Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Ayıklama ve çözümleme katekoiamin nörotransmitter ve onların metabolitleri yüksek basınçlı sıvı Kromatografi ile uygun bir yöntem

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Biz aynı anda üç monoamin nörotransmitter belirlenmesi ve iki onların metabolitleri bebekler idrar için yüksek basınçlı sıvı Kromatografi (HPLC) elektrokimyasal algılama (ECD) ile birleştiğinde uygun bir katı fazlı çıkarma mevcut. Biz Ayrıca metaboliti MHPG beyin hasarı erken tanısı için potansiyel bir biyomarker olarak bebekler için tanımlar.

Abstract

Çıkarma ve biyolojik sıvı katekoiamin nörotransmitter analizini sinir sistemi fonksiyonu ve ilgili hastalıklar değerlendirmede çok önemli, ama onların hassas ölçüm hala bir meydan okuma. Birçok iletişim kuralları nörotransmitter ölçüm için aletleri, yüksek basınçlı sıvı Kromatografi (HPLC) dahil olmak üzere çeşitli tarafından tarif edilmiştir. Ancak, orada eksiklikleri, karmaşık işlemi gibi veya algılamak zor kaçınamayız, birden çok hedef ve halen, baskın analiz tekniği hala nedeniyle duyarlı elektrokimyasal veya fluorimetric algılama, ile birleştiğinde HPLC onun yüksek hassasiyet ve iyi seçicilik. Burada, detaylı bir protokol Önarıtma ve elektrokimyasal algılama (HPLC-ECD) ile yüksek basınç sıvı Kromatografi ile katekolaminler tespiti için bebeklerin electrospun kompozit nanofibers oluşan kullanarak gerçek idrar örneklerinde açıklanmıştır Polimer taç eter ile adsorbent olarak polistiren, Paketli lifli katı faz ayıklama (PFSPE) yöntemi olarak da bilinir. Biz nasıl idrar örnekleri kolayca bir katı faz nanofiber Paketli sütun tarafından ve nasıl örnek analitler hızla zenginleştirilmiş, precleaned desorbed ve bir ECD sistemde algılanan gösterilmiştir. PFSPE büyük ölçüde azalmış saat, masraf ve azaltma hedefleri kaybı için izin biyolojik örnekleri, tedavi öncesi işlemleri basitleştirir.

Genel olarak, bu iş için aynı anda üç monoamin nörotransmiterler (norepinefrin (NE), epinefrin (E), dopamin (DA)) belirlenmesi ve iki adet HPLC-ECD sistemine birleştiğinde katı fazlı çıkarılması için basit ve uygun iletişim kuralı gösterir onların metabolitleri (3-metoksi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) ve 3,4-dihidroksi-fenilasetik asit (DOPAC)) için bebeklerin idrar. Oluşturulmuş protokol idrar katekolaminler farklılıkları ve onların metabolitleri perinatal beyin hasarı ile yüksek riskli bebeklerde ve sağlıklı kontrol arasında değerlendirmek için uygulandı. Karşılaştırmalı analizi idrar MHPG katekoiamin metabolitleri önemli aday marker bebeklerde beyin hasarı riski olguların erken tanı için olabilir gösteren iki grup arasında önemli bir fark ortaya koydu.

Introduction

Katekoiamin nörotransmitter ve metaboliti içeriklerini vücut sıvıları içinde sinir işlevi etkiler ve yanıt uyarıcı Birleşik büyük ölçüde1dengesini etkiler. Abnormities hastalıkları, pheochromacytoma, ganglioneuroma, Nöroblastom ve nörolojik bozukluklar1,2gibi çeşitli neden olabilir. Ayıklama ve vücut sıvıları katekolaminler belirlenmesi ilgili hastalıklar tanı için anlamlı. Ancak, katekolaminler biyolojik örneklerde düşük konsantrasyonlarda mevcut ve kolaylıkla okside. Ayrıca, onlar orta3girişim büyük miktarda nedeniyle elute çok zordur. Böylece, eş zamanlı algılama katekolaminler biyolojik sıvı içinde hala bir meydan okuma olduğunu.

İdrar katekolaminler stres bir ölçü olabilir ve bunların düzeyleri dokunsal uyarım yenidoğan5' te işleme yanıt önemli biyolojik işaretleri olduğunu gösteren değerlendirmeleri olmuştur. Araştırmalara göre erken olaylar yaşamış olan tüm bebeklerde beyin yaralanması4,5,6etkilenir ve yaralanma anormal sürümü katekolaminler ve ilgili konuların sıvıların içine neden olabilir. Beyin hasarı daha önceki aşamaları7,8' tespit edebilen gelişmiş manyetik rezonans teknikleri var. Ancak, ilk 48 saat içinde bir anormal nörogelişimsel süreç tıbbi görüntüleri11' belli olmayacak kalıcı beyin hasarı neden olur. Ayrıca, yüksek maliyetli ve kıt cihazda kaynaklarla birlikte diğer faktörler erişebilmek için bu özel neuro görüntüleme teknikleri tüm yenidoğan birimleri için imkansız kılar. Ancak, (örneğin, katekolaminler ve onların metabolitleri) kolayca ulaşılabilir ve pratik bir biyomarker kullanımı bu eksikliklerin üstesinden gelebilir ve bir biyomarker insan sıvılar içinde tarama beyin hasarı erken tanısında yardımcı olabilir ve istemesine neden Yeni doğmuş bebekler neuroprotection9ihtiyacı tanımlaması. Katekolaminler idrar kolay ve açık dizin, onları sıvı ve neuroactivity işlevi serbest miktarda arasında doğrudan ilişki nedeniyle olabilir.

Biyolojik sıvı arasında beyin-omurilik sıvısı (bos) ve plazma numuneleri varolan travmatik yordamlar almak kolay değildir ve ayrıca girişim nedeniyle yapışkanlı protein ve diğer kirleri zahmetli bir lider, kurtulmak çok zordur ve Yinelenen algılama için elverişsiz zaman alıcı örnekleme işlemi. Ayrıca, çocuk için travmatik bir moda örnekleri almak neredeyse imkansız. Olduğu gibi non-invaziv, kullanımı kolay, bu nedenle, idrar örnekleme örnekleme, diğer formları daha iyidir ve tekrar tekrar yapılabilir. İdrar numuneleri bol ve kolay depolamak ve biyolojik örnekler diğer formları üzerinde büyük avantajı göstermek.

Katekolaminler biyolojik sıvıları ölçmek için ana yöntemleri radioenzymic deneyleri10, bağışıklık jelleştirici deneyleri enzim bağlı11, voltammetry12 ve termal objektif spektrometresi13içerir. Ama eksiklikler var, karmaşık işlemleri gibi ve sert algılamak Birden çok hedef. Bugün, yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC)14olan yüksek hassasiyet ve iyi seçicilik nedeniyle hassas elektrokimyasal15 veya fluorimetric algılama16ile birleştiğinde, baskın analiz tekniğidir. İle tandem kütle spektrometresi teknoloji gibi sıvı Kromatografi/Kütle spektrometresi (LC/MS) ve Sıvı Kromatograflar/kütle spektrometresi/kütle spektrometresi (LC/MS/MS), analiz ve nörotransmitter miktar yüksek elde edebilirsiniz doğruluk ve özgüllük17,18. Ancak, MS teknik pahalı araçları hem de evrensel en geleneksel laboratuvarlarda uygulamak zor yapım yöntemi önemli ölçüde nitelikli insan gücü gerektirir. HPLC-ECD sistemleri yaygın olarak en geleneksel ve klinik laboratuarlarda donatılmıştır ve böylece kimyasal belirlenmesi için kullanmak araştırma grupları için ortak ve iyi bir seçim haline gelmiştir, ancak içine belgili tanımlık sistem temiz olmak ve bir örnek gerektirir microscale cilt19. Böylece, arındırmak ve örnek analiz önce yoğunlaşmak için büyük önem taşımaktadır. Klasik için arıtma adım sıvı-sıvı ekstraksiyon14,15,20 ve aktif Alümina sütun21,22 de dahil olmak üzere devre dışı katı fazlı ayıklama yöntemidir ve diphenylborate (DPBA) complexation23,24,25,26.

Myeongho Lee vd. kimyasal olarak taç eter ile adsorbent Modifiye polimer reçine seçerek katekolaminler 200727beri insan idrar ayıklamak için kullanıyoruz. Ayrıca, 2006 yılında, Haibo o ve ark. functionalizable nanomagnetic yüzlü oligomeric silsesquioxane (POSS) tabanlı nanomagnetic Kompozit ve katekolaminler içinde zenginlik uygulayarak facile sentez yaklaşım boronate benzeşme ayıklama jelleştirici byutilizing için gösterdi insan idrar28(noradrenalin, epinefrin ve isoprenaline). Onlar da Nanomalzemeler nano-electrospinning denilen ve polimer lifli malzeme içinde Nano oluşturan bir teknoloji kullanarak iş yerine getirmek için kullandı. Electrospinning işleminin çapı, morfoloji ve kayma hizalama ürünün Çalışma voltajı kontrol ve iplik çözüm ile birlikte diğer parametreleri29içeriğini değiştirerek ayarlayabilirsiniz. Analitler yüksek verimlilik ile absorbe için yüksek yüzey alanı için birimi oranları ile donatılmıştır gibi geleneksel SPE kartuşu ile karşılaştırıldığında, electrospun nanofibers ayıklamak ve hedef analitler karmaşık bir matris zenginleştirmek son derece uygun ve Hedef bileşiklerin kullanışlı ek izin daha fazla kolaylıkla kontrol yüzey kimyasal özellikleri, sergi. Bu özellikleri onları SPE adsorbents, büyük ölçüde katı faz ve desorpsiyon solvent miktarı30,31,32,33azaltılması için iyi seçimler yapmak. İdrar örneklerinde katekolaminler için electrospun nanofibers apolymeric taç eter polistiren (PCE-PS) ile oluşan seçici üç katekolaminler (NE, E ve DA)34ayıklamak için kullanılmıştır. Kağıdın seçici taç eter NE, E ve hidrojen bağları oluşturan üzerinden katekolaminler bağlama doğru onun geometri dayanıyordu DA hedeflerinden adsorbe belirtti. Sonuçları malzeme taç eter etkili, biyolojik örneklerde yer alan diğer engel bileşikler kaldırma görüntülenir. Bu rapor esinlenerek, bir roman yöntemi katekolaminler seçici çıkarma için PCE-PS oluşan electrospun kompozit nanofibers kullanımıyla geliştirilmiştir

Bu yazıda, yöntemi daha önce34 geliştirilmiş ve sadece başarıyla E, NE ve DA, aynı zamanda idrar MHPG ve DOPAC, onların metabolitleri analiz etmek için istihdam bildirdi. Biz de adsorpsiyon işlemi mekanizması için yeni imkanlarını kəşf edin! Tatmin edici ayıklama verimliliği ve seçicilik beş analitler için yöntemi gösterir ve yöntem perinatal beyin hasarı ve sağlıklı kontrol ile yüksek riskli bebeklerde idrar analizinde doğrulandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aydınlatılmış onam ailelerden elde edildi ve çalışma için kurumsal inceleme kurulu onayı alındı. Çalışma insanlar içeren deneyler için dünya tıp Derneği (Helsinki Deklarasyonu) etik kodu uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma odasında kayıtlı için yazılı bakıcılar sağlanan tüm katılımcıların. Etik kurul onay Zhongda Hospital, Güneydoğu Üniversitesi ile bağlı, aynı zamanda elde edildi.

1. hazırlanması sütunları ve ayıklama ve katekolaminler belirlenmesi için gerekli çözümleri

  1. PFSPE sütun hazırlayın. PCE-PS nanofibers 1-2 mg 5-6 aliquots bölmek ve onları düzenli bir pipet ucu son 200 µL hacmi ile içine sıkıştırmak için 0,5 mm çapı ile iyi bir çelik çubuk kullanın.
  2. Yapay idrar 2.427 g üre, Ürik asit 0,034 g, 0.09 g kreatinin, 0.297 g TRISODYUM sitrat, 0.634 g sodyum klorür, 0,45 g Potasyum klorür, 0.161 g amonyum klorür, 0.089 g Kalsiyum klorür dihydrate, 0.1 g Magnezyum sülfat ağırlığında tarafından hazırlamak heptahydrate, 0,034 g sodyum bikarbonat, 0,003 g sodyum oksalat, 0.258 g sodyum sülfat, 0.1 g sodyum dihydrogen fosfat ve 0.011 g disodyum hidrojen fosfat ve erime yukarıdaki kimyasallar içine 200 mL deiyonize su.
  3. 2 mg/mL distile su 1 mL 2 mg bahçedeki çözülerek diphenylborate (DPBA) çözüm hisse senedi çözüm hazırlamak. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de çözümde
  4. Analit standart
    Not: Kimyasal yapısı ve özellikleri katekolaminler kararsız ve onlar kolayca ayrıştırılması. Standartları hazırlık süreci çok hızlı olmalı ve doğrudan güneş ışığına maruz kalma önlemek gerekir.
    1. NE, E, DA, MHPG, DOPAC ve iç standart 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA ayrı 1.5 mL microcentrifuge tüpler 1.0 mg tartın. Kullanmadan önce 100 ng/ml suda DHBA çözüm sulandırmak.
    2. Analitlerin tamamen erimesi kadar yüksek hızda karanlıkta hazırlanan standartlar salınım. Bu birincil stok. -20 ° C'de için birkaç hafta kadar saklayın.
    3. İkincil 1000 ng/mL analit stokları hazırlayın. NE, E, DA, DOPAC ve MHPG, her birincil analit stokunun 5 µL distile su içinde 5 mL santrifüj tüpü 4,975 µL içine transfer ve kadar kullanmak 4 ° C'de karanlıkta saklarız. Bu çözümler taze günlük hazırlayın. DHBA için birincil stok 5 µL distile su içinde 5 mL santrifüj tüpü 4.995 µL içine transfer ve karanlıkta ayrı olarak 4 ° C'de depolayın
    4. Standart bir eğri oluşturmak için ikincil analit hisse senedi ile daha fazla dilutions yapmak (örn., ek tablo 2). 4 ° C'de karanlıkta çözümleri depolamak ve taze günlük hazırlamak.
    5. ECD Dedektör standart stok uygun konsantrasyon ile kullanarak en uygun voltaj. En iyi en yüksek görünüm analitler olduğu bir değeri bulmak için voltaj değişir.
  5. % 30 fosforik asit, % 15 Asetonitril, içeren eluant hazırlamak ve % 55 distile su. 10 mL çözücü eluant, 5.5 mL distile su kullanın ve Asetonitril 1,5 mL ve fosforik asit damla damla 3 mL suya ekleyin.

2. gerçek İdrar numuneleri ve mobil faz hazırlanması

  1. Anneler bebeğinde aseptik idrar su bardağı kullanarak ilk sabah idrarı toplamak var. Örnekleri polipropilen borular ve etiket hemen aktarın. Ardından, örnekleri-20 ° C dondurucuda saklayın.
  2. Çoğu partikül girişim kurtulmak için sıcaklık (RT) 1,510 x g 10 min için de idrar örnekleri Oda girdap ve santrifüj. Tortu atın ve daha fazla deneyleri için supernatants toplamak. Analitlerin etkili ayıklamak için PFSPE ön (Adım 3) hemen sonra centrifuging devam edin.
  3. Mobil faz hazırlamak
    1. Temiz bir şişe, en az 1 L. hazırlamak Mobil faz kompozisyonu ek tablo 1' de listelenen; 1 L mobil faz için ölçü 6.7242 g sitrik asit, etilen diamin tetra Asetik asit (EDTA) disodyum tuzu, monometallic sodyum orthophosphate, 7,02 g 93.06 mg 1-heptanesulfonic asit sodyum tuzu 404.5 mg ve 3.5 g sodyum şişe içine hidrat. 40 mL Asetonitril ekleyin ve distile su 1000 ml. Tahrik ve ultrasonik 15 dk kadar çözüm bu konuda tüm çözülür titreşimle.
    2. PH metre ile cam elektrot kullanarak, 4.21 ile doymuş sodyum hidroksit çözüm için mobil faz pH değerini ayarlayın.
    3. 0,45 µm polivinilidin florid gözenekli membran ve kirleri kurtulmak için bir vakum emme cihazı ile mobil faz filtre.
    4. Ultrasonik titreşim 15dk için mobil faz kullanmadan önce her zaman degas için kullanın.

3. PFSPE çıkarma ve HPLC analiz

  1. Nanofibers aktif hale getirin. Metanol 100 µL ve su 100 µL sırayla ile PFSPE sütun 5 mL şırınga yavaş, dropwise bir şekilde kullanarak basın.
  2. Mix 100 µL idrar 100 µL 2 mg/ml DPBA çözüm ve 30 µL 100 ng/ml DHBA çözeltisi (IS, dahili standart) 0.5 mL EP tüp içinde örnek sonra karma çözüm PFSPE sütuna aktarmak. Karışık örnek çözümü PFSPE sütunu boyunca hava basınç güç ü 5 mL gastight plastik şırıngayla tuşuna basın.
  3. SPE sütuna DPBA çözüm (2 mg/mL) 100 µL yükleyerek üç kez sütun leach ve solution'ı yavaş yavaş kartuşu 5 mL gastight plastik kullanarak hava basıncı ile itin.
  4. Eluant PFSPE sütun üzerine 50 µL yük ve eluate 0.5 mL EP tüp ile toplama sütunu boyunca itin.
  5. HLPC degasser hava içinde belgili tanımlık sistem degas açın. Önce örnek analizleri, sistem equilibrate ve temel gürültüyü azaltmak için mobil faz ile daha 0,5 h için çalışması gerekir. HPLC sistemi kurulum parametreleri gösterilen ek tablo 1 bakın.
  6. Bir Otomatik Örnekleyici kullanarak eluate 20 µL örnek ve HPLC-ECD sisteme enjekte etmek.
  7. Ne zaman ishal tamamlandığında, Dedektör arabirimini kullanarak dedektörü hücre kapatmak. Bu araç zarar verebilir gibi cep dedektörü, arkasında anahtarlı devre dışı değil.
  8. El ile mobil faz kompozisyon % 10 metanol ve % 90 su değiştirin. En az 30 dakika çalıştırın. Sonra el ile mobil faz HPLC sınıf metanol için değiştirin. Metanol içinde belgili tanımlık sistem korumak yaklaşık 15 dakika çalıştırın. Önerilen çalışma süresi takip Bu adım çalıştırmak için başarısızlık sütun ve Dedektör hasara neden olabilir. Akış kapatmak açmak, sonra degasser açın.

4. Phenylboronic asit kartuşları (PBA) çıkarma

PBA kartuşu çıkarma yordamları Kumar ve arkdüzeninde benzerdi. (2011) 25. tüm çözümler PBA kartuş (100 mg, 1 mL) bir şırınga tarafından zorla hava ile itilir.

  1. 1 mL 80:20 Asetonitril-su (v/v) %1 formik asit ve 1 mL 50 mM fosfat tampon (pH 10) sırayla içeren kartuşla durumu.
  2. PBA kartuş aracılığıyla tamponlu idrar örneği (1 mL idrar ve 2 mL fosfat tampon, pH 8,5) tuşuna basın.
  3. 1 mL 50: 50 v/v Asetonitril-fosfat tampon (10 mM, pH 8,5) kartuşla yıkayın.
  4. %1 formik asit içeren kartuş 1 mL Asetonitril-su (80:20 v/v) ile elute.

5. kimlik ve katekolaminler miktar

  1. Doğrusallık
    1. Altı konsantrasyonları (1,5, 3, 12, 25, 50 ve 100 ng/mL); yapay idrar ile ikincil analitler stok sulandırmak yapay idrar seyreltme hacmi ek tablo 2izler. Kalibrasyon eğriler oluşturmak için 18 analit deneysel çözümleri almak için her konsantrasyon ile üç paralel örnek olun.
    2. DHBA ikincil hisse senedi yapay idrar ile 10 kat 100 ng/mL deneysel çözüm elde etmek için sulandırmak.
    3. 5.1.1, tüm analit çözümlerinden adım 3 (PFSPE çıkarma yordamları) göre pretreat. Adım 3 de olduğu gibi karşılık gelen her eluate 20 µL HPLC Kromatografik almak için HPLC-ECD sisteme enjekte et.
    4. Beş analitler kalibrasyon eğrileri konsantrasyonları oranını karşı Y ekseni (hedefler/IS) en yüksek alan oranını komplo tarafından inşa (hedefler/X ekseni olarak takıma giren şekil 1' de gösterildiği gibi IS).
  2. Duyarlılık için LOD ve LOQ değer
    1. Boş yapay idrar 20 µL HPLC Kromatografik örnek almak için (aynı derecede içinde adım 3), HPLC-ECD sistemine enjekte et.
    2. Kromatografik 5.2.1 üzerinden 11 boş sinyal değerleri toplamak ve ortalama değeri Xb ve standart sapma Sbhesaplamak. Güven, XL, belirli bir düzeyde tespit edilebilir bir madde minimum sinyal XL olarak hesaplamak X =b+ K * Sb (K güven düzeyi tarafından belirlenen katsayısı, Sb gürültü düzeyini yansıtır Ölçüm yöntemi ve makine gürültü seviyesi). Böylece, LOD = (XLX -b) /S (K * Sb) = /S (S standları için çalışma eğrinin eğim değeri).
    3. 3:1 (K = 3) algılama (lod olarak) sınırı olarak bir S/N ve S/N 10:1 (K = 10) miktar (LOQ) sınırı olarak tanımlayın.
  3. İyileşme değerlendirmek
    1. Gerçek ve çivili İdrar numuneleri hazırla. Gerçek idrar üç konsantrasyonları ile ikincil analitler stok seyreltik (5, 50, 100 ng/mL) çivili idrar örneklerini almak için. Üç paralel örnek her analit çözüm için hazır olun. Çivili konsantrasyon miktar idrar örneği çivili hedef bileşikler olarak say. Bu değer birstanımlayın.
    2. DHBA stok 100 ng/ml, olduğu gibi adım 5.1.2 sulandırmak.
    3. 5.3.1 göre adım 3 (PFSPE çıkarma yordamları) her örnek çözüm süreci ve karşılık gelen her eluant 20 µL Kromatografik sonucu elde etmek için HPLC-ECD sistem enjekte. Analitlerin değerini hedef bileşikler çivili idrar örneği sayılabilir bir miktar olarak sayılacaktır. Bu değer birttanımlayın.
    4. İdrar örneği 20 µL Kromatografik sonucu elde etmek için HPLC-ECD (Adım 3) olduğu gibi sisteme enjekte. Analitlerin değerini ilk bir miktar idrar örneği sayılabilir hedef bileşikler olarak sayılacaktır. Bu değer birbentanımlayın.
    5. Miktar standart eğri denklemi örnekte hedef bileşiklerin hesaplayın. Yüzde kurtarma metodolojik Kurtarma %'si olarak tahmin edilmektedir (t - Aben) = × 100 / (s). Ortalama değerleri Tablo 1' de gösterilmiştir.
  4. Tutarsızlık değerlendirmek
    1. 5, 50 ve 100 ng/mL konsantrasyonda olduğu gibi adım 5.3.1 çivili yapay İdrar numuneleri hazırla. Altı paralel örnekleri her analit çözüm için hazır olun. Her gün taze deneysel örnekleri hazırlayın.
    2. DHBA stok 100 ng/ml olduğu gibi adım 5.1.2 sulandırmak.
    3. İçi günlük kesinlik değerlendirmek (n = 6). 5.4.1 adım 3 göre her örnek çözümünde işlemek ve her muhabir eluant 20 µL Kromatografik almak için HPLC-ECD sistem enjekte. Altı kez aynı gün içinde aynı işlemi yapın.
    4. Miktar standart eğri denklemi örnekte hedef bileşiklerin hesaplayın. Aynı bileşik aynı konsantrasyon altında göreli standart sapması (RSD) bir günde altı deneyleri içi günlük hassas belirlenir. Ortalama değerleri Tablo 1' de gösterilmiştir.
    5. Arası gün hassas değerlendirmek (n = 6). Aynı zamanda her gün altı ardışık gün içinde çivili yapay İdrar numuneleri için 5, 50, 100, üç konsantrasyonlarının hazırlamak ng/mL, 5.4.1 ve 5.4.2. ve süreci her analit örnek çözüm adım 3 göre.
    6. 5.4.5 üzerinden karşılık gelen her eluate 20 µL her gün Kromatografik sonuçlar elde etmek için HPLC-ECD sistem enjekte. Miktar standart eğri denklemi örnekte hedef bileşiklerin hesaplayın. Arası gün hassas çivili yapay İdrar numuneleri üç konsantrasyonlarda deneyleri miktardan MSB tarafından altı ardışık gün olarak ifade edilir. Ortalama değerleri Tablo 1' de gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu iletişim kuralı İdrar numuneleri pretreat ve HPLC-ECD sistemi üzerinden algılama için beş katekolaminler zenginleştirmek için bir basit ve kolay PFSPE yöntemdir; bir diyagram işlemin şekil 1' de gösterilen. Protokole esas olarak dört adımları etkinleştirme, yükleme, durulama ve eluting - PCE-PS nanofibers ve basit katı fazlı ayıklama aygıtı küçük bir miktar ile birleştiğinde içerir. PCE-PS nanofibers Morfoloji bir yüzey ve porozite Çözümleyicisi'ni kullanarak değerlendirildi ( Tablo malzemelerigörmek). Dokusal özellikleri-bahis (Brunauer, Emmett ve Teller) yüzey alanı, gözenek hacmi ve gözenek boyutu-2.8297 m2 g-1, 0,009 cm3 g-1ve 12.76 nm, anılan sıraya göre. Bu veriler iletişim kuralında kullanılan malzeme yüksek adsorpsiyon verimliliği ve alçaltılmış bağlama pH iletişim kuralı için katkıda bulunabilir yüzeyi Nano gözenekleri olmadığını belirtmek.

En iyi duruma getirilmiş birimleri, örnek maddeler, sızıntı, eluant, vb, bu iletişimi kullanan yanı sıra çalışma pH ve işlemler sırasında harcanan zamanı. Chen vd., eluant protonated olmak adsorbent asidik koşullar neden çünkü bir 12,0 M Asetik asit çözüm oldu ve olumlu kullanılıyorsa, CAs34,35elüsyon için uygun olduğu. Bu çalışmada eluant tarifi % 30 fosforik asit, % 15 Asetonitril, olmak için yenilenmiş ve % 55 distile su. Eluant son pH değerini 3.0 için ayarlandı. Eluant solvent eluting asidik ortamda ama 12,0 M Asetik asit, zavallı tepe görünümüne yol ve HPLC sistemi zarar daha çok daha ılımlı tutulmalıdır.

Katekolaminler tanımlaması için Kromatografik saklama kez örneklerde Peaks standart çözüm zirveleri ile karşılaştırılır. Şekil 2 HPLC-ECD chromatograms örnekleri çeşitli çözümler gösterilmiştir. Başarılı bir şekilde iletişim kuralını izlediyseniz, üç katekolaminler ve onların metabolitleri Kromatografik profilleri HPLC-ECD tarafından açık simetrik, iyi tanımlanmış zirveleri ile ve en az arka plan gürültü ile Şekil 2 gösterildiği gibi alınmalıdır . Geleneksel yöntem ile karşılaştırma için ticari bir PBA kartuş bir denetim olarak seçildi. Şekil 2' deki(bir-c), beş hedef tepeler (b) PFSPE yöntemi daha PBA kartuş yöntemi daha hassas olduğunu belirten thaosein (c), önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, DOPAC tepe PBA sütun DOPAC çıkarma yeteneğine sahip olmadığını belirten PBA kartuşu çıkarma sonucu, belli etmedi. Resim 2 (d) herhangi bir Önarıtma ve Şekil 2(e) gösterir idrar örneği chromatograms PCE-PS bileşik nanofibers kullanarak elde olmadan boş idrar örneği Kromatografik gösteriyor. Resim 2 (f) ile de Şekil 2' de (c) hiçbir DOPAC ayıklama sonucu ile uyumlu sinirlerde PBA sütun çıkarma sonra idrar örneği chromatograms gösterir. Diyagram PFSPE yöntemi yalnızca iyi bir etki hedeflerle ayıklayabilir değil, ancak aynı zamanda hedef bileşikler için iyi en yüksek kimlik vererek idrarda girişim çoğunu kurtulmak gösterir.

İstatistiksel çözümleme ortaya üç katekolaminler ve iki metabolitleri ölçülerini güvenilir edildi (Tablo 1) çoğaltılamaz. Tüm hedef 1.5 ve 100 ng/mL arasında gösterdi iyi doğrusallık maddeler ve birleşimler (R2> 0,99), ve her analit standart eğri ek şekil 1' de bulunabilir. Eğrileri ve R2 değerleri analitler iyi doğrusallık ve görelilik belirli bir doğrusal aralık içindeki, idrar örneklerinde analitler konsantrasyonları hesaplanması için uygun olduğunu göstermektedir. Algılama (lod olarak) sınırlarını 0,25 0,54 ng/mL arasında değişiyordu ve miktar (LOQ) sınırlarını 0.83-1,81 ng/mL, idi. Sinyal-gürültü (S/N) değeri 3 eşdeğer. Beş hedef bileşiklerin metodolojik iyileşme aralığını %97,4 (MHPG) %124.2 (DOPAC), hangi uygulama gerçek örnekleri için tatmin edici oldu. İçi günlük hassas %2,7 4.8 (göreli standart sapma ifade edilir) ve arası gün hassas 2-%8.1, görüntüleme iyi hassasiyet ve tekrarlanabilirlik oldu.

Gerçek İdrar numuneleri hedeflerin tespiti için 28 yüksek riskli bebek ve çocuk bakımı, Suzhou Belediye Hastanesi, ligde 22 sağlıklı bebekler işe. Çalışmaya alınan bütün 50 bebekler çocuklardınız. Onlar Altı aylıkken bir rutin sağlık kontrolü Eylül 2016 yılında alınmıştır. Tüm İdrar numuneleri toplanmış ve belgili tanımlık protokol merdiven 3.1 ve 3.2 ön işleme ve adım 3 geri kalanı kullanarak örnekleri analiz edildi. Konsantrasyonları kalibrasyon eğrileri karşı hesaplanır. İstatistiksel farklar Varyans analizi tarafından (ANOVA) analiz edildi. Sonuçları Tablo 2' de görülebilir. İki grup arasındaki farkı katekolaminler ve metabolitleri karşılaştırıldığında ve analiz edilebilir. P-değerleri göster metaboliti MHPG içeriği bu grupları arasında farklı iken katekolaminler yüksek risk ve sağlıklı gruplar arasında önemli ölçüde farklı değildi (p = 0.001). Yüksek riskli bebeklerde grup MHPG daha yüksek miktarda idrar MHPG düzeyi yüksek riskli bebeklerin erken teşhis kodu için potansiyel bir işaret olabilir anlamına gelir kontrol grubu (14,8 ± 3.6 ng/mL 1.4 ± 0.2 ng/mL vs.), daha vardı.

Şekil 3 ve Tablo 3 monoamin malzemelerin belirlenmesi için klasik miktar yöntemi açıklamak ve kendisi için işlem süreci ve rakamlar ilgi verilir diğer yöntemleri ile karşılaştırın. Klasik yöntemlere göre PFSPE yöntemi kısa bir timespan (5-10 dk), Basitleştirilmiş işlem süreci, daha az organik çözücü ve tatmin edici metodolojik parametrelerle daha fazla çevre dostu gibi avantajları vardır. Gerekli eluant miktar birim (50 µL) düşüktür ve büyük ölçüde algılama hassasiyeti idrarda hedef bileşikler için teşvik yok buharlaşma hedef zenginleştirme adım gerektirir. Geleneksel parçacık tabanlı SPE karşılaştırıldığında, bu yöntem verimliliği arttırmak, hazırlık süreci Basitleştirilmiş ve zaman analizi kabul edilebilir güvenilirlik, seçicilik ve hassasiyet ile.

Figure 1
Resim 1 : Şematik akış şeması PFSPE yordam kağıt ve onun aygıt gösterimi. (1) Gastight şırınga, (2) pipet ucu ve (3) yemeği nanofibers. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Chromatograms farklı örneklerinin. (bir) Spiked su örnek hedefler ve IS (100 ng/ml) ile ekstraksiyon olmadan. (b) Spiked su örnek PFSPE yöntemi ve (c) tarafından ticari phenylboronic asit (PBA) kartuş tarafından ayıklanır. (d) gerçek boş idrar örneği ayıklama olmadan. PFSPE yöntemi tarafından çıkarılan (e) gerçek idrar örneği. (f) gerçek idrar örneği ticari PBA kartuş tarafından ayıklanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Analitik akış şeması belirleme yöntemleri. (a, b) Daha önce klasik çıkarma yöntemleri bildirdi. (bir) çıkarma Alümina, (b) tarafından DPBA karmaşık, ve (c) yöntemi tarafından önerilen bu yazıda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek şekil 1: Standart eğrileri ve denklemler. Beş analitler için standart eğri çizgi denklemi örnek bilinmeyen analitler toplama hesaplamak için kullanmak için inşa edilir. NE (bir), (b) E, (c) DA, (d) MHPG ve (e) DOPAC. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek resim 2: Boronate benzeşme etkileşim boronic asit ve CIS-diol grup veya bitişik iki hidroksil grubu arasında. Boronic asitler ve form beş ya da altı membered döngüsel esterleri birden fazla -OH grubuna etkileşimini(a)şeması. (B) CIS-diol grup veya bitişik iki hidroksil grubu kırmızı daireler olarak tasvir boronic aside bileşik beş analitler için büyük tepki siteleri. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

NE MHPG E OLDUĞUNU DOPAC DA
Doğrusal aralığı (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1.5-100 1.5-100 1.5-400
R-kare değerlerini 0.9945 0.995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0.322 0,313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1,043 2.191 0,83 1.809
Kurtarma ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Hassas (RSD %) (n = 9)
İçi günlük 4.5 4 2.7 4,8 3.3 4.7
Arası gün 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5,9
NE, norepinefrin; MHPG, 3-metoksi-4-hydroxyphenylglycol; E, epinefrin; IS, dahili standart; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic asit; DA, dopamin;

Tablo 1: Analitik sonuçları üç katekolaminler ve standart çözümleri ile iki metabolitleri belirlenmesi için düşünülmüş bir protokol.

Konsantrasyonu (ng mL-1) Kontrol grubu (22) Yüksek Risk bebek grubu (28) P değeri
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0,001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0,312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0,05 *** iki grup arasında anlamlı bir fark gösterir

Tablo 2: üç katekolaminler ve urines sağlıklı bebekler ve yüksek riskli bebeklerde arasında iki metabolitleri konsantrasyonları karşılaştırılması. Sonuçlar istatistiksel olarak p ile bir önem düzeyidir Varyans analizi (ANOVA) kullanarak analiz edildi MHPG içeriği arasındaki farklar için 0,05 =. Anlamına gelir ± standart sapma gösterilir.

Örnek Yorgun solvent (mL) Numune hacmi (mL) Tedavi öncesi süresi (dk) Doğrusal aralığı LOD Göreli kurtarma (%) Buharlaşır ve
redissolve		 Analitik yöntem
Solvent birim süresi (dk) Kurtarma (%) solvent ve
(mL) (mL) başlamaktan
kalıntı
İdrar 0,5 0,05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0,2-0,5 ng/mL (NE, E, DA) 88.5-94,5 (NE, E, DA) Hayır HPLC-ECD (Chen vd., 2016)
İdrar 19 0,7 — 47 – 167 µg/L (DA) 166-500 nM (DA) 98,3-101.1 (DA) Hayır HPLC-UV (Piotr vd., 2016)
İdrar 1.3 0,01 — 0,5-1250 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0,5-2,5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74.1 – 97,3 (NE, E, DA, NMN, MN) Hayır LC-MS/MS (Li vd., 2016)
Plazma ve idrar 20 0,05 10 0,04-2,5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01 0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87.0-97.5 (NE, E, DA) Hayır HPLC-UV (Muhammed vd., 2016)
İdrar < 0,5 0,1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97,4-124.2 (DOĞU, MHPG, E, DOPAC, DA) Hayır Bu eser
—, Tanımlanmamış.
PBA, Phenylboronic asit

Tablo 3: Bu eser Önarıtma monoamines veya diğer çalışmalar ile karşılaştırılması ile ilgili konular, son yıllarda.

Ek tablo 1: araç parametreleri algılama ve HPLC-ECD tarafından gazetede analitler miktar için. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2: Standart eğri hazırlanması beş analitler için. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu kağıt önerilen PFSPE yönteminde önemli ve anlamlı hız, kolaylık ve rahatlık ile ilgili olabilir. İletişim kuralında kullanılan adsorbents electrospun nanofibers, yüksek yüzey alanı birimi oranları, ve yüksek verimlilik ile analitler absorbe vardır. Yordamı yalnızca nanofiber birkaç miligram ve eluant solvent küçük bir hacim ihtiyacı ve analitler konsantre bir buharlaşma adım gerekli değildir. Burada, biz yeni kullanıcılar algılama için etkili bir yöntem kurmak için izin verir bir HPLC-ECD dayalı iletişim kuralı ayrıntılı bir özetini ve miktar üç katekolaminler ve iki onların metabolitleri (NE, E, DA ve MHPG, DOPAC) sundu.

Bu protokol üstünlüğünü esas olarak dört kritik adım uzaklıkta işlemler sırasında şekil 1' de gösterildiği gibi kaynaklandığını: hızlı adsorpsiyon için önde gelen bir kaç miligramda jelleştirici boyutunu küçültmek için hedef bileşikler yakalamak için PCE-PS nanofibers kullanarak / desorpsiyon ve sadece sıvı (1); eluting küçük bir birim ihtiyacı DPBA onların hydrophobicity (2); geliştirmek için analitler ile karmaşık idrar içine ekleme nanofibers analitler korumak ve (3); kirleri çıkarmak için DPBA içeren çözüm ile durulama ve optimizasyon iyi duyarlılık ve seçicilik (4) analitler için almak için çıkarma ve analiz durumun.

Adım (1) için adsorbent yeteneği üstün performans için PCE-PS mekanizması çeşitli faktörlere atfedilen. Nanofibers içinde katkılı taç eter polimerler ana bilgisayar-konuk karmaşık bir H-tahvil, amin gruplarınca katekolaminler bu kağıt gibi içeren konuk molekülleri ile oluşabilir. Ayrıca, Hongyou Hu vd ve Jishun Chen vd. boronic asit azot atomları B-N etkileşimleri aracılığıyla kimyasal yapısı ile bağ ve hidrofobik iskelet benzen halkaları ve analitler36,37Alifatik diğer grupları ile etkileşim kurabilir Ayrıca evlenme teklif etti. Ayrıca, hidrojen bağları ve B-N etkileşimleri çok düşük pH kolayca kırık desorpsiyon işlemi sırasında; Böylece, eluants asidik pH ile genellikle desorpsiyon için keşif için uygundur. Ayrıca, aynı zamanda hidrofobik, iyonik, dahil olmak üzere çeşitli ikincil etkileşimleri ve boronic Kimyasalları ve ilgili bileşikler36,37,38arasında gerçekleşen, hidrojen vardır. Bu etkileşimler malzemelere analitler adsorpsiyon için katkıda bulunabilir.

Adım (2), eklenen DPBA yardımıyla, PCE-PS nanofibers DPBA-katekoiamin kompleksleri hızla absorbe. Zhen Liu vd. boronate benzeşme malzemeleri seçici ayırma ve Moleküler tanıma nükleozit, saccharides, glukanlardir, gibi Organik bileşiklerin önemli medya olarak glikoproteinlerin, ortaya çıkmıştır ve38benzeri gösterdi. Complexation esas olarak boronate benzeşme etkileşim arasında boronic asit ve CIS-diol grupları veya İki bitişik hidroksil grupları, gelen formu beş ya da altı için membered döngüsel esterleri, gösterildiği gibi oluşur tamamlayıcı şekil 2A. Takıma giren şekil 2B boronic asit bileşiği bu çalışmalarında beş analitler için büyük tepki siteleri gösteriyor. Çevre asidik olduğunda, boronic asit-CIS-diol karmaşık ayrışıp. Boronic asit ve CIS-diol grubu veya bitişik iki hidroksil grupları arasındaki etkileşimi kapsamlı ve nispeten güçlü bulunmaktadır.

Adım (3) için karmaşık analitler arasında kurulan ve diğer kirleri PCE-PS yüzeyden durulanır iken DPBA onları adsorbent hedefleri için en iyi rezervasyon elde tutabilir. Adım (4) için optimum pH yaklaşık 9.0 Borik asit ve Katekol bileşik39bağ için olduğunu gösteren bir rapor olmuştur. Ancak, Chen ve ark. En iyi pH değeri katekoiamin-DPBA kompleks için araştırdı ve pH değeri 6.0 ve 7.034,35arasında olmak ne zaman bileşik PS-PCE nanofibers adsorpsiyon performans CA'ları için en uygun bulundu. Liu ve ark. karıştığı için boronate asit bileşikleri, destekleyici malzemeler yapısı özellikle boşluklar ve Nano gözenekleri ve reaksiyonu sırasında oluşan B-N ligandlar kayma hapsi ile de önemli ölçüde düşürebilir bağlama pH ve bağlama benzeşme38geliştirmek. PCE-PS yapısı hem de katekoiamin yapısı - NH-grupları ile donatılmıştır. Böylece, özellikleri ve Nano gözenekler oluşur, B-N ligandlar yanı sıra PCE-PS ( Temsilcisi sonuçlarıgösterildiği gibi veri) protokolündeki indirdi bağlama pH için katkıda bulunabilir. Böylece, hangi büyük ölçüde yordamları basitleştirir ve analitler bozulması engeller bu protokolü en uygun pH değeri tarafsız, olabilir.

Biyolojik örnekler onların konsantrasyonlarda çok düşüktür ve yapılarını (kolaylıkla okside); kararsız catcholamine belirlenmesi ana sınırlamaları vardır Ayrıca, medyada yabancı maddelerin kurtulmak zordur. Böylece, katekoiamin biyolojik örneklerde analiz için Önarıtma, genellikle katı fazlı ayıklama tarafından gereklidir. Bu raporda önerilen PFSPE yöntemi idrar örneklerinde analitler için basit ve uygun öncesi yoğunlaşması sağlanan. Ama deneme yaparken, deney durumu tamamen kontrol altına alınmalı, ışığa maruz kaçınarak ve kısalma gibi bir yöntemle ön arıtma zaman mümkün olduğu kadar.

Yönteminin uygulanabilirliği üç katekolaminler ve sağlıklı bebekler ve yüksek riskli bebeklerde idrar iki metabolitleri konsantrasyonları belirlemek için kullanımı tarafından incelendi. Üriner MHPG iki grup arasında anlamlı bir fark vardı. Daha önce özetlendiği gibi insan vücudunda MHPG miktar şimdi esas olarak dizin olarak noradrenergic nöronal sesi, Merkez ve periferik sinir sistemi40,41katekoiamin metabolizma etkinliğinde yansıtacak şekilde bildirilmektedir, 42, ve Orta Doğu metabolizma43için yararlı plazma/idrar belirtecidir. Yüksek riskli bebekler için faktörler hipoksik-iskemik ensefalopati (HIE) gibi çeşitli beyin travma ve beyin hakaret, çocukluk nörogelişimsel açıkları farklı derecelerde için önde gelen neden olur. Bu beyin hasarı sırayla nörotransmiterler (MHPG dahil) sürümüne vücut sıvıları44,45içine götürecektir. Tarafından JW Maas haberlere göre beyin, CSF, plazma ve idrar MHPG46,47konsantrasyonları arasındaki önemli ilişkiler vardır. Toplam (ücretsiz + konjuge) MHPG idrar ölçümü uzun Merkezi NE metabolizması ve insanlar41,48,49periferik Kuzey metabolizmasında değerlendirmek için kullanılmıştır. Böylece, yüksek riskli bebeklerde katekoiamin metabolizma Merkezi ve periferik sinir sistemi etkileyen sağlıklı olanlar ile karşılaştırıldığında noradrenergic nöronal sesi hasar var sonucuna. Bu tutarsızlık Üriner MHPG düzeyi ve nörogelişimsel açıkları arasındaki ilişki daha fazla araştırma yapılması gerektiğini gösterir. Önerilen yöntem idrar, huzurunda katekoiamin belirlenmesi için klinik kullanımda hastalıklar bu nörotransmitter ilgili değerlendirmek için umut verici bir umudu ile kullanılabilir olduğu kanıtlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir finansal kuruluş ile ilgili bu makalede açıklanan malzeme ile hiçbir çıkar çatışması olduğunu tasdik.

Acknowledgments

Bu çalışmada Ulusal Bilim Vakfı Çin (No.81172720, No. 81673230), sosyal kalkınma araştırma programı Jiangsu eyaleti bilim ve teknolojisi bölümü (No tarafından desteklenmiştir BE2016741), bilim ve teknoloji proje Çin genel yönetim kalite gözetim, denetim ve karantina (2015QK055), çocuk gelişimi ve Eğitim Bakanlığı bilim öğrenme anahtar laboratuvar açık proje programı Güneydoğu Üniversitesi (CDLS-2016-04). Biz içtenlikle Yuan şarkı ve Ping Liu bizi örnekleri koleksiyonunda yardımcı kabul edersiniz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Tags

Kimya sayı: 133 katekolaminler polimer taç electrospun nanofiber Paketli lifli katı fazlı ayıklama (PFSPE) elektrokimyasal algılama (HPLC-ECD) yüksek riskli bebeklerde ile yüksek basınç sıvı Kromatografi
Ayıklama ve çözümleme katekoiamin nörotransmitter ve onların metabolitleri yüksek basınçlı sıvı Kromatografi ile uygun bir yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter