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Chemistry

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Apresentamos uma conveniente extração de fase sólida acoplada a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com deteção eletroquímica (ECD) para a determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina e dois dos seus metabolitos na urina dos bebês. Também identificamos o metabólito MHPG como um potencial biomarcador para o diagnóstico precoce de lesões cerebrais para infantes.

Abstract

A extração e a análise dos neurotransmissores catecolaminas em fluidos biológicos é de grande importância na avaliação da função do sistema nervoso e doenças relacionadas, mas sua medida precisa ainda é um desafio. Muitos protocolos têm sido descritos para medição do neurotransmissor por uma variedade de instrumentos, incluindo cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). No entanto, existem deficiências, tais como a operação complicada ou difícil de detectar alvos múltiplos, que não podem ser evitados, e atualmente, a técnica de análise dominante é ainda HPLC acoplado com sensível eletroquímico ou detecção de fluorimétrica, devido a sua sensibilidade elevada e boa seletividade. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o pré-tratamento e a detecção de catecolaminas com cromatografia líquida de alta pressão com deteção eletroquímica (HPLC-ECD) em amostras de urina real dos lactentes, usando electrospun de nanofibras composto composto de éter de coroa poliméricas de poliestireno como adsorvente, também conhecido como o método de extração (PFSPE) embalado-fibra de fase sólida. Mostramos como urina amostras podem ser facilmente precleaned por uma coluna de fase sólida nanofibras-embalados, e como os analitos na amostra podem ser rapidamente enriquecidos, em estudo dessorvida e detectado em um sistema ECD. PFSPE simplifica os procedimentos de pré-tratamento de amostras biológicas, permitindo a diminuição do tempo gasto e redução da perda de alvos.

Em geral, este trabalho ilustra um protocolo simples e conveniente para a extração de fase sólida acoplada a um sistema de HPLC-ECD para determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e dois de seus metabólitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e ácido 3,4-diidroxi-fenilacético (DOPAC)) na urina dos bebês. O protocolo estabelecido foi aplicado para avaliar as diferenças de catecolaminas urinárias e seus metabolitos entre lactentes de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis. Análise comparativa revelou uma diferença significativa entre os dois grupos, indicando que os metabólitos de catecolaminas podem ser um marcador de candidato importante para o diagnóstico precoce dos casos em risco de danos cerebrais em crianças em MHPG urinário.

Introduction

Os neurotransmissores catecolaminas e seus conteúdos metabolito em fluidos corporais podem afetar a função neural e afetam o equilíbrio dos Estados de estímulo-resposta-à uma extensão grande1. Abnormities pode causar uma variedade de doenças, tais como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e distúrbios neurológicos1,2. A extração e a determinação de catecolaminas em fluidos corporais é significativo para o diagnóstico das doenças relevantes. No entanto, catecolaminas em amostras biológicas existem em baixas concentrações e são facilmente oxidadas. Além disso, eles são muito difíceis de eluir devido à grande quantidade de interferência no médio3. Assim, a deteção simultânea de catecolaminas em fluidos biológicos ainda é um desafio.

Tem havido comentários mostrando que catecolaminas urinárias podem ser uma medida de stress, e que seus níveis são importantes marcadores biológicos respondendo à estimulação tátil processamento em recém-nascidos5. De acordo com a pesquisa, todas as crianças que sofreram de incidentes prematuros correm risco de lesão de cérebro a4,5,6, e lesão pode causar anormal liberação de catecolaminas e assuntos afins para os fluidos. Existem técnicas avançadas de ressonância magnética que podem detectar danos cerebrais em anteriores fases7,8. No entanto, dentro as primeiras 48 horas, um processo de desenvolvimento neurológico anormal causará danos cerebrais permanentes que não será evidente em imagens médicas11. Além disso, os recursos de alto custo e escassos instrumento, juntamente com outros fatores, torna impossível para todas as unidades neonatais ter acesso a estas técnicas especializadas de neuro-imagem. No entanto, o uso de um biomarcador facilmente acessível e prático (como catecolaminas e seus metabólitos) poderia superar estas deficiências, e a seleção de um biomarcador em fluidos humano pode ajudar no diagnóstico precoce de lesão cerebral e levar a solicitar identificação dos infantes recém-nascidos necessitam de neuroproteção9. As catecolaminas na urina podem ser um índice de fácil e óbvio, devido a correlação direta entre a quantidade deles lançado em fluidos e neuroactivity função.

Entre os fluidos biológicos, líquido cerebrospinal (CSF) e amostras de plasma não são fáceis de obter através de procedimentos traumáticos existentes, e também é muito difícil se livrar de interferência devido a proteína adesiva e outras impurezas, levando a uma incômoda e processo de amostragem demorada que é inadequado para a deteção repetida. Além disso, para as crianças, é quase impossível conseguir as amostras de forma traumática. Portanto, a amostragem urinária é melhor do que as outras formas de amostragem, como é não-invasivo, fácil de operar e pode ser feito repetidamente. Amostras de urina são abundantes e fáceis de armazenar e mostrar grandes vantagens sobre as outras formas de amostras biológicas.

Os principais métodos para quantificar as catecolaminas em fluidos biológicos incluem ensaios de radioenzymic10, ensaios imune-adsorvente enzima-lig11, voltametria12 e lente térmica espectrometria13. Mas existem deficiências, tais como operações complicadas e difíceis de detectar alvos múltiplos. Hoje, a técnica de análise dominante é a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)14, juntamente com o sensível eletroquímica15 ou fluorimétrica deteção16, devido à sua alta sensibilidade e seletividade de boa. Com a tecnologia de espectrometria de massa em tandem, tais como cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS) e espectrometria de massa cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS/MS), a análise e quantificação dos neurotransmissores podem alcançar alto precisão e especificidade17,18. No entanto, a técnica requer instrumentação cara, bem como mão de obra qualificada substancialmente, dificultando o método a aplicar-se universalmente em laboratórios mais convencionais. Sistemas de HPLC-ECD são comumente equipados em laboratórios clínicos e mais convencionais e tornaram-se assim uma escolha comum e bom para grupos de pesquisa a ser usado para determinação de química, mas eles exigem a amostra introduzida no sistema para ser limpo e de microescala volume19. Assim, é de grande importância para purificar e condensar a amostra antes da análise. O método clássico para a etapa de purificação é extração líquido-líquido14,15,20 e off-line extração de fase sólida, incluindo alumina ativada coluna21,22 e diphenylborate (DPBA) complexação23,24,25,26.

Myeongho Lee et al . Tenho vindo a utilizar resina de polímero quimicamente modificada com éter de coroa como o adsorvente para extrair seletivamente catecolaminas de urina humana desde 200727. Além disso, em 2006, que Haibo et al. demonstrou uma abordagem de síntese facile para boronate afinidade extração adsorvente byutilizing um nanomagnetic functionalizable silsesquioxane oligoméricas poliédrico (POSS) composto de nanomagnetic com base e aplicando-a para o enriquecimento de catecolaminas em urina humana (noradrenalina, adrenalina e isoproterenol)28. Eles também aproveitaram os nanomateriais para cumprir o trabalho, usando uma tecnologia chamada nano-eletrofiação e formando o material fibroso de polímero em nanoescala. O processo de eletrofiação pode ajustar o diâmetro, morfologia e alinhamento espacial do produto, controlando a tensão de funcionamento e alterando o conteúdo da solução de fiação, juntamente com outros parâmetros,29. Comparado com o cartucho convencional do SPE, electrospun Nanofibras são altamente apropriadas extrair e enriquecer os analitos de destino de uma matriz complexa, como são equipados com elevados rácios de superfície-área-volume para adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada, e apresentam mais facilmente controlado superfície químicas Propriedades, permitindo que o apego à mão dos compostos alvo. Estas propriedades fazem-lhes boas escolhas para adsorventes SPE, reduzindo a fase sólida e a dessorção solvente quantidade30,31,de32,33. Para catecolaminas em amostras de urina, electrospun nanofibras compostas de éter de coroa apolymeric com poliestireno (PCE-PS) foram usadas para extrair seletivamente três catecolaminas (NE, E e DA)34. O jornal indicou que o éter de coroa seletiva adsorvido os destinos do NE, E e DA, que foi baseada na sua geometria correta para a vinculação de catecolaminas através de formando ligações de hidrogênio. Os resultados exibidos o éter coroa material efetivamente, remoção de outros compostos interferentes contidos em amostras biológicas. Inspirado por este relatório, um novo método foi desenvolvido para a extração seletiva das catecolaminas pelo uso de electrospun de nanofibras composto composto do PCE-PS.

Neste trabalho, o método relatado anteriormente34 foi melhorado e empregados não só para analisar com êxito E, NE e o pai, mas também seus metabolitos, MHPG e DOPAC, na urina. Podemos também explorar novas possibilidades para o mecanismo do processo de adsorção. O método mostra satisfatória eficiência de extração e seletividade para os cinco analitos, e o método foi verificado na análise da urina de bebês de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis.

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Protocol

Foi obtido consentimento dos pais, e aprovação do Conselho de revisão institucional foi obtida para o estudo. O estudo foi realizado em conformidade com o código de ética da associação médica mundial (declaração de Helsinque) para experimentos envolvendo seres humanos. Cuidadores de todos os participantes fornecidos autorização por escrito para serem incluídos no estudo. Aprovação do Comitê de ética do Hospital de Zhongda, afiliado com a Universidade do sudeste, obteve-se também.

1. preparação das soluções necessárias para a extração e a determinação de catecolaminas e colunas

  1. Prepare a coluna PFSPE. Divida 1-2 mg de nanofibras de PCE-PS em alíquotas de 5-6 e use uma haste de aço fina com 0,5 mm de diâmetro para comprimi-los ordenada na extremidade de uma ponta da pipeta com um volume de 200 µ l.
  2. Preparar a urina artificial por pesagem ureia 2,427 g 0,034 g de ácido úrico, creatinina de 0,09 g, citrato trissódico 0,297 g, 0,634 g de cloreto de sódio, 0,45 g de cloreto de potássio, 0,161 g de cloreto de amónio, 0,089 g de cloreto de cálcio dihidratado, 0,1 g de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 0,034 g de bicarbonato de sódio, oxalato de sódio 0,003 g, 0,258 g sulfato de sódio, fosfato de-hidrogenofosfato de sódio 0,1 g e hidrogenofosfato dissódico de 0,011 g e dissolver os produtos químicos acima em 200 mL água deionizada água.
  3. Prepare 2 mg/mL solução stock de diphenylborate (DPBA) solução dissolvendo-se 2 mg do composto em 1 mL de água destilada. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C.
  4. Padrão do analito
    Nota: A estrutura química e propriedades de catecolaminas são instáveis e facilmente decompor. O processo de preparação das normas tem que ser muito rápido e deve evitar a exposição à luz solar direta.
    1. Pese 1,0 mg de NE, E, DA, MHPG, DOPAC e padrão interno 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA em tubos de microcentrifuga separadas 1,5 mL. Dilua a solução DHBA em água a 100 ng/mL antes da utilização.
    2. Oscila os padrões preparados no escuro em alta velocidade até analitos dissolvem completamente. Este é o estoque principal; armazenar a-20 ° C por até várias semanas.
    3. Prepare os 1.000 estoques secundária do analito ng/mL. Para NE, E, DA, DOPAC e MHPG, transferir 5 µ l de cada analito primário estoque para 4.975 µ l de água destilada em um tubo de centrífuga de 5 mL e armazená-lo no escuro a 4 ° C até o uso. Prepare estes diariamente novas soluções. Para DHBA, transferir 5 µ l de caldo primário para 4.995 µ l de água destilada em um tubo de centrífuga de 5 mL e armazená-lo no escuro separadamente a 4 ° C.
    4. Fazer mais diluições com o estoque de analito secundário para criar uma curva padrão (ex., complementar a tabela 2). Loja soluções no escuro a 4 ° C e preparar fresca diariamente.
    5. Teste a voltagem ideal do detector ECD usando o estoque padrão com concentração adequada. Varia a tensão para encontrar um valor onde os analitos tem a melhor aparência de pico.
  5. Preparar o eluente contendo ácido fosfórico de 30%, 15% acetonitrila, e 55% de água destilada. Para 10 mL de solvente eluente, usar 5,5 mL de água destilada e adicione 1,5 mL de acetonitrilo e 3 mL de ácido fosfórico gota a gota na água.

2. preparação de amostras de urina Real e fase móvel

  1. Têm mães coletar a primeira urina da manhã de seus bebês usando copos de urina asséptica. Transferi as amostras em tubos de polipropileno e rótulo imediatamente. Em seguida, armazene as amostras no congelador-20 ° C.
  2. Vórtice e centrifugar as amostras urinárias a 1.510 x g durante 10 minutos a temperatura (RT) para livrar-se da maioria das partículas interferência. Descartar o sedimento e reunir os sobrenadantes para novas experiências. A fim de extrair analitos efetivamente, proceda à PFSPE pré-tratamento (etapa 3) imediatamente após a centrifugação.
  3. Preparar a fase móvel
    1. Preparar um frasco limpo, pelo menos 1 L. A composição da fase móvel está listada na tabela complementar 1; para a fase móvel de 1 L, medida 6,7242 g de ácido cítrico, 93,06 mg de sal dissódico etileno diamina tetra acético (EDTA), de 7,02 g de ortofosfato de sódio monometallic, 404,5 mg de sal de sódio ácido 1-heptanesulfonic e 3,5 g de sódio hidratam de uma garrafa. Adicionar 40 mL acetonitrila e água destilada para 1.000 mL. Agitar e vibrar ultrassonicamente durante 15 min até que o problema na solução é tudo dissolvido.
    2. Usando um medidor de pH com um eletrodo de vidro, ajuste o valor de pH da fase móvel para 4.21 com uma solução saturada de hidróxido de sódio.
    3. Filtre a fase móvel com uma membrana de microporous fluoreto de polivinilideno 0,45 µm e um dispositivo de sucção de vácuo para se livrar de impurezas.
    4. Use vibração ultra-sônica por 15 min para desgaseificar a fase móvel cada vez antes de usar.

3. PFSPE extração e análise HPLC

  1. Ative as nanofibras. Pressione 100 µ l de metanol e 100 µ l de água sequencialmente através da coluna PFSPE usando uma seringa de 5 mL de forma lenta, gota a gota.
  2. Urina de Mix 100 µ l da amostra com solução DPBA 100 µ l 2 mg/ml e 30 µ l 100 ng/ml de solução DHBA (IS, padrão interno) em um tubo de 0,5 mL EP e, em seguida, transferir a solução mista para a coluna PFSPE. Pressione a solução mista amostra através da coluna PFSPE com uma seringa 5ml de plástico herméticos usando a força da pressão do ar.
  3. Lixiviar coluna três vezes carregando 100 µ l de solução DPBA (2 mg/mL) em coluna SPE e empurre a solução lentamente através do cartucho com uma pressão de ar, utilizando uma seringa de plástico herméticos de 5 mL.
  4. Carregar 50 µ l do eluente na coluna PFSPE e empurrá-lo através da coluna, recolhendo o eluído com um tubo de 0,5 mL EP.
  5. Ligue o desgaseificador HLPC para desgaseificar o ar no sistema. Antes da análise da amostra, o sistema deve executar para mais de 0,5 h com a fase móvel para equilibrar e reduzir o ruído da linha de base. Ver tabela complementar 1 mostrando os parâmetros de configuração do sistema de HPLC.
  6. 20 µ l do eluato usando um amostrador automático da amostra e depois injetá-lo no sistema de HPLC-ECD.
  7. Quando as pistas estiverem completas, desliga o celular detector usando a interface do detector. Não desligue o celular com o interruptor na parte traseira do detector, como isso poderia danificar o instrumento.
  8. Altere manualmente a composição da fase móvel, 10% de metanol e 90% de água. Executado pelo menos 30 min. Em seguida, altere manualmente a fase móvel para metanol grau HPLC. Executado por cerca de 15 min proteger o sistema em metanol. Execute esta etapa após o tempo de execução recomendado pode resultar em danos para a coluna e o detector. Desligue o fluxo e, em seguida, desligue o desgaseificador.

4. Phenylboronic ácido extração de cartuchos (PBA)

Procedimentos de extração de cartucho PBA foram semelhantes ao regime em Kumar et al. (2011) 25. todas as soluções são empurradas através do cartucho PBA (100 mg, 1 mL) com ar forçado por uma seringa.

  1. Condição do cartucho com 1 mL 80: 20 acetonitrila-água (v/v) contendo 1% de ácido fórmico e 1 mL de tampão fosfato de 50mm (pH 10) sequencialmente.
  2. Pressione a amostra de urina no buffer (tampão de fosfato de urina e 2 mL de 1 mL, pH 8,5) através do cartucho do PBA.
  3. Lave o cartucho com 1 mL 50: 50 v/v acetonitrilo-fosfato (10 mM, pH 8,5).
  4. Eluir o cartucho com 1 mL de acetonitrila-água (80: 20 v/v) contendo 1% de ácido fórmico.

5. identificação e quantificação de catecolaminas

  1. Linearidade
    1. Diluir o estoque de analitos secundário com urina artificial de seis concentrações (1.5, 3, 12, 25, 50 e 100 ng/mL); o volume de diluição da urina artificial segue suplementares tabela 2. Fazer três amostras paralelas com cada concentração para obter 18 analito experimental soluções para a construção de curvas de calibração.
    2. Dilua o estoque secundário de DHBA com urina artificial 10-fold para obter a solução experimental de 100 ng/mL.
    3. Pré-tratamento todas as soluções de analito de 5.1.1, de acordo com a etapa 3 (procedimentos de extração de PFSPE). Como na etapa 3, Injecte 20 µ l de cada eluído correspondente no sistema HPLC-ECD para obter uma cromatograma HPLC.
    4. Construir as curvas de calibração das substâncias a cinco analisar plotando a relação da área do pico (metas/IS) como eixo Y contra a relação de concentrações (metas/IS) como o eixo X, conforme mostrado na Figura complementar 1.
  2. LOD e LOQ valor para sensibilidade
    1. Injecte 20 µ l de urina artificial em branco no sistema HPLC-ECD (como na etapa 3), para obter o cromatograma HPLC da amostra.
    2. No cromatograma da 5.2.1, coletar os 11 valores de sinal em branco e calcular o valor médio Xb e o desvio-padrão Sb. Calcular o mínimo sinal de uma substância que pode ser detectada em um determinado nível de confiança, X,L, como XL = Xb+ K * Sb (K é o coeficiente determinado pelo nível de confiança, Sb reflete o nível de ruído a método de medição e o nível de ruído da máquina). Assim, LOD = (a XLX -b) / s = (K * Sb) /S (S significa o valor da inclinação da curva de trabalho).
    3. Defina um número de 3:1 (K = 3) como o limite de detecção (LOD) e um S/N de 10:1 (K = 10) como o limite de quantificação (LOQ).
  3. Avaliar as recuperações
    1. Prepare as amostras de urina real e cravado. Diluir o estoque de analitos secundário com urina real de três concentrações (5, 50, 100 ng/mL) para obter as amostras de urina cravado. Prepare três amostras paralelas para cada solução de analito. Conte a concentração cravada como a quantidade de compostos cravado em amostra de urina. Defina esse valor como ums.
    2. Estoque DHBA diluído para 100 ng/mL, como na etapa 5.1.2.
    3. Processar cada solução de amostra de 5.3.1 de acordo com a etapa 3 (procedimentos de extração de PFSPE) e injectar a 20 µ l de cada eluente correspondente no sistema HPLC-ECD para obter o resultado do cromatograma. O valor de analitos será contado como uma quantidade de compostos quantificados na amostra de urina cravado. Defina esse valor como umt.
    4. Injecte 20 µ l de amostra de urina no sistema HPLC-ECD (como na etapa 3) para obter o resultado do cromatograma. O valor de analitos será contado como uma quantidade inicial de compostos quantificados na amostra de urina. Defina esse valor como umeu.
    5. Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Estima-se a percentagem de recuperação como metodológico recuperação % = (umt - Aeu) × 100 / (s). Valores médios são mostrados na tabela 1.
  4. Avaliar a imprecisão
    1. Prepare amostras de urina artificial cravado de 5, 50 e 100 ng/mL concentrações como na etapa 5.3.1. Prepare-se seis amostras paralelas para cada solução de analito. Prepare amostras experimentais frescas todos os dias.
    2. Dilua o estoque DHBA de 100 ng/mL como na etapa 5.1.2.
    3. Avaliar a precisão intradia (n = 6). Processar cada solução de amostra em 5.4.1 de acordo com a etapa 3 e injectar a 20 µ l de cada eluente correspondente no sistema HPLC-ECD para obter o cromatograma. Fazer a mesma operação seis vezes no mesmo dia.
    4. Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Sob a mesma concentração do mesmo composto, o desvio-padrão relativo (RSD) dos seis ensaios em um dia é determinado como precisão intradia. Valores médios são mostrados na tabela 1.
    5. Avaliar a precisão inter dia (n = 6). Ao mesmo tempo todos os dias nos seis dias sequenciais, preparar amostras de urina artificial cravado para três concentrações de 5, 50, 100 ng/mL, como em 5.4.1 e 5.4.2. e processar cada analito solução da amostra de acordo com a etapa 3.
    6. Injecte a 20 µ l de cada correspondente eluato de 5.4.5 no sistema HPLC-ECD para obter resultados de cromatograma cada dia. Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Dia Interamericano de precisão é expresso o RSD da quantidade das amostras urina artificial cravado nas três concentrações de ensaios em seis dias sequenciais. Valores médios são mostrados na tabela 1.

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Representative Results

Este protocolo é um método PFSPE simples e conveniente para pré-tratamento de amostras de urina e enriquecer cinco catecolaminas para a deteção através de um sistema de HPLC-ECD; um diagrama do processo é mostrado na Figura 1. O protocolo inclui principalmente quatro etapas-ativando, carregamento, lavagem e farmacológicos - juntamente com uma pequena quantidade de nanofibras de PCE-PS e um dispositivo simples extração de fase sólida. A morfologia de nanofibras de PCE-PS foi avaliada utilizando um analisador de superfície e porosidade (ver Tabela de materiais). O textural Propriedades-the BET (Brunauer, Emmett e Teller) superfície, área, volume de poros e tamanho do pore-foram 2,8297 m2 g-1, 0,009 cm3 g-1e 12.76 nm, respectivamente. Estes dados indicam que o material usado no protocolo nanoescala poros na superfície, que pode contribuir para a eficiência de alta adsorção e o pH de vinculação abaixado no protocolo.

Este protocolo usa volumes otimizados, ingredientes de amostra, lixiviados, eluente, etc., bem como o pH de trabalho e tempo consumido durante os procedimentos. Em Chen et al., o eluente foi uma solução de ácido acético de 12,0 M porque condições ácidas causam o adsorvente tornar-se protonados e carregados positivamente, que é favorável para a eluição de CAs34,35. Neste estudo, a receita de eluente foi recondicionada para ser 30% ácido fosfórico, 15% acetonitrila, e 55% de água destilada. O valor de pH final do eluente foi ajustado para 3.0. O solvente eluente deve ser mantido em um ambiente ácido quando farmacológicos, mas muito mais moderada do que ácido acético 12,0 M, o que pode levar ao aparecimento de pico pobre e danos no sistema HPLC.

Para identificação das catecolaminas, tempos de retenção cromatograma dos picos nas amostras com picos de solução-padrão são comparados. A Figura 2 mostra exemplos de cromatogramas de HPLC-ECD das várias soluções. Se o protocolo é seguido com sucesso, os perfis cromatográficos de três catecolaminas e seus metabólitos devem ser obtidos por HPLC-ECD com picos claro simétricos, bem definidos e com ruído de fundo mínimo, conforme ilustrado na Figura 2 de . Para comparação com o método convencional, um cartucho PBA comercial foi selecionado como um controle. Na Figura 2(um–c), cinco picos de alvo em (b) são significativamente maiores do que thaosein (c), indicando que o método PFSPE é mais sensível que o método de cartucho do PBA. Também, o pico DOPAC não mostrou o resultado de extração de cartucho PBA, indicando que a coluna PBA não foi capaz de extrair DOPAC. Figura 2 (d) retrata o cromatograma da amostra de urina em branco sem qualquer tratamento prévio e (e) a Figura 2mostra os cromatogramas da amostra urina extraídos utilizando nanofibras compostas de PCE-PS. Figura 2 (f) mostra os cromatogramas da amostra de urina após a extração com a coluna PBA, que também não mostra nenhuma extração de DOPAC consistente com o resultado na Figura 2(c). O diagrama indica que o método PFSPE não pode extrair apenas os alvos com bom efeito, mas também poderia livrar-se da maior parte da interferência na urina, dando bom pico identificação para os compostos alvo.

A análise estatística revelou que medições para as três catecolaminas e os dois metabólitos foram confiantemente reproduzido (tabela 1). O destino de todos os compostos mostrou boa linearidade entre 1,5 e 100 ng/mL (R2> 0,99), e a curva padrão de cada analito pode ser encontrada em complementar a Figura 1. As curvas e R2 valores demonstram que os analitos têm boa linearidade e a relatividade em um determinado intervalo linear, apropriada para o cálculo das concentrações dos analitos em amostras de urina. Os limites de detecção (LOD) variaram de 0,25 a 0,54 ng/mL, e os limites de quantificação (LOQ) eram 0,83 a 1,81 ng/mL, respectivamente. O valor de sinal-ruído (S/N) igualou 3. A gama das recuperações metodológicas dos compostos cinco alvo foi de 97,4% (MHPG) a 124,2% (DOPAC), que foi satisfatório para o aplicativo para as amostras reais. A precisão intradia foi de 2,7 a 4,8% (expressado como desvio padrão relativo) e a precisão do dia Inter foi 2-8,1%, exibindo boa precisão e repetibilidade.

Para detecção de alvos em amostras de urina real, 28 crianças de alto risco e 22 lactentes saudáveis na divisão de assistência à infância, hospital municipal de Suzhou, foram recrutados. Todas as 50 crianças tidas em estudo eram meninos. Quando eles foram seis meses de idade, foram levados para um exame de rotina de saúde em setembro de 2016. Todas as amostras de urina foram coletadas e pré-tratados seguindo os passos do protocolo 3.1 e 3.2, e as amostras foram analisadas usando o restante da etapa 3. As concentrações foram calculadas contra as curvas de calibração. Diferenças estatísticas foram analisadas por análise de variância (ANOVA). Os resultados podem ser vistos na tabela 2. A diferença das catecolaminas e metabólitos entre os dois grupos foram comparados e analisados. Os p-valores mostram que as catecolaminas não foram significativamente diferentes entre os grupos saudáveis, de alto risco e, enquanto o conteúdo MHPG metabólito foi diferente entre estes grupos (p = 0,001). O grupo de crianças de alto risco teve quantidades mais elevadas de MHPG que o grupo controle (14,8 ± 3,6 ng/mL vs 1.4 ± 0,2 ng/mL), o que significa que o nível de MHPG urinário pode ser um potencial marcador para identificação precoce de crianças de alto risco.

Figura 3 e tabela 3 descrevem o método clássico de quantificação para determinar materiais de monoamina e comparam com outros métodos para que o processo de operação e figuras do interesse são dadas. Em comparação com métodos clássicos, o método PFSPE tem vantagens como um timespan curto (5-10 min), processo de operação simplificada, solvente orgânico menos e mais simpatia ambiental com parâmetros metodológicos satisfatórias. A quantidade de eluente necessária é baixa em volume (50 µ l) e a etapa de enriquecimento de destino não requer nenhuma evaporação, que promove grandemente a sensibilidade de detecção para os compostos na urina. Comparado ao convencional baseada em partículas SPE, este método aprimorado a eficiência, simplificou o processo de preparação e reduziu o tempo de análise com sensibilidade, seletividade e confiabilidade aceitável.

Figure 1
Figura 1 : Fluxograma esquemática do processo PFSPE no jornal e uma representação do seu dispositivo. (1) Gastight seringa, (2) pipeta ponta e (3) embalado nanofibras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Cromatogramas das amostras diferentes. (uma) amostra de água Spiked com alvos e é em (100 ng/mL) sem extração. (b) água Spiked amostra extraída pelo método PFSPE e (c) por cartucho de ácido (PBA) phenylboronic comercial. (d) Real em branco urina amostra sem extração. (e) Real urina amostra extraída pelo método PFSPE. (f) Real urina amostra extraída por cartucho comercial do PBA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Fluxograma analítica dos métodos de determinação. (a, b) Relatado anteriormente métodos de extração clássica. (uma) extração de alumina, (b) por DPBA complexo e (c) o método proposto neste trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Figura 1: equações e curvas padrão. As curvas padrão para os cinco analitos são construídas para usar a equação da linha para calcular a concentração de analitos desconhecido na amostra. (um) NE, E (b), (c) DA, MHPG (d) e (e) DOPAC. Clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 2: interação de afinidade Boronate entre o grupo ácido e cis-diol boronic ou adjacentes dois grupos hidroxila. (A) diagrama esquemático da interação entre ácidos boronic e vários grupos -OH de ésteres cíclicos cinco - ou seis membros do formulário. (B) grupo Cis-diol ou adjacentes dois grupos hidroxila em círculos vermelhos mostram os sites principais de reação para os cinco analitos para boronic ácido composto. Clique aqui para baixar esta figura.

NE MHPG E É DOPAC DA
Escala linear (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
Valores de R-quadrado 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0,322 0,313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1,072 1.043 2.191 0,83 1.809
Recuperação ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Precisão (% RSD) (n = 9)
Intradia 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Dia Interamericano de 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5.9
NE, norepinefrina; MHPG, 3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol; E, epinefrina; IS, padrão interno; DOPAC, 3, ácido 4-Dihydroxyphenylacetic; Promotora, dopamina;

Tabela 1: Resultados analíticos do protocolo proposto para a determinação de três catecolaminas e dois metabolitos com soluções-padrão.

Concentração (ng mL-1) Grupo controle (22) Grupo de alto risco infantil (28) Valor de P
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0.001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0,312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0.76
P < 0,05 * * * mostra uma diferença significativa entre os dois grupos

Tabela 2: comparação das concentrações de três catecolaminas e dois metabólitos em urinas entre lactentes saudáveis e bebês de alto risco. Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando a análise de variância (ANOVA) com nível de significância de p = 0,05 para as diferenças entre o conteúdo de MHPG. Significa ± desvios-padrão são mostrados.

Amostra Solvente exausto (mL) Volume de amostra (mL) Tempo de pré-tratamento (min) Escala linear LOD Recuperação relativa (%) Evaporar e
redissolver		 Método analítico
solvente volume de tempo (min) recuperação (%) solvente e
(mL) (mL) reconstituir
resíduo de
Urina 0,5 0.05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0,2-0,5 ng/mL (NE, E, DA) 88,5-94.5 (NE, E, DA) Não HPLC-ECD (Chen et al., 2016)
Urina 19 0.7 — 47 – 167 µ g/L (DA) 166-500 nM (DA) 98.3-101.1 (DA) Não HPLC-UV (Piotr et al., 2016)
Urina 1.3 0.01 — 1250 – 0,5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0,5 a 2,5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74,1 – 97,3 (NE, E, DA, NMN, MN) Não LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Urina e plasma 20 0.05 10 0,04-2,5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01-0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87.0-97,5 (NE, E, DA) Não HPLC-UV (Mohammad et al., 2016)
Urina < 0.5 0.1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97,4-124,2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) Não Este trabalho
—, Indefinido.
PBA, ácido Phenylboronic

Tabela 3: Comparação deste trabalho com estudos sobre a pré-tratamento de monoaminas ou de outros tópicos relacionados nos últimos anos.

Suplementares tabela 1: parâmetros de detecção e quantificação de analitos no jornal por HPLC-ECD do instrumento. Clique aqui para baixar esta tabela.

Suplementares tabela 2: preparação da curva de calibração para cinco analitos. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

O método PFSPE proposto neste trabalho pode ser significativo e significativo no que diz respeito a sua rapidez, simplicidade e conveniência. Os adsorventes usados no protocolo são electrospun de nanofibras, que têm altos superfície rácios de área e o volume e adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada. O procedimento só precisa de alguns miligramas de nanofibras e um pequeno volume de solvente eluente e não requer uma etapa de evaporação para concentrar os analitos. Aqui, apresentamos uma visão geral detalhada de um protocolo de HPLC-ECD baseada que permitirá novos usuários para estabelecer um método eficaz para a deteção e a quantificação de três catecolaminas e dois dos seus metabólitos (NE, E, DA e MHPG, DOPAC).

A superioridade do presente protocolo decorre principalmente dos quatro passos críticos durante os procedimentos, conforme mostrado na Figura 1: usando o PCE-PS nanofibras para capturar os compostos alvo para reduzir o tamanho de adsorvente para alguns miligramas, levando a uma rápida adsorção / dessorção e precisando apenas de um pequeno volume de eluição líquido (1); adicionando DPBA na urina para complexos com os analitos para melhorar sua hidrofobicidade (2); enxaguar as nanofibras com a solução contendo DPBA para reter os analitos e remover as impurezas (3); e otimização da extração e análise de condição para obter boa sensibilidade e seletividade para os analitos (4).

Para a etapa (1), o mecanismo do desempenho superior de capacidade adsorvente para PCE-PS pode atribuída a uma variedade de fatores. Os polímeros de éter de coroa dopados nas nanofibras podem formar um complexo de anfitrião-convidado com as moléculas de comentários que contêm grupos amina por H-títulos, tais como as catecolaminas neste trabalho. Além disso, Hongyou Hu et al e Jishun Chen et al . também propôs que boronic ácido pode ligar-se com átomos de nitrogênio na estrutura química através de interações de B-N, e que o esqueleto hidrofóbico pode interagir com anéis de benzeno e outros grupos alifáticos de analitos36,37. Além disso, durante o processo de dessorção, as ligações de hidrogênio e interações de B-N são facilmente quebradas em pH muito baixo; assim, macroporosa com pH ácido é geralmente adequadas para a exploração de dessorção. Além disso, existem também diversas interações secundárias, incluindo hidrofóbicos, iônico e o hidrogénio, o que pode ocorrer entre boronic produtos químicos e compostos relacionados36,37,38. Todas essas interações podem contribuir para a adsorção dos analitos aos materiais.

Para a etapa (2), com a ajuda do DPBA adicionado, PCE-PS nanofibras adsorver complexos DPBA-catecolamina rapidamente. Zhen Liu et al . mostraram que os materiais de afinidade boronate surgiram como importantes meios de comunicação para a separação selectiva e o reconhecimento molecular de compostos orgânicos, tais como nucleosídeos, sacáridos, os glicanos, glicoproteínas e assim por diante38. A complexação ocorre principalmente a partir da interação de afinidade boronate entre dois grupos hidroxila adjacente e grupos cis-diol ou ácido boronic para ésteres cíclicos de membros de forma cinco ou seis, como mostrado em Figura complementar 2A. Complementar a figura 2B retrata os sites principais de reação para os cinco analitos neste trabalho para o composto ácido boronic. Quando o ambiente se tornar ácido, o complexo ácido-cis-diol boronic dissocia-se. A interação entre boronic ácido e o grupo de cis-diol ou dois grupos hidroxila adjacente existe extensivamente e relativamente forte.

Etapa (3), o complexo formado entre analitos e DPBA pode mantê-los sobre o adsorvente enquanto outras impurezas são lavadas pela superfície PCE-PS, alcançar a melhor reserva para os alvos. Para o passo (4), tem havido um relatório mostrando que o pH ideal era cerca de 9.0 para a ligação de ácido bórico e catecol composto39. No entanto, Chen et al. explorou o melhor valor de pH para os complexantes de catecolamina-DPBA e descobriu que o desempenho de adsorção dos composto nanofibras PS-PCE para o CAs era ideal, quando o valor de pH foi alterado para ser entre 6.0 e 7.034,35. Liu et al implicado que a estrutura dos materiais de apoio para compostos de ácido boronate, especialmente com o confinamento espacial das cavidades nanoescala poros e os ligandos de B-N formados durante a reação, pode diminuir também significativamente a vinculando o pH e aumentar a vinculação afinidade38. A estrutura do PCE-PS, bem como estrutura de catecolamina está todos equipada com - NH-grupos. Assim, as propriedades e os poros de nanoescala do PCE-PS (dados conforme mostrado nos Resultados do representante), bem como ligantes de B-N formados, podem contribuir para o pH de vinculação abaixado no protocolo. Assim, o valor de pH ideal neste protocolo pode ser neutro, que grandemente simplifica procedimentos e evita a degradação das substâncias a analisar.

As principais limitações do catcholamine determinação são que suas concentrações em amostras biológicas são muito baixas e que suas estruturas são instáveis (facilmente oxidado); Além disso, é difícil de se livrar das impurezas na mídia. Assim, para análise das catecolaminas em amostras biológicas, pré-tratamento, geralmente por extração de fase sólida, é necessário. O método PFSPE proposto neste documento fornecido uma pré-concentração simples e conveniente para os analitos em amostras de urina. Mas, quando se faz o experimento, a condição de experiência deve ser estritamente controlada, por meios de evitar a exposição à luz e encurtamento do pré-tratamento tempo tanto quanto possível.

A aplicabilidade do método foi avaliada pelo seu uso para determinar as concentrações de três catecolaminas e dois metabolitos na urina de crianças saudáveis e bebês de alto risco. Houve diferença significativa entre os dois grupos do MHPG urinário. Como resumiu anteriormente, a quantidade MHPG no corpo humano é agora principalmente relatada como um índice para refletir noradrenérgico Tom neuronal, a atividade do metabolismo de catecolaminas na central e periférico nervoso sistemas40,41, 42, e é um marcador útil plasma/urina para central metabolismo NE43. Para lactentes de alto risco, uma variedade de fatores, como a encefalopatia hipóxico-isquêmica (HIE) faz com que o cérebro insultos trauma e cérebro, levando a diferentes graus de défices de desenvolvimento neurológico de infância. Este dano cerebral por sua vez levará para a liberação de neurotransmissores (MHPG incluído) em fluidos corporais44,45. De acordo com relatórios por J.W. Maas, existem correlações significativas entre o cérebro, CSF, plasma e concentrações urinárias de MHPG46,47. A medida do total MHPG (free + conjugado) na urina tem sido muito utilizada para avaliar o metabolismo do NE central e periférico NE metabolismo em seres humanos41,,48,49. Assim, pode concluir-se que bebês de alto risco têm danos noradrenérgico Tom neuronal em comparação com os saudáveis, que afetam o metabolismo de catecolaminas no central e periférico nervoso sistemas. Esta discrepância indica que uma pesquisa mais adicional deve ser feita na relação entre os déficits de nível e desenvolvimento neurológico MHPG urinários. Foi demonstrado que o método proposto pode ser utilizado para a determinação da presença de catecolaminas na urina, com uma perspectiva promissora para uso na clínica para avaliar doenças relevantes para estes neurotransmissores.

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Disclosures

Os autores certificam que não há nenhum conflito de interesses com qualquer organização financeira sobre o material discutido neste artigo.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado por nacional Science Foundation da China (No.81172720, n. º 81673230), o programa de investigação Social desenvolvimento de Jiangsu província ciência e departamento de tecnologia (n. º BE2016741), ciência & tecnologia projeto da China a administração geral de supervisão da qualidade, inspeção e quarentena (2015QK055), o programa de abrir projeto de laboratório chave de desenvolvimento infantil e aprendizagem das Ciências do Ministério da educação, Universidade do Sudeste (CDLS-2016-04). Sinceramente, reconhecemos canção Yuan e Ping Liu, que nos ajudaram na recolha de amostras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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Química edição 133 catecolaminas coroa polimérica nanofibras electrospun extração de fase sólida embalado-fibra (PFSPE) cromatografia líquida de alta pressão com deteção eletroquímica (HPLC-ECD) lactentes de alto risco
Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos
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