/A N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids N/A N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes Genesee Scientific 22-154G
2 thermocyclers Bio-Rad 1861096
Tabletop mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Skim milk solids Thermo Fisher LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated Glycotech 01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 Life Technologies SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature Thermo Fisher 50-76-00
1 M phosphoric acid N/A N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm Tecan Infinite m200 Pro
Name Company Catalog Number Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program N/A N/A
Name Company Catalog Number Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument Malvern Instruments N/A
Vortex Fisher Scientifc 02-215-365
Quartz cuvette Hellma 104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) Malvern Instruments ZEN0040
Name Company Catalog Number Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film Ladd Research 10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers Ted Pella 5372-NM
Qualitative filter paper Sigma-Aldrich (Whatman) WHA1002055
Glass petri dishes Sigma-Aldrich BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) N/A N/A
2% uranyl acetate N/A N/A

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References

  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

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Moore, M. D., Mertens, B. S., Jaykus, L. A. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (129), e56444, doi:10.3791/56444 (2017).

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