Summary
Rutinemessig gjenkjenningsmetoder utnytte viral genomet forsterkning er begrenset av deres manglende evne til å diskriminere smittsomme fra ikke-smittsomme partikler. Formålet med denne artikkelen er å gi detaljert protokoller for alternative metoder for å hjelpe i diskriminering av smittsomme norovirus partikler aptamer binding, dynamisk lysspredning og overføring elektronmikroskop.
Abstract
Menneskelige norovirus exacts betydelige folkehelsemessige og økonomiske tap over hele verden. I vitro gjelder dyrking fremskritt ikke ennå rutinemessig deteksjon av virus. Gjeldende gjenkjenning og kvantifisering teknikker, som bruker primært nukleinsyre forsterkning, diskriminerer ikke smittsomme fra ikke-smittsomme virus partikler. Formålet med denne artikkelen er å presentere bestemt informasjon på nylige fremskritt innen teknikker brukes sammen for å få ytterligere informasjon om statusen infectivity virus partikler. En teknikk innebærer vurdere binding av en norovirus ssDNA aptamer til capsids. Aptamers har fordelen av å være lett syntetisert og endret, og er rimelig og stabile. En annen teknikk, dynamisk lys spredning (DLS), har fordelen av merker kapsid oppførsel i løsningen. Elektronmikroskop tillater visualisering av den strukturelle integriteten til viral capsids. Selv om lovende, er det noen ulemper for hver teknikk, som uspesifisert aptamer binding til positivt ladet molekyler fra prøven matriser, kravet om renset kapsid for Distribusjonslister og dårlig følsomhet for elektronmikroskop. Når disse teknikkene brukes i kombinasjon, gir likevel kroppen data produsert mer omfattende informasjon om norovirus kapsid integritet som kan brukes til å antyde infectivity, informasjon som er viktig for nøyaktig vurdering av inaktivering metoder eller tolkning av virus oppdagelsen. Denne artikkelen inneholder protokoller for å bruke disse metodene til å diskriminere smittsomme menneskelige norovirus partikler.
Introduction
Menneskelige norovirus er ansvarlig for en betydelig folkehelsen byrde globalt, forårsaker ca 685 millioner sykdommer og 212,000 dødsfall årlig1, til i milliarder dollar2,3. I dag, innebærer norovirus gjenkjenning og kvantifisering genomet forsterkning og/eller ligand-baserte plattformer. Førstnevnte er generelt foretrukket som det er mer følsom, gir kvantitativ informasjon, og har generelt lavere risiko for falske positive resultater4. Vanligste norovirus gjenkjenning og kvantifisering genomet forsterkning teknikken er revers transkriptase kvantitative polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR). Fordi det mål og forsterker en liten del av det menneskelige norovirus genomet, RT-qPCR alene er ikke i stand til å forskjellsbehandle smittsomme og ikke-smittsomme partikler som gratis genomisk RNA, skadet capsids som inneholder genomer, og capsids med dødelig mutert/avkortet genomer kan fortsatt bli forsterket av RT-qPCR. Mens to nye i vitro dyrking teknikker for menneskelig norovirus5,6 er rapportert nylig, begge fortsatt stole på RT-qPCR for virus kvantifisering og ennå ikke er gjennomførbart metoder for rutinemessige klinisk/miljø testing av menneskelig noroviruses. RT-qPCR og dermed fortsatt gullstandarden for klinisk/miljømessige testing.
Andre i vitro -metoder har blitt utviklet i et forsøk på å bedre beregne statusen infectivity norovirus partikler. Disse metodene kan generelt kategoriseres som de som integriteten av norovirus kapsid og de evaluerer genomet integritet. Tidligere tilnærmingen er mer populært. En vanlig metode er RNase forbehandling før ekstraksjon av viral genomisk men dette ikke rede for virus partikler som beholdes, men mangel evnen å binde vert reseptorer/co-faktorer, samt virus partikler som har dødelig mutert eller avkuttet eller ødelagt marginalt genomer7. Kapsid integritet kan også bli vurdert basert på evnen til viruset binde menneskelige norovirus co-receptor/co-faktorer, som er karbohydrater kalles histo-blod gruppe antigener (HBGAs). HBGAs finnes i verten intestinal epitelceller som del av glykoproteiner eller glycolipids (blant flere andre vev) og kan skilles ut i kroppsvæsker som spytt. Enteric bakterier som inneholder HBGA-lignende stoffer på sine overflater har også blitt vist å binde menneskelige norovirus8,9,10, og slike interaksjoner kan fremme norovirus infeksjon5. Grunnleggende konseptet utnytte HBGA binding er at bare virus partikler i stand til å binde den antatte reseptoren/co-factor ville være i stand til å infisere celler. Flere studier tyder på at perle-basert HBGA bindende foregående nukleinsyre forsterkning er en lovende metode for infectivity diskriminering11,12,13,14, 15,16. En stor utfordring om HBGAs er at ingen enkelt HBGA type kan binde alle menneskelige norovirus genotyper. Du løser problemet ved har svin gastrisk mucin, som inneholder HBGAs, vært brukt i stedet for renset HBGA karbohydrater i interesse av enkel syntese, konsekvens og reduserte kostnader.
En fersk publikasjon av Moore et al. 17 introdusert et sett med nye teknikker for å estimere menneskelige norovirus kapsid integritet. I stedet for HBGAs, Moore et al. 17 undersøkt binding av en bredt reaktive nukleinsyre aptamer (M6-2)18 og bredt reaktive monoklonalt antistoff (NS14)19 til varmebehandlet GII.4 Sydney norovirus capsids (virus-lignende partikler eller VLPs) og sammenlignet dette til bindingen til syntetiske HBGAs. Nukleinsyre aptamers er kort (~ 20-80 nt) enkelt strandet nucleic syrer (ssDNA eller RNA) som fold i unike tredimensjonale strukturer som følge av deres sekvens og binde et mål. Fordi de er atomer syren, er de mindre kostnadskrevende; lett kjemisk syntetisert, renset og endret; og stabil varme. Flere rapporter om aptamers generert mot noroviruses finnes, noen av dem viser bred reaktivitet til en rekke stammer18,20,21,22. Som eksempel, Moore et al. 17 vist at aptamer M6-2 bundet til renset, samlet menneskelige norovirus capsids (VLPs) og gjorde tilsvarende til HBGA i avhengigheten av viral kapsid å opprettholde høyere orden (f.eks sekundære og tertiære) proteinstruktur for bindende oppstår. På den annen side, en betydelig andel av norovirus VLP binding til antistoffer NS14 forble etter capsids var helt denaturert. Evaluering av norovirus binding i studiet av Moore et al. 17 ble gjort med en enkel, plate-basert metode lik ELISA, med unntak av at aptamers brukes i stedet for antistoffer (derav metoden ble kalt ELASA). Denne høy gjennomstrømning eksperimentell metode ble brukt til å vurdere effekten av ulike behandlinger på norovirus kapsid, som er nyttig for å forstå mekanismen av viral inaktivering ved eksponering til fysiske eller kjemisk stressfaktorer. En ulempe med denne metoden er imidlertid lavere følsomhet og mangel på toleranse for matrix-assosiert forurensninger på høyere nivåer at uspesifisert binding av aptamers.
Moore et al. 17 brukt en annen metode, dynamisk lys spredning (DLS), overvåke samling av virus partikler svar varmebehandling. DLS brukes ofte til å vurdere størrelsen på hydrogenion suspensjoner og har blitt utvidet til proteiner23,24 og virus25,26,27. Intensiteten av lys spredt av partikler i løsningen svinger som en funksjon av partikkelstørrelse, slik at beregningen av diffusjon koeffisient og partikkel diameter veletablerte oppgaver. DLS teknikken kan skille etter diameteren på spredt partikler til nanoskala, som oppdages spredt virus, personlige kapsid proteiner eller dimers og virus aggregater basert på størrelse27. Virus aggregering, representert av en økning i partikkelstørrelse, er et tegn på tap av kapsid integritet. Kapsid er denaturert og strukturen forstyrret, hydrofobe rester bli eksponert og forårsake partikler å holde sammen og danner aggregat. Distribusjonslister kan brukes til å måle partikkelstørrelse etter en angitt behandling eller the kinetics av samling i sanntid17,28. Denne metoden har fordelen at observasjon av kapsid atferd i løsning, men krever høye konsentrasjoner av renset kapsid, som kanskje ikke er helt representant av viruset i sin naturlige tilstand.
Den siste metoden benyttes av Moore et al. 17 var overføring elektronmikroskop (TEM). Selv om denne metoden mangler følsomhet og produserer ikke kvantitative data, gir det visualisering av effekten av ulike behandlinger på viral kapsid strukturen. Selv om ikke ennå ideell for klinisk/miljø-innstillinger, er bruk av disse metodene sammen verdifull i å forstå menneskelig norovirus inaktivering. Formålet med denne artikkelen er å gi grundig protokoller for plate-basert bindende analysen (ELASA), DLS, og TEM forberedelse metoder brukes til å undersøke effekten av varmen behandlinger på norovirus kapsid i sammenheng med behandlinger effekter på kapsid integritet som presentert i Moore et al. 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plate-basert bindende analysen evaluerer tap av høyere orden Norovirus kapsid struktur
Merk: en ligner ELASA protokoll til det som presenteres her har vært publisert 29, og lignende ELASA analyser har tidligere rapportert som en del av forskning artikler andre steder 17 , 18 , 22.
- Varmebehandling av menneskelig norovirus GII.4 Sydney capsids
- få renset menneskelige norovirus store kapsid protein (VP1) av GII.4 Sydney (tiltredelse: JX459908) samlet i capsids.
Merk: Capsids i studien ble innhentet fra R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX). - Dilute capsids til 50 µg/mL i 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.2) til et maksimalt volum på 15 µL i individuelle avkortet PCR rør. Kontroller at røret inneholder minst 600 ng av kapsid. Kontroller at det er 600 ng av kapsid per behandling-ligand kombinasjon.
- Forvarm termisk cycler til ønsket varmebehandling.
Merk: I forbindelse med denne protokollen, behandling på 68 ° C for ulike tider (0 - 25 min) ble valgt. - Forvarm et ekstra termisk cycler 4 ° c for umiddelbar kjøling. Legge rør med kapsid løsning til den termiske cycler for tiden. Øyeblikkelig overføre til pre-avkjølt 4 ° C cycler i 5 min etter oppvarming.
- Inkluder 95 ° C i 5 min behandling som en denaturert kapsid. Inkluder ubehandlede (23 ° C) kapsid løsning som en positiv. Inkluderer PBS med ingen kapsid som en mer negativ kontroll.
- Kort spinne ned i en sentrifuge å få alle dråper til bunnen av røret og fortynne de behandlet kapsid løsningene i PBS 3 µg/mL. Kontroller at det er minst 200 µL av utvannet, behandlet kapsid (100 µL/vel).
- få renset menneskelige norovirus store kapsid protein (VP1) av GII.4 Sydney (tiltredelse: JX459908) samlet i capsids.
- Bruke 100 µL av kapsid løsning i hver brønn, det er minst to brønner per behandling. I tillegg Inkluder 2 kontroll brønner med 100 µL PBS for hver ligand; Dette gir bakgrunnen absorbansen til analysen. Dekkramme med lokk, forsegle kantene med parafin film for å redusere fordampning, og la overnatting på en risting inkubator på 4 ° C eller for 2 timer ved romtemperatur.
- Forberede blokkerer bufferen ved å gjøre 5% skummet melk tørrstoff (w/v) i PBS 0,05% mellom 20 (PBST).
- Fjerne behandlet kapsid løsningene fra platen. Legge til 200 µL/vel blokkerer bufferen. Inkuber for 2 timer ved romtemperatur eller over natten, forseglet på 4 ° C.
- Forberede ligand binding løsninger for biotinylated aptamer M6-2 18 , 29 og biotinylated syntetiske HBGA blod type A eller biotinylated type H.
- Dilute biotinylated aptamer til 1 µM i nuclease-fritt vann. Kontroller at det er nok løsning for 200 µL totalt for hver behandling. Fortynne den valgte biotinylated HBGA til 30 µg/mL i blokkering bufferen. Kontroller at det er nok løsning for 200 µL totalvolumet for hver behandling.
Merk: For å bruke mindre HBGA, 10 µg/mL av HBGA i 0.25% skummet melk-PBST kan erstattes. Konsentrasjoner både biotinylated M6-2 og HBGA har vært tidligere optimalisert og rapportert.
- Dilute biotinylated aptamer til 1 µM i nuclease-fritt vann. Kontroller at det er nok løsning for 200 µL totalt for hver behandling. Fortynne den valgte biotinylated HBGA til 30 µg/mL i blokkering bufferen. Kontroller at det er nok løsning for 200 µL totalvolumet for hver behandling.
- Fjerne blokkering buffer og vask platene 3 ganger med 200 µL/godt PBST. Klapp plate oppned sterilt papirhåndklær for å tørke den gjenværende fuktigheten.
- Legge til 100 µL/godt av ligand binding løsninger, at det er 2 brønner per varmebehandling-ligand kombinasjon. Inkuber platen dekket med lokk på en orbital shaker på ca 60 rpm 1t ved romtemperatur.
Merk: Husk å ta 2 brønner hver av ubehandlet capsids og helt denaturert capsids for hver ligand som positive og negative kontroller, henholdsvis. I tillegg inkluderer 2 " ingen kapsid " brønner for hver ligand som platen bakgrunn kontroll. - Fjerne ligand løsninger og vask brønnene 3 ganger med 200 µL/godt PBST. Klappe platen opp ned på sterilt papirhåndklær for å tørke gjenværende fuktighet.
- Legge til 100 µL/godt i løsning av 0,2 µg/mL streptavidin pepperrotperoksidase i PBS. Inkuber i 15 min ved romtemperatur med mild rister på en orbital shaker.
Merk: Forskjellige streptavidin-pepperrot peroxidase conjugates vil ha ulike konsentrasjoner. Kontakt brukeren ' s håndbok for den ideelle rekke konsentrasjoner for ELISA programmer av enzym og sikre at den optimale. - Fjerne konjugat løsningen. Vask 3 ganger med 200 µL/godt PBST. Klappe platen opp ned på sterilt papirhåndklær for å tørke gjenværende fuktighet.
- Legge til 100 µL/vel 3,3 ', 5,5 '-tetramethylbenzidine (TMB) underlaget, og tillate fargen utvikle for 5-15 min. observere negativ kontroll for farge og husk å konsekvent utvikle for samtidig mellom Repliker plater. Være klar over absorbansen rekke plate leseren brukes, samt.
Merk: Utvikle tider kan variere basert på kvaliteten på ligander/reagensene brukes. - Stopper utviklingen av reaksjon med 100 µL/vel 1M fosforsyre. Umiddelbart lese platen ved 450 nm. Lagre dataene.
Merk: Innføring av syre generelt bremser reaksjonen drastisk men stoppe ikke det helt. Ikke la stoppet platen i en lengre tid før du leser absorbansen.
2. Analyse av Plate-baserte analyseresultatene
- Lagre rå absorbansen dataene i et regnearkprogram. Produsere de gjennomsnittlige absorbances for hvert godt par med spesifikke behandling og ligand. Bruk disse gjennomsnitt for alle etterfølgende analyser.
Merk: Sammenligne begge godt absorbances for å forsikre at ingen par brønner har betydelig ulike verdier. - å analysere absolutt kapsid integriteten (alle bindende), trekke rå absorbansen av den " ingen kapsid " kontroll fra hver andre absorbansen eksempelverdi.
Merk: Eventuelt tap av binding på grunn av tap av høyere orden (sekundær, tertiær, kvartær) strukturen kan direkte analyseres. I stedet for å trekke absorbansen i kontrollen negative (ingen kapsid), trekker du verdien i kontrollen helt denaturert kapsid. Dette fjerner alle bindende signal på grunn av uspesifikke binding til apparatet samt binding på grunn av kapsid sekvensen. HBGA og aptamer M6-2 viser liten binding til helt denaturert kapsid, så enten metoden produserer lignende resultater. Falske positive signal tilskrevet uspesifikke aptamer bindende må vurderes når du velger hvilke analyse bruke. - Med de negative eller denaturert kontroll-justert absorbances, dele behandling absorbances av deres respektive positive (ingen behandling) kontrollere absorbances og multiplisere med 100. Dette gir prosentandelen av signalet av behandlet kapsid i forhold til kontrollen ubehandlet.
- Til å beregne graden av bindende signalet for hver ligand tilskrives kapsid sekvensen, trekke den " ingen kapsid " negativ kontroll fra de første absorbances, og ta justert absorbansen av denaturert kapsid. Dele dette justert absorbansen av positiv kontroll, og multiplisere det med 100. Dette gir tydelig andelen tapsfrie ligand binding til denaturert kapsid/kapsid sekvens.
3. DLS for å oppdage Virus aggregering etter varmebehandling
Merk: Trinnene nedenfor kan være spesifikke for programvaren og instrumentet brukes, men kan tilpasses og brukes på liknende.
- Opprette en ny størrelse SOP i DLS instrument programvare bruker: materiale = Protein, Dispersant = PBS, temperatur = 25 ° C, balanse tid = 0 sec, celle type = disponibel cuvette (små volum, ZEN0040), måling vinkel = 173° Backscatter, Måling varighet = automatisk, antall mål = 3, forsinkelse mellom målinger = 0 sec, databehandling: analyse modell = generelt (normal oppløsning). Bruker standardinnstillingene for alle andre parametere.
- Velg den grønne kjøre pilen i programvaren, og navnet prøven.
- Fremgangsmåten 1.1.1 gjennom 1.1.4 for varmebehandling av VLPs.
- Dilute varme behandlet VLPs 1:10 på 1 x PBS for en siste konsentrasjon av 5 µg/mL. (Valgfritt) Filtrere prøven med en 1 µm porestørrelse for å fjerne støvpartikler; Distribusjonslister er svært følsomme for støv, som store partikler spre mye mer lys enn små partikler.
- Overføre 50 µL av utvannet VLPs til et lite volum disponibel cuvette. Cuvette inn prøven Mysteriekammeret instrumentet.
- Start Kjør, og bruk det ' Correlogram ', ' Cumulants Fit ', og ' ekspert råd ' å vurdere datakvaliteten.
- Under kjøringen, sjekk at polydispersity indeks-verdien er mindre enn 0,3, representerer en kvalitet måling. for i det ‘ flere ’ gjør at korrelasjonskoeffisienten er konstant og nær, men ikke mer enn 1, på kort tid, og dråper av kraftig til 0 senere, karakteristisk for partikkelstørrelse. Bruk det ‘ ekspert råd ’ kategorien for tilbakemelding om datakvaliteten under målene.
- Etter måling er fullført, sjekk igjen at polydispersity indeks-verdien er mindre enn 0,3. Kontroller at cumulants passer linje følger datapunktene tett i den ‘ Cumulants passer ’ kategorien
- Ta gjennomsnittet av Z-gjennomsnittlig partikkel diameter rapportert for hver måling partikkel størrelse av hver prøve. Plot diameter i nm vs temperaturen i ° C.
4. DLS for oppdage Virus-samling i sanntid
Merk: trinnene kan være spesifikke for programvaren og instrumentet brukes, men kan tilpasses og brukes på liknende.
- Opprette en ny størrelse SOP i DLS instrument programvare bruker: materiale = Protein, Dispersant = PBS, temperatur = som ønsket, balanse = 0 sec, celle type = kvarts cuvette, måling vinkel = 173° Backscatter, måling varighet = automatisk, Antall mål = 50 (kan være økt eller redusert avhengig samling rate), forsinkelse mellom målinger = 0 sec, databehandling: analyse modell = flere smale moduser (høy oppløsning). Bruker standardinnstillingene for alle andre parametere.
- Velge løpe pilen i programvaren til å åpne og navngi en ny prøve, og for at maskinen skal nå temperatur likevekt.
- Avbryte VLPs 1 X PBS i et microcentrifuge rør i en konsentrasjon av 5 µg/mL og et volum mellom 200-500 µL. Vortex suspensjon.
- Nedspinning VLP suspensjon for 5-10 s i en tabletop sentrifuge til de gass. Dette bidrar til å hindre boble formasjon under varmebehandling som forstyrrer størrelse mål.
- Overføring av VLP suspensjon å en små quartz cuvette-unngå bobler og Pipetter sakte mot veggen av cuvette. Når maskinen har nådd temperatur likevekt, inn i cuvette i prøven kammeret.
- Vente 10 s for eksempel temperaturen til equilibrate, deretter starter kjøringen. Start en tidtaker på begynnelsen av kjøringen. Opphøre stopuret på slutten av det første målet. Ta denne gangen som første gang punktet. Få gang poeng fra måling tiden registrert av programvaren.
- Start Kjør, og overvåke correlogram, distribuere passer og ekspertråd evaluere datakvaliteten.
Merk: PDI vil ikke nødvendigvis være mindre enn 0,3 for disse målingene som prøven forventes å bli polydisperse under aggregasjon.- Kontroller korrelasjonskoeffisienten er konstant og nær, men ikke mer enn 1 på kort tid, og faller kraftig til én eller flere senere tider, karakteristisk for partikkelstørrelse.
- Sørge for at distribusjonen passer linje følger datapunktene tett.
- Analysere størrelse dataene.
- Finne ut hver gang poeng fra forskjellen i tid mellom hver måling og første tidspunktet. Måler varigheter er ikke alle akkurat det samme.
- Bruker en intensitet distribusjon, registrere størrelsen på toppene med de største områdene for hver måling/tidspunkt.
- Plot peak diameter i nm vs tid i minutter
5. TEM eksempel forberedelse
- motta karbon støtte filmen (nikkel) rutenett designet for TEM.
Merk: Se kjernen funksjonen anbefalte reagenser og deres håndtering for bruk med anlegget mikroskopet. Husk å lagre rutenett i en boks som inneholder fuktighet eller et vakuum kammer å minimere eksponering til fukt. - Rive ca 5 cm x 5 cm biter av filter papir. Få glass Petri retter og riktig selvbildet lukking reversere pinsett utformet for bruk i mikroskopi.
- Kuttet omtrent 2,5 cm x 5 cm stykke parafin film. Plass på Borstemmaskin.
- Varmebehandling av norovirus GII.4 Sydney capsids
- til framgangsmåten varmebehandling akkurat som beskrevet over i trinn 1.1.1 - 1.1.5 unntatt: bruke 10 mM HEPES (pH 7.4) til behandling i stedet for PBS og ikke lenger utvanne capsids etter behandling (holde løsning på 50 µg/mL). Pipetter hele ~ 15 µL dråpe behandlet kapsid løsning på parafin filmen.
- Fange rutenettet kanten med pinsett, slik at de kan lukke på kanten å holde rutenettet og plassere rutenettet karbon-side-ned på slipp av behandlet løsning. La ruge i 10 min å tillate kapsid knytte til rutenettet.
- Avhengig av renhet av kapsid utarbeidelse, legge vasker av 10 mM HEPES løsningen ved behov i form av 10-15 µL dråper plassert i linje etter behandlet kapsid slippverktøyet.
- Etter 10 minutter, plukke opp rutenettet med slippverktøyet. Sted rutenettet nesten vinkelrett filter papir å veken bort slippverktøyet. Hente slippverktøyet 10-15 µL HEPES bufferen med rutenett, holder for 30 s, vil veken bort med et stykke filter papir til Wash
- Plasserer en 15 µL dråpe 2% uranyl acetate løsning på parafin filmen i et tomt område.
- Plukke opp slippverktøyet uranyl acetatark med rutenett og hold i 45 s. veken bort uranyl acetate, husk å fjerne det meste av løsningen. Plasser rutenettet karbon-side opp på filter papir, pass på at rutenettet ikke " stick " til fuktighet på pinsett. Plasser filteret papiret rutenettet på den i et åpent glass Petriskål.
Merk: Ikke bruk plast Petri retter, som rutenettet vil være elektrostatisk tiltrukket av dem og bli stakk til parabolen.
- Plukke opp slippverktøyet uranyl acetatark med rutenett og hold i 45 s. veken bort uranyl acetate, husk å fjerne det meste av løsningen. Plasser rutenettet karbon-side opp på filter papir, pass på at rutenettet ikke " stick " til fuktighet på pinsett. Plasser filteret papiret rutenettet på den i et åpent glass Petriskål.
- Gjenta for alle behandlinger. Plasser Petriskål halvdelene med rutenettene i en desiccator over natten tørke før observere med TEM.
- Se mikroskopi anlegget på respektive institusjonen angående observerer forberedt på nett. Noen fasiliteter tillater brukeren å bli trent på drift av deres anlegg ' s instrument. Spesifikke opplysninger om installasjon og observasjon av en bestemt mikroskopet er beyond denne artikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den strukturelle integriteten til menneskelig norovirus GII.4 Sydney capsids (VLPs) ble vurdert ved hjelp av flere nye metoder som presenteres av Moore et al. 17. første eksperiment ble gjort som integriteten til capsids som en funksjon av deres evne til å binde en antatte reseptor/co-factor (HBGA) eller ssDNA aptamer (M6-2) var forhold (figur 1). Resultatene vises har tidligere blitt presentert av Moore et al. 17, og viser at aptamer M6-2-kapsid bindende virkemåten var lik som virus-HBGA bindingen ved eksponering til 68 ° C varmebehandling for ulike eksponeringstider. Mens HBGA binding signalet var litt tidligere enn at aptamer M6-2, M6-2 vises takt av signaltap beregnes etter VLPs ble utsatt til 65 ° C og 68 ° C for ulike gang poeng (tabell 1)17. Dette tyder på at både HBGA og aptamer M6-2 binding ble avskaffet i en lignende måte.
DLS målinger vist at samling på grunn av protein rødsprit sannsynlig korresponderte med tap av ligand binding signal (figur 2), som etter diameter større enn 100 nm ble observert etter ca 18 min behandling på 68 ° C. Slik var forholdene på som fullstendig tap av HBGA bindende og nesten alle tap av bindende signalet for aptamer M6-2 (> 80%) oppstod (figur 1)17. TEM resultater støttet disse observasjonene som morfologiske endringer og klumper av capsids ble stadig mer tydelig som temperaturen økt trinnvis mellom 60 ° C og 80 ° C i 1 min (figur 3a). Et lignende fenomen ble observert etter oppvarming capsids på 68 ° C i opptil 25 min, men oppløsningen av TEM var mindre uttalt (figur 3b)17.
Figur 1: konformasjon-avhengige bindende av to forskjellige ligander til norovirus GII.4 Sydney capsids utsatt for varmebehandling. Renset GII.4 Sydney capsids (VLPs) ble utsatt for varmebehandling på 68 ° C for forskjellige mengder tid og bindingen til blodet type A HBGA og aptamer M6-2 ble vurdert en plate-baserte ELASA bindende analysen. Y-aksen viser absorbansen signalet observert i behandling (eksponeringstid) som en prosentandel av en ubehandlet kapsid kontroll. Dette tallet har blitt tidligere presentert og dette tallet har blitt endret fra Moore et al. 17 feilfelt representerer ± 1 standardavvik % signal. Data er for minst tre Repliker plater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel DLS dataene for varmebehandlet norovirus GII.4 Sydney capsids viser ideell og tvetydig/lav kvalitet. Capsids (VLPs) ble utsatt for varmebehandling 65 ° C og 68 ° C, og deres størrelse var overvåking i sanntid. Panelet (en) tilsvarer en høy kvalitet, klart korrelasjonskoeffisienten måling; og (b) med lav kvalitet, tvetydig korrelasjonskoeffisienten måling. (C)-panelet viser partikkel størrelse data, viser en klar aggregering profil for capsids behandlet på 68 ° c. og (d) viser tvetydig partikkel størrelse data for varmebehandlet capsids. Noen av disse dataene presenteres, og dermed dette bildet endres fra Moore et al. 17 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: TEM av norovirus GII.4 Sydney capsids utsatt for ulike varme behandlinger. Renset capsids (VLPs) ble utsatt for ulike varme behandlinger og observert bruker overføring elektronmikroskop. Panelet (en) viser data for capsids oppvarmet ved forskjellige temperaturer (60, 65, 70, 75 og 80 ° C) for 1 min. panelet (b) viser capsids utsatt for 68 ° C behandling for 0 - 25 min. skala (bar) på høyre bilder representerer 100 nm. Disse bildene er presentert i Moore et al. 17 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksponentiell forfallet Rate (% signal/min) | |||
| Temperatur | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligand | |||
| HBGA Type A | 2,50 ± 0.24 | 13.30 ± 1.15 | |
| Aptamer M6-2 | 2.47 ± 0,66 | 13.18 ± 0.47 | |
Tabell 1: eksponensiell decay priser for norovirus GII.4 Sydney capsids behandlet på 65 ° C og 68 ° C. Capsids ble utsatt for varme behandlinger for ulike tider på 65 ° C og 68 ° C, avkjølt på 4 ° C, og deres evne til å binde syntetisk HBGA eller aptamer evalueres. Frekvensen av signaltap over tid (forfallet rate) ble deretter beregnet med hver ligand for hver temperatur. Disse dataene har tidligere blitt presentert i Moore et al. 17 data presenteres som % signal/min ± 1 standardavvik % signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen og teknikkene her sørge for å vurdere menneskelige norovirus kapsid integritet/funksjonalitet. Disse metodene kan brukes for å få mekanistisk innsikt i effekten av inaktivering behandlinger mot viruset, og kan potensielt supplere mer tradisjonelle inaktivering evalueringsmetoder som RT-qPCR eller plakk analysen. For eksempel gir evalueringen av kjemiske eller fysisk inaktivering av plakk analysen alene et mål på grad av virus inaktivering men ikke den underliggende mekanismen av at inaktivering. Virus aggregering kan også føre undervurdering av titer og derfor overvurdere behandling effekt30. Disse metodene kan videre informere slik studie ved å gi informasjon om virkningene av en behandling på integriteten av norovirus kapsid. Nylig har to i vitro (cellekultur) dyrkingsmetoder for menneskelig norovirus vært rapportert5,6; disse fremdeles avhengig PCR for virus opplisting, men teoretisk enteroid modellen presentert kan utnyttes til TCID50 ved hjelp av antistoff flekker for relative reduksjonen vilje. Metodene presenteres her kan ha verktøy for å forstå hele mekanismen av viral inaktivering for flere ulike typer behandlinger utover bare varmebehandling. For eksempel ble plate-baserte ligand binding og TEM brukt som verktøy til å supplere RT-qPCR og plakk analysen data ved mekanismen av norovirus inaktivering på kobber overflater31,32, ved eksponering til sølv dihydrogen citrate33, og høy hydrostatisk trykk behandling14.
Det er mange skritt i disse protokollene som metodologiske detaljfokus er avgjørende. Spesielt for plate analysen, må stor oppmerksomhet betales til bufferen å fortynne ligand for bindingen. Aptamer M6-2, og ssDNA aptamers generelt er følsomme for salt konsentrasjoner og buffer forhold. Bruke en ikke-optimal buffer med aptamer kan ablate bindende. Selv om aptamer M6-2 har vært brukt i fortynnet menneskelig avføring, kan for mye krakk/matrise forstyrrelser påvirke bindingen, som samsvarer med observasjoner for andre menneskelige norovirus aptamers18,22. En viktig faktor årsaken er at aptamers kan ha en grad av uspesifikke binding til positivt ladede molekyler. Dermed kan dette føre til en viss grad av falske positive signal i analysen beskrevet her. Dette kan regnskapsføres ved å velge en negativ kontroll som er en kompleks matrise uten virus eller en urelaterte protein. Likeledes HBGA konsentrasjon og mengden skummet melk faste stoffer brukes i bindingen bufferen kan påvirke positivt og bakgrunn signaler. Merk at forskjellige HBGAs har varierende grad av affinitet til ulike stammer av menneskelig norovirus, slik at bindingen bufferne må optimaliseres avhengig av HBGA type14,31,33. Lignende hensyn bør gis til bufferen for streptavidin-pepperrot peroxidase konjugert, som konsentrasjoner fra forskjellige produsenter kan variere; Imidlertid ville mye mindre variasjon forventes gitt høy affinitet av streptavidin-biotin samhandling34. På grunn av høye graden av tilpasning av denne platen-basert metode er feilsøking suboptimal resultater relativt enkelt. For eksempel ved høye signal, optimalisering av økende skummet melk konsentrasjonen og synkende ligand konsentrasjon kan undersøkes, og omvendt for plater med lav positive signaler. TEM, er en av de viktigste hensyn ved bruk av ikke-statisk materialer (som glass) når lagring/håndtering rutenett, som de er svært vanskelig å håndtere rundt materialer som disponibel Petri retter. Hvis slike materialer, nett vil tendere til å "hoppe" og holde seg til materialet. I tillegg bør mye omsorg tas slik at det er ingen gjenværende fuktighet på rutenettet. Ideelt sett bør et vakuum desiccator brukes hvis tilgjengelig.
Når du utfører eksperimenter ved hjelp av DLS, er renheten av prøven en svært viktig faktor. Funksjonene brukes til å koordinere endringer i lysspredning intensitet diameter avhengige har monomodal eller begrense flere partikkel distribusjoner. Urenheter ned nanoskala, inkludert proteiner, introdusere polydispersity og endre størrelse beregninger. Også er intensiteten av lys spredt proporsjonal med diameter opphøyd i en potens av 6, så store partikler som støv betydelig forstyrre målinger. Boble formasjon under sanntid varmen behandlinger resulterer i nonsens resultater på grunn av lys spredt av varierende bobler. Kapsid (VLP) konsentrasjon må også vurderes ved DLS. Eksempel konsentrasjoner må være høy nok til å produsere nok signal og lav nok til å unngå flere spredning. Det er også av avgjørende betydning å input riktig materialet og dispergerings egenskaper, som disse verdiene brukes av programvaren for størrelse beregninger. Spesielt dispergerings viskositet er en funksjon av temperatur og må bli justert tilsvarende under varme behandlinger (programvaren som brukes har temperaturen-avhengige viskositet vann bygget i).
Selv om metodene beskrevet her tilbyr flere muligheter for bedre måter å vurdere kapsid integritet, de er ikke perfekt. Fordi disse metodene krever svært høye konsentrasjoner av virus, må de brukes med renset, samlet capsids i stedet for native smittsom virus. VLPs her består av store kapsid protein av menneskelig norovirus (VP1), som samler inn norovirus kapsid uten viral nukleinsyre. Selv om disse VLPs viser antigenically lignende virkemåter smittsomme virus capsids, kan de være mer utsatt for inaktivering. Videre VLPs er vanskelige å produsere og rense og er ikke tilgjengelig for mange etterforskere. Bruk av renset menneskelige norovirus (f.eksved hjelp ultracentrifugation) er mulig men tilgjengeligheten av norovirus-positive menneskelig avføring er begrenset og selv med rensing, virus titers kanskje ikke høy nok til å romme metodene beskrevet her. Videre arbeidet for å optimalisere analyser for bruk av semi renset smittsomme virus i avføring pågår. Faktisk dette allerede er vist for plate analysen18,22, men ville uten tvil være mer komplisert for Distribusjonslister. Det bør også bemerkes at disse metodene ble bare brukt for å evaluere kapsid integritet etter en fysisk (varme) inaktivering tilnærming, som er kjent for å direkte påvirke kapsid. Resultatene kan være mer tvetydig var disse teknikkene brukes til å evaluere kapsid integritet med andre inaktivering tilnærminger, slik som kjemiske midler eller metoder som er mest rettet mot ødeleggelse av viral genomet. Imidlertid har enkelte rapporter gunstig vist ytelsen til HBGA binding for evaluering av kjemiske inaktivering31,33,35,36,37. På det nåværende tidspunktet, er protokollene rapporterte her best brukt sammen med tradisjonelle teknikken (e) som RT-qPCR og plAque analyser med surrogat virus.
Disse protokollene gir et enkelt alternativ betyr å forstå effekten av en fysisk virus inaktivering metode (varme) på menneskelig norovirus. Disse metodene kan trolig utvides for bruk med andre ikke-innhyllet virus (f.eks, hepatitt A og E virus) som generelle prinsippet om oppdage tap av høyere orden proteinstruktur er den samme. I tillegg bør opptreden og potensialet bruk av andre ligander for å angi tap av kapsid integritet vurderes. Tilpasser protokollene for mer komplekse utvalg matriser, og forbedrer deres analytisk følsomhet (deteksjon grenser) er også en logisk fremtidige retning. Total, metodene som er beskrevet her gir en mer tilgjengelig måte å bestemme menneskets norovirus kapsid integritet og få mekanistisk innsikt i effekten av inaktivering behandlinger mot dette viktige patogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av landbruk og mat forskning initiativ konkurransedyktige tilskudd nr 2011-68003-30395 fra USA Department of Agriculture, National Institute of Food og landbruk gjennom NoroCORE prosjektet. Finansiering for åpen tilgang kostnad ble gitt av United States Department of Agriculture. Vi vil gjerne takke Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) for vennlig å gi oss den renset capsids og Valerie Lapham for henne hjelp med TEM bilder. Vi vil også gjerne takke Frank N. Barry for å hjelpe oss starte eksperimenter presentert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
