Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En praktisk metode til udvinding og analyse med højtryks væskekromatografi catecholamin neurotransmittere og deres metabolitter

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Vi præsenterer en bekvem fast-fase udvinding koblet til højtryks væskekromatografi (HPLC) med elektrokemisk detektion (ECD) samtidige bestemmelse af tre monoamin neurotransmittere og to af deres metabolitter i spædbørns urin. Vi har også identificere metabolit MHPG som en potentiel biomarkør for tidlig diagnosticering af hjerneskade til spædbørn.

Abstract

Udvinding og analyse af katekolamin neurotransmittere i biologiske væsker er af stor betydning for vurderingen af nervesystemet funktion og beslægtede sygdomme, men deres præcise måling er stadig en udfordring. Mange protokoller er blevet beskrevet for neurotransmitter måling af en række instrumenter, herunder højtryks væskekromatografi (HPLC). Men der er mangler, som kompliceret operation eller svære at opdage flere mål, som ikke kan undgås, og i øjeblikket dominerende analyse teknik er stadig HPLC kombineret med følsomme elektrokemiske eller fluorimetri påvisning, skyldes dens høje følsomhed og god selektivitet. Her, er en detaljeret protokol beskrevet for forbehandling og påvisning af katekolaminer med højtryk væskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) i virkelige urinprøver af spædbørn, ved hjælp af electrospun sammensatte nanofibers sammensat polymere crown Eter med polystyren som adsorbent, også kendt som metoden pakket fiber faste fase udvinding (PFSPE). Vi viser hvordan urin prøver kan let precleaned af en nanofiber-pakket faste fase kolonne, og hvordan analysander i stikprøven kan være hurtigt beriget, desorberet, og fundet på en ECD system. PFSPE forenkler de forbehandling procedurer for biologiske prøver, giver mulighed for nedsat tid, udgifter og reduktion af tabet af mål.

Alt i alt illustrerer dette arbejde en enkel og praktisk protokol for fast-fase udvinding koblet til en HPLC-ECD system for samtidige bestemmelse af tre monoamin neurotransmittere (noradrenalin (NE), adrenalin (E), dopamin (DA)) og to af deres metabolitter (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) og 3,4-dihydroxy-Phenyleddikesyre (DOPAC)) i spædbørns urin. Den etablerede protokol blev anvendt til at vurdere forskelle i urin katekolaminer og deres metabolitter mellem højrisiko spædbørn med perinatal hjerneskade og raske kontrolpersoner. Sammenlignende analyse viste en betydelig forskel i urin MHPG mellem de to grupper, der angiver, at catecholamin metabolitter kan være en vigtig kandidat markør for tidlig diagnosticering af tilfælde med risiko for hjerneskade hos spædbørn.

Introduction

Catecholamin neurotransmittere og deres metabolit indholdet i kropsvæsker kan påvirke neurale funktion og påvirker balancen af svar til stimulus stater til et stort omfang1. Abnormities kan forårsage en række sygdomme, såsom pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma, og neurologiske1,2. Ekstraktion og bestemmelse af katekolaminer i kropsvæsker er meningsfuld for diagnosticering af de pågældende sygdomme. Men katekolaminer i biologiske prøver findes i lave koncentrationer og oxideres nemt. De er desuden meget vanskeligt at eluere på grund af den store mængde af indblanding i den mellemstore3. Samtidige påvisning af katekolaminer i biologiske væsker er således stadig en udfordring.

Der har været vurderinger viser, urin katekolaminer kan være en foranstaltning af stress, og at deres niveauer er vigtige biologiske markører reagerer på taktil stimulation forarbejdning i nyfødte5. Ifølge forskning, alle spædbørn, der har lidt af for tidlig hændelser er i risiko for hjernen skade4,5,6, og skade kan forårsage unormale frigivelse af katekolaminer og dertil knyttede spørgsmål i væsker. Der findes avancerede magnetisk resonans teknikker, der kan afsløre hjerneskade i tidligere faser7,8. Men inden for de første 48 timer, en unormal udviklingsforstyrrelser proces vil forårsage permanent hjerneskade, der ikke vil være tydelig i medicinske billeder11. Udover, de høje omkostninger og knappe instrument ressourcer, sammen med andre faktorer, gør det umuligt for alle neonatal enheder skal have adgang til disse specialiserede neuro-imaging teknikker. Men brugen af en let tilgængelig og praktisk biomarkør (såsom katekolaminer og deres metabolitter) kunne overvinde disse mangler og screening af en biomarkør i menneskelige væsker kan hjælpe i den tidlige diagnosticering af hjerneskade og føre til lynhurtig identifikation af nyfødte spædbørn at behøve neuroprotection9. Katekolaminer i urinen kan være en let og indlysende indeks, på grund af den direkte sammenhæng mellem mængden af dem udgivet i væsker og neuroactivity funktion.

Blandt biologiske væsker, cerebrospinalvæske (CSF) og plasmaprøver er ikke let at få via eksisterende traumatisk procedurer, og det er også meget svært at slippe af interferens på grund af selvklæbende protein og andre urenheder, fører til en besværlig og tidskrævende prøvetagning proces, der er uegnede for gentagne påvisning. Også, for børn, det er næsten umuligt at få prøverne i en traumatisk mode. Derfor, urin prøveudtagning er bedre end de andre former for prøveudtagning, som det er non-invasiv, nem at betjene, og kan gøres gentagne gange. Urinprøver er rigelig og let at opbevare, og Vis store fordele i forhold til de andre former for biologiske prøver.

De vigtigste metoder til at kvantificere katekolaminer i biologiske væsker omfatter radioenzymic assays10, enzym-forbundet immun-sorptionsmiddel assays11, voltammetry12 og termisk linse massespektrometri13. Men mangler findes, såsom komplicerede operationer og svære at opdage flere mål. I dag er er den dominerende analyse teknik højtydende væskekromatografi (HPLC)14, kombineret med følsomme elektrokemiske15 eller fluorimetri påvisning16, på grund af sin høje følsomhed og god selektivitet. Med tandem massespektrometri teknologi, såsom væskekromatografi/massespektrometri (LC/MS) og liquid chromatography/masse massespektrometri/massespektrometri (LC/MS/MS), analyse og kvantificering af neurotransmittere kan opnå høj nøjagtighed og specificitet17,18. MS teknik kræver dog dyrt instrumentation samt væsentligt kvalificeret arbejdskraft, hvilket gør metoden vanskelig at anvende almindeligt i de fleste konventionelle laboratorier. HPLC-ECD systemer er almindeligt udstyret i mest konventionelle og kliniske laboratorier, og således er blevet et fælles og gode valg for forskningsgrupper at bruge kemiske bestemmelse, men de kræver prøven blev indført i systemet til at være ren og af individuel bind19. Således, det er af stor betydning at rense og kondensere prøve inden analysen. Den klassiske metode til rensning skridt er væske-væske ekstraktion14,15,20 og off-line fast-fase udvinding, herunder aktiveret aluminiumoxid kolonne21,22 og diphenylborate (DPBA) compleksering23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. har brugt polymer harpiks kemisk modificeret med krone ether som adsorbent til selektivt uddrag katekolaminer fra humant urin siden 200727. Også i 2006, Haibo han mfl. påvist en letkøbt syntese tilgang til boronate affinitet udvinding sorptionsmiddel byutilizing functionalizable nanomagnetic polyeder oligomere silsesquioxane (eventuelt) baseret nanomagnetic sammensat, og anvender det til berigelse af katekolaminer i human urin (noradrenalin, adrenalin og isoprenaline)28. De tog også fordel af nanomaterialer til at opfylde det arbejde, ved hjælp af en teknologi kaldet nano-electrospinning og danner polymer fibermaterialet i nanoskala. Electrospinning processen kan justere diameter, morfologi og rumlige justering af produktet ved at kontrollere arbejdskapital spænding og ændre indholdet af spinning løsning sammen med andre parametre29. Sammenlignet med konventionelle SPE patron, electrospun nanofibers er særdeles velegnet til at udtrække og berige target analysander fra en kompleks matrix, som de er udstyret med høj overflade-areal-til-volumen forhold til adsorberes til analysander med høj effektivitet, og udvise flere let-kontrollerede kemiske overfladeegenskaber, så handy udlæg i target forbindelser. Disse egenskaber gør dem gode valg for SPE adsorbenter, hvilket reducerer den faste fase og desorption opløsningsmiddel beløb30,31,32,33. For katekolaminer i urinprøver, blev electrospun nanofibers, der består af apolymeric crown afdampes med polystyren (PCE-PS) brugt til selektivt udtrække tre katekolaminer (NE, E, og DA)34. Papiret anført, at den selektive crown ether adsorberet mål af NE, E, og DA, som var baseret på dens korrekte geometri for bindende katekolaminer via danne hydrogenbindinger. Resultaterne vises de materielle crown ether effektivt, at fjerne andre interfererende forbindelser indeholdt i biologiske prøver. Inspireret af denne betænkning, en roman metode blev udviklet til en selektiv ekstraktion af katekolaminer ved brug af electrospun sammensatte nanofibers sammensat af PCE-PS.

I dette papir rapporteret metoden tidligere34 blev forbedret og ansat ikke kun til at analysere E, NE, og DA, men også deres MHPG og DOPAC, metabolitter i urin. Vi også udforske nye muligheder for mekanismen af adsorption proces. Metoden viser tilfredsstillende ekstraktionseffektivitet og selektivitet til de fem analysander, og metoden blev efterprøvet i analysen af urin fra højrisiko spædbørn med perinatal hjerneskade og raske kontrolpersoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blev indhentet informeret samtykke fra forældrene, og institutionelle review board godkendelse blev opnået for undersøgelsen. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med etiske kodeks af World Medical Association (Helsinki-erklæringen) for eksperimenter, der involverer mennesker. Pårørende af alle deltagerne givet skriftligt samtykke til at blive indskrevet i undersøgelsen. Etisk udvalg godkendelse fra Zhongda Hospital, affiliate med sydøst Universitet, blev også fremstillet.

1. forberedelse af kolonner og løsninger til ekstraktion og bestemmelse af katekolaminer

  1. Forberede kolonnen PFSPE. Opdele 1-2 mg af PCE-PS nanofibers i 5-6 delprøver, og brug en fin stålstang med 0,5 mm i diameter til at komprimere dem ordnet i slutningen af en pipette tip med et rumfang på 200 µL.
  2. Forberede den kunstige urin ved vejning 2.427 g urea, 0.034 g urinsyre, 0,09 g kreatinin, 0.297 g Trinatriumcitrat, 0.634 g natriumchlorid, 0,45 g kaliumchlorid, 0.161 g ammoniumchlorid, 0.089 g calcium chlorid dihydrat, 0,1 g magnesium sulfat en, 0.034 g natriumbicarbonat, 0,003 g natrium oxalat, 0.258 g natriumsulfat, 0,1 g natrium dihydrogen fosfat, og 0.011 g dinatrium hydrogen fosfat, og opløse de ovenstående kemikalier i 200 mL deioniseret vand.
  3. Forberede 2 mg/mL stamopløsning af diphenylborate (DPBA) løsning ved at opløse 2 mg af stoffet i 1 mL destilleret vand. Gemme løsningen i mørke ved 4 ° C.
  4. Analysandens standard
    Bemærk: Den kemiske struktur og egenskaber af katekolaminer er ustabilt, og de nedbrydes let. Forberedelsesprocessen standarder skal være meget hurtig og skal forhindre udsættelse for direkte sollys.
    1. Veje 1,0 mg af NE, E, DA, MHPG, DOPAC og intern standard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromid DHBA i separate 1,5 mL microcentrifuge rør. Fortynd DHBA opløsning i vand til 100 ng/mL før brug.
    2. Svinge de forberedte standarder i mørke ved en høj hastighed, indtil analysander opløses fuldstændigt. Dette er den primære bestand; opbevares ved-20 ° C i op til flere uger.
    3. Forberede de sekundære 1.000 ng/mL analysand bestande. NE, E, DA, DOPAC og MHPG, overføre 5 µL af hver primære analysand bestand i 4,975 µL af destilleret vand i et 5 mL centrifugeglas, og gemme det i mørke ved 4 ° C indtil brug. Forberede disse løsninger frisk dagligt. For DHBA, overføre 5 µL af primære lager til 4,995 µL af destilleret vand i et 5 mL centrifugeglas, og opbevar den i mørke separat ved 4 ° C.
    4. Yderligere fortyndinger med sekundære analysand bestanden til at oprette en standardkurve (fx., supplerende tabel 2). Gemme løsninger i mørke ved 4 ° C og forberede frisk dagligt.
    5. Test den optimale spænding af ECD detektoren ved hjælp af standard-materiel med ordentlig koncentration. Variere spænding for at finde en værdi hvor analysander har det bedste peak udseende.
  5. Udarbejde eluant indeholdende 30% fosforsyre, 15% acetonitril, og 55% destilleret vand. Til 10 mL opløsningsmiddel, eluant, bruge 5,5 mL destilleret vand og tilsættes 1,5 mL acetonitril og 3 mL phosphorsyre dråbe for dråbe i vandet.

2. forberedelse af virkelige urinprøver og Mobil fase

  1. Har mødre indsamle den første morgen urin fra deres spædbørn ved hjælp af aseptisk urin kopper. Overføre prøverne i polypropylen rør og etiket straks. Derefter gemme prøverne i en-20 ° C fryser.
  2. Vortex og centrifugeres urin prøverne ved 1.510 x g i 10 min. ved stuetemperatur (RT) til at slippe af med de fleste partikler indblanding. Kassér sedimentet og samle supernatanter til yderligere forsøg. For at udtrække analysander effektivt, fortsætte til PFSPE forbehandling (trin 3) umiddelbart efter centrifugering.
  3. Forberede den mobile fase
    1. Forberede en ren flasken, mindst 1 L. Sammensætningen af mobil fase er opført i supplerende tabel 1; for 1 L Mobil fase, foranstaltning 6.7242 g citronsyre, 93.06 mg af ethylen diamin tetra eddikesyre (EDTA) dinatriumsalt, 7.02 g af monometallic natrium orthofosfat, 404.5 mg 1-heptanesulfonic syre natrium salt og 3,5 g natrium hydrat i flasken. Tilføje 40 mL acetonitril og destilleret vand til 1000 mL. Agitere og vibrere ultralyd i 15 min., indtil sagen i løsningen er alle opløst.
    2. Ved hjælp af et pH-meter med en glas elektrode, Juster pH-værdien af den mobile fase til 4,21 med en mættet natriumhydroxidopløsning.
    3. Filtrere den mobile fase med et 0,45 µm polyvinylidene fluor Mikroporøs membran og et vakuum sugeanordning at slippe af urenheder.
    4. Brug ultrasoniske vibrationer til 15 min at degas den mobile fase hver gang før brug.

3. PFSPE udvinding og HPLC-analysen

  1. Aktivere nanofibers. Tryk på 100 µL af methanol og 100 µL vand sekventielt gennem kolonnen PFSPE ved hjælp af en 5 mL sprøjte i en langsom, dråbevis måde.
  2. Mix 100 µL urin prøve med 100 µL 2 mg/ml DPBA opløsning og 30 µL 100 ng/ml af DHBA løsning (IS, intern standard) i 0,5 mL EP rør og derefter overføre blandet løsningen til kolonnen PFSPE. Tryk på blandet prøveopløsningen gennem kolonnen PFSPE med en 5 mL er gastætte plast sprøjte magtanvendelse af lufttrykket.
  3. Leach kolonnen tre gange ved ilægning 100 µL af DPBA løsning (2 mg/mL) i kolonnen SPE, og skub langsomt gennem patronen med lufttryk ved hjælp af en 5 mL er gastætte plast sprøjte.
  4. Indlæse 50 µL af eluant på kolonnen PFSPE, og skub det gennem kolonnen, indsamle eluatet med en 0,5 mL EP tube.
  5. Tænd HLPC afgasser til degas luft i systemet. Før analyseresultat, bør systemet løbe i mere end 0,5 h med den mobile fase skal Reagensglasset og reducere baseline støj. Se supplerende tabel 1 viser opsætningsparametrene af HPLC-systemet.
  6. Prøve 20 µL af eluatet ved hjælp af en automatisk prøveudtager, og derefter injicere det til HPLC-ECD system.
  7. Når kører er komplet, slukke for den detektor celle ved hjælp af grænsefladen detektor. Sluk ikke celle med kontakten på bagsiden af detektoren, da dette kan beskadige apparatet.
  8. Manuelt ændre den mobile fase sammensætning til 10% methanol og 90% vand. Køre i mindst 30 min. Derefter manuelt ændre den Mobil fase til HPLC-grade methanol. Køre i ca 15 min til at beskytte systemet i methanol. Manglende evne til at køre dette trin efter den anbefalede køretid kunne medføre skade på kolonnen og detektoren. Slukke for strømmen, så slå afgasser.

4. Phenylboronic syre patroner (PBA) udvinding

PBA patron ekstraktion procedurer var svarende til ordningen i Kumar mfl. (2011) 25. alle løsninger er skubbet gennem PBA patron (100 mg, 1 mL) med air tvunget af en sprøjte.

  1. Betingelse patron med 1 mL 80: 20 acetonitril-vand (v/v) indeholdende 1% myresyre og 1 mL af 50 mM fosfat buffer (pH 10) sekventielt.
  2. Tryk på buffer urinprøven (1 mL urin og 2 mL fosfat buffer, pH 8,5) gennem PBA patron.
  3. Vask patron med 1 mL 50/50 v/v acetonitril-fosfat buffer (10 mM, pH 8,5).
  4. Elueres cartridge med 1 mL acetonitril-vand (80: 20 v/v) indeholdende 1% myresyre.

5. identifikation og kvantitativ bestemmelse af katekolaminer

  1. Linearitet
    1. Fortynd det sekundære analysander materiel med kunstige urin til seks koncentrationer (1,5, 3, 12, 25, 50 og 100 ng/mL); fortyndingsvolumen af kunstige urin følger supplerende tabel 2. Gøre tre parallelle prøver hver koncentration at få 18 analysand eksperimenterende løsninger til at konstruere kalibreringskurver.
    2. Fortynd DHBA sekundære lager med kunstige urin 10-fold for at få 100 ng/mL eksperimentelle løsning.
    3. Forbehandle alle analysand løsninger fra 5.1.1, efter trin 3 (PFSPE ekstraktion procedurer). Som i trin 3, skal du injicere 20 µL af hver tilsvarende eluatet til HPLC-ECD system til at få en HPLC kromatogram.
    4. Konstruere kalibreringskurverne for de fem analysander af plotte forholdet mellem topareal (mål/IS) som Y-aksen mod forholdet mellem koncentrationer (mål/IS) som X-aksen, som vist i tillægs figur 1.
  2. LOD og LOQ værdi for følsomhed
    1. Indsprøjtes 20 µL af den tomme kunstige urin i ordningen HPLC-ECD (som i trin 3), for at få HPLC kromatogrammet af prøven.
    2. I kromatogrammet fra 5.2.1, indsamle 11 Tom signal værdier og beregne middelværdien Xb og standardafvigelse Sb. Beregne det mindste signal om et stof, der kan detekteres på et bestemt niveau af tillid, XL, som XL = Xb+ K * Sb (K er den værdi af absorptionskoefficienten ved konfidensniveau, Sb afspejler støjniveau i den målemetode og maskine støjniveauet). Således LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) / s (S står for værdien hældning af den arbejdende kurve).
    3. Definere en S/N 3:1 (K = 3) som detektionsgrænsen (LOD), og en S/N på 10:1 (K = 10) som bestemmelsesgrænsen (LOQ).
  3. Evaluere tilbagebetalinger
    1. Forberede reelle og spidse urinprøver. Fortynd det sekundære analysander materiel med virkelige urin til tre koncentrationer (5, 50, 100 ng/mL) til at opnå de spidse urinprøver. Forberede tre parallelle prøver for hver analysand løsning. Tælle mængden af target forbindelser spidse i urinprøven spidse koncentrationen. Denne værdi defineres som ets.
    2. Fortyndet DHBA lager til 100 ng/mL, som i trin 5.1.2.
    3. Behandle hver prøveopløsning fra 5.3.1 efter trin 3 (PFSPE ekstraktion procedurer) og indsprøjtes 20 µL af hver tilsvarende eluant til HPLC-ECD system til at få kromatogrammet resultat. Værdien af analysander vil blive talt som en mængde af target forbindelser kvantificeres i de spidse urinprøve. Definere denne værdi som ent.
    4. Indsprøjtes 20 µL af urinprøven til HPLC-ECD (som i trin 3) system til at få kromatogrammet resultat. Værdien af analysander vil blive talt som en indledende antal mål forbindelser kvantificeret i urinprøven. Definere denne værdi som enjeg.
    5. Beregne antallet af mål forbindelser i prøver fra standardkurven ligning. Genfindingsprocent anslås som metodologisk opsving % = (ent - A,jeg) × 100 / (As). Gennemsnitlige værdier er vist i tabel 1.
  4. Evaluere den upræcise
    1. Forberede spidse kunstige urinprøver til 5, 50 og 100 ng/mL koncentration som i trin 5.3.1. Forberede seks parallelle prøver for hver analysand løsning. Forberede frisk eksperimentelle prøver hver dag.
    2. Fortynd DHBA lager til 100 ng/mL som i trin 5.1.2.
    3. Evaluere intradag-præcision (n = 6). Behandle hver prøveopløsning i 5.4.1 efter skridt 3 og injicere den 20 µL af hver korrespondent eluant til HPLC-ECD system til at få kromatogrammet. Udføre den samme handling seks gange i den samme dag.
    4. Beregne antallet af mål forbindelser i prøver fra standardkurven ligning. Under den samme koncentration af det samme stof bestemmes den relative standardafvigelse (RSD) af seks assays på én dag som intradag-præcision. Gennemsnitlige værdier er vist i tabel 1.
    5. Vurdere den indbyrdes dag præcision (n = 6). På samme tid hver dag i de seks fortløbende dage, forberede spidse kunstige urinprøver for tre koncentrationer af 5, 50, 100 ng/mL, som i 5.4.1 og 5.4.2., og behandle hver analysand prøveopløsningen efter trin 3.
    6. Tilføre HPLC-ECD system at få kromatogrammet resultater hver dag den 20 µL af hver tilsvarende eluatet fra 5.4.5. Beregne antallet af mål forbindelser i prøver fra standardkurven ligning. Inter dag præcision er udtrykt af RSD af assays mængde fra de spidse kunstige urinprøver ved de tre koncentrationer i seks fortløbende dage. Gennemsnitlige værdier er vist i tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol er en enkel og praktisk PFSPE metode til at forbehandle urinprøver og berige fem katekolaminer for registrering via en HPLC-ECD system; et diagram af processen er vist i figur 1. Protokollen omfatter hovedsagelig fire trin-aktivering, lastning, skylning, og eluerer - kombineret med en lille mængde af PCE-PS nanofibers og en enkel solid-fase udvinding enhed. Morfologi af PCE-PS nanofibers blev vurderet ved hjælp af en overflade og porøsitet analyzer (Se Tabel af materialer). Den stoflige egenskaber-the BET (Brunauer, Emmett og Teller) overflade område, porevolumen og porestørrelse-var 2.8297 m2 g-1, 0,009 cm3 g-1og 12.76 nm, henholdsvis. Disse data viser, at det materiale, der anvendes i protokollen har nanoskala porer på overfladen, som kan bidrage til høje adsorptions effektiviteten og sænkede bindende pH i protokollen.

Denne protokol bruger optimeret diskenheder, prøve ingredienser, perkolat, eluant, etc., samt arbejde pH og tidsforbruget under procedurerne. I Chen et al., eluant var en 12,0 M eddikesyre fordi sure betingelser forårsage adsorbent til at blive protonated og ladede positivt, som er gunstig for eluering af CAs34,35. I denne undersøgelse, eluant opskrift blev istandsat for at være 30% fosforsyre, 15% acetonitril, og 55% destilleret vand. Den endelige pH værdi af eluant blev justeret til 3.0. Eluant af opløsningsmiddel bør holdes i et surt miljø når eluerer, men meget mere moderat end 12,0 M eddikesyre, som kan føre til dårlig peak udseende og skade til HPLC-systemet.

Til identifikation af katekolaminer sammenlignes kromatogrammet retentionstider af toppene i prøverne med standardopløsning toppe. Figur 2 viser eksempler på HPLC-ECD kromatogrammer fra de forskellige løsninger. Hvis protokollen følges korrekt, bør de chromatografiske profiler af tre katekolaminer og deres omdannelses opnås ved HPLC-ECD med klare symmetrisk, veldefineret toppe og med minimal baggrundsstøj, som illustreret i figur 2 . Til sammenligning med den konventionelle metode er blev en kommerciel PBA patron valgt som en kontrol. I figur 2(et-c), fem mål toppe i (b) er væsentlig højere end thaosein (c), der angiver, at metoden PFSPE er mere følsomme end metoden PBA patron. DOPAC top viste også, ikke i PBA patron udvinding resultat, der angiver, at kolonnen PBA ikke var i stand til at udvinde DOPAC. Figur 2 (d) skildrer kromatogrammet af den tomme urinprøve uden nogen forbehandling, og figur 2(e) viser kromatogrammer af urinprøven udvundet ved hjælp af PCE-PS sammensatte nanofibers. Figur 2 (f) viser kromatogrammer af urinprøven efter ekstraktion med kolonnen PBA, som også viser ingen DOPAC udvinding overensstemmelse med resultatet i figur 2(c). Diagrammet angiver, at metoden PFSPE ikke kunne kun udtrække mål med god virkning, men også kunne slippe af med de fleste af indblanding i urinen, giver god peak identifikation for target forbindelser.

Statistisk analyse viste, at målinger for de tre katekolaminer og de to metabolitter pålideligt gengivet (tabel 1). Alle mål forbindelser viste god linearitet mellem 1,5 og 100 ng/mL (R2> 0,99), og hver analysand standardkurven kan findes i tillægs figur 1. Kurver og R2 værdier viser, at analysander har god linearitet og relativitetsteori inden for en bestemt lineær interval egnet til beregning af koncentrationerne af analysander i urinprøver. Grænser detektionsgrænsen (LOD) varierede fra 0,25 til 0,54 ng/mL, og grænserne for kvantificering (LOQ) var 0,83 til 1,81 ng/mL, henholdsvis. Signal-støj (S/N) værdi tangerede 3. Rækken af de metodologiske inddrivelser af fem mål forbindelser var fra 97,4% (MHPG) til 124.2% (DOPAC), der var tilfredsstillende for ansøgning til de faktiske prøver. Den intra-dag præcision var fra 2,7 til 4.8% (udtrykt som Relativ standardafvigelse) og Inter dag præcision blev 2-8,1%, viser god nøjagtighed og repeterbarhed.

Til påvisning af mål i virkelige urinprøver, blev 28 højrisiko spædbørn og 22 sunde spædbørn i opdelingen af børnepasning, Suzhou municipal hospital, rekrutteret. Alle 50 spædbørn tages i studiet var drenge. Når de var seks måneder gammel, blev de taget til en rutinemæssig helbredsundersøgelse i September 2016. Alle urinprøver blev indsamlet og forbehandlet efter protokollen trin 3.1 og 3.2, og prøverne blev analyseret ved hjælp af den resterende del af trin 3. Koncentrationerne blev beregnet mod kalibreringskurverne. Statistiske forskelle blev analyseret af variansanalyse (ANOVA). Resultaterne kan ses i tabel 2. Forskel af katekolaminer og metabolitter mellem de to grupper blev sammenlignet og analyseret. P-værdierne viser at katekolaminer ikke var signifikant forskellig mellem høj risiko og sund grupper, mens metabolit MHPG indhold var forskellige på tværs af disse grupper (p = 0,001). Gruppen højrisiko spædbørn havde større mængder af MHPG end kontrolgruppen (14,8 ± 3.6 ng/mL vs 1,4 ± 0,2 ng/mL), hvilket betyder, at niveauet af urin MHPG kan være en potentiel markør til tidlig identifikation af højrisiko spædbørn.

Figur 3 og tabel 3 beskriver den klassiske kvantificering metode til bestemmelse af monoamin materialer, og sammenligne med andre metoder som operation proces og tal af interesse er givet. Sammenlignet med klassiske metoder, har PFSPE metode fordele som en kort tidshorisont (5-10 min), forenklede drift proces, mindre organisk opløsningsmiddel og mere miljøvenlig med tilfredsstillende metodologiske parametre. Eluant nødvendige beløb er lav i volumen (50 µL) og target berigelse trin kræver ingen fordampning, som stærkt fremmer påvisning følsomhed for target forbindelser i urinen. Sammenlignet med konventionelle partikel-baserede SPE, denne metode forbedret effektivitet, forenklet forberedelsesprocessen og reducerede tid af analysen med acceptabel pålidelighed, selektivitet og følsomhed.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk flow diagram af PFSPE procedure i papiret og en repræsentation af dets enhed. (1) Gastight sprøjte, (2) afpipetteres tip og (3) pakket nanofibers. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Kromatogrammer af forskellige prøver. (en) Spiked vandprøve med mål og IS i (100 ng/mL) uden udsugning. (b) Spiked vand stikprøven udvundet af den PFSPE metode, og (c) af kommercielle phenylboronic syre (PBA) patron. (d) reelle Tom urin prøve uden udsugning. (e) virkelige urin prøven ekstraheres ved metoden PFSPE. (f) virkelige urin prøve udvundet af kommercielle PBA patron. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Analytisk diagram af bestemmelse metoder. (a, b) Tidligere rapporteret klassiske udvindingsmetoder. (en) Origin aluminiumoxid, (b) af DPBA kompleks, og (c) af metoden, der foreslås i dette papir. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tillægs figur 1: Standard kurver og ligningerne. Standard kurver for de fem analysander er konstrueret for at beregne koncentrationen af ukendt analysander i prøven ved hjælp af ligningen for en linje. (en) NE, (b) E, (c) DA, (d) MHPG og (e) DOPAC. Venligst klik her for at downloade denne figur.

Tillægs figur 2: Boronate affinitet interaktion mellem boronic syre og cis-diol gruppe eller tilstødende to hydroxylgrupper. (A) skematisk af samspillet mellem boronic syrer og flere -OH grupper til form fem - eller seks-leddede Cycliske estere. (B) Cis-diol gruppe eller tilstødende to hydroxylgrupper i røde cirkler skildrer de store reaktion websteder for de fem analysander til boronic syre sammensatte. Venligst klik her for at downloade denne figur.

NE MHPG E ER DOPAC DA
Lineære område (ng/mL) 1.5-400 1,5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
R-kvadrerede værdier 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0.322 0,313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0,83 1.809
Recovery ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Præcision (RSD %) (n = 9)
Intra-dag 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Inter dag 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, noradrenalin; MHPG, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol; E, adrenalin; IS, intern standard; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic syre; DA, dopamin;

Tabel 1: Analyseresultater fra den foreslåede protokol til bestemmelse af tre katekolaminer og to metabolitter med standard løsninger.

Koncentration (ng mL-1) Kontrolgruppen (22) Høj risiko spædbarn gruppe (28) P-værdi
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0,001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0.312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0,05 *** viser en signifikant forskel mellem to grupper

Tabel 2: sammenligning af koncentrationer for tre katekolaminer og to metabolitter i urines mellem sunde spædbørn og højrisiko spædbørn. Resultaterne var statistisk analyseret ved hjælp af variansanalyse (ANOVA) med et signifikansniveau på p = 0,05 for forskelle mellem MHPG indhold. Middel ± standardafvigelser er vist.

Stikprøve Udmattet opløsningsmiddel (mL) Sample volumen (mL) Forbehandling tid (min) Lineære område LOD Relative opsving (%) Fordampe og
Inddampningsresten		 Analysemetode
opløsningsmiddel volumen tid (min) Recovery (%) opløsningsmiddel og
(mL) (mL) retablere
rest
Urin 0,5 0,05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0,2-0,5 ng/mL (NE, E, DA) 88.5-94,5 (NE, E, DA) Nej HPLC-ECD (Chen et al., 2016)
Urin 19 0,7 — 47 – 167 µg/L (DA) 166-500 nM (DA) 98.3-101,1 (DA) Nej HPLC-UV (Piotr et al., 2016)
Urin 1.3 0,01 — 0,5-1250 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0,5-2,5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74,1-97,3 (NE, E, DA, NMN, MN) Nej LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Urinen, og plasma 20 0,05 10 0,04-2.5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01-0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87.0-97,5 (NE, E, DA) Nej HPLC-UV (Mohammad et al., 2016)
Urin < 0.5 0,1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97,4-124.2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) Nej Dette arbejde
—, Udefineret.
PBA, Phenylboronic syre

Tabel 3: Sammenligning af dette arbejde med undersøgelser på forbehandling af monoaminer eller andre relaterede emner i de seneste år.

Supplerende tabel 1: Instrument parametre til påvisning og kvantificering af analysander i papir af HPLC-ECD. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: forberedelse af Standardkurven for fem analysander. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foreslåede PFSPE metode i dette papir kan være betydelige og meningsfuld for sin hurtighed, enkelhed og bekvemmelighed. Adsorbenter bruges i protokollen er electrospun nanofibers, som har høj overflade område-til-volumen forhold og adsorberes til analysander med høj effektivitet. Proceduren kun brug for et par milligram af nanofiber og en lille mængde af eluant opløsningsmiddel, og kræver ikke en fordampning skridt at koncentrere analysander. Her, har vi fremlagt en detaljeret oversigt over en HPLC-ECD baseret protokol, der vil tillade, at nye brugere til at etablere en effektiv metode til påvisning og kvantificering af tre katekolaminer og to af deres metabolitter (NE, E, DA, og MHPG, DOPAC).

Overlegenhed i denne protokol hovedsagelig stammer fra de fire afgørende trin under procedurerne, som vist i figur 1: ved hjælp af PCE-PS nanofibers for at fange mål forbindelser for at reducere størrelsen af sorptionsmiddel til et par milligram, fører til en hurtig adsorption / desorption, og kun kræver en lille mængde af eluerer væske (1); tilføjer DPBA i urinen Complex med analysander til at forbedre deres hydrophobicity (2); skylning af nanofibers med den løsning, der indeholder DPBA for at bevare analysander og fjerne urenheder (3); og optimering af betingelsen udvinding og analyse at få god følsomhed og selektivitet for analysander (4).

For trin (1), kan mekanismen af superior performance af adsorbent evne for PCE-PS tilskrives en række faktorer. Crown ether polymerer dopede i nanofibers kan danne en vært-gæst kompleks med de gæst molekyler, der indeholder amine grupper af H-bindinger, såsom katekolaminer i dette papir. Hertil kommer, Hongyou Hu et al. og Jishun Chen et al. også foreslået at boronic syre kan obligation med kvælstof atomer i kemiske struktur gennem B-N interaktioner, og at de hydrofobe skelet kan interagere med Benzenringe og andre alifatiske grupper af analysander36,37. Også undervejs desorption er brint obligationer og B-N interaktioner let i stykker ved meget lav pH; således er eluants med sure pH-værdi normalt velegnet til efterforskning desorption. Derudover er der også flere sekundære interaktioner, herunder hydrofobe, ionisk, og brint bonding, der kan opstå mellem boronic kemikalier og beslægtede forbindelser36,37,38. Alle disse interaktioner kan bidrage til adsorption af analysander på materialer.

For trin (2), ved hjælp af ekstra DPBA adsorberes PCE-PS nanofibers DPBA-catecholamin komplekser hurtigt. Zhen Liu et al. viste at boronate affinitet materialer er dukket op som et vigtigt medie til selektiv adskillelse og molekylær anerkendelse af organiske forbindelser, fx Nukleosider, saccharider, glycans, glykoproteiner, og så på38. Kompleks primært opstår fra boronate affinitet interaktion mellem boronic syre og cis-diol grupper eller to tilstødende hydroxylgrupper, til fem eller seks leddede Cycliske estere, som vist i supplerende figur 2A. Supplerende figur 2B skildrer de store reaktion websteder for de fem analysander i dette arbejde til den boronic syre sammensatte. Når omgivelserne bliver Sure, dissocieres boronic syre-cis-diol komplekset. Samspillet mellem boronic syre og cis-diol gruppe eller de tilstødende to hydroxylgrupper findes omfattende og relativt kraftigt.

For trin (3), komplekse dannet mellem analysander og DPBA kan holde dem på adsorbent mens andre urenheder skylles fra PCE-PS overflade, at opnå den bedste reservation for målene. For trin (4), er der en rapport, der viser, at den optimale pH var omkring 9,0 for limning af borsyre og catechol sammensatte39. Dog Chen mfl. udforskede den bedste pH værdi for kompleksbindende af katekolamin-DPBA og fundet at adsorptionen ydeevne af den sammensatte PS-PCE nanofibers til CAs var optimal, når pH-værdien blev ændret til at være mellem 6,0 og 7,034,35. Liu et al. impliceret, at strukturen i de understøttende materialer til boronate syre forbindelser, især med rumlig indeslutning af hulrum og nanoskala porer og B-N ligander dannet under reaktionen, kan også betydeligt lavere i bindende pH og forbedre bindende affinitet38. PCE-PS struktur samt catecholamin struktur er alle udstyrede med - NH-grupper. Således, den egenskaber og nanoskala porer af PCE-PS (data som vist i Repræsentative resultater), samt B-N ligander dannet, kan bidrage til sænket bindende pH i protokollen. Således, den optimale pH værdi i denne protokol kan være neutral, som højlig forenkler procedurerne og undgår nedbrydningen af analysander.

De vigtigste begrænsninger af catcholamine bestemmelse er at deres koncentrationer i biologiske prøver er meget lav, og at deres strukturer er ustabil (let oxideret); Derudover er det svært at slippe af urenheder i medierne. Således, for analyse af katekolamin i biologiske prøver, forbehandling, normalt ved ekstraktion, fast-fase, er nødvendige. Den PFSPE metode, der foreslås i dette dokument leveres en enkel og praktisk pre koncentration for analysander i urinprøver. Men når du gør forsøget, betingelsen eksperiment skal kontrolleres nøje, ved at undgå lys eksponering og afkortning forbehandling tid så meget som muligt.

Anvendelighed af metoden blev evalueret ved dets anvendelse for at fastslå koncentrationerne af tre katekolaminer og to metabolitter i urinen hos sunde spædbørn og højrisiko spædbørn. Der var en signifikant forskel mellem de to grupper i urin MHPG. Som opsummerede tidligere, rapporteres MHPG beløbet i den menneskelige krop nu primært som et indeks afspejler noradrenerge neuronal tone, katekolamin stofskifte aktivitet i de centrale og perifere nervesystem40,41, 42, og er en nyttig plasma/urin markør for centrale NE stofskifte43. For højrisiko spædbørn forårsager en lang række faktorer såsom hypoksiske iskæmisk encefalopati (HIE) hjerne traumer og hjernen fornærmelser, fører til forskellige grader af barndommen udviklingsforstyrrelser underskud. Denne hjerneskade vil igen føre til frigivelse af neurotransmittere (MHPG inkluderet) i kropsvæsker44,45. Ifølge rapporter fra J.W. Maas er der vigtige sammenhænge mellem hjerne, CSF, plasma og urin koncentrationer af MHPG46,47. Måling af total (gratis + konjugeret) MHPG i urinen har længe været anvendt til at vurdere metabolismen af centrale NE og perifere NE metabolisme i mennesker41,48,49. Det kan således konkluderes, at høj risiko spædbørn har noradrenerge neuronal tone skade sammenlignet med et sundhedstegn, der påvirker catecholamin metabolisme i centralt og perifere nervesystem. Denne uoverensstemmelse angiver, at yderligere forskning bør foretages på forholdet mellem de urin MHPG niveau og udviklingsforstyrrelser underskud. Det er blevet påvist, at den foreslåede metode kunne anvendes til bestemmelse af katekolamin tilstedeværelse i urin, med en lovende udsigter til brug i klinikken til at vurdere sygdomme relevante for disse neurotransmittere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne attesterer, at der er nogen interessekonflikt med nogen finansielle organisation med hensyn til det materiale, der omtales i denne artikel.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Science Foundation of China (No.81172720, nr. 81673230), sociale udvikling forskning Program af Jiangsu provinsen videnskab og teknologi afdeling (nr. BE2016741), videnskab & teknologi projekt af Kina General Administration for Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), åbne projektet Program af centrale laboratorium for barnets udvikling og læring videnskab af Undervisningsministeriet, Sydøst Universitet (CDLS-2016-04). Vi anerkender oprigtigt Yuan sang og Ping Liu, der hjalp os i prøver samling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Tags

Kemi sag 133 katekolaminer polymere krone electrospun nanofiber pakket fiber fast-fase udvinding (PFSPE) højtryks væskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) højrisiko spædbørn
En praktisk metode til udvinding og analyse med højtryks væskekromatografi catecholamin neurotransmittere og deres metabolitter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter