Summary
Metodi di rilevazione sistematica che utilizzano amplificazione del genoma virale sono limitati dalla loro incapacità di discriminare infettive da particelle non infettive. Lo scopo di questo articolo è di fornire protocolli dettagliati per metodi alternativi di aiuto nella discriminazione delle particelle infettive norovirus utilizzando l'associazione aptamer, diffusione dinamica della luce e microscopia elettronica di trasmissione.
Abstract
Norovirus umana esige di sanità pubblica considerevole e perdite economiche in tutto il mondo. Emergenti in vitro anticipi di coltivazione non sono ancora applicabili per la determinazione sistematica del virus. L'attuale rilevazione e quantificazione tecniche, che si basano principalmente su amplificazione degli acidi nucleici, non discriminare infettive da particelle virali non infettive. Lo scopo di questo articolo è di presentare dettagli specifici sui recenti progressi nelle tecniche utilizzate insieme al fine di acquisire ulteriori informazioni sullo stato di infettività delle particelle virali. Una tecnica prevede la valutazione di associazione di un aptamero ssDNA norovirus a capsidi. Aptameri hanno il vantaggio di essere facilmente sintetizzati e modificato e sono poco costosi e stabile. Un'altra tecnica, dynamic light scattering (DLS), ha il vantaggio di osservare il comportamento del capsid in soluzione. La microscopia elettronica consente la visualizzazione dell'integrità strutturale dei capsidi virali. Anche se promettente, ci sono alcuni svantaggi per ogni tecnica, ad esempio aspecifici aptamero associazione alle molecole caricati positivamente da matrici di campioni, requisito del capside purificato per liste di distribuzione e la scarsa sensibilità per microscopia elettronica. Tuttavia, quando queste tecniche vengono utilizzate in combinazione, il corpo di dati prodotti fornisce informazioni più complete sull'integrità del capsid di norovirus che possono essere utilizzate per dedurre infettività, informazioni che è essenziale per una valutazione accurata dei metodi di inattivazione o interpretazione di rilevazione dei virus. Questo articolo fornisce i protocolli per l'utilizzo di questi metodi per discriminare le particelle infettive umane norovirus.
Introduction
Norovirus umana è responsabile di un onere considerevole sanità pubblica a livello mondiale, causando malattie circa 685 milioni e 212.000 morti annualmente1, ad un costo di miliardi di dollari2,3. Oggi, quantificazione e norovirus rilevamento coinvolge amplificazione del genoma e/o piattaforme basate su ligando. Il primo è generalmente preferito quanto è più sensibile, fornisce informazioni quantitative e ha generalmente più a basso rischio di risultati falsi positivi4. La tecnica più comune norovirus rilevazione e quantificazione del genoma amplificazione è reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Perché esso è destinato e amplifica un piccolo segmento del genoma umano norovirus, RT-qPCR da solo non è in grado di discriminare tra infettive e particelle non infettive, come RNA genomico gratis, danneggiato capsidi contenenti genomi e capsidi con fatalmente genomi mutati/troncato possono ancora essere amplificati da RT-qPCR. Mentre due nuove in vitro tecniche colturali per norovirus umano5,6 sono state segnalate recentemente, entrambi ancora contare su RT-qPCR per quantificazione del virus e non sono ancora metodi fattibile per la routine clinica/ambientale test per i norovirus umani. Così, RT-qPCR rimane il gold standard per test clinici/ambientali.
Nel tentativo di valutare meglio lo stato di infettività delle particelle norovirus sono stati sviluppati altri metodi in vitro . Questi metodi possono essere classificati generalmente come quelli che riguardano l'integrità del capside norovirus e quelli valutando l'integrità genomica. Il primo approccio è più popolare. Un metodo comunemente usato è il pretrattamento di RNAsi prima dell'estrazione di RNA genomico virale, tuttavia questo non tiene conto per le particelle virali che rimangono intatte, ma mancano la capacità di legare i recettori/co-fattori dell'ospite, come pure le particelle virali che fatalmente hanno mutato o hanno troncato o danneggiato marginalmente genomi7. L'integrità del capsid possa anche essere valutato basato sulla capacità del virus di legarsi al norovirus umano co-receptor/co-fattori, che sono carboidrati conosciuto come antigeni di gruppo di histo-anima (HBGAs). HBGAs sono presenti in cellule epiteliali intestinali di host come parte di glicoproteine o glicolipidi (tra altri tessuti multipli) e può essere secreto nei fluidi corporei come la saliva. Batteri enterici contenenti sostanze simil-HBGA sulle loro superfici inoltre sono stati indicati per associare norovirus umano8,9,10, e tali interazioni possono promuovere norovirus infezione5. Il concetto di base dell'associazione HBGA di utilizzazione è che solo le particelle virali in grado di legare il putativo recettore/co-factor sarebbe in grado di infettare altre cellule. Gli studi multipli suggeriscono che l'associazione di HBGA basati su perlina precedente amplificazione degli acidi nucleici è un metodo promettente per infettività discriminazione11,12,13,14, 15,16. Una sfida importante per quanto riguarda HBGAs è che nessun singolo tipo HBGA possibile associare tutti i genotipi umani norovirus. Per risolvere questo problema, porcina mucina gastrica, che contiene HBGAs, è stata utilizzata al posto di carboidrati HBGA purificati nell'interesse di facilità di sintesi, coerenza e costi ridotti.
Una recente pubblicazione di Moore et al. 17 ha introdotto una serie di nuove tecniche per la stima dell'integrità umana norovirus capside. Al posto di HBGAs, Moore et al. 17 studiato il legame di un largamente reattivo dell'acido nucleico aptamero (M6-2)18 e largamente reattivo anticorpo monoclonale (NS14)19 al trattato termicamente capsidi di norovirus GII.4 Sydney (particelle virus-like o VLP) e rispetto a questo per l'associazione HBGAs sintetico. Acido nucleico aptameri sono breve (~ 20-80 nt) singolo incagliato acidi nucleici (RNA o ssDNA) che piegare in strutture tridimensionali uniche in conseguenza della loro sequenza e una destinazione. Perché sono gli acidi nucleici, sono meno costosi; facilmente chimicamente sintetizzati, purificati e modificati; e stabile al calore. Esistono parecchi rapporti di aptameri generati contro i norovirus, con alcuni di loro mostrando ampia reattività ad una varietà di ceppi18,20,21,22. A titolo di esempio, Moore et al. 17 hanno dimostrato quel aptamero M6-2 associato a capsidi norovirus umano purificato, assemblati (VLPs) e si sono comportati allo stesso modo di HBGA nell'affidamento sulle proteine del capside virale per mantenere la struttura della proteina di più alto ordine (ad es., secondaria e terziaria) per si verifichi l'associazione. D'altra parte, una percentuale significativa di legame norovirus VLP anticorpo NS14 rimase dopo capsidi erano completamente denaturati. Valutazione di norovirus associazione nello studio di Moore et al. 17 è stato fatto utilizzando un metodo semplice, basato su piastra, simile a ELISA, con l'eccezione che aptameri sono usati al posto di anticorpi (quindi il metodo è stato chiamato ELASA). Questo metodo sperimentale di throughput elevato è stato utilizzato per valutare gli effetti dei diversi trattamenti sul capside di norovirus, lavoro che è prezioso per la comprensione del meccanismo di inattivazione virale sull'esposizione a fattori di stress fisici o chimici. Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è la sensibilità e la mancanza di tolleranza per matrix-collegata di contaminanti a livelli più alti che causano il legame non specifico di aptameri inferiore.
Moore et al. 17 utilizzato un altro metodo, diffusione dinamica della luce (DLS), per monitorare l'aggregazione delle particelle virali in risposta ad un trattamento termico. DLS è comunemente usato per valutare la dimensione delle sospensioni di nanoparticella ed è stato esteso a proteine23,24 e virus25,26,27. L'intensità della luce diffusa dalle particelle in soluzione varia in funzione della dimensione delle particelle, consentendo per il calcolo del coefficiente di diffusione e quindi diametro della particella mediante formule ben consolidate. La tecnica di liste di distribuzione in grado di distinguere il diametro idrodinamico delle particelle disperse nanometriche, che permette la rilevazione di virus dispersi, proteine del capside individuali o dimeri e aggregati di virus basati su dimensioni27. Aggregazione di virus, rappresentato da un aumento della dimensione delle particelle, è indicativo di perdita di integrità del capside. Mentre le proteine del capside è denaturato e sua struttura interrotti, residui idrofobici diventano esposti e causano le particelle stare insieme e formare aggregati. Liste di distribuzione può essere utilizzato per misurare la dimensione delle particelle dopo un trattamento specificato o la cinetica di aggregazione in tempo reale17,28. Questo metodo ha il vantaggio di permettere l'osservazione del comportamento del capsid in soluzione ma richiede alte concentrazioni del capside purificata, che non può essere interamente rappresentativa del virus nel suo stato naturale.
L'ultimo metodo utilizzato da Moore et al. 17 era microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Sebbene questo metodo manca di sensibilità e non produce dati quantitativi, consente per la visualizzazione degli effetti di diversi trattamenti sulla struttura del capside virale. Anche se non è ancora ideale per impostazioni cliniche/ambientale, l'uso di questi metodi in combinazione è utile nella comprensione umana norovirus inattivazione. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire approfondite protocolli per l'analisi di associazione basata su piastra (ELASA), DLS, e TEM preparazione metodi utilizzati per studiare gli effetti dei trattamenti termici sul capside di norovirus nel contesto degli effetti dei trattamenti sul capside integrità come presentato in Moore et al. 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. piastra-base legando l'analisi per valutare perdita di ordine Norovirus capside struttura superiore
Nota: un protocollo ELASA molto simile a quella presentata qui è stato pubblicato 29, e simili ELASA saggi precedentemente sono stati segnalati come parte della ricerca articoli altrove 17 , 18 , 22.
- Trattamento termico di capsidi GII.4 Sydney norovirus umano
- ottenere norovirus umano purificato proteina principale del capsid (VP1) di Sydney GII.4 (adesione: JX459908) assemblati in capsidi.
Nota: Capsidi nello studio sono state ottenute per gentile concessione di R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX). - Diluire capsidi a 50 µ g/mL in 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7,2) ad un volume massimo di 15 µ l in singole provette PCR con tappi. Assicurarsi che il tubo contiene almeno 600 ng del capside. Assicurarsi che vi sia 600 ng del capside per ogni combinazione di trattamento-ligando.
- Preriscaldare il termociclatore a trattamento termico desiderato.
Nota: ai fini del presente protocollo, trattamento a 68 ° C per tempi diversi (0 - 25 min) è stato scelto. - Preriscaldare un cycler termico aggiuntivo a 4 ° C per il raffreddamento immediato. Aggiungere tubi con la soluzione del capsid termociclatore per il tempo desiderato. Trasferire immediatamente al ciclatore pre-raffreddata 4 ° C per 5 min dopo il riscaldamento.
Trattamento
- Include 95 ° C per 5 min come controllo del capsid denaturato. Sono soluzione capside non trattati (23 ° C) come controllo positivo. Includono PBS con nessun capside come un ulteriore controllo negativo.
- Brevemente rotazione verso il basso in una centrifuga per ottenere tutte le goccioline sul fondo del tubo e diluire le soluzioni del capsid trattati in PBS a 3 µ g/mL. Assicurarsi che vi sia almeno 200 µ l di diluito, trattato del capsid (100 µ l/pozzetto).
- ottenere norovirus umano purificato proteina principale del capsid (VP1) di Sydney GII.4 (adesione: JX459908) assemblati in capsidi.
- Applicare 100 µ l di soluzione di capside in ciascun pozzetto, assicurando che ci sono almeno due pozzi per ogni trattamento. Inoltre, includono 2 pozzetti di controllo con 100 µ l PBS per ogni ligando; Questo fornisce l'assorbanza di fondo del dosaggio. Coprire la piastra con un coperchio, sigillo bordi con paraffina per ridurre l'evaporazione della pellicola e lasciano durante la notte su un incubatore d'agitazione a 4 ° C o per 2 h a temperatura ambiente.
- Preparare il tampone bloccante facendo 5% latte scremato solidi (w/v) in PBS con 0.05% Tween 20 (PBST).
- Rimuovere le soluzioni del capsid trattati dalla piastra. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di tampone bloccante. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte, sigillato a 4 ° C.
- Preparare il ligando vincolanti soluzioni per l'aptamero biotinilati M6-2 18 , 29 e biotinilati sintetico HBGA sangue di tipo A o tipo di biotinylated H.
- Diluire l'aptamero biotinilato a 1 µM in acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che ci sia una soluzione abbastanza per 200 µ l totale per ogni trattamento. Diluire il biotinilati selezionati HBGA a 30 µ g/mL in tampone bloccante. Assicurarsi che vi sia una soluzione abbastanza per 200 µ l di volume totale per ogni trattamento.
Nota: Per utilizzare meno HBGA, 10 µ g/mL di HBGA a 0,25% latte scremato-PBST può essere sostituito. Concentrazioni per entrambi biotinilati M6-2 e HBGA precedentemente ottimizzate e riferite.
- Diluire l'aptamero biotinilato a 1 µM in acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che ci sia una soluzione abbastanza per 200 µ l totale per ogni trattamento. Diluire il biotinilati selezionati HBGA a 30 µ g/mL in tampone bloccante. Assicurarsi che vi sia una soluzione abbastanza per 200 µ l di volume totale per ogni trattamento.
- Rimuovere il tampone bloccante e lavare le piastre 3 volte con 200 µ l/pozzetto PBST. La piastra capovolta su carta sterile assorbente per asciugare l'umidità residua di Pat. Soluzioni di collegamento di
- aggiungere 100 µ l/pozzetto del ligando, assicurando che ci sono 2 pozzi per ogni combinazione di trattamento termico-ligando. Incubare la piastra coperta con un coperchio su agitatore orbitale a circa 60 giri/min per 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Assicurarsi di includere 2 pozzetti ciascuna delle capsidi non trattate e completamente denaturati capsidi per ogni legante come controlli positivi e negativi, rispettivamente. Inoltre, includono 2 " no capside " pozzi per ogni legante come la piastra di base control. - Rimuovere le soluzioni di ligando e lavare i pozzetti 3 volte con 200 µ l/pozzetto PBST. Pat la piastra capovolta su carta sterile assorbente per asciugare l'umidità residua. Perossidasi di streptavidina-rafano,
- aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di 0,2 µ g/mL in PBS. Incubare per 15 min a temperatura ambiente con agitazione delicata su agitatore orbitale.
Nota: Diversi streptavidina-rafano perossidasi coniugati avrà diverse concentrazioni. Consultare l'utente ' s manuale per la gamma ideale di concentrazioni per applicazioni di ELISA dell'enzima e verificare che sia ottima. - Rimuovere la soluzione di coniugato. Lavare 3 volte con 200 µ l/pozzetto PBST. Pat la piastra capovolta su carta sterile assorbente per asciugare l'umidità residua.
- Aggiungere 100 µ l/pozzetto 3,3 ', 5,5 '-substrato tetrametilbenzidina (TMB) e consentire il colore di sviluppare per pozzetti di controllo negativo di osservare 5-15 minuti per qualsiasi colore ed essere sicuri di sviluppare costantemente allo stesso orario tra piastre di replicare. Essere consapevoli della gamma assorbanza del lettore della piastra utilizzata, pure.
Nota: I tempi di sviluppo possono variare in base alla qualità dei ligandi/reagenti utilizzati. - Arrestare lo sviluppo della reazione con acido fosforico di 100 µ l/pozzetto 1M. Leggere immediatamente piastra a 450 nm. Salvare i dati.
Nota: Introduzione dell'acido in genere rallenta drasticamente la reazione ma completamente non si ferma. Non lasciare la piastra si fermò per un lungo periodo di tempo prima di leggere l'assorbanza.
2. Analisi dei risultati del test basato su piastra
- salvare i dati di assorbanza crudo in un foglio di calcolo. Produrre l'assorbanza media per ogni coppia bene con il trattamento specifico e ligando. Utilizzare queste medie per tutte le successive analisi.
Nota: Confrontare entrambi assorbanze bene per essere sicuri che nessuna coppia di wells hanno valori significativamente disparati. - Per analizzare l'integrità assoluta del capsid (tutte le associazione), sottrarre l'assorbanza crudo del " no capside " controllo da ogni altro valore di assorbanza del campione.
Nota: In alternativa, perdita di associazione a causa di perdita di più alto ordine (secondario, terziario e Quaternario) struttura possa direttamente essere analizzato. Invece di sottrarre l'assorbanza del controllo negativo (nessun capside), sottrarre il valore del controllo completamente denaturato capside. Questo consente di rimuovere tutte le associazione del segnale dovuto vincolante all'apparato non specifici così come associazione dovuto la sequenza del capside. HBGA e aptamero M6-2 visualizzare poco vincolante a capside completamente denaturato, così entrambi i metodi produce risultati simili. Falso segnale positivo attribuito all'associazione aptamer non specifico deve essere considerato quando si sceglie quale analisi utilizzare. - Con le assorbanze adeguato controllo negative o denaturate, dividere il trattamento assorbanze dai loro rispettivo positivo (nessun trattamento) controllano assorbimenti e moltiplicano per 100. Questo fornisce la percentuale del segnale del capside trattato rispetto al controllo non trattato.
- Per stimare il livello di segnale di collegamento per ogni ligando attribuibile alla sequenza del capsid, sottrarre il " no capside " controllo dall'assorbanza iniziale negativo e prendere l'assorbanza rettificato del capside denaturato. Dividi questo numero per l'assorbanza rettificato del segnale di controllo positivo e moltiplicarlo per 100. Questo dà la percentuale apparente del segnale a causa del grippaggio del ligand a sequenza denaturato capside/capside.
3. Liste di distribuzione per il rilevamento di Virus aggregazione dopo il trattamento termico
Nota: La procedura seguente potrebbe essere specifica per il software e strumento utilizzato, ma può essere adattato e applicato a dispositivi simili.
- Crea una nuova dimensione SOP in liste di distribuzione dello strumento software utilizzando: materiale = proteina, Dispersant = PBS, temperatura = 25 ° C, tempo di equilibramento = 0 sec, tipo di cella = cuvetta monouso (piccolo volume, ZEN0040), angolo di misura = 173° Backscatter, Durata misura = automatico, numero di misurazioni = 3, ritardo tra misurazioni = 0 sec, elaborazione dei dati: modello di analisi = General purpose (risoluzione normale). Utilizzare le impostazioni predefinite per tutti gli altri parametri.
- Selezionare la freccia verde in esecuzione all'interno del software e il nome del campione.
- Seguire passaggi 1.1.1 attraverso 1.1.4 per il trattamento termico di VLP.
- Diluire il calore trattato VLPs 01:10 in PBS 1X per una concentrazione finale di 5 µ g/mL. (Opzionale) Filtrare il campione con un 1 µm dei pori per rimuovere le particelle di polvere; DLS è molto sensibile alla polvere, come particelle di grandi dimensioni a dispersione molto più luce di piccole particelle. Cuvetta
- trasferire 50 µ l di VLP diluito in un piccolo volume USA e getta. Inserire la cuvetta nel pozzetto di misurazione dello strumento.
- Iniziare la corsa e utilizzare il ' Correlogramma ', ' cumulanti Fit ', e ' i consigli esperti ' schede per valutare la qualità dei dati.
- Durante l'esecuzione, controllare che il valore di indice di polidispersione è inferiore a 0,3, che rappresenta una misura di qualità. nella ‘ multi-view ’ scheda, assicurarsi che il coefficiente di correlazione è costante e vicino a, ma non più di 1, in breve tempo, e cade bruscamente a 0 in un secondo momento, caratteristico della dimensione delle particelle. Uso il ‘ i consigli esperti ’ scheda per il feedback sulla qualità dei dati durante le misurazioni.
- Dopo la misurazione è completata, controllare nuovamente che il valore di indice di polidispersione è inferiore a 0,3. Assicurarsi che i cumulanti forma segue linea dati punti strettamente nella ‘ cumulanti fit ’ Tab.
- Prendere la media del diametro della particella Z-media segnalata per ogni misurazione come la dimensione delle particelle di ciascun campione. Tracciare il diametro in nm vs temperatura in ° C.
4. DLS per rilevare Virus aggregazione in tempo reale
Nota: I seguenti passaggi potrebbero essere specifici per il software e strumento utilizzato, ma può essere adattato e applicato a dispositivi simili.
- Crea una nuova dimensione SOP in liste di distribuzione dello strumento software utilizzando: materiale = proteina, Dispersant = PBS, temperatura = come desiderato, tempo di equilibramento = 0 sec, tipo di cella = cuvette in quarzo, angolo di misura = 173° Backscatter, durata di misura = automatico, Numero di misurazioni = 50 (può essere aumentata o diminuita a seconda aggregazione tasso), ritardo tra misure = 0 sec, elaborazione dei dati: modello di analisi = più strette modalità (alta risoluzione). Utilizzare le impostazioni predefinite per tutti gli altri parametri.
- Selezionare la freccia in esecuzione all'interno del software per aprire e il nome di un nuovo campione e lasciare lo strumento raggiungere l'equilibrio di temperatura.
- Sospendere i VIP in 1X PBS in un tubo del microcentrifuge ad una concentrazione di 5 µ g/mL e un volume tra 200-500 µ l. vortice la sospensione.
- Rotazione verso il basso la sospensione VLP per 5-10 s in una centrifuga da tavolo per-gas. Questo aiuta a prevenire la formazione di bolle durante il trattamento termico che interferisce con la dimensione misurazioni.
- Trasferimento le VLP sospensione al quarzo piccolo volume cuvette-evitare bolle e pipettare lentamente contro la parete della provetta. Dopo che lo strumento ha raggiunto l'equilibrio di temperatura, inserire la cuvetta nel pozzetto di misurazione.
- Aspettare 10 s per la temperatura del campione equilibrare, quindi iniziare la corsa. Avviare un timer all'inizio della corsa. Interrompere il timer alla fine della prima misurazione. Prendere questa volta come il primo punto di tempo. Ottenere punti successivi di tempo dai tempi di misura registrati dal software.
- Iniziare la corsa e monitorare il Correlogramma, distribuzione adatta e consulenza di esperti per valutare la qualità dei dati.
Nota: Il PDI non necessariamente sarà che inferiore a 0,3 per queste misurazioni come il campione dovrebbe essere polidispersi durante l'aggregazione.- Assicurarsi che il coefficiente di correlazione è costante e vicino a, ma non più di 1 a breve termine e scende bruscamente a uno o più periodi successivi, caratteristici della dimensione delle particelle.
- Assicurarsi che la distribuzione in forma segue linea dati punti strettamente.
- Analizzare i dati in formato.
Punto
- determinare ogni volta dalla differenza di tempo tra ogni misurazione e il punto di tempo iniziale. Durate di misurazione non sono tutti esattamente uguali.
- Utilizzando una distribuzione di intensità, registrare le dimensioni delle cime con le più grandi zone per ciascun punto di misurazione/tempo.
- Tracciare i diametri di picco in nm rispetto al tempo in min.
5. Preparazione del campione TEM
- ottenere supporto in carbonio griglie di pellicola (nichel) progettati per TEM.
Nota: Consultare la struttura di nucleo su reagenti consigliati e la loro manipolazione per uso con il microscopio di impianto. Assicurarsi di memorizzare le griglie in una scatola contenente essiccante o una camera a vuoto per minimizzare l'esposizione all'umidità. - Strappare circa pezzi di 5 cm x 5 cm di carta da filtro. Ottenere vetro di Petri e corretto dichiusura reverse pinzette progettate per uso in microscopia.
- Tagliare circa 2,5 cm x 5 cm pezzo di pellicola di paraffina. Posto sul banco. Trattamento termico di norovirus capsidi di Sydney GII.4
- seguire la procedura di trattamento termico esattamente come descritto sopra ai punti 1.1.1 - 1.1.5 tranne: utilizzare 10 mM HEPES (pH 7.4) per il trattamento invece di PBS e non diluire ulteriormente capsidi dopo il trattamento (mantenere la soluzione a 50 µ g/mL). Dispensare la goccia di intero ~ 15 µ l di soluzione di capside trattati sulla pellicola di paraffina.
- Afferrare il bordo della griglia con le pinzette, permettendo loro di chiudere sul bordo per tenere la griglia e posizionare la griglia carbonio-lato-giù sopra la goccia di soluzione trattata. Lasciare Incubare per 10 minuti consentire il capside collegare alla rete.
- a seconda della purezza della preparazione del capsid, aggiungere lavaggi della soluzione 10 mM HEPES, se necessario sotto forma di goccioline di µ l di 10-15 posti in linea dopo la goccia di capside trattati.
- Dopo 10 min, ritirare la griglia con la goccia. Posizionare la griglia quasi perpendicolare a un pezzo di carta da filtro a stoppino via la goccia. Riprendere la goccia di 10-15 µ l di tampone HEPES con la griglia, tenere premuto per 30 s, poi stoppino via con un altro pezzo di carta da filtro per WA
- Posto una goccia di 15 µ l di soluzione di acetato di uranile 2% sul film paraffina in un'area vuota.
- Prendere la goccia di acetato di uranile con griglia e tenere per 45 s. stoppino via l'acetato di uranile, avendo cura di togliere la maggior parte della soluzione. Posizionare il griglia carbonio-lato alto su un pezzo di carta da filtro, facendo attenzione che la griglia non " bastone " all'umidità sulle pinzette. Inserire la carta da filtro con la griglia su di esso in un vetro aperto di Petri.
Nota: Non utilizzare piastre di Petri in plastica, come le griglie saranno elettrostaticamente attratte da loro e diventano bloccate al piatto.
- Prendere la goccia di acetato di uranile con griglia e tenere per 45 s. stoppino via l'acetato di uranile, avendo cura di togliere la maggior parte della soluzione. Posizionare il griglia carbonio-lato alto su un pezzo di carta da filtro, facendo attenzione che la griglia non " bastone " all'umidità sulle pinzette. Inserire la carta da filtro con la griglia su di esso in un vetro aperto di Petri.
- Ripetere per tutti i trattamenti. Posizionare le due metà di Petri con le griglie in un essiccatore durante la notte ad asciugare prima dell'osservazione con TEM.
- Rivolgersi alla sede di microscopia presso la rispettiva istituzione per quanto riguarda osservando le griglie preparate. Alcuni servizi consentono all'utente di essere addestrato sul funzionamento degli impianti di ' strumento di s. Dettagli specifici per quanto riguarda l'installazione e l'osservazione di un microscopio specifico è bgenerici nell'ambito di questo articolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'integrità strutturale del norovirus umano capsidi GII.4 Sydney (VLP) è stata valutata utilizzando diversi metodi di romanzo come presentato da Moore et al. 17. in primo luogo, è stato fatto un esperimento in cui l'integrità dei capsidi in funzione della loro capacità di legare un putativo recettore/co-factor (HBGA) o ssDNA aptamero (M6-2) sono stati confrontati (Figura 1). I risultati visualizzati sono stati presentati in precedenza da Moore et al. 17e dimostrare che il comportamento di associazione aptamer M6-2-capside era simile a quella di associazione virus-HBGA sopra l'esposizione ad un trattamento termico di 68 ° C per diversi tempi di esposizione. Mentre il segnale di associazione HBGA è stato perso leggermente in anticipo rispetto che di aptamero M6-2, M6-2 visualizzato un simile tasso di perdita di segnale calcolato dopo VLP sono stati esposti a 65 ° C e 68 ° C per volta vari punti (tabella 1)17. Ciò suggerisce che sia HBGA e l'associazione aptamer M6-2 è stato abolito in modo simile.
DLS misure hanno dimostrato che aggregazione dovuto denaturazione proteica probabilmente corrispondeva con perdita di segnale di collegamento del ligando (Figura 2), come diametro idrodinamico superiore a 100 nm è stato osservato dopo circa 18 min di trattamento a 68 ° C. Queste erano le condizioni alle quali perdita completa dell'associazione HBGA e quasi tutte le perdite di segnale di collegamento per aptamero M6-2 (> 80%) si è verificato (Figura 1)17. TEM risultati supportato queste osservazioni come cambiamenti morfologici e aggregazione dei capsidi è diventato sempre più evidente come la temperatura era aumentata in modo incrementale tra 60 ° C e 80 ° C per 1 min (Figura 3a). Un fenomeno simile è stato osservato dopo i capsidi a 68 ° C per fino a 25 min di riscaldamento, ma la risoluzione della popolazione TEM è stato che meno pronunciato (Figura 3b)17.
Figura 1: associazione dipendente dalla conformazione dei due diversi ligandi di capsidi GII.4 Sydney norovirus sottoposti a trattamento termico. Capsidi di Sydney GII.4 purificati (VLPs) sono stati sottoposti a trattamento termico a 68 ° C per diverse quantità di tempo, e l'associazione al tipo di sangue A HBGA e aptamero M6-2 è stata valutata usando un'analisi di associazione ELASA piastra-base. L'asse y Mostra il segnale di assorbanza osservato per un trattamento (tempo di esposizione) come la percentuale di un controllo non trattato del capside. Questa figura è stata presentata in precedenza e questa cifra è stata modificata da Moore et al. 17 barre di errore rappresentano ± 1 deviazione standard del segnale in %. I dati sono per replicare almeno tre piastre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esempio DLS dati per norovirus trattato termicamente capsidi di Sydney GII.4 ideale e ambiguo/bassa qualità risultati. Capsidi (VLPs) sono stati sottoposti a trattamento termico a 65 ° C e 68 ° C, e la loro dimensione è stato monitorato in tempo reale. Pannello (un) corrisponde ad un'elevata qualità, misurazione del coefficiente di correlazione chiara; e (b) a una bassa qualità, misurazione del coefficiente di correlazione ambiguo. Pannello (c) Visualizza i dati di dimensione delle particelle, che mostra un profilo chiaro aggregazione per capsidi trattati a 68 ° C; e (d) Visualizza i dati di dimensione delle particelle ambiguo per capsidi trattato termicamente. Alcuni di questi dati sono presentati, e così questa immagine viene modificata da Moore et al. 17 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: TEM di capsidi GII.4 Sydney norovirus sottoposti a diversi trattamenti termici. Capsidi purificati (VLPs) sono stati sottoposti a diversi trattamenti termici e osservate mediante microscopia elettronica a trasmissione. Pannello (un) Mostra dati per capsidi riscaldati a diverse temperature (60, 65, 70, 75 e 80 ° C) per 1 min pannello (b) Mostra capsidi sottoposti a trattamento di 68 ° C per 0 - 25 min. scala (bar) sulla destra foto rappresenta 100 nm. Queste immagini vengono presentate in Moore et al. 17 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tasso di decadimento esponenziale (% segnale/min) | |||
| Temperatura | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligando | |||
| HBGA tipo A | 2.50 ± 0,24 | 13.30 ± 1,15 | |
| Aptamer M6-2 | 2,47 ± 0,66 | 13.18 ± 0,47 | |
Tabella 1: tassi di decadimento esponenziale per capsidi GII.4 Sydney norovirus trattati a 65 ° C e 68 ° C. Capsidi sono stati sottoposti a trattamenti termici per varie volte a 65 ° C e 68 ° C, raffreddati a 4 ° C e la loro capacità di legare sintetico HBGA o aptamero valutati. Il tasso di perdita di segnale nel tempo (tasso di decadimento) è stata quindi calcolato con ogni ligando per ogni temperatura. Questi dati sono stati presentati in precedenza in Moore et al. 17 i dati sono presentati come % segnale/min ± 1 deviazione standard del segnale in %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo e le tecniche qui descritte forniscono un mezzo per valutare il norovirus umano del capsid integrità e funzionalità. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere informazioni mecanicistiche gli effetti dei trattamenti di inattivazione contro il virus e potenzialmente possono completare più tradizionali metodi di valutazione di inattivazione quale analisi di RT-qPCR o placca. Per esempio, la valutazione di inattivazione chimica o fisica di saggio della placca da solo fornisce una misura del grado di inattivazione di virus ma non il meccanismo sottostante che l'inattivazione. Inoltre, l'aggregazione virus può provocare sottovalutazione del titolo e pertanto sopravvalutare trattamento efficacia30. Questi metodi possono informare ulteriormente tale studio fornendo informazioni sugli effetti di un trattamento sull'integrità del capside norovirus. Recentemente, due in vitro (colture cellulari) metodi di coltivazione per norovirus umana sono stati segnalati5,6; questi ancora valere sulla PCR per l'enumerazione di virus, anche se teoricamente il modello enteroid presentato poteva essere utilizzato per TCID50 usando l'anticorpo che macchia per determinazione di riduzione relativa. I metodi presentati qui potrebbero avere utilità per comprendere il meccanismo completo di inattivazione virale per i più diversi tipi di trattamenti di là solo trattamento termico. Ad esempio, basato su piastra ligando e TEM sono stati utilizzati come strumenti per integrare i dati di analisi di RT-qPCR e placca nel determinare il meccanismo di inattivazione di norovirus su superfici in rame31,32, sopra l'esposizione all'argento diidrogeno citrato33e pressione idrostatica trattamento14.
Esistono numerosi passaggi in questi protocolli in cui attenzione al dettaglio metodologico è cruciale. In particolare, per l'analisi del piatto, grande attenzione dovrà essere pagato in buffer utilizzato per diluire il ligando per l'associazione. Aptamer M6-2 e aptameri ssDNA in generale, sono sensibili al sale concentrazioni e condizioni di buffer. Utilizzando un buffer non ottimale con la aptamer può l'ablazione associazione. Anche se aptamero in che M6-2 è stato utilizzato con successo diluito feci umane, troppe interferenze sgabello/matrice possono interferire con l'associazione, che è consistente con le osservazioni per altri umani norovirus aptameri18,22. Uno dei fattori principali che causano questo è che aptameri possono esibire un certo grado di legame non specifico di molecole positivamente caricate. Così, questo potrebbe portare ad un certo grado di falso segnale positivo con il test descritto qui. Questo può essere contabilizzato selezionando un controllo negativo che rappresenta una matrice complessa senza virus o una proteina non correlata. Allo stesso modo, la concentrazione di HBGA e la quantità di latte scremato solidi utilizzati nel buffer di associazione possono influenzare significativamente positivi e segnali di sfondo. Si noti che HBGAs diversi hanno diversi gradi di affinità di diversi ceppi di norovirus umano, quindi i buffer di associazione potrebbero essere necessario essere ottimizzati a seconda HBGA tipo14,31,33. Simili deve considerare il buffer utilizzato per il coniugato perossidasi di streptavidina-rafano, come le concentrazioni di diversi produttori possono differire; Tuttavia, molto meno variabilità ci si aspetterebbe data l'alta affinità dell' interazione streptavidina-biotina34. A causa dell'elevato grado di adattabilità di questo metodo basato su piastra, risoluzione dei risultati non ottimali è relativamente semplice. Ad esempio, nel caso di segnale di alta priorità bassa, ottimizzazione aumentando che la concentrazione di latte scremato e la concentrazione di ligando decrescente può essere indagati, e viceversa per piastre con bassi segnali positivi. Per TEM, una delle considerazioni più importanti è l'utilizzo di materiali non statico (come il vetro) quando archiviazione/gestione di griglie, come le griglie sono estremamente difficili da gestire nei dintorni di materiali come USA e getta di Petri. Se tali materiali sono usati, griglie tenderà a "saltare" e bastone al materiale. Inoltre, molta cura deve essere presa per assicurare che non esiste nessuna umidità residua sulle griglie. Idealmente, un essiccatore sotto vuoto dovrebbe essere usato se disponibile.
Durante gli esperimenti utilizzando le liste di distribuzione, la purezza del campione è una considerazione molto importante. Le funzioni utilizzate per correlare cambiamenti nell'intensità di dispersione della luce al diametro si basano sulla presenza monomodale o strette distribuzioni di particelle multimodale. Impurità nanometriche, tra cui proteine, introdurre polidispersità e alterare i calcoli delle dimensioni. Inoltre, l'intensità di luce sparsi è proporzionale al diametro elevato a una potenza di 6, così grandi particelle come la polvere sostanzialmente interferiscano con le misurazioni. Formazione di bolle durante trattamenti termici in tempo reale si traduce in risultati senza senso a causa della luce diffusa dalle bolle fluttuanti. Concentrazione del capsid (VLP) deve essere considerato anche quando si utilizzano liste di distribuzione. Concentrazioni di campione devono essere sufficientemente elevata per produrre segnale sufficiente e abbastanza basso per evitare dispersione multiple. È anche di vitale importanza per il corretto materiale di input e proprietà disperdenti, come questi valori vengono utilizzati dal software per i calcoli delle dimensioni. In particolare, viscosità disperdente è funzione della temperatura e deve essere regolato di conseguenza durante trattamenti termici (il software utilizzato è dipendente dalla temperatura viscosità dell'acqua costruito).
Anche se i metodi descritti qui offrono molteplici opportunità per altri metodi per valutare l'integrità del capsid, non sono perfetti. Poiché questi metodi richiedono molto alte concentrazioni di virus, essi deve essere utilizzati con capsidi purificate, assemblati invece di virus infettivi nativo. I VIP usati qui consistono della proteina del capside principali di norovirus umano (VP1), che assembla nel capside di norovirus senza acido nucleico virale. Anche se questi VLPs esibiscono un comportamento antigenicamente simile a capsidi virali infettive, possono essere più suscettibili di inattivazione. Ulteriormente, i VIP sono difficili da produrre e purificare e non sono prontamente disponibili per molti ricercatori. È possibile utilizzare purificato umano norovirus (ad es., usando ultracentrifugazione) ma disponibilità di campioni fecali umani norovirus-positiva è limitata e anche con purificazione, i titoli del virus potrebbero non essere abbastanza alti per ospitare i metodi descritto qui. Lavoro futuro ad ottimizzare le analisi per l'uso del virus contagioso semipurificata nelle feci è attualmente in corso. In realtà, questo è già stato dimostrato per il dosaggio di piastra18,22, ma senza dubbio sarebbe più complicato per le liste di distribuzione. Dovrebbe anche essere notato che questi metodi sono stati applicati solo per valutare l'integrità del capsid dopo l'applicazione di un fisico (calore) approccio di inattivazione, che è conosciuto per colpire direttamente le proteine del capside. Risultati possono essere più ambigui erano queste tecniche utilizzate per valutare l'integrità del capsid usando altri metodi di inattivazione, quali agenti chimici o metodi destinati principalmente a distruzione del genoma virale. Tuttavia, alcuni rapporti hanno dimostrato favorevole le prestazioni dell'associazione HBGA per la valutazione di inattivazione chimica31,33,35,36,37. Al momento attuale, i protocolli riportati qui sono meglio utilizzati in concerto con tecnica tradizionale come RT-qPCR e plaque saggi con virus surrogato.
Questi protocolli forniscono che un'alternativa semplice significa per comprendere gli effetti di un metodo di inattivazione di virus fisico (calore) il norovirus umano. Questi metodi probabilmente potrebbero essere esteso per l'utilizzo con altri virus non capsulati (ad es., l'epatite A ed E virus), come il principio generale di rilevazione perdita della struttura di proteina di ordine superiore è lo stesso. Inoltre, l'uso di comportamento e potenziale di altri ligandi per indicare la perdita di integrità del capsid dovrebbe essere valutato. Adattare i protocolli a più complesse matrici di campioni e migliorare la loro sensibilità analitica (limiti di rilevabilità) è anche una direzione logica futura. Nel complesso, i metodi descritti qui consentono di determinare l'integrità umana norovirus capside e guadagnando informazioni mecanicistiche gli effetti dei trattamenti di inattivazione contro questo agente patogeno importante in modo più accessibile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dall'agricoltura e cibo ricerca iniziativa concorrenziale Grant n ° 2011-68003-30395 dal dipartimento dell'agricoltura degli Stati Uniti, Istituto nazionale di cibo e agricoltura attraverso il progetto NoroCORE. Finanziamenti a costo di accesso aperto è stato fornito dal dipartimento di agricoltura degli Stati Uniti. Vorremmo ringraziare Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) per gentilmente averci i capsidi purificate e Valerie Lapham per la sua assistenza con le immagini TEM. Vorremmo anche ringraziare Frank N. Barry per aiutarci a iniziare gli esperimenti presentati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
