Summary
Rutinmässiga detektionsmetoder utnyttja virusgenom förstärkning är begränsade av sin oförmåga att diskriminera smittsamma från icke-infektiös partiklar. Syftet med denna artikel är att ge detaljerade protokoll för alternativa metoder till stöd i diskriminering av infektiös norovirus partiklar hjälp aptamer bindande, dynamisk ljusspridning och transmissionselektronmikroskopi.
Abstract
Humana norovirus utkräver betydande folkhälsa och ekonomiska förluster i hela världen. Nya in vitro- ännu odling framsteg inte tillämpliga för rutinmässig påvisande av viruset. De nuvarande detektering och kvantifiering teknikerna, som primärt beroende nukleinsyra förstärkning, diskriminerar inte smittsam från icke-infektiösa viruspartiklar. Syftet med denna artikel är att lägga fram specifika detaljer om senaste framstegen inom tekniker som används tillsammans för att erhålla ytterligare information om smittsamhet status av viruspartiklar. En teknik innebär bedömning av bindningen av en norovirus ssDNA aptamer till förhoppningsvis. Aptamers har fördelen av att vara lätt syntetiseras och ändras och är billiga och stabila. En annan teknik, dynamisk ljus spridning (DLS), har fördelen av att observera kapsid beteende i lösning. Elektronmikroskopi möjliggör visualisering av den strukturella integriteten av de virala förhoppningsvis. Även om lovande, finns det några nackdelar att varje teknik, såsom icke-specifik aptamer bindning till positivt laddade molekyler från provmatriser, kravet på renat kapsid för DLS och dålig känslighet för elektronmikroskopi. Ändå, när dessa tekniker används i kombination, ger kroppen produceras mer omfattande information om norovirus kapsid integritet som kan användas för att härleda smittsamhet, information som är nödvändig för korrekt utvärdering av metoder för inaktivering eller tolkning av virus upptäckten. Den här artikeln innehåller protokoll för att använda dessa metoder för att diskriminera infektiösa humana norovirus partiklar.
Introduction
Humana norovirus ansvarar för en betydande folkhälsa börda globalt, orsakar ca 685 miljoner sjukdomar och 212 000 dödsfall årligen1, till en kostnad i miljarder dollar2,3. Idag, innebär norovirus detektering och kvantifiering genomet förstärkning och/eller ligand-baserade plattformar. Den förstnämnda är generellt att föredra eftersom den är mer känslig, ger kvantitativ information och har generellt lägre risk för falskt positiva resultat4. Den vanligaste norovirus detektering och kvantifiering genomet amplifiering är omvänt transkriptas kvantitativa polymeraskedjereaktion (RT-qPCR). Eftersom den riktar och förstärker ett litet segment av det humana norovirus genomet, RT-qPCR ensam kan inte diskriminera mellan smittsamma och icke-infektiös partiklar, som gratis genomisk RNA, skadade förhoppningsvis som innehåller arvsmassan, och förhoppningsvis med dödligt muterat/trunkerade genomen kan fortfarande förstärkas av RT-qPCR. Medan två nya in vitro- odlingstekniker för humana norovirus5,6 har rapporterats nyligen, båda fortfarande lita på RT-qPCR för virus kvantifiering och ännu inte är genomförbara metoder för rutinmässig klinisk och miljömässiga testning för humana Norovirus. RT-qPCR förblir således guldmyntfoten för kliniska och miljömässiga testning.
Andra in vitro- metoder har utvecklats i ett försök att bättre uppskatta smittsamhet status av norovirus partiklar. Dessa metoder kan vara generellt kategoriseras som de som adress norovirus kapsid integritet och de utvärdera genomet integritet. Det före detta tillvägagångssättet är mer populära. En vanligt förekommande metod är RNase förbehandling före extraktion av viral genomisk RNA, men detta inte tar hänsyn till viruspartiklar som förblir intakta men saknar förmågan att binda värd receptorer/co-faktorer, liksom viruspartiklar som hade dödligt muterade eller har trunkerats eller marginellt skadad genomen7. Kapsid integritet kan också utvärderas baserat på viruset förmåga att binda till mänskliga norovirus co-beta-receptor/co-faktorer, som är kolhydrater kallas histo-blod grupp antigener (HBGAs). HBGAs finns i värd tarmepitelceller som del av glykoproteiner eller glykolipider (bland flera andra vävnader) och kan utsöndras i kroppsvätskor som saliv. Enteriska bakterier som innehåller HBGA-liknande ämnen på sin yta har också visat att binda humana norovirus8,9,10, och sådana interaktioner kan främja norovirus infektion5. Det grundläggande konceptet med att utnyttja HBGA bindning är att endast viruspartiklar kan bindande den förmodade receptorn/co-factor skulle kunna infektera celler. Flera studier tyder på att pärla-baserade HBGA bindande föregår nukleinsyra förstärkning är en lovande metod för smittsamhet diskriminering11,12,13,14, 15,16. En stor utmaning när det gäller HBGAs är att ingen enda HBGA typ kan binda alla humana norovirus genotyper. För att åtgärda detta, har svin gastric mucin, som innehåller HBGAs, använts i stället för renat HBGA kolhydrater intresse användarvänlighet syntes, konsekvens och minskade kostnader.
En ny publikation av Moore et al. 17 införde en rad nya tekniker för att uppskatta mänsklig norovirus kapsid integritet. I stället för HBGAs, Moore et al. 17 undersökt bindningen av en i stort sett reaktiva nukleinsyra aptamer (M6-2)18 och i stort sett reaktiva monoklonal antikropp (NS14)19 att värmebehandlad GII.4 Sydney norovirus förhoppningsvis (virusliknande partiklar eller framställda) och jämfört detta bindningen till syntetiska HBGAs. Nukleinsyra aptamers är kort (~ 20-80 nt) enda stranded nukleinsyror (ssDNA eller RNA) som vika in unika tredimensionella strukturer till följd av deras ordningsföljd och bind ett mål. Eftersom de är nukleinsyror, är de mindre kostsamt; enkelt kemiskt syntetiserade, renat och modifierad; och stabil till värme. Flera rapporter om aptamers genereras mot Norovirus finns, med några av dem visar bred reaktivitet till en mängd olika stammar18,20,21,22. Som exempel kan nämnas Moore et al. 17 visat att aptamer M6-2 bunden till renat, monterade humana norovirus förhoppningsvis (framställda) och betedde sig på liknande sätt att HBGA i beroendet av viral kapsid att bibehålla högre ordning (t.ex. sekundär och tertiär) proteinstruktur för bindning till uppstå. Däremot, en betydande del av norovirus VLP bindning till antikroppar NS14 återstod efter förhoppningsvis var fullständigt denaturerad. Utvärdering av norovirus bindande i studien av Moore et al. 17 var gjort med en enkel, plattan-baserad metod som liknar ELISA, med det undantaget att aptamers används i stället för antikroppar (därav metoden anropades ELASA). Denna hög genomströmning experimentell metod användes för att utvärdera effekterna av olika behandlingar på norovirus kapsid, arbete som är värdefull för att förstå mekanismen av virala agens vid exponering för fysikaliska eller kemiska stressfaktorer. En nackdel med denna metod är dock lägre känslighet och brist på tolerans för matrix-associerade föroreningar på högre nivåer som orsakar icke-specifik bindning av aptamers.
Moore et al. 17 används en annan metod, dynamiskt ljus spridning (DLS), för att övervaka aggregering av viruspartiklar som svar på värmebehandling. DLS används ofta för att bedöma storleken på nanopartiklar suspensioner och har utvidgats till proteiner23,24 och virus25,26,27. Intensiteten hos ljuset som sprids av partiklar i lösningen varierar som en funktion av partikelstorlek, möjliggör beräkning av diffusion koefficient och sedan partikeldiameter med väletablerade formler. DLS tekniken kan skilja spridda partiklar ner till nanoskala, som gör upptäckten av spridda virus, enskilda kapsid proteiner eller dimerer och virus aggregat baserat på storlek27hydrodynamiska diameter. Virus aggregering, företrädd av en ökning av partikelstorlek, är vägledande för förlust av kapsid integritet. Som kapsid är denaturerad och dess struktur störs, hydrofoba rester blir utsatta och orsaka partiklarna att hålla ihop och bilda aggregat. DLS kan användas för att mäta partikelstorlek efter en viss behandling eller kineticsen av aggregation i realtid17,28. Denna metod har fördelen av att observation av kapsid beteende i lösning men kräver höga koncentrationer av renat kapsid, vilket kanske inte är helt representativt av viruset i sitt naturliga tillstånd.
Den sista metoden utnyttjas av Moore et al. 17 var transmissionselektronmikroskopi (TEM). Även om denna metod saknar känslighet och producerar inte kvantitativa data, möjliggör det visualisering av effekterna av olika behandlingar på viral kapsid struktur. Även om inte ännu perfekt för kliniska och miljömässiga inställningar, är användning av dessa metoder i kombination värdefulla för att förstå mänskliga norovirus inaktivering. Syftet med denna artikel är att ge fördjupad protokoll för plattan-baserade bindande analysen (ELASA), DLS, och TEM förberedelse metoder används för att undersöka effekterna av värmebehandlingar på norovirus kapsid i samband med behandlingarna effekter på kapsid integritet som presenteras i Moore et al. 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plattan-baserade bindande test för utvärdering av förlust av högre ordning Norovirus kapsid struktur
Obs: en mycket liknande ELASA protokollet till den som presenteras här har varit publicerad 29, och liknande ELASA analyser har tidigare rapporterats som del av forskning artiklar någon annanstans 17 , 18 , 22.
- Värmebehandling av humana norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis
- få renat humana norovirus stora kapsid protein (VP1) av GII.4 Sydney (anslutning: JX459908) monteras i förhoppningsvis.
Obs: Förhoppningsvis i studien erhölls artighet av R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX). - Dilute förhoppningsvis till 50 µg/mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,2) till en maximal volym på 15 µL i enskilda utjämnade PCR-rören. Se till att röret innehåller minst 600 ng av kapsid. Säkerställa att det finns 600 ng av kapsid per behandling-ligand kombination.
- Värm termocykel önskad värmebehandling.
Obs: vid tillämpningen av detta protokoll, behandling vid 68 ° C för olika tider (0 - 25 min) valdes. - Värm en ytterligare termocykel till 4 ° C för omedelbar kylning. Lägga till rör med kapsid lösning till termocykel för önskad tid. Omedelbart överföra till nedkylda 4 ° C apparat för 5 min efter upphettning.
- Inkludera 95 ° C i 5 min behandling som denaturerat kapsid kontroll. Inkludera obehandlad (23 ° C) kapsid lösning som positiv kontroll. Inkluderar PBS med ingen kapsid som en ytterligare negativ kontroll.
- Kort snurra ner i en centrifug att få alla droppar till botten av röret och späd ut behandlade kapsid lösningarna i PBS 3 µg/ml. Säkerställa att det finns minst 200 µL utspädda, behandlade kapsid (100 µL per brunn).
- få renat humana norovirus stora kapsid protein (VP1) av GII.4 Sydney (anslutning: JX459908) monteras i förhoppningsvis.
- Tillämpa 100 µL av kapsid lösning i varje brunn, se till att det finns minst två brunnar per behandling. Dessutom inkludera 2 kontrollbrunnarna med 100 µL PBS för varje ligand; Detta ger bakgrundsabsorbansen i analysen. Täck tallriken med lock, försegla kanterna med paraffin filma för att minska avdunstning, och lämna över natten på en skakande inkubator vid 4 ° C eller för 2 h i rumstemperatur.
- Förbereda det blockerande buffert genom att 5% fettfri mjölktorrsubstans (w/v) i PBS med 0,05% Tween 20 (PBST).
- Ta bort de behandlade kapsid lösningarna från plattan. Tillsätt 200 µL per brunn blockerande buffert. Inkubera i 2 h i rumstemperatur eller över natten, förseglade vid 4 ° C.
- Förbered liganden bindande lösningar för den biotinylerade aptamer M6-2 18 , 29 och biotinylerade syntetisk HBGA Blodgrupp A eller biotinylerade typ H.
- Dilute den biotinylerade aptamer till 1 µM i nuclease-gratis vatten. Se till att det finns tillräckligt lösning för 200 µL totalt för varje behandling. Späd den valda biotinylerade HBGA till 30 µg/mL i det blockerande buffert. Se till att det finns tillräckligt lösning för 200 µL totala volym för varje behandling.
Obs: För att använda mindre HBGA, 10 µg/mL HBGA i 0,25% lättmjölk-PBST kan ersättas. Koncentrationer för både biotinylerade M6-2 och HBGA har optimerats och rapporterade tidigare.
- Dilute den biotinylerade aptamer till 1 µM i nuclease-gratis vatten. Se till att det finns tillräckligt lösning för 200 µL totalt för varje behandling. Späd den valda biotinylerade HBGA till 30 µg/mL i det blockerande buffert. Se till att det finns tillräckligt lösning för 200 µL totala volym för varje behandling.
- Ta bort blockerande buffert och tvätta plattorna 3 gånger med 200 µL per brunn PBST. Klappa plattan uppochner på sterila hushållspapper för att torka den kvarvarande fukten.
- Tillsätt 100 µL per brunn av liganden bindande lösningar, att se till att det finns 2 brunnar per värmebehandling-ligand kombination. Inkubera plattan täckt med ett lock i orbitalskak på ca 60 varv för 1 h i rumstemperatur.
Obs: Glöm inte att inkludera 2 brunnar varje obehandlad förhoppningsvis och fullständigt denaturerad förhoppningsvis för varje ligand som positiva och negativa kontroller, respektive. Dessutom inkluderar 2 " ingen kapsid " brunnar för varje liganden som plattan bakgrund kontroll. - Ta bort ligand lösningarna och Tvätta brunnarna 3 gånger med 200 µL per brunn PBST. Klappa plätera uppochner på sterila hushållspapper för att torka kvarvarande fukt.
- Tillsätt 100 µL per brunn lösning 0,2 µg/mL streptividin-pepparrotsperoxidas i PBS. Inkubera i 15 min i rumstemperatur med milda skakningar i orbitalskak.
Obs: Olika streptividin-pepparrot peroxidas konjugat har olika koncentrationer. Kontakta användaren ' s manual för perfekt utbud av koncentrationer för ELISA tillämpningar av enzym och vara säker på att det är optimalt. - Ta bort konjugatet lösning. Tvätta 3 gånger med 200 µL per brunn PBST. Klappa plätera uppochner på sterila hushållspapper för att torka kvarvarande fukt.
- Tillsätt 100 µL per brunn 3,3 ', 5,5 '-tetrametylbensidin (TMB) substrat, och låta färgen utveckla till 5-15 min. Observera negativa kontrollbrunnar för någon färg och se till att konsekvent utveckla för samma tid mellan plattorna och replikera. Vara medveten om absorbansen spänna av den spektrofotometer som används, samt.
Obs: Utveckla tider kan variera beroende på kvaliteten på de ligander/reagens som används. - Stoppa utvecklingen av reaktionen med 100 µL per brunn 1M fosforsyra. Omedelbart läsa plattan vid 450 nm. Spara data.
Obs: Införandet av syran generellt bromsar reaktionen drastiskt men slutar inte helt det. Lämna inte stoppat plattan under en längre tid innan du läser absorbansen.
2. Analys av plattan-baserat test resultat
- Spara raw absorbansen data i ett kalkylprogram. Producera de genomsnittliga absorbanserna för varje väl par med specifik behandling och ligand. Använda dessa medelvärden för alla efterföljande analyser.
Obs: Jämföra båda väl absorbanserna för att kontrollera att inga par brunnar har avsevärt skilda värden. - Att analysera absoluta kapsid integritet (alla bindande), subtrahera raw absorbans i " ingen kapsid " kontroll från varje andra provets absorbansvärde.
Obs: Alternativt förlust av bindande på grund av förlust av högre ordning (sekundära, tertiära, Kvartär) struktur kan direkt analyseras. Istället för att subtrahera absorbans kontrollen negativa (ingen kapsid), subtrahera värdet av fullständigt denaturerad kapsid kontroll. Detta tar bort alla bindande signal på grund av ospecifik bindning till apparaten samt bindande på grund av kapsid sekvensen. HBGA och aptamer M6-2 Visa lite bindning till fullständigt denaturerad kapsid, så antingen metod ger liknande resultat. Falskt positiv signal tillskrivs ospecifik aptamer bindande måste beaktas när man väljer vilken analys använda. - Med negativa eller denaturerat kontroll-justerade absorbanserna, dividera behandling absorbanserna av deras respektive positiv (ingen behandling) styra absorbanserna och multiplicera med 100. Detta ger procentandelen av signalerar av behandlade kapsid relativt den obehandlade kontrollen.
- Att uppskatta graden av bindande signal för varje ligand hänförligt till kapsid sekvensen, subtrahera den " ingen kapsid " negativ kontroll från de inledande absorbanserna och ta denaturerat kapsid justerade absorbans. Dividera detta med positiva styrsignal justerade absorbans och multiplicera det med 100. Detta ger uppenbara andelen signal på ligand bindning till denaturerat kapsid/kapsid sekvens.
3. DLS för att upptäcka Virus Aggregation efter värmebehandling
Obs: Stegen nedan kan vara specifika för programvaran och instrument används, men kan anpassas och tillämpas på liknande anordningar.
- Skapa en ny storlek SOP i DLS instrumentet programvara med: Material = Protein, Dispersant = PBS, temperatur = 25 ° C, Jämviktstiden tid = 0 sec, celltyp = disponibel kyvetten (liten volym, ZEN0040), mätning vinkel = 173° Backscatter, Mätning varaktighet = automatisk, antal mätningar = 3, fördröjning mellan mätningar = 0 sec, databehandling: analysmodell = General purpose (normal upplösning). Använda standardinställningarna för alla andra parametrar.
- Välj den gröna kör pilen i mjukvaran och namnge provet.
- Följ steg 1.1.1 genom 1.1.4 för värmebehandling av framställda.
- Dilute värmen behandlas framställda 1:10 i 1 x PBS för en slutlig koncentration på 5 µg/mL. (Valfritt) Filtrera urvalet med en 1 µm porstorlek att ta bort dammpartiklar; DLS är mycket känslig för damm, eftersom stora partiklar spridas mycket mer ljus än små partiklar.
- Överföra 50 µL utspädda framställda i en liten volym disponibla kyvetten. Infoga kyvetten i provkammaren instrumentets.
- Starta körningen och använda den ' korrelogrammetoder ', ' Cumulants Fit ', och ' Expert råd ' flikar att utvärdera datakvalitet.
- Under körningen, kontrollera att polydispertion indexvärdet är mindre än 0,3, som representerar en kvalitet mätning. I den ‘ multi-View ’ fliken, se till att korrelationskoefficienten är konstant och nära, men inte mer än 1, på kort tid, och droppar bort kraftigt till 0 vid ett senare tillfälle, karakteristiska av partikelstorlek. Använd den ‘ Expert råd ’ fliken för feedback på kvaliteten på uppgifterna under mätningarna.
- När mätningen är klar, kontrollera igen att polydispertion indexvärdet är mindre än 0,3. Kontrollera att cumulants passar linjen följer data pekar noga i den ‘ Cumulants passar ’ tab.
- Ta medelvärdet av de Z-genomsnittliga partikeldiameter rapporteras för varje mätning som partikelstorlek av varje prov. Rita diametern i nm vs. temperatur i ° C.
4. DLS för att upptäcka Virus aggregering i verklig tid
Observera: stegen nedan kan vara specifika för programvaran och instrument används, men kan anpassas och tillämpas på liknande enheter.
- Skapa en ny storlek SOP i DLS instrumentet programvara med: Material = Protein, Dispersant = PBS, temperatur = som önskat, Jämviktstiden tid = 0 sec, celltyp = kvarts kyvetten, mätning vinkel = 173° Backscatter, mätning varaktighet = automatisk, Antal mätningar = 50 (kan vara ökad eller minskad beroende på aggregering rate), fördröjning mellan mätningar = 0 sec, databehandling: analysmodell = flera smala lägen (hög upplösning). Använda standardinställningarna för alla andra parametrar.
- Välja pilen kör inom programvaran för att öppna och namnge ett nytt stickprov, och låta instrumentet för att nå temperaturjämvikt.
- Avbryta framställda i 1 X PBS i en mikrocentrifug rör vid en koncentration på 5 µg/mL och en volym mellan 200-500 µL. Vortex suspensionen.
- Snurra ner VLP suspensionen för 5-10 s i en bordsskiva centrifug till avinstallation gas. Detta hjälper till att förhindra bubbla bildandet under värmebehandling som stör storlek mätningar.
- Överföring av VLP suspension till en liten volym kvarts cuvette-undvika bubblor och Pipettera långsamt mot väggen av kyvetten. När instrumentet har nått temperaturjämvikt, sätta i kyvetten i en provkammare.
- Vänta 10 s för provtemperaturen temperera, sedan starta körningen. Starta en timer i början av loppet. Stoppa timern i slutet av den första mätningen. Ta den här tiden som den första tidpunkten. Få efterföljande tidpunkter från mätning tider registreras av programvara.
- Starta körningen och övervaka korrelogrammetoder, distribution passar och expertråd att utvärdera kvaliteten på uppgifterna.
Obs: PDI inte nödvändigtvis är mindre än 0,3 för dessa mätningar som provet är väntat till vara polydisperse under aggregering.- Kontrollera att korrelationskoefficienten är konstant och nära, men inte mer än 1 på kort tid, och sjunker kraftigt vid en eller flera senare tillfällen, karakteristiska av partikelstorlek.
- Se till att fördelningen passar linjen följer data pekar noga.
- Analysera storlek data.
- Bestämma varje gång punkt från skillnaden i tid mellan varje mätning och den första tidpunkten. Mätning varaktigheter är inte alla exakt samma.
- Med en intensitet distribution, registrera storleken på topparna med de största områdena för varje mätning/tidpunkt.
- De topp diametrarna i nm vs. tid i min.
5. TEM provberedning
- Skaffa kol stöd film (nickel) nät avsedda för TEM.
Obs: Rådfråga en core facilitet på rekommenderade reagenser och deras hantering för användning med mikroskopet anläggning. Se till att förvara rutnät i en låda som innehåller torkmedel eller en vakuumkammare att minimera exponering för fukt. - Riv cirka 5 x 5 cm bitar filtrerpapper. Erhålla glas petriskålar och ordentlig självstängande omvänd pincett avsedd för användning i mikroskopi.
- Skär ca 2,5 x 5 cm bit paraffin film. Plats på bänkmonterade.
- Värmebehandling av norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis
- följa förfarandet för värmebehandling exakt som beskrivs ovan i steg 1.1.1 - 1.1.5 utom: Använd 10 mM HEPES (pH 7,4) för behandling i stället för PBS och späd inte ytterligare förhoppningsvis efter behandling (hålla lösning på 50 µg/mL). Pipettera hela ~ 15 µL släpp av behandlade kapsid lösning på paraffin film.
- Ta tag i rutnätet kanten med pincett, gör det möjligt för dem att stänga på kanten för att hålla rutnätet, och placera den rutnät kol-och-ner ovanpå släpp av behandlade lösning. Låt Inkubera i 10 min till tillåta kapsid att fästa nätet.
- Beroende på renhet av kapsid preparatet, tillsätt tvättar av 10 mM HEPES lösningen vid behov i form av 10-15 µL droppar placeras i raden efter behandlade kapsid dropletprogrammet.
- Efter 10 min, plocka upp rutnätet med droplet-programmet. Placera rutnätet nästan vinkelrätt mot en papperslapp filter till veken bort droplet-programmet. Plocka droplet-programmet i 10-15 µL HEPES buffert med grid, håll i 30 s, sedan wick bort med ett annat filter papper till Wash
- Placera en 15 µL droplet 2% uranyl Acetat lösning på paraffin filma i ett tomt område.
- Plocka upp droplet-programmet av uranyl acetat med grid och håll 45 s. Wick bort den uranyl acetat, att se till att ta bort de flesta av lösningen. Placera den rutnät kol-Sidan upp på ett filterpapper, var försiktig så att elnätet inte " stick " till fukten på pincetten. Placera filterpappret med rutnätet på den i en öppen glas petriskål.
Obs: Använd inte petriskålar av plast, eftersom rutnäten kommer att elektrostatiskt lockas till dem och bli stickat till maträtt.
- Plocka upp droplet-programmet av uranyl acetat med grid och håll 45 s. Wick bort den uranyl acetat, att se till att ta bort de flesta av lösningen. Placera den rutnät kol-Sidan upp på ett filterpapper, var försiktig så att elnätet inte " stick " till fukten på pincetten. Placera filterpappret med rutnätet på den i en öppen glas petriskål.
- Upprepa för alla behandlingar. Placera de petriskål halvorna med rutnäten i exsickator över natten torka före observation med TEM.
- Rådgöra mikroskopi anläggningen vid respektive institution när det gäller att observera förberedda gallren. Vissa faciliteter tillåter användaren att utbildas om driften av deras anläggning ' s instrument. Specifika detaljer om setup och observation av specifika Mikroskop är btillämpningsområdet för denna artikel eyond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den strukturella integriteten av humana norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis (framställda) bedömdes med flera nya metoder som presenteras av Moore et al. 17. först ett experiment utfördes i vilket förhoppningsvis integritet som en funktion av deras förmåga att binda en förmodad receptor/co-factor (HBGA) eller ssDNA aptamer (M6-2) var jämfört (figur 1). Resultaten som visas har tidigare presenterats av Moore et al. 17, och visa att beteendet aptamer M6-2-kapsid bindande var liknande till det av virus-HBGA bindande exponering till 68 ° C värmebehandling för olika exponeringstider. Medan HBGA bindande signalen var förlorat något tidigare än att av aptamer M6-2, M6-2 visas en liknande hastighet av signalförlust beräknas efter framställda utsattes till 65 ° C och 68 ° C för olika tid punkter (tabell 1)17. Detta tyder på att både HBGA och aptamer M6-2 bindande avskaffades på ett liknande sätt.
DLS mätningar visat att aggregation på grund av protein denaturering sannolikt korresponderade med ligand bindande signalförlust (figur 2), som en hydrodynamisk diameter som är större än 100 nm observerades efter ca 18 min behandling vid 68 ° C. Dessa var villkor på vilka fullständig förlust av HBGA bindande och nästan all förlust av bindande signal för aptamer M6-2 (> 80%) uppstod (figur 1)17. TEM resultat stöds dessa observationer som morfologiska förändringar och klumpar av förhoppningsvis blev allt tydligare som temperaturen höjdes stegvis mellan 60 ° C och 80 ° C i 1 min (figur 3a). Ett liknande fenomen observerades efter värme förhoppningsvis vid 68 ° C i upp till 25 min, men upplösningen på TEM var mindre uttalad (figur 3b)17.
Figur 1: konformationsberoende bindning av två olika ligander till norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis genomgått värmebehandling. Renat GII.4 Sydney förhoppningsvis (framställda) utsattes för värmebehandling vid 68 ° C för olika mängder av tid och bindningen till Blodgrupp A HBGA och aptamer M6-2 utvärderades med hjälp av en tallrik-baserade ELASA bindande assay. Y-axeln visar absorbansen signalen observerats för en behandling (exponeringstid) som procentandelen av en obehandlad kapsid kontroll. Denna siffra har presenterats tidigare och denna siffra har ändrats från Moore et al. 17 felstaplar representera ± 1 standardavvikelse för % signal. Data finns för minst tre replikera plåtar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel DLS data för värmebehandlad norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis visar perfekt och tvetydiga/låg kvalitetsresultat. Förhoppningsvis (framställda) utsattes för värmebehandling vid 65 ° C och 68 ° C, och deras storlek var övervakas i realtid. Panelen (en) motsvarar en hög kvalitet, tydliga korrelationskoefficienten mätning; och (b) till en låg kvalitet, tvetydiga korrelationskoefficienten mätning. (C) visar partikel storlek data, som visar en tydlig aggregering profil för förhoppningsvis behandlas vid 68 ° C; och (d) visar tvetydiga partikel storlek data för värmebehandlad förhoppningsvis. Några av dessa data presenteras och därmed denna bild ändras från Moore et al. 17 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: TEM av norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis utsätts för olika värmebehandlingar. Renat förhoppningsvis (framställda) utsattes för olika värmebehandlingar och observerade använder transmissionselektronmikroskopi. Panelen (en) visar data för förhoppningsvis uppvärmd vid olika temperaturer (60, 65, 70, 75 och 80 ° C) för 1 min. Panel (b) visar förhoppningsvis 68 ° C reningskrav för 0 - 25 min. skala (bar) på högra foton representerar 100 nm. Dessa bilder presenteras i Moore et al. 17 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Exponentiell förruttnelse hastighet (% signal/min) | |||
| Temperatur | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligand | |||
| HBGA typ A | 2.50 ± 0,24 | 13.30 ± 1.15 | |
| Aptamer M6-2 | 2.47 ± 0,66 | 13.18 ± 0,47 | |
Tabell 1: exponentiell förruttnelse priser för norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis behandlas vid 65 ° C och 68 ° C. Förhoppningsvis utsattes för värmebehandlingar för olika tider vid 65 ° C och 68 ° C, kyls vid 4 ° C, och deras förmåga att binda syntetiska HBGA eller aptamer utvärderas. Graden av signalförlust över tid (decay rate) beräknades sedan med varje ligand för varje temperatur. Dessa data har tidigare presenterats i Moore et al. 17 data presenteras som % signal/min ± 1 standardavvikelse för % signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokoll och tekniker som beskrivs här ger ett sätt att bedöma människors norovirus kapsid integritet/funktionalitet. Dessa metoder kan användas för att erhålla mekanistisk insikt effekterna av inaktivering behandlingar mot viruset, och potentiellt kan komplettera mer traditionella inaktivering utvärderingsmetoder som RT-qPCR eller plack assay. Till exempel ger utvärdering av kemiska eller fysiska inaktivering av plack assay ensam ett mått på graden av virus inaktivering men inte den underliggande mekanismen vid denna inaktivering. Även kan virus aggregation leda till underskattning av titer och därför överskatta behandling effekt30. Dessa metoder kan ytterligare informera sådan studie genom att tillhandahålla information om effekterna av en behandling på integriteten av norovirus kapsid. Nyligen har två in vitro- (cellkultur) odlingsmetoder för humana norovirus varit rapporterade5,6. dessa fortfarande åberopas PCR för virus uppräkning, men teoretiskt enteroid modellen presenteras skulle kunna utnyttjas för TCID50 med antikroppen färgning för relativ minskning bestämning. De metoder som presenteras här kan ha verktyg för att förstå hela mekanismen av viral inaktivering för flera olika typer av behandlingar utöver bara värmebehandling. Till exempel användes plåt-baserade ligand bindande och TEM som verktyg för att komplettera RT-qPCR och plack assay data i att bestämma mekanismen av norovirus inaktivering på koppar ytor31,32, vid exponering mot silver dihydrogen citrat33och höga hydrostatiska trycket behandling14.
Det finns många steg i dessa protokoll där uppmärksamhet på metodologiska detaljer är avgörande. Specifikt för plattan analysen, måste bra uppmärksammas att den buffert som används för att späda ut liganden för bindning. Aptamer M6-2 och ssDNA aptamers i allmänhet är känsliga för salt koncentrationerna och buffert villkor. Använder en icke-optimala buffert med aptamer kan ablatera bindande. Även om aptamer M6-2 har framgångsrikt använts i utspädd mänsklig avföring, kan för mycket avföring/matrix störningar störa bindande, vilket överensstämmer med observationerna för andra människors norovirus aptamers18,22. En viktig faktor som orsakar detta är att aptamers kan uppvisa en grad av ospecifik bindning till positivt laddade molekyler. Sålunda, detta kan leda till viss grad av falsk positiv signal i analysen beskrivs här. Detta kan förklaras av att välja en negativ kontroll som är antingen en komplex matris utan virus eller en icke-närstående protein. Likaså HBGA koncentrationen och mängden skumma mjölk fasta ämnen som används i bindande bufferten kan väsentligt påverka positivt och bakgrunden signaler. Observera att olika HBGAs har olika grader av affinitet till olika stammar av mänsklig norovirus, så bindande buffertar kan behöva optimeras beroende på HBGA typ14,31,33. Liknande övervägande bör ges till det buffert som används för det streptividin-konjugatet av pepparrotperoxidas, som koncentrationer från olika tillverkare kan variera; dock kan mycket mindre variabilitet förväntas med tanke på den streptividin-biotin interaktiv34hög affinitet. På grund av den höga graden av anpassningsförmåga av denna tallrik-baserade metod är felsökning suboptimala resultat relativt okomplicerad. Till exempel när det gäller hög bakgrund signal, optimering av ökande skumma mjölk koncentration och minskande ligand koncentration kan undersökas, och vice versa för plattor med låg positiva signaler. För TEM, en av de mest kritiska övervägandena är användningen av icke-statisk material (som glas) när lagring/hantering grids, eftersom näten är extremt svårt att hantera runt material såsom disponibel petriskålar. Om sådant material används, tenderar nät att ”hoppa” och hålla sig till materialet. Dessutom bör mycket vård vidtas för att säkerställa att det finns ingen kvarvarande fukt på gallren. Vakuum exsickator bör helst användas om tillgängliga.
När du utför experiment med DLS, är renheten av provet en mycket viktig faktor. De funktioner som används för att korrelera ändringar till diameter intensitet på ljusspridning förlita sig på att ha monomodal eller smal multimodala partikel distributioner. Orenheter ned till nanoskala, inklusive proteiner, införa polydispertion och ändra storlek beräkningar. Också, ljus utspridda intensitet är proportionell mot diametern upphöjt till en exponent av 6, så stora partiklar såsom damm avsevärt stör mätningarna. Bubbla bildandet under realtid värmebehandlingar resulterar i meningslösa resultat på grund av ljus som sprids av fluktuerande bubblor. Kapsid (VLP) koncentration måste också beaktas när du använder DLS. Prov koncentrationer måste vara tillräckligt hög för att producera tillräcklig signal och tillräckligt låg för att undvika flera spridning. Det är också av avgörande betydelse att mata in rätt material och dispergeringsmedel egenskaper, som dessa värden används av programvara för storlek beräkningar. I synnerhet dispergeringsmedel viskositet är en funktion av temperatur och måste justeras under värmebehandling (den programvara som används har temperatur-anhörigen viskositet vatten byggdes).
Även om metoderna som beskrivs här erbjuder flera möjligheter till förbättrade sätt att bedöma kapsid integritet, de är inte perfekta. Eftersom dessa metoder kräver mycket höga koncentrationer av virus, måste de användas med renat, sammansatta förhoppningsvis istället för infödda smittsamma virus. De framställda används här består av stora kapsid protein av humana norovirus (VP1), som monterar in norovirus kapsid utan viral nukleinsyra. Även om dessa framställda uppvisar antigena liknande beteende till infektiöst virus förhoppningsvis, kan de vara mer mottagliga för inaktivering. Ytterligare, framställda är svåra att producera och rena och är inte lätt tillgängliga för många utredare. Användning av renat humana norovirus (t.ex., använder ultracentrifugering) är möjligt men tillgänglighet av norovirus-positiva mänskliga fekal exemplar är begränsad och även med rening, virus titrar kan inte vara tillräckligt hög för att rymma metoderna beskrivs här. Framtida arbete på att optimera analyser för användning av semi renade smittsamma virus i avföringen pågår för närvarande. I själva verket detta redan har visats plate assay18,22, men utan tvekan skulle vara mer komplicerat för DLS. Det bör också noteras att dessa metoder tillämpades endast för att utvärdera kapsid integritet efter applicering av en fysisk (värme) inaktivering strategi, som är kända för att direkt påverka kapsid. Resultaten kan bli mer tvetydig var dessa tekniker används för att utvärdera kapsid integritet använder andra inaktivering metoder, såsom kemiska medel eller metoder som är främst riktade till förstörelsen av det virala genomet. Dock visat vissa rapporter gynnsamt prestanda för HBGA bindande för att utvärdera kemisk inaktivering31,33,35,36,37. Vid den aktuella tiden används protokollen redovisas här bäst tillsammans med traditionella tekniker som RT-qPCR och plakvedukten analyser med surrogat virus.
Dessa protokoll ger ett enkelt alternativ innebär att förstå effekterna av en fysisk virus inaktivering metod (värme) på humana norovirus. Dessa metoder skulle sannolikt kunna utvidgas för användning med andra icke-höljeförsedda virus (t.ex., hepatit A och E virus), som övergripande principen för att upptäcka förlust av högre ordning proteinstruktur är densamma. Dessutom, bör beteende och potential att andra ligander för indikerar förlust av kapsid integritet utvärderas. Anpassa protokollen till mer komplexa provmatriser och förbättra deras Analytisk känslighet (detektionsgränser) är också en logisk framtida riktning. Sammantaget ger metoderna som beskrivs här ett mer lättillgängligt sätt fastställandet av humana norovirus kapsid integritet och att få mekanistisk insikt i effekterna av inaktivering behandlingar mot detta viktigt patogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av jordbruk och livsmedel forskning initiativ konkurrenskraftiga bidrag nr 2011-68003-30395 från Förenta staternas Department of Agriculture, nationella institutet för livsmedel och jordbruk genom projektet NoroCORE. Finansiering för öppen tillgång avgift lämnades av United States Department of Agriculture. Vi vill tacka Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) för vänligt att ge oss den renade förhoppningsvis och Valerie Lapham för hennes hjälp med TEM bilder. Vi vill också tacka Frank N. Barry för att hjälpa oss börjar de experiment som presenteras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
