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Chemistry

निष्कर्षण और Catecholamine न्यूरोट्रांसमीटर और उनके चयापचयों के उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक तरीका

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

हम एक सुविधाजनक ठोस चरण निष्कर्षण तीन monoamine न्यूरोट्रांसमीटर और शिशुओं के मूत्र में अपने चयापचयों के दो के एक साथ निर्धारण के लिए विद्युत डिटेक्शन (ECD) के साथ उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के लिए युग्मित प्रस्तुत करते हैं । हम भी शिशुओं के लिए मस्तिष्क क्षति के प्रारंभिक निदान के लिए एक संभावित metabolite MHPG के रूप में पहचान ।

Abstract

निष्कर्षण और जैविक तरल पदार्थ में catecholamine न्यूरोट्रांसमीटर के विश्लेषण तंत्रिका तंत्र समारोह और संबंधित रोगों के आकलन में बहुत महत्व का है, लेकिन उनके सटीक माप अभी भी एक चुनौती है. कई प्रोटोकॉल उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) सहित उपकरणों की एक किस्म द्वारा न्यूरोट्रांसमीटर माप के लिए वर्णित किया गया है. हालांकि, इस तरह के जटिल आपरेशन या मुश्किल से पता लगाने के लिए कई लक्ष्य है, जो बचा नहीं जा सकता है, और वर्तमान में, प्रमुख विश्लेषण तकनीक अभी भी संवेदनशील विद्युत या fluorimetric का पता लगाने के साथ युग्मित HPLC के रूप में कमियों, कर रहे है के कारण इसकी उच्च संवेदनशीलता और अच्छी selectivity । यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है और उच्च दाब तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ catecholamines का पता लगाने के लिए विद्युत का पता लगाने (HPLC-ECD) शिशुओं के असली मूत्र के नमूनों में, electrospun समग्र nanofibers रचित का उपयोग adsorbent के रूप में polystyrene के साथ बहुलक मुकुट ईथर के, भी पैक-फाइबर ठोस चरण निष्कर्षण (PFSPE) विधि के रूप में जाना जाता है । हम बताएंगे कि कैसे मूत्र के नमूनों को आसानी से एक nanofiber पैक ठोस चरण कॉलम द्वारा साफ किया जा सकता है, और कैसे नमूने में analytes तेजी से समृद्ध किया जा सकता है, desorbed, और एक ECD प्रणाली पर पता चला । PFSPE बहुत जैविक नमूनों के लिए उपचार प्रक्रियाओं को सरल, कम समय, खर्च, और लक्ष्य के नुकसान की कमी के लिए अनुमति देता है ।

कुल मिलाकर, यह काम ठोस चरण तीन monoamine न्यूरोट्रांसमीटर के एक साथ दृढ़ संकल्प के लिए एक HPLC-ECD प्रणाली के लिए युग्मित निष्कर्षण के लिए एक सरल और सुविधाजनक प्रोटोकॉल दिखाता है (norepinephrine (NE), एड्रेनालाईन (ई), डोपामाइन (डीए)) और के दो शिशुओं के मूत्र में उनका चयापचयों (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) और 3, 4-dihydroxy-phenylacetic एसिड (DOPAC)) होता है । स्थापित प्रोटोकॉल प्रसवकालीन मस्तिष्क क्षति और स्वस्थ नियंत्रण के साथ उच्च जोखिम वाले शिशुओं के बीच मूत्र catecholamines और उनके चयापचयों के मतभेदों का आकलन करने के लिए लागू किया गया था । तुलनात्मक विश्लेषण दो समूहों के बीच मूत्र MHPG में एक महत्वपूर्ण अंतर का पता चला, यह दर्शाता है कि catecholamine चयापचयों शिशुओं में मस्तिष्क क्षति के लिए जोखिम में मामलों की जल्दी निदान के लिए एक महत्वपूर्ण उंमीदवार मार्कर हो सकता है ।

Introduction

Catecholamine न्यूरोट्रांसमीटर और शरीर के तरल पदार्थ में उनके metabolite सामग्री तंत्रिका समारोह को प्रभावित और प्रतिक्रिया के संतुलन को प्रभावित कर सकते हैं करने के लिए एक बड़ी हद तक उत्तेजना राज्यों1. Abnormities रोगों की एक किस्म के कारण हो सकता है, जैसे pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma, और स्नायविक विकारों1,2. शरीर के तरल पदार्थों में catecholamines की निकासी और दृढ़ संकल्प से संबंधित रोगों के निदान के लिए सार्थक है । हालांकि, जैविक नमूनों में catecholamines कम सांद्रता में मौजूद होते हैं और आसानी से ऑक्सीकरण हो जाते हैं । इसके अलावा, वे बहुत मुश्किल है क्योंकि मध्यम3में हस्तक्षेप की बड़ी राशि के elute के लिए कर रहे हैं । इस प्रकार, जैविक तरल पदार्थ में catecholamines का एक साथ पता लगाना अभी भी एक चुनौती है ।

वहाँ दिखा रहा है कि मूत्र catecholamines तनाव का एक उपाय हो सकता है समीक्षा कर रहे हैं, और है कि अपने स्तर पर महत्वपूर्ण जैविक मार्करों के नवजात शिशुओं में स्पर्श उत्तेजना प्रसंस्करण के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं5. अनुसंधान के अनुसार, सभी शिशुओं जो समय से पहले की घटनाओं से ग्रस्त है मस्तिष्क चोट के लिए जोखिम में हैं4,5,6, और चोट तरल पदार्थ में catecholamines और संबंधित मामलों की असामान्य रिहाई का कारण हो सकता है. वहां उंनत चुंबकीय अनुनाद तकनीक है कि पहले चरण7,8में मस्तिष्क क्षति का पता लगाने कर सकते है मौजूद हैं । हालांकि, पहले ४८ एच के भीतर, एक असामांय neurodevelopmental प्रक्रिया स्थाई मस्तिष्क चोट है कि चिकित्सा छवियां11में स्पष्ट नहीं होगा कारण होगा । इसके अलावा, उच्च लागत और दुर्लभ साधन संसाधनों, अन्य कारकों के साथ साथ, यह असंभव सभी नवजात इकाइयों के लिए इन विशेष न्यूरो इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करने के लिए बनाता है. हालांकि, एक आसानी से पंहुचा और व्यावहारिक (जैसे catecholamines और उनके चयापचयों के रूप में) के उपयोग के लिए इन कमियों को दूर कर सकता है, और मानव तरल पदार्थ में एक अगोचर की स्क्रीनिंग मस्तिष्क चोट के प्रारंभिक निदान में मदद कर सकते है और शीघ्र नेतृत्व neuroprotection9की आवश्यकता वाले नवजात शिशुओं की पहचान । मूत्र में catecholamines तरल पदार्थ और neuroactivity समारोह में जारी की राशि के बीच प्रत्यक्ष संबंध की वजह से, एक आसान और स्पष्ट सूचकांक हो सकता है ।

जैविक तरल पदार्थ के अलावा, मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) और प्लाज्मा नमूने मौजूदा दर्दनाक प्रक्रियाओं के माध्यम से प्राप्त करने के लिए आसान नहीं हैं, और यह भी बहुत मुश्किल चिपकने वाला प्रोटीन और अन्य अशुद्धियों के कारण हस्तक्षेप से छुटकारा पाने के लिए, एक परेशानी के लिए अग्रणी और समय लेने वाली नमूना प्रक्रिया है कि दोहराया पता लगाने के लिए unsuited है । इसके अलावा, बच्चों के लिए, एक दर्दनाक फैशन में नमूनों को प्राप्त करने के लिए लगभग असंभव है । इसलिए, मूत्र नमूना नमूना के अन्य रूपों की तुलना में बेहतर है, के रूप में यह गैर इनवेसिव, संचालित करने के लिए आसान है, और बार-बार किया जा सकता है. मूत्र के नमूनों की दुकान करने के लिए प्रचुर और आसान कर रहे हैं, और जैविक नमूनों के अन्य रूपों पर महान लाभ दिखा.

मुख्य तरीके जैविक तरल पदार्थ में catecholamines यों तो radioenzymic परख10, एंजाइम से जुड़े प्रतिरक्षा-sorbent परख11, voltammetry12 और थर्मल लेंस स्पेक्ट्रोमेट्री13शामिल हैं । लेकिन कमियों मौजूद है, ऐसे जटिल आपरेशनों और मुश्किल के रूप में कई लक्ष्यों का पता लगाने के लिए । आज, प्रमुख विश्लेषण तकनीक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC)14, संवेदनशील विद्युत15 या fluorimetric का पता लगाने के साथ युग्मित है16, क्योंकि इसकी उच्च संवेदनशीलता और अच्छे selectivity की । साथ मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रौद्योगिकी, जैसे तरल क्रोमैटोग्राफी/mass स्पेक्ट्रोमेट्री (lc/ms) और तरल क्रोमैटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा/ms/, न्यूरोट्रांसमीटर के विश्लेषण और ठहराव उच्च प्राप्त कर सकते हैं सटीकता और विशिष्टता17,18. हालांकि, एमएस तकनीक महंगी इंस्ट्रूमेंटेशन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से काफी योग्य जनशक्ति की आवश्यकता है, विधि सबसे पारंपरिक प्रयोगशालाओं में सार्वभौमिक लागू करने के लिए मुश्किल बना । HPLC-ECD सिस्टम सामांयतः सबसे पारंपरिक और नैदानिक प्रयोगशालाओं में सुसज्जित हैं, और अनुसंधान समूहों के लिए रासायनिक संकल्प का उपयोग करने के लिए इस प्रकार एक आम और अच्छा विकल्प बन गए हैं, लेकिन वे साफ करने के लिए प्रणाली में पेश नमूना की आवश्यकता होती है और अतिसूक्ष्म volume19. इस प्रकार, यह विश्लेषण करने से पहले नमूना को शुद्ध और गाढ़ा करने के लिए बहुत महत्व का है । शुद्धि चरण के लिए शास्त्रीय विधि तरल-तरल निष्कर्षण14,15,20 और बंद लाइन ठोस चरण निष्कर्षण, सक्रिय एल्यूमिना स्तंभ सहित21,22 और diphenylborate (DPBA) का परिसर23,24,25,26.

Myeongho ली एट अल. है बहुलक राल का उपयोग कर रहा है रासायनिक adsorbent के रूप में मुकुट ईथर के साथ संशोधित करने के लिए चुन कर मानव मूत्र से catecholamines निकालने के २००७27के बाद से । इसके अलावा, २००६ में, Haibo वह एट अल। boronate संबध निष्कर्षण के लिए एक सतही संश्लेषण दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया sorbent byutilizing एक functionalizable nanomagnetic बहुतलीय oligomeric silsesquioxane (एसेसरीज) आधारित nanomagnetic समग्र, और यह में catecholamines के संवर्धन के लिए आवेदन मानव मूत्र (noradrenaline, एड्रेनालाईन आणि isoprenaline)२८. उन्होंने इस काम को पूरा करने, नैनो-electrospinning नामक तकनीक का इस्तेमाल करने और नेनो में बहुलक रेशेदार पदार्थ बनाने की मैटीरियल्स का भी लाभ उठाया । electrospinning प्रक्रिया व्यास, आकृति विज्ञान, और काम वोल्टेज को नियंत्रित करने और अन्य मानकों के साथ कताई समाधान की सामग्री को बदलने के द्वारा उत्पाद के स्थानिक संरेखण समायोजित कर सकते हैं29. पारंपरिक एसपीई कारतूस के साथ तुलना में, electrospun nanofibers अत्यधिक निकालने और एक जटिल मैट्रिक्स से लक्ष्य analytes को समृद्ध करने के लिए उपयुक्त हैं, क्योंकि वे उच्च क्षमता के साथ adsorb analytes करने के लिए उच्च सतह क्षेत्र के लिए मात्रा अनुपात के साथ सुसज्जित हैं, और और अधिक आसानी से नियंत्रित सतह रासायनिक गुणों का प्रदर्शन, लक्ष्य यौगिकों के काम लगाव की अनुमति । ये गुण उंहें एसपीई अधिशोषक के लिए अच्छा विकल्प है, बहुत ठोस चरण और desorption विलायक राशि30,31,३२,३३को कम करने । मूत्र के नमूनों में catecholamines के लिए, electrospun nanofibers polystyrene के साथ apolymeric क्राउन ईथर से बना (PCE-PS) चुनिंदा तीन catecholamines निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया (NE, ई, और डीए)३४। कागज ने संकेत दिया कि चयनात्मक मुकुट ईथर adsorbed के लक्ष्यों को NE, E, और डा, जो अपने हाइड्रोजन बांड बनाने के माध्यम से बाध्यकारी catecholamines के लिए सही ज्यामिति पर आधारित था । परिणाम सामग्री क्राउन ईथर प्रभावी ढंग से प्रदर्शित, जैविक नमूनों में निहित अन्य हस्तक्षेप यौगिकों को हटाने. इस रिपोर्ट से प्रेरित होकर, एक उपंयास विधि catecholamines के चयनात्मक निष्कर्षण के लिए विकसित किया गया था electrospun समग्र nanofibers के रचित PCE-PS ।

इस पत्र में, विधि पहले३४ की रिपोर्ट में सुधार किया गया था और न केवल सफलतापूर्वक ई, NE, और डा, लेकिन यह भी उनके चयापचयों, MHPG और DOPAC, मूत्र में विश्लेषण करने के लिए कार्यरत हैं । हम भी सोखना प्रक्रिया के तंत्र के लिए नई संभावनाओं का पता लगाने । विधि पांच analytes के लिए निष्कर्षण दक्षता और selectivity संतोषजनक दिखाता है, और विधि उच्च जोखिम शिशुओं से मूत्र के विश्लेषण में प्रसवकालीन मस्तिष्क क्षति और स्वस्थ नियंत्रण के साथ सत्यापित किया गया था ।

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Protocol

माता पिता से सूचित सहमति प्राप्त किया गया था, और संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी के अध्ययन के लिए प्राप्त किया गया था । यह अध्ययन मानव से जुड़े प्रयोगों के लिए वर्ल्ड मेडिकल एसोसिएशन (हेलसिंकी की घोषणा) की आचार संहिता के अनुसार किया गया था । सभी प्रतिभागियों के देखभाल करने वालों को अध्ययन में दाखिल होने के लिए लिखित सहमति प्रदान की गई । Zhongda अस्पताल, दक्षिण पूर्व विश्वविद्यालय के साथ सहबद्ध से नैतिक समिति की मंजूरी भी प्राप्त की गई थी ।

1. कॉलम और Catecholamines के निष्कर्षण और संकल्प के लिए आवश्यक समाधान की तैयारी

  1. PFSPE स्तंभ तैयार करें । 1-2 PCE के मिलीग्राम-5-6 aliquots में पी एस nanofibers, और ०.५ mm व्यास के साथ एक ठीक स्टील रॉड का उपयोग करने के लिए उंहें २०० µ एल की मात्रा के साथ एक पिपेट टिप के अंत में आदेश सेक ।
  2. २.४२७ ग्राम यूरिया, ०.०३४ ग्राम यूरिक एसिड, ०.०९ ग्राम क्रिएटिनिन, ०.२९७ ग्राम trisodium साइट्रेट, ०.६३४ ग्राम सोडियम क्लोराइड, ०.४५ ग्राम पोटेशियम क्लोराइड, ०.१६१ ग्राम अमोनियम क्लोराइड, ०.०८९ ग्राम कैल्शियम क्लोराइड डाईहाइड्रेट, ०.१ ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट वजन द्वारा कृत्रिम मूत्र तैयार करें heptahydrate, ०.०३४ ग्राम सोडियम बिकारबोनिट, ०.००३ ग्राम सोडियम oxalate, ०.२५८ ग्राम सोडियम सल्फेट, ०.१ ग्राम सोडियम dihydrogen फॉस्फेट, और ०.०११ ग्राम disodium हाइड्रोजन फॉस्फेट, और २०० मिलीलीटर पानी में उपरोक्त रसायनों को भंग.
  3. 2 मिलीग्राम/एमएल diphenylborate के शेयर समाधान (DPBA) समाधान 2 यौगिक के एमजी भंग द्वारा आसुत जल के 1 मिलीलीटर में तैयार । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  4. Analyte मानक
    नोट: रासायनिक संरचना और catecholamines के गुण स्थिर हैं, और वे आसानी से मिटता है । मानकों की तैयारी की प्रक्रिया बहुत तेजी से हो सकता है और प्रत्यक्ष सूर्य के रोशनी के लिए जोखिम को रोकने चाहिए ।
    1. वजन १.० मिलीग्राम पूर्वोत्तर, ई, डीए, MHPG, DOPAC और आंतरिक मानक 3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA में अलग १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों । उपयोग करने से पहले १०० एनजी/एमएल को पानी में DHBA समाधान पतला ।
    2. analytes पूरी तरह से भंग जब तक एक उच्च गति से अंधेरे में तैयार मानकों दोलन । यह प्राथमिक स्टॉक है; कई हफ्तों तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    3. माध्यमिक १,००० एनजी/एमएल analyte स्टॉक्स तैयार करें । NE, E, DA, DOPAC और MHPG के लिए, एक प्राथमिक analyte शेयर के 5 µ एल हस्तांतरण ४,९७५ µ एल में आसुत जल के एक 5 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर का उपयोग करें जब तक । इन समाधानों को ताजा रोज़ तैयार करें । DHBA के लिए, 5 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में आसुत जल के ४,९९५ µ एल में प्राथमिक स्टॉक के ५ µ एल हस्तांतरण, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर अलग से अंधेरे में स्टोर ।
    4. माध्यमिक analyte स्टॉक के साथ आगे की कमजोरियां बनाने के लिए एक मानक वक्र (जैसे, अनुपूरक तालिका 2) बनाएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में समाधान की दुकान और ताजा दैनिक तैयार करते हैं ।
    5. उचित एकाग्रता के साथ मानक स्टॉक का उपयोग कर ECD डिटेक्टर के इष्टतम वोल्टेज का परीक्षण । वोल्टेज एक मूल्य जहां analytes सबसे अच्छा पीक उपस्थिति है खोजने के लिए बदलती हैं ।
  5. 30% फॉस्फोरस एसिड, 15% acetonitrile, और ५५% आसुत जल युक्त eluant तैयार करें । eluant विलायक के 10 मिलीलीटर के लिए, आसुत पानी की ५.५ मिलीलीटर का उपयोग करें, और पानी में बूंद से acetonitrile और फॉस्फोरस एसिड ड्रॉप की 3 मिलीलीटर की १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।

2. असली मूत्र नमूने और मोबाइल चरण की तैयारी

  1. माताओं अपूतित मूत्र कप का उपयोग कर अपने शिशुओं की पहली सुबह मूत्र इकट्ठा । के नमूनों में स्थानांतरण और तुरंत लेबल के लिए । इसके बाद, नमूनों को एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें ।
  2. भंवर और कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए १,५१० x g पर मूत्र नमूने के लिए सबसे अधिक हस्तक्षेप कण से छुटकारा पाने के लिए । तलछट को त्यागें और आगे के प्रयोगों के लिए supernatants इकट्ठा करें । आदेश में प्रभावी ढंग से analytes निकालने के लिए, PFSPE के लिए आगे बढ़ना (चरण 3) तुरंत केंद्रापसारक के बाद ।
  3. मोबाइल चरण तैयार करें
    1. एक साफ बोतल तैयार है, कम से 1 एल । मोबाइल चरण की संरचना अनुपूरक तालिका 1में सूचीबद्ध है; 1 एल मोबाइल चरण के लिए, उपाय ६.७२४२ साइट्रिक एसिड की जी, ९३.०६ मिलीग्राम की ईथीलीन डायमाइन टेट्रा एसिटिक एसिड (EDTA) disodium नमक, ७.०२ ग्राम के monometallic सोडियम orthophosphate, ४०४.५ मिलीग्राम की 1-heptanesulfonic एसिड सोडियम नमक, और ३.५ ग्राम सोडियम की बोतल में हाइड्रेट । ४० मिलीलीटर acetonitrile और आसुत जल को १,००० मिलीलीटर जोड़ें । आंदोलन और 15 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक कंपन जब तक समाधान में मामला सब भंग है ।
    2. एक ग्लास इलेक्ट्रोड के साथ एक पीएच मीटर का उपयोग करना, एक संतृप्त सोडियम हीड्राकसीड समाधान के साथ ४.२१ करने के लिए मोबाइल चरण के पीएच मान को समायोजित करें ।
    3. एक ०.४५ µm polyvinylidene फ्लोराइड सूक्ष्मदर्शी झिल्ली और एक वैक्यूम सक्शन डिवाइस के साथ मोबाइल चरण फिल्टर अशुद्धियों से छुटकारा पाने के लिए ।
    4. उपयोग करने से पहले हर बार मोबाइल चरण degas करने के लिए 15 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक कंपन का उपयोग करें ।

3. PFSPE निष्कर्षण और HPLC विश्लेषण

  1. nanofibers को सक्रिय करें । प्रेस १०० µ एल के मेथनॉल और १०० µ एल के पानी क्रमिक रूप से PFSPE स्तंभ के माध्यम से एक 5 मिलीलीटर एक धीमी, dropwise तरीके से सिरिंज का उपयोग कर.
  2. मिक्स १०० µ एल मूत्र नमूना के साथ १०० µ एल 2 मिलीग्राम/एमएल DPBA समाधान और 30 µ एल १०० DHBA समाधान (है, आंतरिक मानक) में से एक ०.५ मिलीलीटर EP ट्यूब में, फिर मिश्रित समाधान PFSPE स्तंभ के लिए स्थानांतरण । हवा के दबाव के बल का उपयोग कर एक 5 मिलीलीटर gastight प्लास्टिक सिरिंज के साथ PFSPE कॉलम के माध्यम से मिश्रित नमूना समाधान दबाएँ.
  3. एसपीई कॉलम में DPBA समाधान (2 मिलीग्राम/एमएल) के १०० µ एल लोड करके कॉलम तीन बार नमकीन पानी, और समाधान धक्का धीरे एक 5 मिलीलीटर gastight प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग कर हवा के दबाव के साथ कारतूस के माध्यम से ।
  4. लोड ५० PFSPE कॉलम पर eluant के µ एल, और यह कॉलम के माध्यम से धक्का, एक ०.५ मिलीलीटर EP ट्यूब के साथ eluate का संग्रह ।
  5. HLPC degasser को चालू करें ताकि सिस्टम में हवा degas । नमूना विश्लेषण करने से पहले, सिस्टम equilibrate और आधारभूत शोर को कम करने के लिए मोबाइल चरण के साथ ०.५ से अधिक एच के लिए चलाना चाहिए । देखें अनुपूरक तालिका 1 HPLC सिस्टम के सेटअप पैरामीटर्स दिखा रहा है ।
  6. एक स्वचालित नमूना का उपयोग कर eluate के 20 µ एल नमूना, और फिर यह HPLC-ECD प्रणाली में सुई.
  7. जब रन पूरा कर रहे हैं, डिटेक्टर इंटरफेस का उपयोग कर डिटेक्टर सेल बंद कर देते हैं । इस उपकरण को नुकसान पहुंचा सकता है, के रूप में डिटेक्टर के पीछे स्विच के साथ सेल बंद मत करो ।
  8. मैन्युअल रूप से मोबाइल चरण संरचना में परिवर्तन करने के लिए 10% मेथनॉल और ९०% पानी. चलाने के लिए ंयूनतम 30 मिनट । फिर, मैन्युअल रूप से मोबाइल चरण HPLC ग्रेड मेथनॉल करने के लिए परिवर्तित करें । के बारे में 15 मिनट के लिए भागो मेथनॉल में प्रणाली की रक्षा के लिए । अनुशंसित चल रहे समय के बाद इस चरण को चलाने के लिए विफलता स्तंभ और डिटेक्टर को नुकसान में परिणाम हो सकता है । प्रवाह बंद करें, फिर degasser बंद कर दें ।

4. Phenylboronic एसिड कारतूस (PBA) निष्कर्षण

PBA कारतूस निष्कर्षण प्रक्रियाओं कुमार एट अलमें योजना के समान थे । (२०११) 25. सभी समाधान PBA कारतूस के माध्यम से धक्का दिया (१०० मिलीग्राम, एक सिरिंज द्वारा मजबूर हवा के साथ 1 मिलीलीटर) कर रहे हैं ।

  1. 1 मिलीलीटर 80:20 acetonitrile-पानी के साथ कारतूस हालत (v/v) 1% फार्मिक एसिड और ५० mM फॉस्फेट बफर (पीएच 10) के 1 मिलीलीटर क्रमिक रूप से युक्त ।
  2. PBA कारतूस के माध्यम से बफर मूत्र नमूना (1 मिलीलीटर मूत्र और 2 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर, पीएच ८.५) दबाएँ ।
  3. 1 मिलीलीटर 50:50 वी/वी acetonitrile-फॉस्फेट बफर (10 मिमी, पीएच ८.५) के साथ कारतूस धो लो ।
  4. Elute 1 मिलीलीटर acetonitrile-पानी के साथ कारतूस (80:20 v/v) 1% प्रपत्र एसिड युक्त ।

5. Catecholamines की पहचान और ठहराव

  1. linearity
    1. छह सांद्रता (१.५, 3, 12, 25, ५०, और १०० एनजी/एमएल) के लिए कृत्रिम मूत्र के साथ माध्यमिक analytes स्टॉक पतला; कृत्रिम मूत्र की कमजोर मात्रा अनुपूरक तालिका 2के बाद । अंशांकन curves के निर्माण के लिए 18 analyte प्रयोगात्मक समाधान पाने के लिए प्रत्येक एकाग्रता के साथ तीन समानांतर नमूने बनाओ ।
    2. पतला DHBA माध्यमिक स्टॉक के साथ कृत्रिम मूत्र 10-गुना पाने के लिए १०० एनजी/एमएल प्रयोगात्मक समाधान ।
    3. सभी analyte समाधान 5.1.1 से, चरण 3 (PFSPE निष्कर्षण कार्यविधियों) के अनुसार मानें । चरण 3 में के रूप में, HPLC-ECD प्रणाली में प्रत्येक इसी eluate के 20 µ एल इंजेक्षन करने के लिए एक HPLC वर्णलेख मिलता है ।
    4. पांच analytes के अंशांकन curves का निर्माण करने के लिए पीक क्षेत्र के अनुपात की साजिश रचने (लक्ष्य/है) की सांद्रता के अनुपात के खिलाफ Y अक्ष के रूप में X अक्ष, के रूप में दिखाया गया है अनुपूरक चित्रा 1में ।
  2. संवेदनशीलता के लिए लोद और LOQ मान
    1. HPLC-ECD प्रणाली में खाली कृत्रिम मूत्र के 20 µ एल इंजेक्षन (के रूप में चरण 3 में), नमूना के HPLC वर्णलेख प्राप्त करने के लिए.
    2. 5.2.1 से वर्णलेख में, 11 रिक्त संकेत मान संग्रहीत करें, और परिकलित माध्य मान Xb और मानक विचलन Sb। एक पदार्थ है कि विश्वास के एक निश्चित स्तर पर पता लगाया जा सकता है की ंयूनतम संकेत की गणना, एक्स l के रूप मेंएक्सएल = xb+ कश्मीर * एसबी (कश्मीर विश्वास के स्तर से निर्धारित गुणांक है, एसबी के शोर स्तर को दर्शाता है विधि और मशीन शोर के स्तर को मापने). इस प्रकार, लोद = (xL-xb)/s = (K * sb)//////
    3. 3:1 (k = 3) का पता लगाने की सीमा के रूप में (लोद), और एक s/n के 10:1 (k = 10) ठहराव (LOQ) की सीमा के रूप में परिभाषित एक s/
  3. वसूली का मूल्यांकन
    1. असली और नुकीला मूत्र के नमूने तैयार करें । तीन सांद्रता (5, ५०, १०० एनजी/एमएल) को असली मूत्र के साथ माध्यमिक analytes स्टॉक नुकीला मूत्र नमूने प्राप्त करने के लिए पतला । प्रत्येक analyte समाधान के लिए तीन समानांतर नमूने तैयार करें । मूत्र नमूना में नुकीला लक्ष्य यौगिकों की मात्रा के रूप में नुकीला एकाग्रता गिनती । यह मान एकsके रूप में निर्धारित करें ।
    2. १०० एनजी/एमएल करने के लिए DHBA शेयर पतला, के रूप में कदम 5.1.2 में ।
    3. प्रक्रिया प्रत्येक नमूना समाधान 5.3.1 से चरण 3 (PFSPE निष्कर्षण प्रक्रियाओं) के अनुसार और HPLC परिणाम प्राप्त करने के लिए ECD-वर्णलेख सिस्टम में प्रत्येक संगत eluant के 20 µ l सुई. analytes के मान को नुकीला मूत्र नमूना में लक्ष्य यौगिकों quantified की एक मात्रा के रूप में गिना जाएगा । इस मान कोtके रूप में परिभाषित करें ।
    4. HPLC-ECD में मूत्र नमूना के 20 µ एल इंजेक्षन (चरण 3 में के रूप में) प्रणाली वर्णलेख परिणाम प्राप्त करने के लिए. analytes के मान को मूत्र नमूना में quantified लक्ष्य यौगिकों की एक प्रारंभिक मात्रा के रूप में गिना जाएगा । इस मान कोiके रूप में परिभाषित करें ।
    5. मानक वक्र समीकरण से नमूनों में लक्ष्य यौगिकों की मात्रा की गणना । प्रतिशत वसूली के रूप में अनुमानित है methodological रिकवरी% = (एकt - ai) × 100/(एकs) । माध्य मान तालिका 1में दिखाए जाते हैं ।
  4. अस्पष्टता का मूल्यांकन करें
    1. कदम 5.3.1 में के रूप में 5, ५०, और १०० एनजी/एमएल सांद्रता के लिए नुकीला कृत्रिम मूत्र नमूने तैयार । प्रत्येक analyte समाधान के लिए छह समानांतर नमूने तैयार करें । हर दिन ताजा प्रायोगिक नमूने तैयार करें ।
    2. DHBA शेयर पतला करने के लिए १०० एनजी/एमएल के रूप में कदम 5.1.2 ।
    3. इंट्रा-डे परिशुद्धता (n = 6) का मूल्यांकन करें । प्रत्येक नमूना समाधान 5.4.1 में चरण 3 के अनुसार प्रक्रिया और प्रत्येक संवाददाता eluant के 20 µ एल इंजेक्षन करने के लिए HPLC-ECD प्रणाली में वर्णलेख पाने के लिए. एक ही दिन में छह बार एक ही ऑपरेशन करें ।
    4. मानक वक्र समीकरण से नमूनों में लक्ष्य यौगिकों की मात्रा की गणना । एक ही यौगिक की इसी एकाग्रता के अंतर्गत, एक दिन में छः परख के सापेक्ष मानक विचलन (RSD) को इंट्रा-डे परिशुद्धता के रूप में निर्धारित किया जाता है. माध्य मान तालिका 1में दिखाए जाते हैं ।
    5. अंतर-दिवस शुद्धता (n = 6) का मूल्यांकन करें । एक ही समय में छह अनुक्रमिक दिनों में प्रत्येक दिन, 5, ५०, १०० एनजी/एमएल, 5.4.1 और 5.4.2 के रूप में के तीन सांद्रता के लिए कृत्रिम मूत्र नमूनों नुकीला तैयार है, और चरण 3 के अनुसार प्रत्येक analyte नमूना समाधान प्रक्रिया ।
    6. हर दिन ECD परिणाम प्राप्त करने के लिए HPLC-वर्णलेख प्रणाली में 5.4.5 से प्रत्येक इसी eluate के 20 µ एल इंजेक्षन. मानक वक्र समीकरण से नमूनों में लक्ष्य यौगिकों की मात्रा की गणना । अंतर दिन परिशुद्धता छह अनुक्रमिक दिनों में तीन सांद्रता पर नुकीला कृत्रिम मूत्र के नमूनों से परख मात्रा के RSD द्वारा व्यक्त की है । माध्य मान तालिका 1में दिखाए जाते हैं ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल मूत्र नमूनों का इलाज और एक HPLC-ECD प्रणाली के माध्यम से पता लगाने के लिए पांच catecholamines को समृद्ध करने के लिए एक सरल और सुविधाजनक PFSPE विधि है; प्रक्रिया का एक आरेख चित्र 1में दिखाया जाता है । प्रोटोकॉल मुख्य रूप से चार कदम-सक्रिय, लोड हो रहा है, धोने, और eluting-PCE-PS nanofibers और एक सरल ठोस चरण निष्कर्षण डिवाइस की एक छोटी मात्रा के साथ युग्मित शामिल हैं । PCE की आकृति विज्ञान-PS nanofibers एक सतह और porosity विश्लेषक का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें) । textural गुण-शर्त (Brunauer, Emmett, और टेलर) सतह क्षेत्र, ताकना मात्रा और ताकना आकार-थे २.८२९७ एम2 जी-1, ०.००९ सेमी3 जी-1, और १२.७६ एनएम, क्रमशः । इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि सामग्री प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया है नेनो सतह पर pores, जो उच्च सोखना दक्षता में योगदान कर सकते है और कम बंधन पीएच प्रोटोकॉल में ।

इस प्रोटोकॉल अनुकूलित मात्रा का उपयोग करता है, नमूना सामग्री, leachate, eluant, आदि, साथ ही साथ काम कर पीएच और समय की खपत प्रक्रियाओं के दौरान. चेन एट अल.में, eluant एक १२.० मीटर एसिटिक एसिड समाधान था क्योंकि अम्लीय स्थितियों के कारण adsorbent protonated और सकारात्मक रूप से चार्ज हो जाता है, जो कैस३४,३५के रेफरेंस के लिए अनुकूल है. इस अध्ययन में, eluant नुस्खा के लिए 30% फास्फोरस एसिड, 15% acetonitrile, और ५५% आसुत जल होने का जीर्णोद्वार किया गया था । eluant के अंतिम पीएच मान ३.० करने के लिए समायोजित किया गया था । eluant विलायक एक अंलीय वातावरण में रखा जाना चाहिए जब eluting, लेकिन बहुत अधिक १२.० मीटर एसिटिक एसिड से मध्यम, जो गरीब चोटी उपस्थिति और HPLC प्रणाली को नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

catecholamines की पहचान के लिए, मानक समाधान चोटियों के साथ नमूनों में चोटियों की वर्णलेख प्रतिधारण बार तुलना कर रहे हैं । चित्रा 2 विभिंन समाधानों से HPLC-ECD chromatograms के उदाहरण दिखाता है । प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पीछा किया जाता है, तो तीन catecholamines और उनके चयापचयों के क्रोमेटोग्राफिक प्रोफाइल स्पष्ट सममित, अच्छी तरह से परिभाषित चोटियों के साथ और न्यूनतम पृष्ठभूमि शोर के साथ, के रूप में चित्र 2 में सचित्र के साथ HPLC-ECD द्वारा प्राप्त की जानी चाहिए . पारंपरिक विधि के साथ तुलना के लिए, एक वाणिज्यिक PBA कारतूस एक नियंत्रण के रूप में चुना गया था । चित्रा 2में(ए-सी), (बी) में पांच लक्ष्य चोटियों thaosein (सी) की तुलना में काफी अधिक हैं, यह दर्शाता है कि PFSPE विधि PBA कारतूस विधि की तुलना में अधिक संवेदनशील है । इसके अलावा, DOPAC चोटी PBA कारतूस निष्कर्षण परिणाम में नहीं दिखा था, यह दर्शाता है कि PBA कॉलम DOPAC निकालने के लिए सक्षम नहीं था । चित्र 2 (घ) बिना किसी उपचार के खाली मूत्र नमूना के वर्णलेख को दर्शाया गया है, और चित्रा 2(ई) PCE-PS समग्र nanofibers का उपयोग कर निकाले गए मूत्र नमूना के chromatograms से पता चलता है । चित्र 2 (च) PBA स्तंभ के साथ निष्कर्षण के बाद मूत्र नमूना की chromatograms दिखाता है, जो चित्रा 2(c) में परिणाम के अनुरूप कोई DOPAC निष्कर्षण भी नहीं दिखाता है । आरेख इंगित करता है कि PFSPE विधि केवल अच्छे प्रभाव के साथ लक्ष्यों को नहीं निकाल सकता है, लेकिन यह भी मूत्र में हस्तक्षेप के अधिकांश से छुटकारा मिल सकता है, लक्ष्य यौगिकों के लिए अच्छा शिखर पहचान दे रही है.

सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला कि तीन catecholamines के लिए माप और दो चयापचयों मज़बूती से reproduced थे (तालिका 1) । सभी लक्ष्य यौगिकों १.५ और १०० एनजी/एमएल (आर2> 0.99) के बीच अच्छा रैखिकता दिखाया, और प्रत्येक analyte के मानक वक्र अनुपूरक आंकड़ा 1में पाया जा सकता है । घटता है और R2 मान प्रदर्शित करता है कि analytes अच्छा रैखिकता और सापेक्षता एक निश्चित रेखीय रेंज के भीतर, मूत्र के नमूनों में analytes की सांद्रता की गणना के लिए उपयुक्त है । पता लगाने की सीमा (लोद) ०.२५ से ०.५४ एनजी/एमएल, और ठहराव (LOQ) की सीमा ०.८३ के लिए १.८१ एनजी/एमएल, क्रमशः थे । सिग्नल-टू-शोर (S/N) मान 3 लोकेशंस. पांच लक्ष्य यौगिकों के methodological की वसूली की सीमा ९७.४% (MHPG) से १२४.२% (DOPAC) है, जो वास्तविक नमूनों के लिए आवेदन के लिए संतोषजनक था । इंट्रा डे परिशुद्धता २.७ से ४.८% (सापेक्ष मानक विचलन के रूप में व्यक्त) और अंतर दिन सटीक था 2-8.1%, अच्छा सटीक और दोहराव प्रदर्शित ।

असली मूत्र के नमूनों में लक्ष्यों का पता लगाने के लिए, 28 उच्च जोखिम वाले शिशुओं और बच्चे की देखभाल, सूज़ौ नगर अस्पताल के विभाजन में 22 स्वस्थ शिशुओं, भर्ती किया गया । अध्ययन में लिए गए सभी ५० शिशुओं में लड़के थे । जब वे छह महीने के थे, वे सितंबर २०१६ में एक नियमित स्वास्थ्य जांच के लिए ले जाया गया । सभी मूत्र नमूने एकत्र किए गए थे और प्रोटोकॉल कदम ३.१ और ३.२ के बाद से इलाज, और नमूने चरण 3 के शेष का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । सांद्रता अंशांकन curves के खिलाफ गणना की गई । सांख्यिकीय अंतर प्रसरण (ANOVA) के विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया । परिणाम तालिका 2में देखा जा सकता है । दोनों गुटों के बीच catecholamines और चयापचयों के अंतर की तुलना की गई और उनका विश्लेषण किया गया. p-मान बताते है कि catecholamines उच्च जोखिम और स्वस्थ समूहों के बीच भिंन नहीं थे, जबकि metabolite MHPG सामग्री इन समूहों (p = ०.००१) में भिंन थी । उच्च जोखिम वाले शिशुओं समूह के नियंत्रण समूह से अधिक मात्रा में था MHPG (१४.८ ± ३.६ एनजी/एमएल बनाम १.४ ± ०.२ एनजी/, जिसका अर्थ है कि मूत्र MHPG का स्तर उच्च जोखिम वाले शिशुओं की प्रारंभिक पहचान के लिए एक संभावित मार्कर हो सकता है ।

चित्रा 3 और तालिका 3 monoamine सामग्री का निर्धारण करने के लिए क्लासिक ठहराव विधि का वर्णन है, और जिसके लिए आपरेशन प्रक्रिया और ब्याज की आंकड़े दिए जाते है अंय तरीकों के साथ तुलना करें । क्लासिक तरीकों के साथ तुलना में, PFSPE विधि एक छोटी timespan (5-10 मिनट), सरलीकृत आपरेशन प्रक्रिया, कम कार्बनिक विलायक, और संतोषजनक methodological मापदंडों के साथ और अधिक पर्यावरण मैत्री की तरह लाभ है । eluant राशि की जरूरत मात्रा में कम है (५० µ एल) और लक्ष्य संवर्धन कदम कोई वाष्पीकरण, जो बहुत मूत्र में लक्ष्य यौगिकों के लिए पता लगाने संवेदनशीलता को बढ़ावा देता है की आवश्यकता है । पारंपरिक कण आधारित एसपीई की तुलना में, इस विधि दक्षता बढ़ाया, तैयारी की प्रक्रिया को सरलीकृत, और स्वीकार्य विश्वसनीयता, selectivity, और संवेदनशीलता के साथ विश्लेषण के समय कम.

Figure 1
चित्र 1 : योजनाबद्ध कागज में PFSPE प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट और अपने डिवाइस का प्रतिनिधित्व । (१) Gastight सिरिंज, (२) पिपेट टिप, और (३) पॉवरफुल nanofibers. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : विभिन्न नमूनों की Chromatograms. (क) लक्ष्य के साथ पानी के नमूने नुकीला और निष्कर्षण के बिना (१०० एनजी/एमएल) में है । (ख) नुकीला पानी PFSPE विधि द्वारा निकाले नमूना, और (ग) वाणिज्यिक phenylboronic एसिड (PBA) कारतूस द्वारा । (d) निष्कर्षण के बिना वास्तविक रिक्त मूत्र नमूना । (ई) PFSPE विधि द्वारा निकाली गई असली मूत्र नमूना । (च) असली मूत्र नमूना वाणिज्यिक PBA कारतूस द्वारा निकाली गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : संकल्प तरीकों का विश्लेषणात्मक प्रवाह चार्ट । (a, b) पहले क्लासिक निष्कर्षण विधियों की रिपोर्ट की गई । (क) एल्यूमिना द्वारा निष्कर्षण, (ख) DPBA द्वारा जटिल, और (ग) इस पत्र में प्रस्तावित विधि द्वारा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक चित्रा 1: मानक घटता है और समीकरणों । पांच analytes के लिए मानक curves नमूने में अज्ञात analytes एकाग्रता की गणना करने के लिए लाइन के समीकरण का उपयोग करने के लिए निर्माण कर रहे हैं । (क) ण्, (ख) ई, (ग) दा, (घ) MHPG, और (ङ) DOPAC. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 2: boronic एसिड और सीआईएस-दिओल समूह या आसंन दो हाइड्रॉक्सिल समूहों के बीच Boronate संबध बातचीत । (एक) boronic एसिड और कई OH समूहों के बीच बातचीत की योजनाबद्ध पांच फार्म या छह चक्रीय एस्टर के सदस्य हैं । (ख) सीआईएस-दिओल समूह या लाल हलकों में आसंन दो हाइड्रॉक्सिल समूहों boronic एसिड यौगिक के लिए पांच analytes के लिए प्रमुख प्रतिक्रिया साइटों को दर्शाती है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

ne MHPG ई है DOPAC डा
रैखिक रेंज (एनजी/ 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
R-वर्गित मान ०.९९४५ ०.९९५ ०.९९७६ ०.९९०२ ०.९९५४
लोद (एनजी/ ०.३२३ ०.३२२ ०.३१३ ०.६५७ ०.२४९ ०.५४३
LOQ (एनजी/ १.०७६ १.०७२ १.०४३ २.१९१ ०.८३ १.८०९
वसूली ± RSD (%) (n = 9) 110.7 ± 2.9 97.4 ± 9.1 103.9 ± 5.2 86.5 ± 7.3 124.2 ± 3.1 117.3 ± 5.4
प्रेसिजन (RSD%) (n = 9)
इंट्रा डे ४.५ 4 २.७ ४.८ ३.३ ४.७
इंटर डे ४.१ ८.१ 2 ६.३ ३.२ ५.९
णे, norepinephrine; MHPG, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol; ई, एड्रेनालाईन; है, आंतरिक मानक; DOPAC, ३, ४-Dihydroxyphenylacetic अम्ल; दा, डोपामाइन;

तालिका 1: तीन catecholamines और मानक समाधानों के साथ दो चयापचयों के निर्धारण के लिए प्रस्तावित प्रोटोकॉल का विश्लेषणात्मक परिणाम ।

एकाग्रता (एनजी एमएल-1) नियंत्रण समूह (22) उच्च जोखिम शिशु समूह (28) P मान
ne 7.52 ± 1.34 5.56 ± 1.7 ०.३७
MHPG 1.4 ± 0.2 14.8 ± 3.6 ०.००१
ई 24 ± 15.8 20.9 ± 5.87 ०.८४१
DOPAC 106.36 ± 30.1 72.12 ± 18.07 ०.३१२
डा 55.53 ± 11.9 48.12 ± 20.9 ०.७६
P < 0.05 * * * दो समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाता है

तालिका 2: तीन catecholamines और स्वस्थ शिशुओं और उच्च जोखिम वाले शिशुओं के बीच मूत्र में दो चयापचयों के लिए सांद्रता के मुक़ाबले । परिणाम MHPG सामग्री के बीच अंतर के लिए p = ०.०५ का एक महत्व स्तर के साथ प्रसरण (ANOVA) के विश्लेषण का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया । मतलब ± मानक विचलन दिखाए जाते हैं ।

नमूना थक विलायक (एमएल) नमूना वॉल्यूम (mL) उपचार समय (min) रेखीय श्रेणी लोद सापेक्ष पुनर्प्राप्ति (%) लुप्त हो जाना और
redissolve		 विश्लेषणात्मक विधि
विलायक वॉल्यूम समय (min) रिकवरी (%) विलायक और
एमएल) एमएल) गठित
अवशेष
मूत्र ०.५ ०.०५ 10 2.0 – 200 एनजी/एमएल (NE, ई, डीए) 0.2-0.5 एनजी/एमएल (NE, ई, डीए) 88.5-94.5 (NE, E, DA) नहीं HPLC-ECD (चेन एट अल., २०१६
मूत्र 19 ०.७ — 47 – 167 µ g/L (दा) 166-500 एनएम (डीए) 98.3-101.1 (DA) नहीं HPLC-यूवी (Piotr एट अल., २०१६)
मूत्र १.३ ०.०१ — 0.5 – 1250 एनजी/एमएल (NE, ई, डीए, NMN, MN) 0.5-2.5 एनजी/एमएल (NE, ई, डीए, NMN, MN) 74.1 – 97.3 (NE, E, DA, NMN, MN) नहीं LC-ms/ms (ली एट अल., २०१६)
मूत्र और प्लाज्मा 20 ०.०५ 10 0.04-2.5 एनजी/एमएल (NE, ई, डीए) 0.01-0.02 एनजी/एमएल (NE, ई, डीए) 87.0-97.5 (NE, E, DA) नहीं HPLC-यूवी (मोहंमद एट अल., २०१६
मूत्र < ०.५ ०.१ 5 1.5-400 एनजी/एमएल (NE, MHPG, ई, DOPAC, डीए) 0.249-0.543 एनजी/एमएल (NE, MHPG, ई, DOPAC, डीए) 97.4-124.2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) नहीं यह काम
—, अनिर्धारित ।
PBA, Phenylboronic अम्ल

तालिका 3: हाल के वर्षों में monoamines या अंय संबंधित विषयों के इलाज पर अध्ययन के साथ इस काम की तुलना ।

अनुपूरक तालिका 1: पता लगाने के लिए साधन मापदंडों और HPLC-ECD द्वारा कागज में analytes की ठहराव. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: पांच analytes के लिए मानक वक्र की तैयारी । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस पत्र में प्रस्तावित PFSPE पद्धति अपनी द्रुतता, सरलता, और सुविधा के संबंध में महत्वपूर्ण और सार्थक हो सकती है. अधिशोषक प्रोटोकॉल में प्रयुक्त electrospun nanofibers, जो उच्च सतह क्षेत्र के लिए मात्रा अनुपात है, और उच्च दक्षता के साथ analytes adsorb हैं । प्रक्रिया केवल nanofiber के कुछ मिलीग्राम और eluant विलायक की एक छोटी मात्रा की जरूरत है, और एक वाष्पीकरण कदम analytes ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता नहीं है । यहां, हम एक HPLC-ECD आधारित प्रोटोकॉल है कि नए उपयोगकर्ताओं को पता लगाने और तीन catecholamines और उनके चयापचयों (NE, ई, दा, और MHPG, DOPAC) के दो ठहराव के लिए एक प्रभावी तरीका स्थापित करने की अनुमति देगा की एक विस्तृत सिंहावलोकन प्रस्तुत किया है ।

इस प्रोटोकॉल की श्रेष्ठता प्रक्रियाओं के दौरान मुख्य रूप से चार महत्वपूर्ण चरणों से उपजी है, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है: PCE-PS nanofibers का उपयोग करके लक्ष्य यौगिकों को कुछ मिलीग्राम तक sorbent के आकार को कम करने के लिए कैप्चर करने के लिए, एक तेजी से सोखना करने के लिए अग्रणी/ desorption, और केवल eluting द्रव (1) की एक छोटी मात्रा की जरूरत; analytes के साथ जटिल करने के लिए अपने hydrophobicity (2) में सुधार करने के लिए मूत्र में DPBA जोड़ना; analytes को बनाए रखने के लिए DPBA युक्त समाधान के साथ nanofibers को धोना और अशुद्धियों को दूर करना (3); और निष्कर्षण और विश्लेषण हालत का अनुकूलन अच्छी संवेदनशीलता और analytes (4) के लिए selectivity पाने के लिए ।

चरण के लिए (1), PCE के लिए adsorbent क्षमता के बेहतर प्रदर्शन के तंत्र-PS कारकों की एक किस्म के लिए जिंमेदार हो सकता है । क्राउन ईथर पॉलिमर nanofibers में मैगनीज के अतिथि इस पत्र में catecholamines के रूप में एच बॉण्ड, द्वारा अमीन समूहों वाले अणुओं के साथ एक मेजबान अतिथि जटिल फार्म कर सकते हैं । इसके अलावा Hongyou हू एट अल. और Jishun चेन एट अल. यह भी प्रस्ताव किया है कि boronic एसिड रासायनिक संरचना में बी के माध्यम से नाइट्रोजन परमाणुओं के साथ बांड-N बातचीत कर सकते हैं, और hydrophobic कंकाल बेंजीन के छल्ले और analytes के अंय aliphatic समूहों के साथ बातचीत कर सकते है३६,३७। इसके अलावा, desorption प्रक्रिया के दौरान, हाइड्रोजन बांड और बी एन बातचीत आसानी से बहुत कम पीएच पर टूट रहे हैं; इस प्रकार, अंलीय पीएच के साथ eluants desorption के लिए खोज के लिए आम तौर पर उपयुक्त हैं । इसके अलावा, वहां भी कई माध्यमिक बातचीत, hydrophobic, ईओण सहित, और हाइड्रोजन संबंध है, जो boronic रसायनों और संबंधित यौगिकों के बीच हो सकता है३६,३७,३८। इन सभी इंटरैक्शन सामग्रियों को analytes के सोखना में योगदान दे सकता है.

कदम (2) के लिए, जोड़ा DPBA की मदद से, PCE-PS nanofibers adsorb DPBA-catecholamine परिसरों तेजी से । Zhen लियू एट अल दिखाया है कि boronate संबध सामग्री चयनात्मक जुदाई और कार्बनिक यौगिकों के आणविक मांयता के लिए महत्वपूर्ण मीडिया के रूप में उभरा है, जैसे nucleosides, saccharides, glycans, नच, और३८पर । परिसर में मुख्य रूप से boronic एसिड और सीआईएस-दिओल समूहों, या दो आसंन हाइड्रॉक्सिल समूहों के बीच boronate संबध बातचीत से होता है, पांच या छह सदस्यीय चक्रीय एस्टर के रूप में, के रूप में अनुपूरक आंकड़ा 2a में दिखाया गया है । अनुपूरक आंकड़ा बी 5 boronic एसिड यौगिक के लिए इस काम में पांच analytes के लिए प्रमुख प्रतिक्रिया साइटों को दर्शाया गया है । जब परिवेश अम्लीय हो जाता है, boronic एसिड-सीआईएस-दिओल जटिल dissociates. boronic एसिड और सीआईएस-दिओल समूह या आसंन दो हाइड्रॉक्सिल समूहों के बीच बातचीत बड़े पैमाने पर और अपेक्षाकृत दृढ़ता से मौजूद है ।

कदम (3) के लिए, analytes और DPBA के बीच गठित परिसर उंहें adsorbent पर पकड़ कर सकते हैं, जबकि अंय अशुद्धियों PCE-PS सतह से कुल्ला कर रहे हैं, लक्ष्यों के लिए सबसे अच्छा आरक्षण प्राप्त करने । चरण के लिए (4), वहां एक दिखा रहा है कि इष्टतम पीएच बोरिक एसिड और catechol यौगिक३९के संबंध के लिए ९.० के बारे में था रिपोर्ट गया है । हालांकि, चेन एट अल. catecholamine-DPBA के परिसर के लिए सबसे अच्छा पीएच मान का पता लगाया और पाया कि कैस के लिए समग्र PS-PCE nanofibers के सोखना प्रदर्शन इष्टतम था जब pH मान ६.० और ७.०३४,३५के बीच परिवर्तित किया गया था । लियू एट अल. फंसाया कि boronate एसिड यौगिकों के लिए समर्थन सामग्री की संरचना, विशेष रूप से गुहाओं और नेनो pores के स्थानिक शोधन के साथ, और बी एन लाइगैंडों प्रतिक्रिया के दौरान गठित, यह भी काफी कम कर सकते है बाइंडिंग pH और बाइंडिंग संबध३८को एंहांस करें । PCE-पुनश्च संरचना के रूप में अच्छी तरह से catecholamine संरचना के साथ सभी एनएच समूहों से सुसज्जित हैं । इस प्रकार, गुण और PCE के नेनो pores-पी एस ( प्रतिनिधि परिणामोंमें दिखाया गया के रूप में डेटा), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बी एन लाइगैंडों का गठन, प्रोटोकॉल में कम बाध्यकारी पीएच में योगदान कर सकते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में इष्टतम पीएच मूल्य तटस्थ हो सकता है, जो बहुत प्रक्रियाओं को सरल और analytes के क्षरण से बचा जाता है ।

catcholamine निर्धारण की मुख्य सीमाएं हैं कि जैविक नमूनों में उनकी सांद्रता बहुत कम होती है और उनकी संरचनाएं अस्थिर होती हैं (आसानी से ऑक्सीकरण); इसके अलावा, यह मुश्किल है कि मीडिया में अशुद्धियों से छुटकारा पाने के लिए । इस प्रकार, जैविक नमूनों में catecholamine के विश्लेषण के लिए, उपचार, आमतौर पर ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा, आवश्यक है । इस पत्र में प्रस्तावित PFSPE विधि मूत्र के नमूनों में analytes के लिए एक सरल और सुविधाजनक पूर्व एकाग्रता प्रदान की है । लेकिन, प्रयोग करते समय, प्रयोग की स्थिति कड़ाई से नियंत्रित किया जाना चाहिए, जैसे प्रकाश जोखिम से बचने और पूर्व उपचार के समय के रूप में ज्यादा से ज्यादा संभव के रूप में छोटा करने के माध्यम से ।

विधि की प्रयोज्यता तीन catecholamines और स्वस्थ शिशुओं और उच्च जोखिम वाले शिशुओं के मूत्र में दो चयापचयों की सांद्रता निर्धारित करने के लिए इसके उपयोग द्वारा मूल्यांकन किया गया था । मूत्र MHPG में दो समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था । के रूप में पहले संक्षेप, मानव शरीर में MHPG राशि अब मुख्य रूप से एक सूचकांक के रूप में सूचित करने के लिए noradrenergic ंयूरॉन टोन प्रतिबिंबित, केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका प्रणालियों में catecholamine चयापचय गतिविधि४०,४१, ४२, और एक उपयोगी प्लाज्मा केंद्रीय NE चयापचय के लिए मूत्र मार्कर४३है । उच्च जोखिम शिशुओं, जैसे कारकों की एक किस्म के लिए hypoxic-कोरोनरी encephalopathy (हिे) मस्तिष्क आघात और मस्तिष्क अपमान का कारण बनता है, बचपन neurodevelopmental घाटे के विभिंन डिग्री के लिए अग्रणी । बारी में यह मस्तिष्क क्षति न्यूरोट्रांसमीटर के रिलीज करने के लिए नेतृत्व करेंगे (MHPG शामिल) शरीर के तरल पदार्थ में४४,४५. J.W. Maas द्वारा रिपोर्टों के अनुसार, वहां मस्तिष्क, सीएसएफ, प्लाज्मा, और MHPG४६,४७के मूत्र सांद्रता के बीच महत्वपूर्ण सहसंबंध हैं । मूत्र में कुल (free + संयुग्मित) MHPG की माप लंबे समय से मनुष्यों में मध्य पूर्वोत्तर और परिधीय पूर्वोत्तर चयापचय के चयापचय का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है४१,४८,४९। इस प्रकार, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि उच्च जोखिम शिशुओं स्वस्थ लोगों के साथ तुलना में noradrenergic ंयूरॉन टोन नुकसान है, केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका प्रणालियों में catecholamine चयापचय को प्रभावित । यह विसंगति बताती है कि आगे का अनुसंधान मूत्र MHPG स्तर और neurodevelopmental घाटे के बीच संबंधों पर किया जाना चाहिए. यह दर्शाया गया है कि प्रस्तावित विधि मूत्र में catecholamine उपस्थिति के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन न्यूरोट्रांसमीटर के लिए प्रासंगिक रोगों के मूल्यांकन के लिए क्लिनिक में उपयोग के लिए एक होनहार संभावना के साथ.

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Disclosures

लेखक प्रमाणित है कि इस लेख में चर्चा की सामग्री के बारे में किसी भी वित्तीय संगठन के साथ ब्याज की कोई संघर्ष है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (no. 81172720, नो ८१६७३२३०), Jiangsu प्रांत विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी विभाग के सामाजिक विकास अनुसंधान कार्यक्रम (सं. BE2016741), विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना के चीन के सामांय प्रशासन गुणवत्ता पर्यवेक्षण, निरीक्षण और संगरोध (2015QK055), बाल विकास और शिक्षा मंत्रालय के अधिगम विज्ञान के प्रमुख प्रयोगशाला के खुले परियोजना कार्यक्रम, दक्षिण पूर्व विश्वविद्यालय (CDLS-2016-04) । हम ईमानदारी से युआन गीत और पिंग लियू जो हमें नमूनों संग्रह में सहायता स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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रसायन विज्ञान अंक १३३ Catecholamines बहुलक मुकुट electrospun nanofiber पैक्ड-फाइबर ठोस चरण निष्कर्षण (PFSPE) उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ विद्युत डिटेक्शन (HPLC-ECD) उच्च जोखिम शिशुओं
निष्कर्षण और Catecholamine न्यूरोट्रांसमीटर और उनके चयापचयों के उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक तरीका
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Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

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