Summary
Här beskriver vi ett protokoll för hela berget immunofluorescens och image-baserad kvantitativ volymetrisk analys av tidiga skede musembryon. Vi presenterar denna teknik som en kraftfull metod att kvalitativt och kvantitativt bedöma hjärt strukturer under utveckling, och föreslår att det kan vara allmänt anpassas till andra organsystem.
Abstract
Användning av någonsin framåt avbildningstekniker har bidragit i stort sett till vår ökad förståelse av embryonal utveckling. Pre-implantation utveckling och organogenesen är två områden av forskning som kraftigt har gynnats av dessa framsteg, på grund av den höga kvaliteten på data som kan erhållas direkt från imaging pre-implantation embryon eller ex vivo organ. Medan pre-implantation embryon har gett data med särskilt hög rumslig upplösning, varit senare skeden mindre mottaglig för tredimensionell rekonstruktion. Få högkvalitativa 3D eller volymetrisk data för kända embryonala strukturer i kombination med öde mappning eller genetiska härstamning spårning kommer att möjliggöra en mer omfattande analys av morphogenetic evenemang som äger rum under embryogenes.
Det här protokollet beskriver en helhet-mount immunofluorescens strategi som möjliggör för märkning, visualisering och kvantifiering av progenitor cellpopulationer inom den utveckla hjärt crescent, en nyckel struktur bildas under hjärtat utveckling. Metoden är utformad på ett sådant sätt att både cell - och vävnad-nivå information kan erhållas. Använda konfokalmikroskopi och bildbehandling, möjliggör detta protokoll tredimensionella rumsliga återuppbyggnad av hjärt crescent, vilket ger möjlighet att analysera för lokalisering och organisationen av specifika stamceller populationer under denna kritiska fas av hjärtat utveckling. Ännu viktigare, tillåter användning av referens antikroppar successiva maskering av hjärt crescent och efterföljande kvantitativa mätningar av områden inom månskäran. Detta protokoll kommer inte bara aktivera en detaljerad granskning av tidig hjärtat utveckling, men med anpassningar bör vara tillämplig på de flesta organsystem i gastrula till tidig somite arrangerar mus embryo.
Introduction
Studien av organogenesen har länge förlitat sig på observation av morphogenetic händelser i det växande embryot. Dessa studier är ofta beroende av användning av fluorescerande färgämnen eller lineage tracing reportrar i kombination med märkning av definierade referens populationer. 1 genom att jämföra den relativa positionen av dessa etiketter, information kan utläsa på ursprung, rörelse eller ultimate bidrag i en population av intresse. Transplantation och öde mappning experiment kan du använda antingen morfologiska sevärdheter eller injektion av färgämnen i icke-rörliga härstamningar för att definiera utgångspunkten för celler i intresse, som undersöks sedan för bidrag till utvecklade embryot. 2 , 3 , 4 , 5 genetiska härstamning-tracing experiment använda samma koncept med väldefinierade reporter alleler som används till label cellpopulationer utan experimentella manipulation. Nyckeln till dessa synsätt är förmågan att avgöra, med hög rumslig upplösning, platser av den experimentella och referens etiketter. Dessa metoder har gett enastående framsteg i pre-implantation utveckling och explant organogenesen studier. 6 , 7 , 8 , 9
De utvecklingsmässiga händelser som ligger bakom hjärtat morfogenes har beskrivits allt väl under de senaste åren. 10 en av de stora upptäckterna inom detta forskningsområde är beskrivningen av ett antal stamceller populationer som kan särskiljas genom uttryck av unika markörer. 11 dessa populationer inkluderar den första och andra hjärtat fält (FHF och SHF), som finns inom hjärt månskäran på främre sidan av embryot på embryonala dag (E) 8,25 mus utveckling. 12 dessa populationer undersöks ofta genom en kombination av wide-fältet mikroskopi, som ger vävnad-nivå information, och seriell sektionering med immunofluorescens-analyser, som erbjuder hög cellulära upplösning men bara tvådimensionell rumslig information. 13 således, medan dessa studier har kraftigt avancerade vår förståelse av hjärtat utveckling, tillgängliga metoder har begränsat i djup kvantitativ analys av morfogenes under dessa stadier, skapar behovet av metoder för att undersöka den organisationen av dessa populationer på hel-organismen nivå.
Den senaste tidens framsteg inom både konfokalmikroskopi och 3D-bildanalys möjliggör hög upplösning och hög genomströmning algoritmisk rekonstruktioner av celler och strukturer i situ med relativ lätthet, därigenom bereda väg för detaljerade studier av komplexa cellulära strukturer. 14 med ökningen av datorkraft och utveckling av stordata verkställande algoritmer, båda behövs för att hantera den exponentiella ökningen av storleken på imaging data-set, analyser kan nu vara fullständigt automatiserad. 15 automatiserad analys av imaging data-set har fördelen att vara opartisk, men det är bara lika tillförlitliga som kvaliteten på de ingående datamängden. sedan, är det nödvändigt att bästa praxis används under förvärv och före bildbehandling för att säkerställa högsta kvalitet, objektiv analys. 16 protokoll kan vara helt automatiserad och delade för reproducerbarhet och de algoritmer som används av proprietär programvara är lätt tillgängliga via bibliotek som ska användas av forskare som har förtrogenhet med moderna egna eller öppen källkod utvecklarverktyg. 17
Följande protokoll förklarar de åtgärder som krävs för att utföra en sådan analys på en väl definierad modell för organogenes, bildandet av hjärt crescent under hjärtat utveckling. Närmare bestämt det här protokollet beskriver hur (1) skörden och dissekera hjärt crescent scenen embryon, (2) utföra hela mount immunofluorescens för referens (Nkx2-5) och experimentell (Foxa2Cre:YFP18,19) markörer, (3) förbereda och bild de embryon som använder konfokalmikroskopi, och slutligen (4) analysera och kvantifiera de resulterande bilderna med hjälp av avancerade tredimensionella metoder. Medan den kardiella halvmånen används som exempel här, med lämpliga ändringar, kan detta protokoll användas för analys av flera utvecklingslinjer i gastrula tidig somite arrangerar embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai.
1. avverkning och bearbetning hjärt Crescent scenen embryon
- Mate en bördig kvinnliga mus med en bördig stud hane.
- Kontrollera förekomsten av en vaginal parning plug med en trubbig sond eller pincett. Klockan tolv på dagen för plug upptäckt anses embryonala dag (E) 0,5 (se figur 1A för full tidslinjen).
Obs: Pluggar för ska kontrolleras på morgonen, eftersom de är förlorade hela dagen. - På morgonen den 8 : e dagen (E8.25), offra gravid dammen vid CO 2 inandning eller enligt lokala och institutionella bestämmelser.
Obs: Exakta tidpunkten kan vara stam beroende och empiriskt bestämmas med morfologi. - Spray buken av musen med 70% etanol att rengöra området och minimera blodsutgjutelse. Exponera inälvor genom att utföra ett buk snitt genom både huden och kroppen väggen.
- Leta upp livmodern och ta försiktigt bort hela livmodern horn från djuret. Börja med att skära ovanför ena äggledaren, trimma fett från livmodern samtidigt fortsätter till livmoderhalscancer slutet. Skär genom livmoderhalsen och fortsätta att den övre delen av den andra äggledaren, skära för att släppa hela livmodern.
- Plats i livmodern i en 10 cm skålen med fosfat buffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) att tvätta bort överflödigt blod. Sub dissekera livmodern genom att skära mesometrium mellan varje deciduum, som innehåller embryona. Överföra embryon till en 6 cm skålen med färska PBS.
- i dissektion Mikroskop, använda fin pincett (#5) att ta bort livmodern vävnaden från decidual vävnaden.
- Med pincett, skiva noggrant spetsen av den embryonala hälften av deciduum att avslöja embryot. Nypa deciduum för att driva embryot ut och dra försiktigt embryot ut.
- Dissekera bort embryoniskt vävnader så mycket som möjligt utan att skada morfologi av embryot ( figur 1B).
- Använda överföring pipett för att placera embryon i ett 1,5 mL rör med färska PBS och placera på is. Upprepa 1,7-1,9 för återstående embryona innan du fortsätter.
- Aspirera PBS och skölj en gång med PBS. Aspirera PBS.
Obs: Försök att ta bort så mycket PBS som möjligt utan att skadas eller torkning embryon. Manuell borttagning av lösningar rekommenderas på alla åtgärder för att undvika förlust av embryon. - Fix embryon med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS för 1 h på RT.
Obs: Embryon kan vara fast övernattning (O/N) på 4 ° C. - Skölj tre gånger med PBS. Hålla embryon vid 4 ° C tills det att fortsätta med immunofluorescens.
Obs: Pausa punkt. Embryon kan lagras säkert i PBS vid 4 ° C i flera veckor.
2. Immunofluorescens färgningen
Obs: inkubation villkoren nedan kan justeras för att passa olika scheman. Rekommenderas användning av milda skakningar eller gunga för alla långa inkubationsstegen.
- Ta bort PBS och tillsätt 1 mL blockerande buffert (0,5% saponin, 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS).
- Inkubera minst 4 h på RT. Detta kan också göras O/N vid 4 ° C.
- Ta bort blockerande buffert och tillsätt primär antikropp blandning späds i blockerande buffert. Inkubera O/N vid 4 ° C.
Obs: Se material avsnitt Beskrivning av antikroppar används och föreslog utspädningar. Antikropp utspädningar bör bestämmas empiriskt. Användning av Nkx2-5 som en referens fläck för hjärt månskäran rekommenderas och är nyckeln till nedströms bild segmentering och analys steg. - Ta bort primär antikroppar genom aspiration.
- Tvätta 3 gånger för 1 h varje med 0,1% Triton i PBS.
- Bort tvätta och lägga till sekundära antikroppar blandning späds i Blocking buffert. Inkubera under 3 h på RT. Detta kan också göras O/N vid 4 ° C.
- Tvätta 3 gånger för 1 h varje med 0,1% Triton i PBS. Detta kan också göras O/N vid 4 ° C.
- Motfärg med 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) i PBS för 10 min.
Obs: Denna motfärg kan utföras samtidigt med med sekundär antikropp. - Tvätta 2 gånger för 5 min varje med 0,1% Triton i PBS.
- Avbryta långsamt embryon i anti fade montering media (2% w/v n-propylgallat (nPG), 90% glycerol, 1 x PBS; Se material) för mer detaljer). Att temperera minst 1 h innan montering. Knacka försiktigt tube regelbundet för att hjälpa embryon släppa i anti fade lösning.
Obs: Pausa punkt. Embryon kan förvaras i flera dagar i anti fade lösning förrän du är klar att montera och bild.
3. Montering av embryon för mikroskopi
- Förbered Mikroskop glider för montering med antingen dubbel-stick tape eller silikon distanser. Om du använder dubbel-stick tape, göra två parallella travar av 5-6 lager ca 15-20 mm apart. Detta kommer att lämna tillräckligt med utrymme för att placera embryona och säkra täckglaset ( figur 1 c).
- Placera en droppe 15 µL anti fade på bilden mellan dubbel-stick tejpen. Noggrant återför ett embryo till bild.
Obs: mer än ett embryo kan placeras på en bild. Men de efterföljande läggning stegen är svårare med flera embryon och länge imaging varaktigheter kan leda till foto-blekning. - i dissektion Mikroskop med fin pincett, placera embryot så att den främre sidan är vänd bort från bilden med kroppen axeln i linje med den långa axeln av bilden. Se figur 1 c för en schematisk av montering installationen.
- Noggrant placera ett täckglas över provet genom att vila ena sidan på en stack av dubbel-stick tape och använda pincett att försiktigt sänka täckglaset tills den kontaktar andra bandet.
Obs: Steg 3.3 och 3.4 är avgörande för att säkerställa rätt orientering av embryot för avbildning. Genom att sänka täckglaset längs bakre till främre riktning, embryot ska inte rulla och hjärt crescent regionen kommer bo orienterade bort från bilden, som är idealisk för avbildning på ett inverterat Mikroskop. - Använd en pipett för att lägga till ytterligare anti tona mellan bild och täckglas att hålla provet från att dö ut under lagring/imaging.
4. Confocal Imaging
- förvärva bilder med målsättningen för högsta förstoring som möjliggör hela hjärt crescent regionen att fångas i en synfält. Använda Nyquist samplingsfrekvenser för att bestämma x-y-z voxel dimensioner. De flesta Mikroskop tillverkare kommer att ha en " optimera " för att säkerställa Nyquist provtagning.
Obs: Färgning för Nkx2-5 är fördelaktigt här, eftersom det kommer att avgränsa regionen för hela hjärt crescent. Mindre Z-steg storlekar (översampling) kommer att ge bättre 3D-modellering resultat men kan leda till utökade anskaffningstid eller blekning för några prover. - Ställa in imaging parametrar med hjälp av standard bäst bildgivande metoder. Nämligen, Använd den lägsta möjliga laser intensiteten att uppnå bra signal-brus-förhållande för varje fluorophore och välja gain och offset nivåer som ger ett brett dynamiskt omfång utan mättar signalen.
Obs: Överensstämma med imaging parametrar mellan prover som kommer att jämföras direkt. Detta är särskilt viktigt för nedströms 3D analys och kvantifiering.
5. Bild analys och kvantitativa 3D modellering
Obs: För detta protokoll analyserades bilder med hjälp av programpaketet Imaris. Liknande analys kan göras genom användning av alternativa paket. Beskrivningen nedan täcker rörledningen analys för en referens-kanal (dvs. Nkx2-5) och en experimentell kanal (dvs YFP). Ytterligare kanaler kan analyseras genom upprepning av dessa steg. Ett exempel datamängden har tillhandahållits som kan användas för att replikera analysen nedan.
- Ladda raw-bild datauppsättningar i Imaris Arena Visa och öppna filen för önskad embryo i överstiga Visa. Data ska läsas in i 3D-vyn i MIP (max) läge. Öppna fönstret Display justering och välj endast referens kanal.
- Justera tröskeln till bilden om det behövs för bättre visualisering. För denna analys, justera gamma om signal-brus-förhållandet är för låg för segmentering.
Obs: Om utför gamma korrigeringar, som är icke-linjära justeringar, justerat bilderna kan inte användas för intensitet mätningar eller jämförelser. I detta skede kan du utföra ytterligare före bildbehandling (dvs belysning korrigeringar, Gaussisk oskärpa eller andra filtrering), om din signal-brus-förhållande inte är tillfredsställande. Om du väljer att göra förbehandling, måste du utföra samma Pre-processing steg för alla bilder i datamängden. - Skapa en ny yta för referens kanalen använder Surface algoritm dialogen.
- Välj de " Segment endast en intresseområdet " kryssrutan.
- Justera markeringsramen box regionen så att den innehåller regionen av intresse (ROI, dvs hjärt crescent området) som avgränsas av referens fläcken.
- Välj referens kanal i listmenyn källkanalen. Standardinställningen för utjämning (lika med z voxel storleken) brukar räcka men kan kräva empiriska optimering. För denna analys använder Utjämning motsvarar z voxel-hälften.
- Utför tröskelvärde av absolut intensitet. För att säkerställa att ytan inte sträcker sig utöver kanalsignalen, justera den nedre gränsen med hjälp av skjutreglagen.
Obs: För vissa bilder där cellerna kan avgränsas på ett enkelt, kan du inkludera den " split röra föremål " algoritm, att ytterligare separera din signal från bakgrunden. - Filtrera objekt av voxel antal eller en volym, och avvisar bakgrunden (små eller i områden utanför området Nkx2-5) objekt som algoritmen skulle ha genererat. Avsluta algoritmen.
- Med nyskapade ytan, skapa en maskerade kanal för experimentell kanal.
- Med den 1.3.4.2.för som valts, välja den " Mask Sel... ͟ " funktion från redigeringsfönstret.
- Markera den experimentella kanalen av intresse (dvs. YFP). Se till att den " duplicera kanal innan du applicerar masken " är markerad.
- i the Display justering fönstret Välj endast den maskerade kanalen. Skapa en ny yta för maskerade kanalen genom att följa steg 5.3-5.3.5.
Obs: Vid denna punkt kan det vara bra att justera utseendet på varje mask att underlätta visualisering av 3D-modellen: Välj varje yta och välj den färg tab. Justera basfärgen och öppenhet som behövs. Yta färger inte sammanfoga när överlappade. - Att erhålla den volymetriska data, med varje yta som valt Välj fliken statistik. I den " detaljerad " sub fliken, Välj " genomsnittliga värden " från droppa-ned menyn. Den totala volymen av ytan kan hittas i kolumnen summan av genererade tabellen.
Obs: Om den genererade ytan innehåller felaktiga fragment (dvs fragment som från bakgrund signal inte är undantagna under segmentering eller områden diskontinuerlig från huvudsakliga ytan), det kan vara nödvändigt att beräkna den totala volymen manuellt, eller Filtrera ytorna av volym eller antal voxlar och säkerställa att endast signal segment ingår i beräkningen. Volymen för varje del av ytan kan hittas genom att markera " alla värden " från droppa-ned menyn. Att välja varje värde kommer att göra regionen motsvarande visas gult, som hjälpmedel för att fastställa värden för att utesluta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på den slutliga uppgifter och analys beror mycket på (1) integritet och morfologi av dissekerade embryon, (2) användningen av hög specificitet antikroppar och (3) korrekt inställning av imaging parametrar. Skadade embryon kommer förbrylla ytan genereringsprocessen och hindra kvantitativ analys. Exempel på korrekt dissekeras och iscensatta embryon visas i figur 2B. Embryon kan vara ytterligare dissekeras genom att ta bort gulesäcken, som antikroppar binds ofta icke-specifikt. Men kommer avlägsnande av gulesäcken göra embryon mindre robust, så försiktighet bör iakttas under efterföljande hantering.
Kombinationen av hög kvalitet antikroppar och korrekt imaging inställningar är avgörande för att uppnå hög signal-brus-förhållande bilder. Figur 2A visar en exempel-bild där antikroppar mot Nkx2-5 som referens markör till etikett den kardiella crescent och GFP till etikett en släktlinje spåras befolkningen av intresse (Foxa2Cre:YFP ventrikulära kardiovaskulära progenitorceller) (se kompletterande data för raw bild och data-filer). 19 denna strategi möjliggör jämförelse av en given population med hela hjärt crescent regionen. För några experiment, kan det vara av intresse att undersöka FHF och SHF underdomäner av hjärt crescent. I det här fallet den FHF och SHF kan märkas med Hcn4 och Islet1, respektive (se referens19 för bilder och kvantitativ analys med dessa antikroppar kombinationer). Med lämpliga inställningar och sekundär antikropp kombinationer, har vi framgångsrikt avbildas och analyseras tre utvecklingslinjerna samtidigt (dvs hjärt månskäran, YFP och första eller andra HF).
Oförmåga att uppnå stark signal kommer också att begränsa förmågan att generera högt förtroende 3D-modeller, så det blir svårt att ta bort bakgrund signal från de slutliga ytorna. I dessa fall, försiktighet bör iakttas när du justerar bilden gamma (under förbearbetning, figur 2B, 2 C, 2N, 2O) eller ytan tröskelvärde (under ytan generation algoritm, figur 2 g, 2 H, 2 L ) och liknande inställningar ska användas för alla bilder inom ett experiment. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i inkonsekventa volymetriska data som skulle vara olämpligt att använda för direkt jämförelse. Ofta, kan felaktiga ytor följd bakgrund signal tas bort genom storlek filtrering (figur 2I, 2J), fast göra det från hög-bakgrundsbilder kommer att vara svårt utan att förlora sant ytan fragment samt.
Figur 1: Experimental tidslinje och scheman. (A) hela experimentet, från parning till dataanalys, kan utföras i ungefär två veckor. Embryon samlas på morgonen på den 8: e dagen inlägg parning (E8.25) för hjärt crescent scenen analys (B). När fasta, är embryon blockerat och färgas med primära och sekundära antikroppar före montering. Embryon är monterade med standard mikroskopi rutschkanor och coverslips, med dubbelhäftande tejp som en spacer (C). Embryon är placerade i en droppe anti fade i visas orientering (C, övre) och ett täckglas sänks långsamt på bandet (C, lägre). Confocal bildbehandling och bildanalys utförs för att generera bilder med hög upplösning z-stack (D) och 3D surface-modeller (E). HF, huvudet fålla; CC, hjärt crescent; A, främre; P, bakre; AF, anti fade. Skala barer är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: stegvis confocal bildbehandling och 3D yta generation. (A) Confocal z-serie som lastas i vyn volym. Referens kanalen (Nkx2-5) är markerade (B) och intensitet och gamma justerat (C) innan du börjar skapa ytor algoritmen. Efter regionen av intresse är markerade (D) och ytan detaljnivån är valt (E). Den ursprungliga ytan (F) är thresholded att inkludera alla sanna signalen i ytan (G). Filtrering utförs sedan för att ta bort små bakgrund fragment (H) för att ge en sista referensyta (jag). Genom att välja referensytan (J), jämförelse kanalen (YFP) kan dupliceras och maskerat (K). Intensitet och gamma för den här kanalen är sedan justerat (L) innan du genererar en andra ytan genom samma sekvens av steg (M, N). Den totala volymen för varje yta beräknas automatiskt och kan jämföras både kvantitativt och visuellt (O, Observera att ytan färger inte sammanfoga när överlappade). Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet ovan beskriver en strategi för att erhålla kvantitativa uppgifter från hela mount immunofluorescens-bilder av hög kvalitet av konceptionsfrekvens musembryon. När de utförs korrekt, kan den 3D volymetriska data som genereras via dessa steg användas för jämförande och intersektionell analys av flera domäner i embryot. Yta signalen maskering tillvägagångssätt som beskrivs är av särskild användning när du undersöker roman cellpopulationer jämfört med väletablerade referens strukturer.
Vi anser att denna strategi erbjuder en klar fördel jämfört med befintliga metoder. Hela berget immunofluorescens med wide-området imaging kan erbjuda vävnad-nivå information men saknar cellulär upplösning. Omvänt, immunofluorescens seriell avsnitt kan ge detaljerad cellulära-nivå upplösning, även om dessa uppgifter saknar tredimensionella fördelen med hela mount imaging. Samtidigt tredimensionell confocal avbildning åtgärdar bristerna, några användare dra nytta av den kvantitativa potentialen hos dessa data och vi hoppas att gör våra protokoll att fler forskare att dra full nytta av de data de samlar in.
Här, har denna metod exemplifierats med märkpenna Nkx2-5 att avgränsa hjärt månskäran och undersöka förekomsten av Foxa2Cre:YFP härstamning-spåras celler inom domänen. Dock på grund av möjligheten att bild minst tre utvecklingslinjerna samtidigt och de högupplösta tre-dimension data som genereras, kommer detta protokoll sannolikt att användbar för forskare inom många områden. Vi föreslår att detta synsätt kan tillämpas på flera embryonala stadier, organsystem och härstamningar genom smärre justeringar av protokoll baserat på de specifika behoven hos systemet. Vår erfarenhet är detta protokoll direkt tillämplig på en rad embryonala åldrar (E6.5-E9.5 på minimum) med begränsade anpassningar. 19 vi har inte stött på problem med permeabilitet eller antikropp penetration i embryon så stor som E9.5 med de inkubation tiderna, men vi förväntar oss att dessa med tjockare eller tätare vävnader måste vara långsträckt för att uppnå full penetration.
Den analys som beskrivs här utfördes med hjälp av en egenutvecklad mjukvara, men kan anpassas till utföras i alternativa egenutvecklade paket optimerad för stordata hantering. Alternativt, liknande rörledningar kan enkelt implementeras med hjälp computational språk eller öppen källkod paket, vilket leder till den snabba utvecklingen av en shareable protokoll databas. Tillväxten av ett globalt nätverk av forskare, med tillgång till fritt tillgängliga verktyg och protokoll för bild förvärv och analys, kommer att snabbt avancera fältet och öka reproducerbarheten för studier. 17
I vår erfarenhet, den stora begränsningen för detta tillvägagångssätt var relaterad till imaging djup, särskilt för senare embryonala stadier, och kommer är starkt beroende av detaljerna i mikroskopi installationen används. Likaså kommer att hur prover är monterade för imaging bero på de särskilda behoven hos användaren. Vi har funnit att placera regionen sevärdheter närmast objektivet förbättrar imaging djup minskar bakgrund signal och vi föreslår att du använder lager dubbelhäftande tejp för montering, eftersom det gör det möjligt för användare att skapa en kammare som passar deras specifika behov. Användning av en glycerol-baserade montering media med ett anti fade-reagens och equilibrating prov i detta media innan montering, rekommenderas att undertrycka fotoblekning. Slutligen är de prover som används i denna analys nästan transparent; användare kan behöva införliva clearing steg för mer avancerade embryonala stadier, vävnad fragment och organoids, och att fastställa de bästa clearing protokoll för en given applikation kräver empiriska tester.
Vid kardiella morfogenes, kan olika avbildningsmetoder användas. Konfokalmikroskopi används här, är ljus ark mikroskopi ytterst väl lämpade för dessa studier på grund av hastighet, upplösning och signal-brus-förhållande av förvärvade bilden. 20 vi förväntar oss att den ökade tillgången på denna nya teknik för att vidareutveckla verktyget och rikedomen av liknande bildgivande metoder. På samma sätt fortlöpande befordran av fluorescerande reportrar,21 chromophores, färgämnen,22 och live-embryo kultur23,24 kommer att leda till dessa studier flyttar till fyra dimensioner, lägga till elementet i tid, och ger ännu mer information om hur embryonala kontostrukturer formuläret under utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH/NHLBI R56 HL128646 och Mindich barns hälsa och utveckling Institute (MCHDI) på ISMMS (till N.D.). E.B. stöds av en NIH/NIDCR praktik T32 HD075735. Mikroskopi och bildanalys utfördes vid mikroskopi kärnan vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai, som stöds delvis av Tisch Cancer Institute vid Mount Sinai P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
