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Chemistry

Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Wir präsentieren eine bequeme Festphasen-Extraktion gekoppelt an Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischen Detektion (ECD) für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmittern und zwei ihrer Metaboliten im Urin von Säuglingen. Wir erkennen auch der Metabolit MHPG als potenzielle Biomarker für die Früherkennung von Schädigungen des Gehirns für Kleinkinder.

Abstract

Die Extraktion und Analyse von Katecholamin Neurotransmitter in biologischen Flüssigkeiten ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung der Funktion des Nervensystems und damit verbundenen Krankheiten, aber ihre genaue Messung ist nach wie vor eine Herausforderung. Viele Protokolle sind für die Messung der Neurotransmitter durch eine Vielzahl von Instrumenten, einschließlich Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) beschrieben worden. Allerdings gibt es Mängel, wie z. B. komplizierte Operation oder schwer zu erkennende mehrere Ziele, die nicht vermieden werden können, und derzeit die dominante Analysetechnik ist noch gepaart mit empfindlichen elektrochemische oder fluorimetrischen Erkennung durch HPLC seine hohe Empfindlichkeit und gute Selektivität. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Vorbehandlung und Erkennung von Katecholaminen mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit elektrochemischen Detektion (HPLC-ECD) in realen Urinproben von Säuglingen mit Electrospun zusammengesetzten Nanofasern komponierte beschrieben. Polymeren Krone Ether mit Polystyrol als Adsorbens auch bekannt als der Festphase verpackt-Faser-Extraktionsmethode (PFSPE). Wir zeigen, wie Urin, die Proben können leicht durch eine Nanofaser verpackt Festphase-Spalte, und wie die Analyten in der Probe schnell angereichert werden können, vorgereinigt werden desorbiert, und auf einem ECD-System erkannt. PFSPE vereinfacht die Vorbehandlung Verfahren für biologische Proben für verringerte Zeit, Kosten und die Verringerung des Verlustes der Ziele ermöglicht.

Insgesamt zeigt diese Arbeit eine einfache und bequeme Protokoll für die Festphasen-Extraktion, gekoppelt an ein HPLC-ECD-System für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmitter (Dopamin (DA), Noradrenalin (NE), Adrenalin (E)) und zwei ihre Stoffwechselprodukte (3-Methoxy-4-Hydroxyphenylglycol (MHPG) und 3,4-Dihydroxy-Phenylacetic Säure (DOPAC)) im Urin von Säuglingen. Das etablierte Protokoll wurde angewandt, um die Unterschiede der Harn Katecholamine und deren Metabolite zwischen risikoreichen Säuglinge mit perinatalen Hirnschäden und gesunden Kontrollpersonen zu beurteilen. Vergleichende Analyse ergab einen signifikanten Unterschied im Harn MHPG zwischen den beiden Gruppen, die darauf hinweist, dass die Katecholamin-Metaboliten ein wichtiger Kandidat Marker zur Früherkennung von Fällen für Hirnschäden bei Säuglingen gefährdet sein können.

Introduction

Katecholamin Neurotransmitter und deren Metaboliten Inhalte in Körperflüssigkeiten können neuronale Funktion beeinflussen und Auswirkungen auf das Gleichgewicht der Reaktion auf Anregung Staaten zu einem großen Teil1. Abnormities kann dazu führen, dass eine Vielzahl von Krankheiten, z. B. Ganglioneuroma, Pheochromacytoma, Neuroblastom und neurologischen Störungen1,2. Extraktion und Bestimmung der Katecholamine in Körperflüssigkeiten ist sinnvoll, die Diagnose der relevanten Krankheiten. Jedoch gibt es in geringen Konzentrationen Katecholamine in biologischen Proben und leicht oxidierbar. Darüber hinaus sind sie sehr schwierig, wegen der großen Menge der Einmischung in die mittleren3eluieren. Simultane Detektion von Katecholaminen in biologischen Flüssigkeiten ist somit nach wie vor eine Herausforderung.

Es wurden Bewertungen zeigen, dass Harn Katecholamine ein gewisses Maß an Stress sein können und ihre Ebenen sind wichtige biologische Marker reagieren auf taktile Stimulation, die Verarbeitung in Neugeborenen-5. Den Untersuchungen zufolge alle Kinder, die von der vorzeitigen Vorfälle litten sind mit einem Risiko für Gehirn Verletzungen4,5,6, und abnorme Freisetzung von Katecholaminen und damit zusammenhängende Fragen in den Flüssigkeiten kann zu Verletzungen führen. Es gibt erweiterte Magnet-Resonanz-Techniken, die Schädigung des Gehirns in früheren Phasen7,8erkennen können. Jedoch innerhalb der ersten 48 h verursacht ein abnorme Neurodevelopmental Prozess permanent-Hirn-Trauma, das zeigt sich in medizinische Bilder11wird nicht. Außerdem hohe Kosten und knappen Instrument Ressourcen, zusammen mit anderen Faktoren macht es unmöglich für alle Neugeborenen Einheiten Zugriff auf diese speziellen Neuro-Imaging-Techniken zu. Jedoch die Verwendung von eine leicht zugängliche und praktische Biomarker (z.B. Katecholamine und deren Metabolite) konnte diese Mängel überwinden, und die Vorführung eines Biomarkers in menschlichen Flüssigkeiten kann helfen bei der Früherkennung von Hirn-Trauma und führen zu veranlassen Kennung des Neugeborenen benötigen Neuroprotektion9. Die Katecholamine im Urin können ein einfach und klar Index durch die direkte Korrelation zwischen der Höhe der ihnen in Flüssigkeiten und Neuroactivity Funktion freigegeben sein.

Unter biologischen Flüssigkeiten, zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) und Plasma-Proben sind nicht leicht zu bekommen über bestehenden traumatische Verfahren, und es ist auch sehr schwer loszuwerden, Störungen durch Klebstoff Protein und andere Verunreinigungen, führt zu einer lästigen und zeitraubende Probenahme Prozess, für wiederholte Erkennung ungeeignet ist. Auch für Kinder ist es fast unmöglich, die Proben auf traumatische Weise zu bekommen. Harn Probenahme deshalb besser als die anderen Formen der Probenahme, wie es ist, nicht-invasive, einfach zu bedienen, und kann immer wieder durchgeführt werden. Urinproben sind reichlich vorhanden und leicht zu verstauen, und zeigen große Vorteile gegenüber anderen Formen der biologischen Proben.

Die wichtigsten Methoden zur Quantifizierung von Katecholaminen in biologischen Flüssigkeiten gehören Radioenzymic Assays10, Enzym-linked immun-sorbent Assays11, Voltammetrie12 und thermische Linse Spektrometrie13. Aber Mängel vorhanden sind, wie z. B. komplizierte Vorgänge und schwer zu erkennende mehrere Ziele. Heute ist die dominierende Analyseverfahren Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)14, gepaart mit sensiblen elektrochemische15 oder fluorimetrischen Erkennung16, wegen seiner hohen Empfindlichkeit und gute Selektivität. Mit Tandem-Massenspektrometrie Technologie, wie flüssige Chromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) und flüssige Chromatographie/Masse Spektrometrie/Massenspektrometrie (LC/MS/MS), die Analyse und Quantifizierung der Neurotransmitter erreichen hohe Genauigkeit und Spezifität17,18. Der MS-Technik erfordert jedoch teuer Instrumentierung sowie wesentlich qualifizierte Arbeitskräfte, erschwert die Methode allgemein in den meisten herkömmlichen Labors anzuwenden. HPLC-ECD-Systeme sind häufig in konventionellen und klinischen Laboratorien ausgestattet und haben somit eine gemeinsame und gute Wahl für Forschungsgruppen für chemische Bestimmung verwenden, aber sie erfordern die Probe eingeführt in das System sauber zu sein und der Microscale Volumen19. Daher ist es von großer Bedeutung, zu reinigen und die Probe vor der Analyse zu kondensieren. Die klassische Methode für den Reinigungsschritt ist flüssig-flüssig-Extraktion14,15,20 und off-line Festphasen-Extraktion, einschließlich aktivierte Tonerde Spalte21,22 und Diphenylborate (DPBA) Komplexierung23,24,25,26.

Myeongho Lee Et al. haben chemisch modifiziert mit Krone Äther als das Adsorbens Polymer-Harz verwendet, um selektiv Katecholamine aus menschlicher Urin seit 200727zu extrahieren. Auch in 2006 Haibo He Et Al. bewies eine einfache Synthese für Boronate Affinität Extraktion Sorbens Byutilizing ein functionalizable Nanomagnetische polyedrischen Oligomere Silsesquioxane (POSS) auf der Grundlage Nanomagnetische Composite und zur Bereicherung der Katecholamine in Anwendung menschlicher Urin (Noradrenalin, Adrenalin und Isoprenalin)28. Sie nutzte die Gelegenheit der Nanomaterialien, die Arbeit mit einer Technologie namens Nano-Elektrospinnen und bilden das Polymer Fasermaterial im Nanobereich zu erfüllen. Elektrospinnen Prozess kann der Durchmesser, die Morphologie und die räumliche Ausrichtung des Produktes anpassen, durch die Steuerung der Arbeitsspannung und Änderung des Inhalts der Spinnlösung zusammen mit anderen Parametern29. Im Vergleich mit der konventionellen SPE Patrone, Electrospun Nanofasern eignen sich hervorragend zu extrahieren und zu bereichern Ziel Analyten aus einer komplexen Matrix, da sie mit hoher Oberfläche-Bereich-zu-Volumen-Verhältnis ausgestattet sind, um die Analyten mit hohem Wirkungsgrad zu adsorbieren und weisen Sie mehr leicht kontrolliert Oberfläche chemische Eigenschaften auf, so dass praktische Befestigung der Ziel-Verbindungen. Diese Eigenschaften machen sie gute Möglichkeiten für SPE Adsorbentien, reduziert die feste Phase und Desorption Lösungsmittel Betrag30,31,32,33. Für Katecholamine in Urinproben wurden Electrospun Nanofasern bestehend aus Apolymeric Krone Äther mit Polystyrol (PCE-PS) verwendet, um gezielt drei Katecholamine ("NE", "E" und "DA")34extrahieren. Das Papier darauf hingewiesen, dass die selektive Krone Äther die Ziele von NE, E, und DA, basierend auf seine korrekte Geometrie zum Binden von Katecholaminen adsorbiert über Wasserstoffbrückenbindungen bilden. Die Ergebnisse angezeigt den materiellen Krone Äther effektiv entfernen andere störenden Verbindungen enthalten in biologischen Proben. Inspiriert von diesem Bericht, wurde eine neuartige Methode für den selektiven Abbau der Katecholamine durch Verwendung von Electrospun zusammengesetzte Nanofasern bestehend aus PCE-PS entwickelt

In diesem Papier berichtet die Methode bisher34 wurde verbessert und beschäftigt nicht nur um E, NE, und DA, sondern auch deren Metaboliten, MHPG und DOPAC, im Urin erfolgreich analysieren. Auch Möglichkeiten neue für den Mechanismus der Adsorption-Prozess. Die Methode zeigt befriedigende Extraktionseffizienz und Selektivität für die fünf Analyten, und die Methode wurde in der Analyse des Urins von risikoreichen Säuglinge mit perinatalen Hirnschäden und gesunden Kontrollen überprüft.

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Protocol

Einwilligung der Eltern war, und institutionelle Review Board Genehmigung wurde für die Studie. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Code of Ethics der World Medical Association (Declaration of Helsinki) für Experimente mit Menschen durchgeführt. Pflegende Angehörige von allen Teilnehmern zur Verfügung gestellt schriftliche Zustimmung für sein in die Studie aufgenommen. Ethikkommission Genehmigung von Zhongda Krankenhaus, affiliate mit Southeast University, wurde auch gewonnen.

1. Vorbereitung der Spalten und Lösungen für die Extraktion und Bestimmung der Katecholamine benötigt

  1. Bereiten Sie die PFSPE-Spalte. Unterteilen Sie 1-2 mg von PCE-PS Nanofasern in 5-6 Aliquote, und verwenden Sie einen feinen Stahldraht mit 0,5 mm Durchmesser zu, um sie ordentlich in das Ende einer Pipettenspitze mit einem Volumen von 200 µL komprimieren.
  2. Bereiten Sie die künstliche Urin durch Wägung 2,427 g Harnstoff, Harnsäure 0,034 g, 0,09 g Kreatinin, 0,297 g Trinatrium Citrat, 0,634 g Natrium-Chlorid, 0,45 g Kaliumchlorid, 0,161 g Ammoniumchlorid, 0,089 g Calciumchlorid-Dihydrat, 0,1 g Magnesiumsulfat Heptahydrat, 0,034 g Natriumbicarbonat 0,003 g Natrium Oxalat, 0,258 g Natriumsulfat, 0,1 g Natrium Dihydrogen Phosphat und 0,011 g Binatrium Wasserstoff Phosphat und lösen sich die oben genannten Chemikalien in 200 mL entionisiertem Wasser.
  3. Bereiten Sie 2 mg/mL Stammlösung der Diphenylborate (DPBA) Lösung durch 2 mg der Verbindung in 1 mL destilliertem Wasser auflösen. Speichern Sie die Lösung im Dunkeln bei 4 ° C.
  4. Analyten standard
    Hinweis: Die chemische Struktur und Eigenschaften von Katecholaminen sind instabil, und sie leicht zersetzen. Der Ausarbeitung der Normen muss sehr schnell sein und muss direkte Sonneneinstrahlung vermeiden.
    1. Wiegen Sie 1,0 mg NE, E, DA, MHPG, DOPAC und internen standard 3,4-Dihydroxybenzylamine Hydrobromide DHBA in separate 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Die DHBA-Lösung in Wasser bis 100 ng/mL vor Gebrauch zu verdünnen.
    2. Schwingen Sie den vorbereiteten Standards in der Dunkelheit mit hoher Geschwindigkeit, bis Analyten vollständig auflösen. Dies ist der primäre bestand; Lagerung bei-20 ° C bis zu mehreren Wochen.
    3. Bereiten Sie die sekundäre 1.000 ng/mL Analyten Bestände. NE, E, DA, DOPAC und MHPG 5 µL der einzelnen primären Analyten Aktien in 4.975 µL destilliertes Wasser in eine 5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C lagern. Diese Lösungen täglich frisch zubereiten. Für DHBA 5 µL des primären Lager in 4.995 µL destilliertes Wasser in eine 5 mL Zentrifugenröhrchen, und speichern Sie es im Dunkeln separat bei 4 ° C.
    4. Weitere Verdünnungen mit dem sekundären Analyten bestand erstelle ich eine Standardkurve machen (zB., ergänzende Tabelle 2). Lösungen im Dunkeln bei 4 ° C lagern und täglich frisch zubereiten.
    5. Testen Sie die optimale Spannung des ECD-Detektors mit standard Lager mit richtige Konzentration. Variieren Sie die Spannung um einen Wert zu ermitteln, wo die Analyten haben das beste Spitze aussehen.
  5. Laufmittel enthält 30 % Phosphorsäure, 15 % Acetonitril, vorbereiten und 55 % destilliertem Wasser. Verwenden Sie für 10 mL des Lösungsmittels Laufmittel 5,5 mL destilliertes Wasser zu, und fügen Sie 1,5 mL Acetonitril und 3 mL Phosphorsäure tropfenweise ins Wasser.

2. Vorbereitung des realen Urinproben und mobilen Phase

  1. Haben Sie Mütter, die den ersten Morgenurin ihre Säuglinge mit aseptischen Urin Cups sammeln. Übertragen Sie die Proben sofort in Polypropylenröhrchen und Label. Speichern Sie dann die Proben in einem Gefrierschrank-20 ° C.
  2. Wirbel und Zentrifuge Urin Proben bei 1.510 x g für 10 min bei Zimmer-Temperatur (RT) get rid of die meisten Partikel Störungen. Das Sediment zu verwerfen und die Überstände für weitere Experimente zu sammeln. Um effektiv Analyten zu extrahieren, gehen Sie zu PFSPE Vorbehandlung (Schritt 3) sofort nach dem Zentrifugieren.
  3. Vorbereiten der mobilen phase
    1. Bereiten Sie eine saubere Flasche, mindestens 1 L. Die Zusammensetzung der mobilen Phase ist im ergänzenden Tabelle1aufgeführt; für 1 L mobile Phase, Maßnahme 6,7242 g Zitronensäure, 93,06 mg Ethylen Diamin Tetra Acetic Acid (EDTA) Binatrium Salz, 7,02 g monometallic Natrium Orthophosphat, Hydrat 404,5 mg 1-Heptanesulfonic-saures Natriumsalz und 3,5 g Natrium in die Flasche. Fügen Sie 40 mL Acetonitril und destilliertes Wasser bis 1.000 mL. Schütteln Sie und vibrieren Sie Ultraschall für 15 min, bis die Angelegenheit in der Lösung alle aufgelöst ist.
    2. Mit dem pH-Meter mit einer Glaselektrode, der mobilen Phase auf 4.21 mit einer gesättigten Natriumhydroxid-Lösung einen pH-Wert einstellen.
    3. Filtern Sie die mobile Phase mit einer 0,45 µm Polyvinylidene Fluorid mikroporösen Membran und eine Vakuumsauganlage get rid of Verunreinigungen.
    4. Verwenden Sie Ultraschallschwingungen für 15 min zu entgasen die mobile Phase jedes Mal vor dem Gebrauch.

3. PFSPE-Extraktion und HPLC-Analytik

  1. Die Nanofasern zu aktivieren. Drücken Sie 100 µL von Methanol und 100 µL Wasser nacheinander durch die PFSPE-Spalte mit einer 5 mL Spritze langsam und tropfenweise.
  2. Mix 100 µL Urin Probe mit 100 µL 2 mg/ml DPBA Lösung und 30 µL 100 ng/ml DHBA-Lösung (IS, interner Standard) in einem Rohr 0,5 mL EP, dann übertragen die gemischte Lösung auf die PFSPE-Spalte. Drücken Sie die Mischprobe Lösung durch die PFSPE-Spalte mit einer gasdichten Plastik Spritze 5 mL mit der Kraft des Luftdrucks.
  3. Auslaugen der Spalte dreimal 100 µL der DPBA Lösung (2 mg/mL) in der SPE-Spalte geladen, und drücken Sie die Lösung langsam durch die Patrone mit Luftdruck mit einer gasdichten Kunststoff 5 mL-Spritze.
  4. Laden Sie 50 µL Fließmittel auf der PFSPE-Spalte, und schieben Sie es durch die Spalte, das Eluat mit einem Schlauch 0,5 mL EP sammeln.
  5. Schalten Sie die HLPC Degasser zu entgasen die Luft im System. Vor der Analyseergebnisse läuft das System länger als 0,5 h mit der mobilen Phase zu equilibrate und Grundlinie Bildrauschen zu reduzieren. Siehe zusätzliche Tabelle1 zeigt die Setup-Parameter von der HPLC-Anlage.
  6. Probieren Sie 20 µL das Eluat mit ein automatischer Probenehmer und dann in das HPLC-ECD-System zu injizieren.
  7. Wenn die Läufe abgeschlossen sind, schalten Sie die Detektorzelle mit dem Detektor-Schnittstelle. Schalten Sie die Zelle mit dem Schalter auf der Rückseite der Detektor nicht da das Gerät dadurch beschädigt werden könnte.
  8. Ändern Sie manuell die Zusammensetzung der mobilen Phase in 10 % Methanol und 90 % Wasser. Für mindestens 30 Minuten laufen. Ändern Sie dann manuell die mobile Phase in Methanol HPLC-Klasse. Führen Sie für ca. 15 min zum Schutz des Systems in Methanol. Führen Sie diesen Schritt nach der empfohlenen Laufzeit kann zu Schäden an der Spalte und der Detektor Nichtbeachtung. Schalten Sie den Fluss, dann schalten Sie die Degasser.

(4) Phenylboronic Säure Patronen (PBA) Extraktion

PBA Patrone Extraktionsverfahren waren ähnlich wie die Regelung in Kumar Et Al. (2011) 25. alle Lösungen mit Luftkühlung mittels einer Spritze durch die PBA-Patrone (100 mg, 1 mL) geschoben.

  1. Zustand der Patrone mit 1 mL 80: 20 Acetonitril-Wasser (V/V) mit 1 % Ameisensäure und 1 mL 50 mM Phosphatpuffer (pH 10) gegenüber dem Vorquartal.
  2. Drücken Sie die gepufferten Urinprobe (1 mL Urin und 2 mL Phosphatpuffer, pH 8,5) durch die PBA-Patrone.
  3. Waschen Sie die Patrone mit 1 mL 50: 50 V/V Acetonitril-Phosphat-Puffer (10 mM, pH 8,5).
  4. Eluieren Sie die Patrone mit 1 mL Acetonitril-Wasser (80: 20 V/V) mit 1 % Ameisensäure.

5. Identifizierung und Quantifizierung der Katecholamine

  1. Linearität
    1. Verdünnen Sie die sekundäre Analyten Aktie mit künstlichem Urin zu sechs Konzentrationen (1,5, 3, 12, 25, 50 und 100 ng/mL); die Verdünnung Volumen von künstlichem Urin folgt ergänzenden Tabelle 2. Bilden Sie drei parallele Proben mit jeder Konzentration, 18 Analyten experimentelle Lösungen für den Bau von Kalibrierkurven.
    2. DHBA sekundäre Lager mit künstlichem Urin 10-fach um 100 ng/mL experimentelle Lösung zu verdünnen.
    3. Die Analyt-Lösungen von 5.1.1, nach Schritt 3 (PFSPE Extraktionsverfahren) vorbehandeln. Wie in Schritt 3 20 µL jeder entsprechenden Eluat in das HPLC-ECD-System eine HPLC-Chromatogramm zu injizieren.
    4. Kalibrierkurven der fünf Analyten durch Plotten das Verhältnis der Peakfläche (Ziele/IS) als die y-Achse gegen das Verhältnis der Konzentrationen zu konstruieren (Ziele/IS) als der X-Achse, wie in ergänzende Abbildung1dargestellt.
  2. LOD und LOQ Wert für die Empfindlichkeit
    1. Injizieren Sie 20 µL leer künstliche Urin in das HPLC-ECD-System (siehe Schritt 3), um die HPLC-Chromatogramm der Probe zu erhalten.
    2. Das Chromatogramm von 5.2.1 sammeln Sie 11 leer Signalwerte und berechnen Sie den Mittelwert Xb und Standardabweichung Sb. Berechnen Sie das minimale Signal einer Substanz, die auf ein gewisses Maß an Vertrauen, XL, erkannt werden können als XL = Xb+ K * Sb (K ist der Koeffizient von Konfidenzniveau bestimmt, Sb spiegelt Geräuschpegel von der Messmethode und der Geräuschpegel der Maschine). So, LOD = (X-L-X-b) / s = (K * Sb) / s (S steht für den Wert der Steigung der Kurve arbeiten).
    3. Definieren Sie ein S/N von 3:1 (K = 3) als der Nachweisgrenze (LOD) und eine S/N von 10:1 (K = 10) als die Grenze der Quantifizierung (LOQ).
  3. Die Rückforderungen zu bewerten
    1. Real und Spike Urinproben vorbereiten. Verdünnen Sie die sekundäre Analyten Aktie mit echten Urin drei Konzentrationen (5, 50, 100 ng/mL) um den Spike Urinproben zu erhalten. Drei parallele Proben für jeden Analyten Lösung vorbereiten. Zählen Sie die Spike Konzentration als die Menge der Ziel-Verbindungen in die Urinprobe gespickt. Definieren Sie diesen Wert als eines.
    2. Verdünnen Sie DHBA Lager bis 100 ng/mL, wie in Schritt 5.1.2.
    3. Verarbeiten Sie jede Probenlösung von 5.3.1 nach Schritt 3 (PFSPE Extraktionsverfahren) zu und injizieren Sie die 20 µL jedes entsprechende Fließmittel in das HPLC-ECD-System das Chromatogramm Resultat zu erzielen. Der Wert des Analyten wird als Menge von Ziel-Verbindungen in der Spike Urinprobe quantifiziert gezählt werden. Definieren Sie diesen Wert als eint.
    4. Injizieren Sie 20 µL Urin Probe in das HPLC-ECD (wie in Schritt 3) System das Chromatogramm Resultat zu erzielen. Der Wert des Analyten wird als eine Ausgangsmenge Ziel Verbindungen im Urin quantifiziert gezählt. Definieren Sie diesen Wert als einich.
    5. Berechnen Sie die Menge der Ziel-Verbindungen in den Proben aus der Standardkurve Gleichung. Die Prozentsatz Erholung wird als methodische Verwertung % geschätzt (A-t - Aich) = × 100 / (s). Mittelwerte sind in Tabelle 1dargestellt.
  4. Die Ungenauigkeit zu bewerten
    1. Spike künstliche Urinproben zu 5, 50 und 100 ng/mL Konzentrationen wie in Schritt 5.3.1 vorzubereiten. Sechs parallele Proben für jeden Analyten Lösung vorbereiten. Jeden Tag frische experimentellen Proben vorbereiten.
    2. DHBA Lager, wie in Schritt 5.1.2 100 ng/mL zu verdünnen.
    3. Die Intraday-Genauigkeit bewerten (n = 6). Jede Probenlösung in 5.4.1 nach Schritt 3 verarbeiten und 20 µL jeder Korrespondent Laufmittel in der HPLC-ECD-System das Chromatogramm zu injizieren. Den gleichen Vorgang sechs Mal an einem Tag zu tun.
    4. Berechnen Sie die Menge der Ziel-Verbindungen in den Proben aus der Standardkurve Gleichung. Unter der gleichen Konzentration von der gleichen Verbindung wird die relative Standardabweichung (RSD) sechs Tests an einem Tag als Intraday-Präzision bestimmt. Mittelwerte sind in Tabelle 1dargestellt.
    5. Die Inter Tage Genauigkeit bewerten (n = 6). Zur gleichen Zeit jeden Tag in den sechs sequenziellen Tagen bereiten Spike künstliche Urinproben für drei Konzentrationen von 5, 50, 100 ng/mL, wie in 5.4.1 und 5.4.2., und jeden Analyten Beispiellösung nach Schritt 3 zu verarbeiten.
    6. Die 20 µL jeder entsprechenden Eluat von 5.4.5 in das HPLC-ECD-System Chromatogramm Resultat jeden Tag zu injizieren. Berechnen Sie die Menge der Ziel-Verbindungen in den Proben aus der Standardkurve Gleichung. Inter Tag Präzision wird durch die RSD der Assays Menge von Spike künstliche Urinproben bei den drei Konzentrationen in sechs sequenziellen Tagen ausgedrückt. Mittelwerte sind in Tabelle 1dargestellt.

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Representative Results

Dieses Protokoll ist eine einfache und bequeme PFSPE Methode zum Vorbehandeln Urinproben und bereichern fünf Katecholamine zur Erkennung über ein HPLC-ECD-System; eine Abbildung des Prozesses ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll enthält hauptsächlich vier Schritte aktivieren, laden, spülen, und eluting - gepaart mit einer kleinen Menge von PCE-PS Nanofasern und einem einfachen Festphasen-Extraktion-Gerät. Die Morphologie der PCE-PS Nanofasern wurde anhand einen Oberfläche und Porosität Analyzer (siehe Tabelle der Materialien). Die strukturelle Eigenschaften der Wette (Brunauer, Emmett und Teller) Oberflächen-Bereich, Porenvolumen und Porengröße-waren 2,8297 m2 g-1, 0,009 cm3 g-1und 12.76 nm, beziehungsweise. Diese Daten deuten darauf hin, dass das Material in das Protokoll verwendet nanoskalige Poren auf der Oberfläche, was möglicherweise zu hohe Adsorption-Effizienz und der abgesenkten Bindung pH-Wert im Protokoll.

Dieses Protokoll verwendet Probe Zutaten, Sickerwasser, Fließmittel, optimierte Bände, etc., sowie Arbeiten pH und Zeitaufwand im Verlauf der Verfahren. Das Laufmittel in Chen Et Al.war eine 12,0 M Essigsäure Lösung, weil saure Bedingungen dazu führen, dass das Adsorbens protonierten zu werden und positiv geladen, das ist günstig für die Elution von CAs34,35. In dieser Studie das Laufmittel Rezept wurde um 30 % Phosphorsäure, 15 % Acetonitril, revidiert und 55 % destilliertem Wasser. Der endgültige pH-Wert Laufmittel wurde 3.0 angepasst. Das Laufmittel Lösungsmittel sollten in einer sauren Umgebung wenn eluierenden, aber viel mehr Mittel als 12,0 M Essigsäure, die möglicherweise führen zu schlechten Spitze aussehen und Beschädigung der HPLC-Anlage gehalten werden.

Für die Identifikation der Katecholamine werden Chromatogramm Retentionszeiten der Gipfel in den Proben mit Standardlösung Gipfeln verglichen. Abbildung 2 zeigt Beispiele für HPLC-ECD Chromatogramme aus den verschiedenen Lösungen. Wenn das Protokoll erfolgreich gefolgt ist, die chromatographische Profile der drei Katecholamine und deren Metabolite durch HPLC-ECD mit klaren symmetrischen, gut definierten Gipfeln und mit minimalen Hintergrundgeräuschen, erhalten Sie wie in Abbildung 2 . Für den Vergleich mit der konventionellen Methode wurde eine kommerzielle PBA-Patrone als Steuerelement ausgewählt. In Abbildung 2(ein–c), fünf Ziel Gipfeln in (b) sind deutlich höher als Thaosein (c), darauf hinweist, dass die PFSPE-Methode empfindlicher als die PBA-Patrone-Methode ist. Außerdem zeigte DOPAC Gipfel nicht in das PBA Patrone Extraktion Ergebnis, darauf hinweist, dass die PBA-Spalte nicht in der Lage, DOPAC zu extrahieren. Abbildung 2 (d) zeigt das Chromatogramm der leere Urinprobe ohne jede Vorbehandlung und Abbildung 2(e) zeigt die Chromatogramme der Urinprobe mit PCE-PS zusammengesetzte Nanofasern extrahiert. Abbildung 2 (f) zeigt die Chromatogramme der Urinprobe nach der Extraktion mit der PBA-Spalte, die in Abbildung 2(c) auch keine DOPAC Extraktion konsistent mit dem Ergebnis zeigt. Das Diagramm zeigt, dass die PFSPE-Methode konnte nicht nur die Ziele mit gutem Effekt extrahieren, aber auch der Großteil der Störungen im Urin, geben gute Spitze Identifikation für die Ziel-Verbindungen befreien könnte.

Statistische Analyse ergab, dass Messungen für die drei Katecholamine und die beiden Metaboliten zuverlässig reproduziert (Tabelle 1). Das Ziel Verbindungen zeigten gute Linearität zwischen 1,5 und 100 ng/mL (R2> 0,99), und Standardkurve für jeden Analyten finden Sie ergänzende Abbildung 1. Die Kurven und R-2 -Werte zeigen, dass die Analyten gute Linearität und Relativitätstheorie in einem bestimmten linearen Bereich, geeignet für die Berechnung der Konzentration des Analyten in Urinproben. Der Nachweisgrenze (LOD) reichten von 0,25 bis 0,54 ng/mL, und die Grenzen der Quantifizierung (LOQ) waren 0,83 bis 1,81 ng/mL, beziehungsweise. Der Signal-Rausch-(S/N) Wert erreicht 3. Das Leistungsspektrum der methodischen Rückforderungen der fünf Ziel Verbindungen war von 97,4 % (MHPG) auf 124,2 % (DOPAC), zufrieden stellend für die Anwendung auf die eigentlichen Proben. Die Intraday-Präzision war von 2,7 bis 4,8 % (ausgedrückt als relative Standardabweichung) und die Inter Tage Präzision war 2-8,1 %, Anzeige, gute Präzision und Wiederholgenauigkeit.

Für die Erkennung von Zielen in realen Urinproben wurden 28 mit hohem Risiko Säuglinge und 22 gesunden Säuglingen im Bereich der Kinderbetreuung, Suzhou Städtisches Krankenhaus, rekrutiert. Jungs waren alle 50 Kinder in die Studie aufgenommen. Wenn sie sechs Monate alt waren, wurden sie zu einer routinemäßigen Gesundheits-Check im September 2016. Die Urinproben wurden gesammelt und nach dem Protokoll Schritte 3.1 und 3.2 vorbehandelt, und die Proben wurden mit dem Rest von Schritt 3 analysiert. Die Konzentrationen wurden gegen die Kalibrierkurven berechnet. Statistische Unterschiede wurden durch Varianzanalyse (ANOVA) ausgewertet. In Tabelle 2sind die Ergebnisse zu sehen. Die Differenz der Katecholamine und Metabolite zwischen den beiden Gruppen wurden verglichen und analysiert. Die p-Werte zeigen, dass die Katecholamine nicht signifikant unterschiedlich hohes Risiko und gesunde Gruppen wurden während der Metabolit MHPG Inhalte über diese Gruppen verschiedene war (p = 0,001). Die Gruppe mit hohem Risiko Säuglinge hatte höhere Mengen an MHPG als die Kontrollgruppe (14,8 ± 3,6 ng/mL vs. 1,4 ± 0,2 ng/mL), was bedeutet, dass das Niveau der urinausscheidenden MHPG ein potenzieller Marker zur frühzeitigen Erkennung von risikoreichen Säuglinge werden kann.

Abbildung 3 und Tabelle 3 beschreiben die klassische Quantifizierungsmethode zur Bestimmung Monoamin-Materialien, und vergleichen Sie mit anderen Methoden für die Bedienung und Figuren von Interesse gegeben sind. Verglichen mit klassischen Methoden, hat PFSPE Methode Vorteile, wie eine kurze Zeitspanne (ca. 5-10 min), vereinfachte Bedienung, weniger organische Lösungsmittel und mehr Umweltfreundlichkeit mit zufriedenstellenden methodischen Parameter. Die benötigte Menge Fließmittel ist leise (50 µL) und Bereicherung Zielschritt erfordert keine Verdunstung, die stark die Nachweisempfindlichkeit für die Ziel-Verbindungen im Urin fördert. Im Vergleich zu herkömmlichen partikelbasierte SPE, diese Methode verbessert die Effizienz, vereinfacht den Vorbereitungsprozess und verringert die Zeit der Analyse mit akzeptablen Zuverlässigkeit, Selektivität und Empfindlichkeit.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Flussdiagramm des PFSPE Verfahrens in das Papier und eine Darstellung seines Geräts. (1) Gastight Spritze, (2) Pipette Tipp und Nanofasern (3) verpackt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Chromatogramme verschiedener Proben. (ein) Spiked Wasserprobe mit Zielen und IS im (100 ng/mL) ohne Extraktion. (b) Spiked Wasser-Probe extrahiert, indem die PFSPE-Methode, und (c) durch kommerzielle Phenylboronic Säure (PBA) Patrone. (d) wirklich leer Urin Probe ohne Extraktion. (e) echte Urin Probe extrahiert von der PFSPE-Methode. (f) echte Urin Probe durch kommerzielle PBA Patrone extrahiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Analytische Bestimmungsmethoden Flussdiagramm. (a, b) Zuvor berichtete klassische Extraktionsmethoden. (ein) Gewinnung von Aluminiumoxid, (b) durch komplexe, DPBA und (c) die Methode vorgeschlagen, in diesem Papier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung1: Standardkurven und Gleichungen. Standardkurven für fünf Analyten sind gebaut, um die Gleichung der geraden zu verwenden, um die unbekannten Analyten-Konzentration in der Probe zu berechnen. (ein) NE, (b) E (c) DA, (d) MHPG und (e) DOPAC. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

Ergänzende Abbildung2: Boronate Affinität Interaktion zwischen boronic Säure und Cis-Diol Gruppe oder angrenzenden zwei Hydroxylgruppen. (A) schematische Darstellung der Interaktion zwischen boronic Säuren und mehrere -OH-Gruppen zu fünf oder sechs-gliedriger zyklische Ester Form. (B) Cis-Diol Gruppe oder angrenzenden zwei Hydroxylgruppen im roten Kreis zeigen die Hauptreaktion Standorte für die fünf Analyten zu zusammengesetzten boronic Säure. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

NE MHPG E IST DOPAC DA
Linearen Bereich (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1,5-100 1,5-100 1.5-400
R-squared-Werte 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0.322 0.313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0,83 1.809
Erholung ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Präzision (RSD %) (n = 9)
Intraday- 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Inter-Tag 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, Noradrenalin; MHPG, 3-Methoxy-4-Hydroxyphenylglycol; E, Adrenalin; IS, interner Standard; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic Säure; DA Dopamin;

Tabelle 1: Analyseergebnisse des vorgeschlagenen Protokolls zur Bestimmung der drei Katecholamine und zwei Metaboliten mit standard-Lösungen.

Konzentration (ng mL-1) Kontrollgruppe (22) Hohen Risiko-Kleinkind-Gruppe (28) P-Wert
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0,001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0.312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0,05 *** zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen beiden Gruppen

Tabelle 2: Vergleich der Konzentrationen für drei Katecholamine und zwei Metaboliten in Urinproben zwischen gesunden Säuglingen und risikoreiche Kleinkinder. Die Ergebnisse wurden statistisch analysiert mit Varianzanalyse (ANOVA) mit einem Signifikanzniveau von p = 0,05 für Unterschiede zwischen MHPG Inhalt. Mittel ± Standardabweichung werden angezeigt.

Probe Erschöpft Lösungsmittel (mL) Volumen (mL) Vorbehandlung Zeit (min) Linearen Bereich LOD Relativen Erholung (%) Verdunsten und
redissolve		 Analytische Methode
Lösungsmittel Volumen Zeit (min) Verwertung (%) Lösungsmittel und
(mL) (mL) Neuaufbau
Rückstände
Urin 0,5 0.05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0,2-0,5 ng/mL (NE, E, DA) 88,5-94,5 (NE, E, DA) Nein HPLC-ECD (Chen Et Al., 2016)
Urin 19 0,7 — 47 – 167 µg/L (DA) 166-500 nM (DA) 98,3-101,1 (DA) Nein HPLC-UV (Piotr Et Al., 2016)
Urin 1.3 0,01 — 0,5 – 1250 ng/mL (NE, E, DA NMN, MN) 0,5-2,5 ng/mL (NE, E, DA NMN, MN) 74,1-97,3 (NE, E, DA NMN, MN) Nein LC-MS/MS (Li Et Al., 2016)
Urin und plasma 20 0.05 10 0,04 bis 2,5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01-0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87,0-97,5 (NE, E, DA) Nein HPLC-UV (Mohammad Et Al., 2016)
Urin < 0,5 0.1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97,4-124,2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) Nein Diese Arbeit
—, Nicht definiert.
PBA, Phenylboronic Säure

Tabelle 3: Vergleich dieses Werkes mit Studien zur Vorbehandlung der Monoamine oder andere Verwandte Themen in den letzten Jahren.

Ergänzende Tabelle1: Parameter für die Erkennung und Quantifizierung von Analyten in der Zeitung durch HPLC-ECD instrumentieren. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Vorbereitung der Standardkurve für fünf Analyten. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Die vorgeschlagene PFSPE-Methode in diesem Artikel möglicherweise erhebliche und aussagekräftig in Bezug auf seine Schnelligkeit, Einfachheit und Bequemlichkeit. Die Adsorbentien im Protokoll verwendet werden Electrospun Nanofasern, die hohe Oberfläche Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und der Analyten mit hohem Wirkungsgrad zu adsorbieren. Die Prozedur nur braucht ein paar Milligramm Nanofaser und ein kleines Volumen des Lösungsmittels Fließmittel und erfordert keinen Verdunstung Schritt Analyten zu konzentrieren. Hier haben wir eine detaillierte Übersicht über ein HPLC-ECD-basierten Protokoll, die erlauben neue Benutzer herstellen eine effektive Methode zur Erkennung und Quantifizierung von drei Katecholamine und zwei ihrer Metaboliten (NE, E, DA, und MHPG, DOPAC) präsentiert.

Die Überlegenheit dieses Protokolls vor allem ergibt sich aus den vier wichtige Schritte im Verlauf der Verfahren, wie in Abbildung 1dargestellt: mit PCE-PS Nanofasern zu die Ziel-Verbindungen zum Reduzieren der Größe des Sorbens auf wenige Milligramm, führt zu einer raschen Adsorption erfassen / Desorption und benötigen nur eine kleine Menge eluierenden Fluids (1); Hinzufügen von DPBA in den Urin bis hin zu komplexen mit dem Analyten zur Verbesserung ihrer Hydrophobie (2); spülen die Nanofasern mit der Lösung mit DPBA um den Analyten zu behalten und Entfernen der Verunreinigungen (3); und Optimierung der Extraktion und Analyse Bedingung, gute Empfindlichkeit und Selektivität für den Analyten (4) zu erhalten.

Für Schritt (1) kann der Mechanismus der überragende Leistung des Adsorbens Fähigkeit für PCE-PS zu einer Vielzahl von Faktoren zurückzuführen. Die Krone Äther Polymere in der Nanofasern dotierten können einen Wirt-Gast-Komplex mit den Gast-Molekülen mit Amin Gruppen durch H-Bindungen, wie z. B. der Katecholamine in diesem Papier bilden. Darüber hinaus Hongyou Hu Et Al. und Jishun Chen Et al. auch vorgeschlagen, dass boronic Säure binden kann mit Stickstoffatome in der chemischen Struktur durch B-N-Interaktionen und die hydrophobe Skelett mit Benzolringe und anderen aliphatischen Gruppen von Analyten36,37interagieren kann. Auch sind bei der Desorption der Wasserstoffbrücken und B-N Interaktionen brechen leicht bei sehr niedrigen pH; Damit eignen sich Eluants mit sauren pH-Wert in der Regel für die Exploration für Desorption. Darüber hinaus gibt es auch mehrere sekundäre Wechselwirkungen, einschließlich hydrophobe, ionische und Wasserstoffbindung, die zwischen boronic Chemikalien und verwandte Verbindungen36,37,38auftreten können. Diese Interaktionen können die Adsorption der Analyten zu den Materialien beitragen.

Für Schritt (2), mit Hilfe der zusätzlichen DPBA adsorbieren PCE-PS Nanofasern schnell DPBA-Katecholamin-komplexe. Zhen Liu Et Al. zeigten, dass die Boronate Affinität Materialien entstanden als wichtiges Medium für die selektive Trennung und molekulare Erkennung von organischen Verbindungen, wie z. B. Nukleoside, Saccharide, Glykoproteinen, Glykoproteine, und so weiter38. Die Komplexierung tritt vor allem aus der Boronate Affinität Interaktion zwischen boronic Säure und Cis-Diol Gruppen oder zwei benachbarten Hydroxylgruppen, Form fünf oder sechs gliedriger zyklische Ester, wie in gezeigt ergänzende Abbildung 2A. Zusätzliche Abbildung 2 b zeigt die Hauptreaktion Standorte für die fünf Analyten in dieser Arbeit auf die boronic Säure Verbindung. Wenn die Umgebung sauer werden, distanziert sich der boronic Säure-Cis-Diol-Komplex. Die Interaktion zwischen boronic Säure und die Cis-Diol-Gruppe oder die angrenzenden zwei Hydroxylgruppen vorhanden ist intensiv und relativ stark.

Für Schritt (3) der Komplex zwischen Analyten gebildet und DPBA kann halten, auf das Adsorbens während andere Verunreinigungen von der Oberfläche PCE-PS gespült sind die besten Reservierung für die Ziele zu erreichen. Für Schritt (4) gab es einen Bericht mit, dass der optimale pH-Wert ca. 9,0 für die Verklebung von Borsäure und Brenzcatechins zusammengesetzte39war. Doch Chen Et Al. die besten pH-Wert für die Komplexbildner Katecholamin-DPBA untersucht und festgestellt, dass die Adsorption Leistung der zusammengesetzten PS-PCE-Nanofasern für die CAs optimal war, wenn der pH-Wert zwischen 6,0 und 7,034,35geändert wurde. Liu Et Al. impliziert, dass die Struktur der unterstützenden Materialien für Boronate sauren Verbindungen, vor allem mit räumliche Beengtheit der Hohlräume und nanoskalige Poren und die B-N-Liganden gebildet während der Reaktion auch deutlich senken kann die verbindliche pH-Wert und verbindliche Affinität38zu verbessern. Die PCE-PS-Struktur als auch die Katecholamin-Struktur sind alle ausgestattet mit: NH-Gruppen. So können die Eigenschaften und nanoskalige Poren der PCE-PS (Daten siehe Vertreter Ergebnisse), sowie B-N-Liganden gebildet, auf der abgesenkten Bindung pH im Protokoll beitragen. So kann der optimale pH-Wert in diesem Protokoll neutral, sein, die stark vereinfacht die Verfahren und verhindert den Abbau des Analyten.

Die wichtigsten Einschränkungen der Catcholamine Bestimmung sind, dass ihre Konzentrationen in biologischen Proben sehr niedrig sind und ihre Strukturen instabil sind (leicht oxidierbar); Darüber hinaus ist es schwierig, loszuwerden, die Verunreinigungen in den Medien. So ist für die Analyse von Katecholamin in biologischen Proben, Vorbehandlung, in der Regel durch Festphasen-Extraktion, notwendig. In diesem Papier vorgeschlagene PFSPE Methode zur Verfügung, eine einfache und bequeme Vorkonzentrierung für den Analyten in den Urinproben. Aber dabei das Experiment, Experiment Bedingung muss streng kontrolliert werden, mit Mitteln wie Vermeidung von Belichtung und Verkürzung der Vorbehandlung Zeit so weit wie möglich.

Die Anwendbarkeit der Methode wurde durch seine Verwendung zu bestimmen, die Konzentrationen von drei Katecholamine und zwei Metaboliten im Urin von gesunden Säuglingen und risikoreiche Kleinkinder bewertet. Es gab ein signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen im Harn MHPG. Wie zuvor zusammengefasst, wird der MHPG Betrag in den menschlichen Körper jetzt hauptsächlich als Index berichtet, noradrenergen neuronalen Ton, Katecholamin-Stoffwechselaktivität im zentralen und peripheren Nervensystem40,41zu reflektieren, 42, und ist ein nützliches Plasma/Urin-Marker für zentrale NE Stoffwechsel43. Für risikoreiche Säuglinge verursacht eine Vielzahl von Faktoren wie hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie (HIE) Gehirn Trauma und Gehirn Beleidigungen, in unterschiedlichem Ausmaß der Kindheit Neurodevelopmental Defizit führt. Diese Schädigung des Gehirns führt wiederum zur Freisetzung von Neurotransmittern (MHPG im Lieferumfang enthalten) in Körperflüssigkeiten44,45. Nach den Berichten von j. W. Maas gibt es signifikante Korrelationen zwischen dem Gehirn, CSF, Plasma und Urin Konzentrationen von MHPG46,47. Die Messung der Gesamt (frei + konjugierte) MHPG im Urin wurde lange zur Bewertung der Stoffwechsel des zentralen NE und periphere NE Stoffwechsel im Menschen41,48,49. Somit kann geschlossen werden, dass hohes Risiko Säuglinge noradrenergen neuronalen Ton Schaden im Vergleich zu gesunden, haben die Katecholamin-Stoffwechsel im zentralen und peripheren Nervensystems. Diese Diskrepanz weist darauf hin, dass weiterer Forschung über die Beziehung zwischen der urinausscheidenden MHPG Ebene und Entwicklungsstörungen Defizite erfolgen sollte. Es wurde nachgewiesen, dass die vorgeschlagene Methode zur Bestimmung der Katecholamin-Präsenz im Urin, mit eine vielversprechende Perspektive für den Einsatz in der Klinik für die Bewertung relevant für diese Neurotransmitter Krankheiten verwendet werden könnte.

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Disclosures

Die Autoren bestätigen, dass es kein Interessenkonflikt mit jeder finanzielle Organisation bezüglich des Materials in diesem Artikel beschriebenen gibt.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch die National Science Foundation of China (No.81172720, Nr. 81673230), die soziale Entwicklung Forschung Programm der Jiangsu Provinz Wissenschaft und IT-Abteilung (Nr. BE2016741), Wissenschaft & Technologie-Projekt der China General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), das geöffnete Projekt Programm der Key Laboratory der kindlichen Entwicklung und das Lernen des Ministeriums für Bildung, Wissenschaft Southeast University (CDLS-2016-04). Wir erkennen mit freundlichen Grüßen Yuan Song und Ping Liu, die uns in Proben Sammlung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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Chemie Ausgabe 133 Katecholamine Polymeren Krone Electrospun Nanofaser verpackt-Faser Festphasen-Extraktion (PFSPE) Hochdruck-Flüssigchromatographie mit elektrochemischen Detektion (HPLC-ECD) mit hohem Risiko Säuglinge
Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite
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