Summary
Burada, Bütün Dağı ayirt ve nicel hacimsel analizi erken sahne fare embriyo yansıma tabanlı bir protokol açıklayın. Bu teknik nitelik ve nicelik geliştirme sırasında kalp yapıları değerlendirmek ve diğer organ sistemleri yaygın olarak adapte olması teklif için güçlü bir yaklaşım olarak mevcut.
Abstract
Şimdiye kadar ilerleyen görüntüleme teknikleri genel olarak artan embriyonik gelişim anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Ön-implantasyon geliştirme ve organogenesis bu büyük ölçüde bu gelişmeler, doğrudan ön-implantasyon embriyo görüntüleme veya ex vivo organ elde edilebilir veri yüksek kalitesi nedeniyle gelen benefitted var. iki araştırma alanlarıdır. Ön-implantasyon embriyo özellikle yüksek Uzaysal çözünürlük verilerle vermiştir, daha sonraki aşamaları daha az üç boyutlu yeniden yapılmasına müsait edilmiş. Kader eşleme veya genetik soy izleme ile birlikte bilinen embriyonik yapıları için yüksek kaliteli 3D veya hacimsel veri alma morfogenetik olaylar sırasında embriyogenez meydana daha kapsamlı bir analiz için izin verir.
Bu iletişim kuralı bir anahtar yapısı kalp geliştirme sırasında oluşan etiketleme, görselleştirme ve progenitör hücre popülasyonlarının gelişmekte olan kardiyak Hilal içinde miktar için sağlar bir bütün-mount ayirt yaklaşımı açıklar. Yaklaşım bu tür yerlerde tasarlanmıştır bir şekilde her iki hücre ve doku düzeyinde bilgi elde edilebilir. Confocal mikroskobu ve görüntü işleme kullanarak, bu iletişim kuralı böylece Yerelleştirme ve organizasyon sırasında belirli progenitör nüfusun analiz yeteneği sağlayan kalp Hilal üç boyutlu kayma yeniden inşası için izin verir kalp gelişiminin bu kritik aşama. Önemlisi, kardiyak Hilal ardışık maskeleme ve hilal içinde alanların sonraki nicel ölçümler için başvuru antikor kullanımı sağlar. Bu protokolü yalnızca ayrıntılı bir inceleme erken kalp geliştirme, izin vermez ama uyarlamalar ile erken somite sahne fare embriyo için gastrula en organ sistemleri için geçerli olmalıdır.
Introduction
Organogenesis çalışmanın uzun gelişmekte olan embriyo morfogenetik olayların gözlenmesi üzerine güvendi. Bu çalışmalar sık tanımlanmış başvuru nüfus etiketleme ile floresan boyalar veya soy izleme gazetecilere birlikte kullanımı güveniyor. 1 bu etiketlerin göreli konumlar karşılaştırarak, bilgi kökeni, hareketini ve nihai ilgi nüfusu katkısını panoda. Transplantasyon ve kader eşleme deneyler morfolojik yerler veya boya hareketli soy içine enjeksiyon sonra Gelişmiş embriyo katkılardan ötürü incelenir faiz, hücrelerinin başlangıç noktasını tanımlamak için kullanın. 2 , 3 , 4 , 5 etiket hücre popülasyonlarının deneysel manipülasyon olmadan eskiden iyi tanımlanmış muhabir gen ile aynı kavram genetik soy izleme deneyler kullanın. Yeteneği yüksek Uzaysal çözünürlük, deneysel yerlerini ve başvuru etiketleri ile belirlemek için bu yaklaşımlar anahtarıdır. Bu yaklaşımlar ön-implantasyon geliştirmede olağanüstü ilerleme vermiştir ve organogenesis çalışmalar explant. 6 , 7 , 8 , 9
Kalp morfogenez altında yatan gelişimsel olayları son yıllarda giderek daha iyi tarif edilmiştir. 10 araştırma bu alanda büyük keşiflerinden birini benzersiz işaretleri ifade tarafından seçkin atası nüfus sayısı açıklaması bulunur. 11 ilk ve ikinci kalp embriyonik gününde (E) 8,25 fare gelişme embriyo ön tarafındaki kardiyak Hilal içinde var olmayan (FHF ve SHF), bu örneğin alınma olasılığını içerir. 12 bu nüfus sık ama sadece yüksek hücresel çözünürlük sunan doku düzeyinde bilgi ve seri kesit ayirt deneyleri ile sağlayan, geniş alanlı mikroskobu, bir arada yoluyla incelenir iki boyutlu mekansal bilgi. 13 bu çalışmalar büyük ölçüde kalp geliştirme, anlayışımızı gelişmiş iken böylece, kullanılabilir yöntemleri morfogenez derinliği kantitatif analiz bu aşamalarında incelemek yaklaşımlar gereksinimini oluşturma sınırlı Bu nüfus bir bütün-organizma düzeyinde organizasyonu.
Son gelişmeler confocal mikroskobu ve 3D görüntü analizi yüksek çözünürlüklü ve yüksek işlem hacmi algoritmik rekonstrüksiyonu, hücreler ve yapıları içinde in situ için göreli kolaylıkla izin böylece ayrıntılı çalışmalar kompleks önünü hücresel yapılar. 14 bir işlem gücü artış ve büyük veri yönetim algoritma, veri setleri, Imaging boyutta üstel artış işlemek için her iki gerekli geliştirme ile analizleri şimdi tamamen otomatik hale getirilebilir. 15 otomatik analiz görüntüleme veri kümelerinin tarafsız olmanın verdiği avantajla vardır, ama sadece giriş veri kümesi kalite güvenilir; Bu, o zaman, en iyi yöntemler edinme ve görüntü ön işleme sırasında en yüksek kalite, tarafsız analiz sağlamak için kullanıldığını zorunludur. 16 iletişim kuralları tamamen otomatik ve tekrarlanabilirlik için paylaşılan olabilir ve özel mülk yazılım tarafından kullanılan algoritmalar kolayca modern özel olarak bilindiğini var bilim adamları tarafından kullanılmak üzere Kütüphaneler üzerinden kullanılabilir veya açık kaynak geliştirici araçları. 17
Aşağıdaki iletişim kuralı bir iyi tanımlanmış modeli bir organogenesis, kardiyak Hilal oluşumu kalp geliştirme sırasında bu tip çözümlemeler gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Özellikle, bu iletişim kuralını (1) hasat açıklar ve kardiyak Hilal sahne embriyo incelemek, gerçekleştirmek (2) bütün Dağı ayirt için referans (Nkx2-5) ve deneysel (Foxa2Cre:YFP18,19) işaretleri, (3) hazırlamak ve confocal mikroskobu kullanılarak embriyo resim ve son olarak (4) analiz ve gelişmiş üç boyutlu yaklaşımlar kullanarak elde edilen görüntüleri ölçmek. Kardiyak Hilal uygun değişiklik ile burada, bir örnek kullanılırken bu protokolü gastrula erken somite sahne embriyolar için birden çok soy analizi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Mount Sinai Tıp Icahn okul tarafından onaylanmış olan.
1. hasat ve işleme kardiyak Hilal sahne embriyo
- verimli bir dişi fare ile verimli damızlık erkek dostum. Bir künt sonda veya forseps kullanarak
- onay vajinal birleşme varlığı için tak. Öğlen tak algılama günü olarak kabul edilir embriyonik gün (E) 0.5 (bkz: şekil 1A tam zaman çizelgesi için).
Not: gün boyunca kayıp oldukları gibi fişler için sabahları, denetlenmesi. - (E8.25) 8 inci günün sabahı, hamile Barajı CO 2 Solunduğunda veya yerel ve kurumsal düzenlemelere göre kurban.
Not: Tam zamanlama zorlanma bağımlı olabilir ve ampirik olarak Morfoloji tarafından belirlenmesi gerektiğini. - Fare karın alanı temizleyin ve dökülme en aza indirmek için % 70 etanol ile sprey. İç organlar karın bir kesi cilt ve vücut duvar üzerinden gerçekleştirerek maruz.
- Rahim bulun ve tüm rahim boynuz hayvandan dikkatli bir şekilde çıkarın. Yukarıda bir ovidukt, rahim rahim ağzı sonuna geçmeden süre uzak yağları azaltma keserek başlayın. Serviks kesme ve üst diğer ovidukt tüm rahim serbest bırakmak için kesme, sonuna kadar devam. Fosfat ile
- yeri 10 cm rahmine çanak arabelleğe alınmış serum (aşırı kan silsin için PBS, pH 7,4). Rahim mesometrium embriyo içerir her deciduum arasında kesim tarafından alt incelemek. Taze PBS ile 6 cm çanak embriyo transfer.
- Uzak decidual doku rahim dokusu kaldırmak için iyi forseps (#5) bir diseksiyon mikroskop altında kullanın.
- Kullanma forseps, dikkatle embriyonik daha embriyo ortaya çıkarmak için deciduum bir ucu dilim. Embriyo itmek ve dikkatle embriyo çıkar deciduum tutam.
- Embriyo ( şekil 1B) Morfoloji zarar vermeden mümkün olduğu kadar uzak extraembryonic doku teşrih.
- Embriyo taze PBS ile 1,5 mL tüp yerleştirin ve buza yerleştirmek için bir transfer pipet kullanın. Devam etmeden önce için kalan embriyo 1.7-1.9 yineleyin.
- Aspiratı PBS ve durulama kez PBS ile. PBS Aspire edin.
Not: zarar veya embriyo kurutma olmadan mümkün olduğu kadar PBS kaldırmayı deneyin. El kaldırma çözümleri tüm adımları embriyo kayıplarını önlemek için tavsiye edilir.
Dik, 1 h için - düzeltme embriyo % 4 ile paraformaldehyde (PFA) PBS içinde
Not: Embriyo sabit gecelik (O/N) 4 ° C. - Üç kez PBS ile durulama. Embriyo 4 ° C'de ayirt ile devam etmek için hazır kadar devam.
Not: noktası duraklatma. Embriyo güvenli bir şekilde saklanabilir PBS içinde 4 ° C'de birkaç hafta için.
2. Ayirt Staining
Not: kuluçka koşulları aşağıdaki farklı zamanlamaları karşılamak için ayarlanabilir. Nazik sallayarak veya tüm uzun bir kuluçka adımları için sallanan kullanım önerilir.
- PBS kaldırıp engelleme arabellek (% 0.5 saponin, PBS içinde % 1 sığır serum albümin (BSA)) 1 mL ekleyin.
- En az 4 h RT. kuluçkaya Bu da O/N 4'te yapılabilir ° C.
- Engelleme arabellek kaldırmak ve engelleme arabellekte seyreltilmiş birincil antikor karışımı ekleyin. O/N 4 ° C'de kuluçkaya
Not: Antikor açıklaması için bkz: belgeleri bölümüne kullanılan ve dilutions önerdi. Antikor dilutions ampirik olarak tespit edilmelidir. Kardiyak Hilal başvuru leke olarak Nkx2-5 kullanımı tavsiye edilir ve aşağı akım için anahtar görüntü segmentasyonu ve analiz adımdır. - Aspirasyon tarafından kaldırmak birincil antikorlar.
- Yıkama % 0.1 ile her 1 h için 3 kez PBS Triton.
- Yıkama kaldırmak ve engelleme arabellekte seyreltilmiş ikincil antikor karışımı ekleyin. Dik, 3 h için kuluçkaya Bu da O/N 4'te yapılabilir ° C.
- Yıkama % 0.1 ile her 1 h için 3 kez PBS Triton. Bu da O/N 4'te yapılabilir ° C. 4
- counterstain ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) PBS içinde 10 dakika süreyle
Not: Bu counterstain aynı anda ile ikincil antikor gerçekleştirilebilir. - Yıkama 2 kez % 0.1 ile her 5 min için PBS Triton.
- Yavaş yavaş embriyo Anti-fade montaj medyada (% 2 w/v n-propil gallat (nPG), % 90 gliserol, 1 x PBS; askıya. Daha fazla ayrıntı için malzeme bölümüne bakın). En az 1 h montaj önce equilibrate olanak sağlar. Yavaşça düzenli olarak anti-fade çözüm damla embriyo yardım için tüp fiske.
Not: noktası duraklatma. Embriyo saklanabilir Anti-fade çözüm içinde birkaç gün kadar Dağı ve görüntü hazır.
3. Embriyo mikroskopi için montaj
- hazırla mikroskop slaytlar çift sopa şerit ya da silikon çubukları kullanarak montaj için. Çift sopa şerit kullanarak, 5-6 kat yaklaşık 15-20 mm iki Paralel Yığınlar ayrı olun. Bu embriyoların yerleştirin ve coverslip ( şekil 1 c) güvenli için yeterli alan bırakacaktır.
- Anti-fade 15 µL damlasını çift sopa şerit arasında slayt üzerine yerleştirin. Dikkatle slayda bir embriyo transfer.
Not: birden fazla embriyo bir slayt üzerinde yerleştirilebilir. Ancak, sonraki yönlendirme adımları ile birden fazla embriyo daha zordur ve fotoğraf-ağartma neden olabilir uzun süreler Imaging. - Slayt Slayt uzun ekseni doğrultusunda vücut eksenli uzak ön yüzü öyle ki iyi forseps kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında embriyo getirin. şekil 1 c montaj kurulum bir şematik için bkz.
- Dikkatle yer bir coverslip örnek üzerinde bir tarafı çift sopa şerit bir yığın üzerinde dinlenme ve forseps kullanarak diğer kaseti kişiler kadar coverslip yavaşça indirin.
Not: Adım 3.3 ve 3.4 embriyo görüntüleme için doğru yönünü emin olmak için kritik öneme sahiptir. Coverslip posterior anterior yönde boyunca düşürerek, embriyo değil rulo ve kardiyak Hilal bölge ters bir mikroskop üzerinde görüntüleme için idealdir slayt uzak odaklı kalacak. - Slayt ve örnek depolama/görüntüleme sırasında ölmek tutmak için coverslip arasında ek Anti-fade eklemek için bir pipet kullanın.
4. Confocal görüntüleme
- edinme imge bir görüş alanı içinde yakalanması tüm kalp Hilal bölge için verir en yüksek büyütme amacı istimal. Nyquist örneklendirme oranı x-y-z Voksel boyutlarını belirlemek için kullanın. Mikroskop üreticilerinin çoğu olacak bir " en iyi duruma " Nyquist örnekleme sağlamak için düğmesini.
Not: tüm kalp Hilal bölgenin betimlemek gibi Nkx2-5 için boyama burada, faydalı olduğunu. Küçük Z-adım boyutları (deπiµtirebilme) daha iyi 3D modelleme sonuçları verecektir ama genişletilmiş edinme kez ve/veya bazı örnekler için beyazlatma neden olabilir. - Standart en iyi görüntüleme yöntemleri kullanarak parametrelerini görüntüleme ayarla. Yani, her fluorophore için iyi sinyal-gürültü oranı elde etmek ve kazanç seçin ve geniş dinamik alan sinyali doyurarak olmadan verim düzeyleri ofset için en düşük olası lazer yoğunluğu kullanın.
Not: parametreleri doğrudan Karşılaştırılacak örnek arasında Imaging ile tutarlı olması. Aşağı akım 3D analiz ve miktar için önem kazanır.
5. Görüntü analizi ve nicel 3D modelleme
Not: Bu iletişim kuralı için Imaris yazılım paketi kullanarak görüntüleri analiz edildi. Benzer analiz alternatif paketleri kullanarak mümkün olabilir. Aşağıdaki açıklamayı analiz boru hattı için bir referans kanal (Yani Nkx2-5) ve bir deneysel kanal (Yani YFP) kapsar. Ek kanalları adımları tekrarlama çözümlenebilir. Bu analiz çoğaltmak için kullanılabilir sağlanan bir örnek veri kümesi oldu.
- Imaris Arena görünüme raw görüntü veri kümeleri yüklemek ve dosya için istenen embriyo Surpass görünümünde açın. Verileri MIP (en çok) modunda 3D görünümünde yüklemek. Ekran ayarlaması penceresi açın ve sadece referans kanal seçin.
- Daha iyi görselleştirme için gerekirse görüntü eşik ayarlayın. Sinyal-gürültü oranı bölümleme için çok düşükse bu çözümleme için gama ayarlamak.
Not: doğrusal olmayan ayarlar olan gama düzeltmeleri gerçekleştirme ayarlanan görüntü yoğunluk ölçümleri veya karşılaştırmalar için kullanılamaz. Bu aşamada, sinyal-gürültü oranı tatmin edici değilse daha fazla görüntü ön işleme (yani aydınlatma düzeltmeler, Gauss Bulanıklığı veya diğer filtreleme), gerçekleştirebilirsiniz. Ön işleme yapmayı seçerseniz, aynı ön-işleme adımları tüm resimler için veri kümesi içinde gerçekleştirmelisiniz. - Yüzey algoritması diyalog kullanarak referans kanal için yeni bir yüzey oluşturma.
- Seçin " ilgi sadece bir bölge Segment " onay kutusu.
- Başvuru leke tarafından belirlenen gibi bölgenin ilgi (yatırım Getirisi, Yani kalp Hilal alan) içerip sınırlayıcı kutusunu bölge ayarlayın.
- Referans kanal kaynak kanalı açılır menüden seçin. Yumuşatma (z Voksel boyutuna eşit) için varsayılan ayar genellikle yeterli olmakla birlikte ampirik optimizasyonu gerektirebilir. Bu çözümleme için yarım z voxel-boyutuna eşit yumuşatma kullanın.
- Gerçekleştir eşik mutlak yoğunluğu tarafından. Yüzey kanal sinyal genişletmek değil emin olmak için kaydırıcıları kullanarak alt sınırı ayarlamak.
Not: nerede hücreleri belirlenen kolayca belirli görüntüleri için dahil edebileceğiniz " nesneleri dokunmadan bölünmüş " algoritma daha fazla ayrı sinyalinizi arka plan,. - Nesneleri Voksel numarası veya birim tarafından filtre ve algoritma oluşturulan (küçük veya alanlarda Nkx2-5 alan dışında bulunan) arka plan nesnelerine reddediyorum. Algoritma bitirmek.
- Yeni oluşturulan yüzeyi kullanarak oluşturmak için deneysel kanal maskeli bir kanal.
- Seçili surface(s) ile seçin " maskesi Sel..... ͟ " düzenleme penceresi işlevinden.
- İlgi (Yani YFP) deneysel kanalı seçin. Emin olun " yinelenen kanal maske uygulamadan önce " onay kutusu seçildiğinde.
- İçinde ekran ayarlaması penceresi yalnızca maskeli kanal seçin. 5.3-5.3.5 takip ederek maskeli kanal adımlar için yeni bir yüzey oluşturma.
Not: Bu noktada 3D modelin görselleştirme kolaylaştırmak için her maskeyi görünümünü ayarlamak yararlı olabilir: her yüzey seçin ve renk sekmesini ayarlama temel renk ve saydamlık gerektiği gibi seçin. Yüzey renkleri değil ne zaman üst üste birleştirme.
Seçili her yüzey hacimsel veri elde etmek için - istatistik sekmesini seçin. İçinde " detaylı " alt sekmesinde, seçim " ortalama değerleri " aþaðý açýlan menüsünden. Yüzey hacmi toplamı sütun oluşturulan tablo bulunabilir.
Not: oluşturulan yüzey hatalı parçaları (Yani arka plan sinyalini segmentasyon veya alanları ana yüzeyden kesintili sırasında hariç değildir parçaları) içeriyorsa, bu el ile Toplam hacim hesaplamak gerekli olabilir veya yüzeyler birim veya voxels sayısı tarafından filtre ve sadece sinyal kesimleri hesaplamasına dahil emin olun. Her bir bölümünü yüzey için birim seçerek bulunabilir " tüm değerleri " aþaðý açýlan menüsünden. Her değer seçerek karşılık gelen bölge dışlamak için değerleri belirlemede yardımcı sarı görünür yapacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Son veri ve analiz kalitesini büyük ölçüde (1) bütünlük ve Morfoloji disseke embriyolar, (2) yüksek özgüllük antikor kullanımı ve (3) uygun kurulum parametrelerini görüntüleme üzerinde bağlıdır. Hasarlı embriyo yüzey oluşturma işlemi yıkmak ve kantitatif analiz engel. Düzgün disseke ve aşamalı embriyo örnekleri şekil 2Biçinde gösterilir. Embriyolar daha fazla sarısı sac için sık sık özellikle olmayan antikorlar bağlayacaksınız kaldırarak disseke. Aşağı akım işleme sırasında özen gösterilmelidir ancak, sarısı sac kaldırılması embriyo daha az güçlü yapacak.
Yüksek kaliteli antikorlar ve uygun görüntü ayarları ile birlikte yüksek sinyal gürültü oranı görüntüleri elde etmek için çok önemli. Etiket için bir başvuru işaretçisi olarak Nkx2-5 karşı antikor kullanarak örnek resim kardiyak Hilal ve GFP nüfusu bir soy takip etiket için faiz (Foxa2Cre:YFP Ventriküler kardiyovasküler progenitör hücre) (bkz. ek şekil 2A gösterir veri ham görüntü ve veri dosyaları için). 19 bu strateji tüm kalp Hilal bölgenin belirli nüfusuyla karşılaştırılması için sağlar. Bazı deneyler için kardiyak Hilal FHF ve SHF alt incelemek için ilgi olabilir. Bu durumda, FHF ve SHF Hcn4 ve Islet1, sırasıyla etiketli (başvuru19 görüntüleri ve bu antikor kombinasyonları ile kantitatif analiz için bakınız). Uygun kurulum ve ikincil antikor kombinasyonları ile biz başarıyla görüntüsü ve üç soy aynı anda (Yani kalp Hilal, YFP ve birinci veya ikinci HF) analiz.
O-ecek var olmak arka plan sinyal son yüzeyler arasında kaldırmak zor gibi güçlü sinyal elde etmek için yetersizlik de yüksek güven 3D modelleri, oluşturma yeteneği sınırlar. Bu gibi durumlarda, resmin gammasını (ön işleme sırasında şekil 2B, 2 C, 2N, 2O) ayarlarken dikkat edilmelidir veya yüzey eşik (sırasında yüzey oluşturma algoritması, Şekil 2 g, 2 H, 2 L ) ve benzer ayarların bir deney içinde tüm görüntüler için kullanılması gerekir. Aksi halde doğrudan karşılaştırma için uygun olmaz tutarsız hacimsel veri neden olur. Çoğu zaman, hatalı yüzeylerde arka plan sinyalini kaynaklanan yüksek arka plan görüntüleri böylece doğru yüzey parçaları de kaybetmeden zor olsa (şekil 2I, 2J), filtre boyutu ile kaldırılabilir.
Şekil 1: deneysel zaman çizelgesi ve şemaları. (A) tüm deney, veri analizi, çiftleşme üzerinden yürütülen yaklaşık iki hafta içinde. Embriyo 8inci gün sonrası (E8.25) birleşme sabahı kalp Hilal sahne analiz (B) için toplanır. Bir kez sabit, embriyo bloke ve montaj önce birincil ve ikincil antikorlar ile lekeli. Embriyo standart mikroskobu slaytlar ve çift taraflı bant (C) ayırıcı kullanarak coverslips ile monte edilir. Embriyo Anti-solmak içinde görüntülenen yönlendirme (C, üst) bir damla yerleştirilir ve bir coverslip yavaş yavaş (C, daha düşük) teyp indirilir. Confocal görüntüleme ve görüntü analizi yüksek çözünürlüklü z-yığını görüntüler (D) oluşturmak için yapılmaktadır ve 3 boyutlu yüzey modeller (E). HF, baş kat; CC, kardiyak Hilal; A, ön; P, posterior; AF, Anti-fade. Ölçek barlar vardır 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kademeli confocal görüntü işleme ve 3B yüzey üretimi. (A)Confocal z-birim görünümünde yüklü serisi. Başvuru (Nkx2-5) seçili (B) ve yoğunluğu ve gama (C) ayarlanabilir yüzeyler oluşturma algoritması başlamadan önce kanalıdır. Sonra faiz seçili (D) ve yüzey ayrıntı düzeyini bölgedir (E) seçilir. İlk yüzey (F) tüm doğru sinyal yüzey (G) dahil etmek için thresholded. Süzme sonra küçük arka plan parçaları (bir son başvuru yüzey (Ben) vermeye,H) kaldırmak için gerçekleştirilir. Referans yüzeyi (J) seçildiğinde, karşılaştırma kanal (YFP) çoğaltılamaz olabilir ve (K) maskeli. Yoğunluk ve bu kanal için gama o zaman vardır (L) aynı adımlar (M, N) dizisini ikinci bir yüzey oluşturmadan önce ayarlanabilir. Toplam hacim her yüzey için otomatik olarak hesaplanır ve hem nicelik hem de görsel olarak karşılaştırılabilir (O, yüzey renkleri üst üste ne zaman birleştirme değil Not). Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki Protokolü Nicel veri sonrası implantasyon fare embriyolar kaliteli bütün Dağı ayirt görüntüleri elde etmek için bir strateji açıklar. Doğru gerçekleştirilen, bu adımlarda oluşturulan 3D hacimsel veri karşılaştırmalı ve intersectional analiz embriyo içindeki birden çok etki alanı için kullanılabilir. Açıklanan yaklaşım maskeleme yüzey sinyal belirli roman hücre popülasyonlarının köklü başvuru yapıları ile karşılaştırıldığında soruşturma zaman kullanılır.
Bizce bu yaklaşım varolan yaklaşımlar ayrı bir avantaj sunuyor. Bütün Dağı ayirt geniş alanlı görüntüleme ile doku düzeyi bilgisini yoksun ama hücresel çözünürlük sunar. Bunun tersi olarak, Bütün Dağı görüntüleme üç boyutlu avantajı bu veri eksikliği rağmen ayirt seri bölümlerin detaylı hücresel düzeyinde çözünürlük, verebilir. Süre üç boyutlu confocal görüntüleme bu eksiklikleri giderir, az sayıda kullanıcı bu verilerin nicel potansiyel yararlanmak ve umarız bizim iletişim kuralı daha fazla araştırmacılar onlar toplamak veri tam yararlanmak için izin verir.
Burada, bu yaklaşım-var örneği kardiyak Hilal betimlemek ve bu etki alanı içinde Foxa2Cre:YFP soy takip hücrelerinin varlığı incelemek için Nkx2-5 işaretçisi kullanarak. Ancak, aynı anda en az üç soy ve oluşturulan yüksek çözünürlüklü üç-boyut veri görüntü yeteneği nedeniyle, bu iletişim kuralı büyük olasılıkla birçok alan araştırmacılar için yararlı olacaktır. Önerdiğimiz bu yaklaşım birden çok embriyonik aşamalarında, organ sistemleri ve soy sistem belirli ihtiyaçlarına göre iletişim kuralı küçük ayarlamalar aracılığıyla uygulanabilir. Deneyim, bu iletişim kuralı ile sınırlı uyarlamaların embriyonik yaş (en azından E6.5-E9.5) bir dizi için doğrudan geçerlidir. 19 kalın veya daha yoğun kurcalayarak Bunlar tam penetrasyon ulaşmak için uzamış gerekir bekliyoruz rağmen biz sorunları geçirgenliği veya antikor penetrasyonu embriyo E9.5 büyük ile listelenen, kuluçka süreleri ile karşılaşmadım.
Burada açıklanan analiz özel mülk yazılım paketi kullanılarak gerçekleştirilen ama alternatif özel paketlerinde büyük veri işleme için en iyi duruma getirilmiş yapılması için adapte edilebilir. Alternatif olarak, benzer boru hatları kolayca Hesaplamalı diller veya paylaşılabilir protokolleri veritabanı hızlı gelişmesine yol açacak açık kaynak yazılım paketleri kullanarak uygulanabilir. Bilim adamları, resim alma ve çözümleme, serbestçe kullanılabilir araçları ve iletişim kuralları erişimi olan küresel bir ağ gelişimini hızla alan ilerlemek ve tekrarlanabilirlik çalışmaların artırmak. 17
Deneyimlerimiz, bu yaklaşımın büyük sınırlama görüntüleme derinliği için özellikle daha sonra embriyonik aşamaları için ilgili ve ağır kullanılan mikroskobu kurulum özelliklerini temel bağlıdır. Benzer şekilde, nasıl örnekleri için görüntüleme monte edilen kullanıcı ihtiyaçlarına özel bağlı olacaktır. Kullanıcıların kendi özel ihtiyaçlarınıza uygun bir oda oluşturmalarını sağlar gibi bölgenin ilgi yakın lens yerleştirerek görüntüleme artırılır ve arka plan sinyali azalır ve montaj için katmanlı çift taraflı bant kullanarak öneririz buldum. Gliserol tabanlı kullanımı bir anti-fade reaktif ile medya montaj ve montaj önce bu medya örnekleri sıcaklığına, photobleaching bastırmak için önerilir. Son olarak, bu analizde kullanılan örnekleri hemen hemen saydam; kullanıcı-ebilmek lüzum daha embriyonik aşamaları, doku parçaları veya organoids gelişmiş temizleme adımları dahil etmek ve en iyi iletişim kuralı belirli bir uygulama için takas belirleme ampirik test gerektirir.
Söz konusu olduğunda kardiyak morfogenez, çeşitli görüntüleme yöntemleri kullanılabilir. Confocal mikroskobu burada kullanılırken, ışık sayfalık mikroskobu hız, çözünürlük ve alınan sinyal-gürültü oranı nedeniyle bu çalışmalar için son derece uygundur. 20 daha fazla yardımcı program ilerlemek için bu yeni teknolojinin artırılmış kullanılabilirlik ve benzer görüntüleme yaklaşımlar zenginliği bekliyoruz. Benzer şekilde, floresan gazetecilere,21 kromofor, boyalar,22 ve canlı-embriyo kültürü23,24 sürekli gelişme bu çalışmalar zaman, eleman ekleyerek dört boyut için hareketli olacak yol ve verimli henüz geliştirme sırasında nasıl embriyonik yapıları formu hakkında daha fazla bilgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NIH/NHLBI R56 HL128646 ve Mindich çocuk sağlığı ve geliştirme Enstitüsü (MCHDI) ISMMS (ND için) tarafından finanse edildi. E.B. bir NIH/NIDCR staj T32 HD075735 tarafından desteklenir. Mikroskobu ve görüntü analizi Icahn Tıp Fakültesi Mount Sinai, kısmen Mount Sinai P30 CA196521-Kanser Merkezi destek hibe Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen, mikroskobu özünde de gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
