Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56446

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لجبل كاملة الفلورة والمستندة إلى الصور التحليل الحجمي الكمية المرحلة المبكرة الماوس الأجنة. أننا نقدم هذا الأسلوب كنهج قوية كمياً ونوعيا تقييم هياكل القلب خلال التنمية، واقترح أنه قد يكون على نطاق واسع التكيف مع أنظمة أخرى للجهاز.

Abstract

قد ساهم باستخدام تقنيات التصوير النهوض من أي وقت مضى على نطاق واسع فهمنا المتزايد من التنمية الجنينية. غرس ما قبل التنمية و organogenesis هما مجالين من مجالات البحوث التي استفادت كثيرا من أوجه التقدم هذه، نظراً للجودة العالية للبيانات التي يمكن الحصول عليها مباشرة من التصوير قبل غرس الأجنة أو السابقين فيفو الأجهزة. في حين قبل غرس الأجنة قد أسفرت عن البيانات مع خاصة عالية الدقة المكانية، كانت المراحل اللاحقة أقل قابلية لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. الحصول على بيانات عالية الجودة 3D أو الحجمي لهياكل الجنينية المعروفة في تركيبة مع تعيين مصير أو تتبع السلالة الجينية ستسمح بإجراء تحليل أكثر شمولاً للأحداث مورفوجينيتيك التي تجري أثناء امبريوجينيسيس.

ويصف هذا البروتوكول نهجاً الفلورة الجامع-جبل يسمح لوضع العلامات، والتصور، والتقدير الكمي للسكان خلية السلف داخل الهلال القلب النامية، تشكل بنية أساسية أثناء تطوير القلب. ويهدف النهج المتبع في مثل هذه طريقة التي يمكن الحصول على كل المعلومات على مستوى الخلايا والأنسجة. باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، ومعالجة الصور، يسمح هذا البروتوكول للتعمير المكاني ثلاثي الأبعاد الهلال القلب، مما يوفر القدرة على تحليل التعريب وتنظيم السكان السلف محددة خلال هذه المرحلة الحرجة من قلب التنمية. الأهم من ذلك، يتيح استخدام الأجسام المضادة للإشارة لإخفاء المتعاقبة للهلال القلب والقياسات الكمية اللاحقة من المناطق داخل الهلال. هذا البروتوكول لن تمكن فقط دراسة تفصيلية للتنمية القلب في وقت مبكر، ولكن مع التعديلات يجب أن تنطبق على معظم أنظمة الجهاز في جاسترولا إلى مرحلة سميط المبكر الماوس الجنين.

Introduction

دراسة organogenesis طويلة تعتمد على مراقبة الأحداث مورفوجينيتيك في الجنين النامي. كثيرا ما تعتمد هذه الدراسات على استخدام الأصباغ الفلورية أو النسب تتبع الصحفيين في تركيبة مع تصنيف السكان إشارة محددة. 1 بمقارنة الأوضاع النسبية لهذه التسميات، يمكن استخلاصها المعلومات على المنشأ أو حركة، أو المساهمة في نهاية المطاف للسكان لمصلحة. زرع ومصير تعيين تجارب استخدام معالم المورفولوجية أو الحقن بالأصباغ في الأنساب غير متحركة لتحديد نقطة البداية للخلايا ذات الاهتمام، والتي يتم فحص ثم لمساهمة الجنين نمواً. 2 , 3 , 4 , 5 استخدام التجارب الجينية النسب-تتبع نفس المفهوم مع الآليلات مراسل المعالم التي تستخدم لتسمية الخلية السكان دون التلاعب التجريبية. المفتاح لهذه النهج هو القدرة على تحديد، مع عالية الدقة المكانية والمواقع التجريبية والعلامات المرجعية. حققت تقدما بارزا في التنمية قبل غرس هذه النهج و explant الدراسات أورجانوجينيسيس. 6 , 7 , 8 , 9

وكانت الأحداث التنموية التي تكمن وراء morphogenesis القلب وصفاً جيدا يتزايد في السنوات الأخيرة. 10 من الاكتشافات الكبرى في هذا المجال من البحوث هو وصف لعدد من السكان السلف التي يمكن تمييزها بالتعبير عن علامات فريدة من نوعها. 11 تشمل هؤلاء السكان الأولى والثانية حقول القلب (فهف وأفران الموجات الدقيقة)، التي موجودة داخل الهلال القلب في الجانب الأمامي للجنين في اليوم الجنينية (ه) 8.25 التنمية الماوس. 12 كثيرا ما يتم فحص هؤلاء السكان من خلال مزيج من واسع المجال المجهري، مما يوفر معلومات على مستوى الأنسجة، وتقطيع المسلسل مع فحوصات الفلورة، الذي يوفر دقة عالية الخلوية ولكن فقط المعلومات المكانية ثنائي الأبعاد. 13 هكذا، بينما تقدمت هذه الدراسات إلى حد كبير فهمنا للتنمية القلب، والأساليب المتاحة محدودة في عمق التحليل الكمي من morphogenesis خلال هذه المراحل، خلق الحاجة إلى اتباع نهج لدراسة منظمة لهؤلاء السكان على مستوى كل الكائنات.

الأخيرة التقدم في [كنفوكل] مجهرية وتحليل الصور الثلاثية الأبعاد يسمح بإعادة البناء حسابي عالية الاستبانة والفائق للخلايا والهياكل في الموقع بسهولة نسبية، يمهد الطريق لدراسات تفصيلية لمجمع الهياكل الخلوية. 14 مع زيادة الطاقة الحاسوبية وتطوير خوارزميات إدارة البيانات الكبيرة، على حد سواء اللازمة للتعامل مع الزيادة الهائلة الحجم لتصوير مجموعات البيانات، التحليلات يمكن الآن أن تكون مؤتمتة بالكامل. 15 التحليل الآلي للتصوير من مجموعات البيانات قد تستفيد من غير منحازة، ولكن فقط موثوقة بقدر جودة dataset المدخلات؛ ثم، من الضروري أن تستخدم أفضل الممارسات خلال اقتناء وتجهيز الصور قبل لضمان أعلى مستوى من الجودة، تحليل غير متحيزة. 16 البروتوكولات يمكن أن تكون مؤتمتة بالكامل ومشترك لإمكانية تكرار نتائج، والخوارزميات المستخدمة من قبل البرمجيات المسجلة الملكية متاحة من خلال المكتبات لاستخدامها من قبل العلماء الذين لديهم إلمام بالملكية الحديثة أو مفتوحة المصدر أدوات المطور. 17

ويوضح البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لإجراء مثل هذا التحليل على نموذج محدد واحد ل organogenesis، تشكيل الهلال القلب أثناء تطوير قلب. على وجه التحديد، يصف هذا البروتوكول كيفية (1) الحصاد وتشريح الأجنة مرحلة الهلال القلب، (2) إجراء جبل كاملة الفلورة للمرجع (Nkx2-5) والتجريبية علامات (Foxa2Cre:YFP،من1819)، (3) إعداد وصورة الأجنة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، وأخيراً (4) تحليل وتحديد حجم الصور الناتجة باستخدام نهج ثلاثي الأبعاد المتقدم. بينما يستخدم في الهلال القلب كمثال هنا، مع إدخال التعديلات المناسبة، قد تستخدم هذا البروتوكول لتحليل الأنساب متعددة في جاسترولا للأجنة مرحلة سميط في وقت مبكر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة الاستخدام في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-حصاد ومعالجة الأجنة مرحلة الهلال القلب

  1. رفيقه ماوس الإناث خصبة مع عشيق خصوبة الذكور.
  2. التوصيل
  3. الاختيار لوجود الجماع المهبلي استخدام مسبار كليلة أو الملقط. ظهر اليوم للكشف عن التوصيل يعتبر الجنينية اليوم (ﻫ) 0.5 (انظر الشكل 1A لكامل الفترة الزمنية)-
    ملاحظة: المقابس يجب التحقق في الصباح، كما أنها تفقد طوال اليوم-
  4. صباح اليوم ال 8 (E8.25)، يوم التضحية السد الحوامل باستنشاق أول أكسيد الكربون 2، أو وفقا للوائح المحلية والمؤسسية-
    ملاحظة: التوقيت الدقيق يمكن أن سلالة تعتمد وينبغي أن يحدده مورفولوجيا تجريبيا.
  5. رذاذ
  6. البطن للماوس مع الإيثانول 70% تنظيف المنطقة وتقليل سفك. كشف الأحشاء عن طريق إجراء شق البطن من خلال الجلد وجدار الجسم.
  7. موقع الرحم وإزالة الرحم كامل القرن الأفريقي بعناية من الحيوان. ابدأ بالقطع فوق قناة واحدة، تقليم الدهون الموجودة خارج الرحم أثناء الانتقال إلى نهاية عنق الرحم. قطع طريق عنق الرحم، وتستمر إلى نهاية العلوي من قناة أخرى، قطع للإفراج عن كامل الرحم.
  8. صحن
  9. مكان الرحم في 10 سم مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) ليغسل الدم الزائد. دون تشريح الرحم بقطع ميسوميتريوم بين كل ديسيدووم، الذي يحتوي على الأجنة. نقل الأجنة إلى طبق 6 سم مع برنامج تلفزيوني جديد.
  10. تحت مجهر تشريح، استخدام الملقط غرامة (#5) لإزالة أنسجة الرحم بعيداً عن الأنسجة ديسيدوال.
  11. استخدام الملقط، شريحة بعناية غيض نصف الجنينية ديسيدووم للكشف عن الجنين. قرصه ديسيدووم دفع الجنين للخارج وعناية سحب الجنين.
  12. تشريح الأنسجة اكسترامبريونيك بعيداً بقدر الإمكان دون إلحاق الضرر مورفولوجية الجنين ( الشكل 1B).
  13. استخدام ماصة نقل لوضع الأجنة في أنبوب 1.5 مل مع برنامج تلفزيوني جديد ثم ضع على الجليد. كرر 1.7-1.9 للأجنة المتبقية قبل المتابعة.
  14. أسبيراتي برنامج تلفزيوني وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. نضح PBS.
    ملاحظة: حاول إزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن دون إلحاق الضرر بها أو تجفيف الأجنة. ينصح الإزالة اليدوية للحلول في جميع الخطوات لتجنب فقدان الأجنة.
  15. بارافورمالدهيد
  16. الأجنة فيكس مع 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في الرايت
    ملاحظة: يمكن أن تكون ثابتة الأجنة بين عشية وضحاها (O/N) في 4 ° C.
  17. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. تبقى الأجنة في 4 درجات مئوية حتى على استعداد للمضي قدما مع الفلورة.
    ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت. الأجنة ويمكن تخزينها بأمان في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.

2. Staining الفلورة

ملاحظة: يمكن تعديل شروط الحضانة أدناه لاستيعاب جداول مختلفة. يوصي باستخدام لطيف الهز أو هزاز لجميع الخطوات حضانة طويلة.

  1. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت حظر (صابونين 0.5%، 1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني).
  2. احتضان على الأقل 4 ح في الرايت يمكن أيضا أن يتم ذلك س/ن 4 ° C.
  3. إزالة المخزن المؤقت حظر
  4. وإضافة خليط جسم الابتدائي المخفف في المخزن المؤقت لحظر. احتضان س/ن في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: انظر مواد القسم لوصف للأجسام المضادة المستخدمة واقترح تخفيف. وينبغي تحديد تخفيف جسم تجريبيا. استخدام Nkx2-5 كمرجع وصمة عار للهلال القلب ينصح، وهي الصورة الرئيسية إلى المصب تجزئة وتحليل الخطوات.
  5. إزالة الأجسام المضادة الأولية بتطلع.
  6. الغسيل 3 مرات لكل مع 0.1% 1 ح تريتون في برنامج تلفزيوني.
  7. إزالة المياه والصرف الصحي، وإضافة مزيج الأجسام المضادة الثانوية المخفف في المخزن المؤقت لحظر. احتضانها ح 3 في الرايت يمكن أيضا أن يتم ذلك س/ن 4 ° C.
  8. الغسيل 3 مرات لكل مع 0.1% 1 ح تريتون في برنامج تلفزيوني. يمكن أيضا أن يتم ذلك س/ن 4 ° C.
  9. كونتيرستين
  10. مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 10
    ملاحظة: هذا كونتيرستين يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع الجسم المضاد الثانوي.
  11. الغسيل 2 مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.1% تريتون في برنامج تلفزيوني.
  12. ببطء تعليق الأجنة في وسائل الإعلام تتلاشى لمكافحة تصاعد (2% w/v البروبيل – يبيغاللوكاتيشين (nPG)، 90% والغليسيرول، 1 x PBS؛ انظر قسم المواد لمزيد من التفاصيل). السماح لحجته على الأقل 1 ساعة قبل التركيب. بلطف نفض الغبار أنبوب دورياً لمساعدة الأجنة إسقاط في حل تتلاشى المضادة.
    ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت. ويمكن تخزين الأجنة لعدة أيام في حل تتلاشى المضادة حتى جاهزة للتحميل وصورة-

3. تصاعد الأجنة للفحص المجهري

المجهر
  1. تحضير الشرائح للتركيب باستخدام أما شريط مزدوج-عصا أو الفواصل سيليكون. إذا كان استخدام الشريط المزدوج-عصا، جعل المكدسات المتوازية اثنين من 5-6 طبقات حوالي 15-20 ملم وبصرف النظر. هذا وسوف اترك مساحة كافية لوضع الأجنة وتأمين ساترة ( الشكل 1).
  2. ضع
  3. قطره 15 ميليلتر تتلاشى المضادة على الشريحة، بين الشريط المزدوج-عصا. نقل الأجنة واحد بعناية إلى الشريحة-
    ملاحظة: يمكن وضع الجنين واحد أو أكثر على شريحة. ومع ذلك، الخطوات اللاحقة التوجه أكثر صعوبة مع أجنة متعددة، والتصوير فترات طويلة قد تؤدي إلى تبييض الصورة.
  4. تحت مجهر تشريح باستخدام الملقط الجميلة، وضع الجنين أن تواجه الجانب الأمامي بعيداً عن الشريحة مع محور الجسم تمشيا مع المحور الطويل للشريحة. انظر الشكل 1 لتخطيطي للإعداد المتزايدة.
  5. ضع
  6. بعناية ساترة على العينة يستريح جانب واحد على مكدس واحد من الشريط المزدوج-عصا واستخدام الملقط لأقل ساترة بلطف حتى أنها تجري اتصالات أخرى الشريط.
    ملاحظة: الخطوات 3.3 و 3.4 أمرا حاسما لضمان التوجيه الصحيح للجنين للتصوير. عن طريق خفض ساترة على طول الخلفي للاتجاه الأمامي، لا ينبغي دحر الجنين ومنطقة الهلال القلب سيبقى موجها بعيداً عن الشريحة، الذي يعتبر مثاليا لتصوير المعني مجهر مقلوب.
  7. استخدام ماصة إضافة الإضافية تتلاشى المضادة بين الشرائح وساترة للحفاظ العينة من الزوال أثناء التخزين/تصوير-

4. [كنفوكل] تصوير

  1. الحصول على الصور باستخدام أعلى تكبير الهدف الذي يسمح لمنطقة الهلال كله القلب لالتقاطها في حقل واحد لعرض. استخدام معدلات أخذ العينات نايكست لتحديد أبعاد فوكسل x-y-z. وسوف يكون معظم الشركات المصنعة للمجهر " تحسين " الزر للتأكد من أخذ العينات نايكست.
    ملاحظة: صبغة Nkx2-5 مفيد هنا، كما أنها سوف تحدد منطقة الهلال القلب بأكملها. Z-خطوة أصغر حجماً (الإفراط) سوف تعطي أفضل 3D النمذجة النتائج لكن قد يؤدي إلى أوقات طويلة اقتناء و/أو تبييض لبعض العينات.
  2. إعداد
  3. التصوير المعلمات باستخدام الممارسات الأفضل التصوير القياسية. إلا وهي استخدام أقل كثافة الليزر ممكن لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة لكل فلوروفوري واختر مكسب وإزاحة المستويات التي تدر دينامية واسعة نطاق دون تشبع الإشارة-
    ملاحظة: تكون متسقة مع التصوير معلمات بين العينات التي سيتم مقارنة مباشرة. وهذا مهم بشكل خاص المصب 3D التحليل والقياس الكمي-

5. صورة التحليل والنمذجة 3D الكمية

ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم تحليل الصور باستخدام حزمة البرامج إيماريس. قد يكون من الممكن استخدام حزم البديلة تحليل مماثل. ويغطي الوصف أدناه تحليل خط الأنابيب لقناة إشارة (أي Nkx2-5) وقناة واحدة تجريبية (أي يفب). يمكن تحليل قنوات إضافية من خلال تكرار هذه الخطوات. قدمت dataset مثال التي يمكن استخدامها لإجراء نسخ متماثل التحليل الوارد أدناه.

تحميل مجموعات بيانات الصورة الخام إلى عرض الساحة إيماريس
  1. وفتح ملف للجنين المطلوب في رأي تفوق. يجب تحميل البيانات في طريقة عرض ثلاثي الأبعاد في وضع خطة التأمين الطبي (كحد أقصى). فتح نافذة "ضبط العرض" وحدد القناة مرجع فقط.
  2. ضبط عتبة الصورة إذا لزم الأمر لرؤية أفضل. لهذا التحليل، ضبط غاما إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة جداً لتجزئة-
    ملاحظة: إذا كان إجراء التصحيحات أشعة غاما، وتعديلات غير الخطية، لا يمكن استخدام الصور المعدلة لكثافة القياسات أو المقارنات. في هذه المرحلة يمكنك إجراء مزيد من المعالجة التمهيدية الصورة (أي تصويبات الإضاءة أو التمويه الضبابي أو التصفية الأخرى)، إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضجيج الخاصة بك غير مرضية. إذا اخترت القيام بالمعالجة التمهيدية، يجب إجراء نفس الخطوات السابقة التجهيز لكافة الصور في الخاص بك dataset.
  3. إنشاء سطح جديد للقناة مرجع باستخدام خوارزمية السطحية الحوار-
    1. حدد " جزء فقط من "المنطقة مصلحة" " خانة الاختيار-
    2. ضبط منطقة المربع المحيط بحيث أنه يحتوي على المنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار، أي منطقة الهلال القلب) كما رسمتها وصمة عار المرجعية.
    3. حدد القناة مرجع من القائمة المنسدلة قناة المصدر. الإعداد الافتراضي لتجانس (مساوياً لحجم فوكسل z) يكفي عادة ولكن قد تتطلب التحسين التجريبية. لهذا التحليل، استخدام تجانس يساوي نصف z فوكسل-الحجم-
    4. العتبة القيام بكثافة مطلقة. للتأكد من أن السطح لا يتعدى إشارة القناة، ضبط الحد الأدنى لاستخدام المنزلقات.
      ملاحظة: بعض الصور حيث يمكنك تحديد الخلايا بسهولة، يمكنك تضمين " تقسيم لمس الأجسام " الخوارزمية، وكذلك فصل الإشارات الخلفية.
    5. تصفية الكائنات بعدد فوكسل أو وحدة التخزين، ورفض الكائنات الخلفية (صغيرة أو تم العثور عليها في مناطق خارج منطقة Nkx2-5) التي يمكن إنشاؤها الخوارزمية. إنهاء الخوارزمية.
  4. باستخدام السطح الذي تم إنشاؤه حديثا، وإنشاء قناة مقنعين للقناة التجريبية.
    1. مع surface(s) المحددة، اختر " قناع Sel... ͟ " الدالة من إطار تحرير-
    2. حدد القناة التجريبية للفائدة (أي يفب). تأكد من أن " تكرار القناة قبل تطبيق قناع " يتم تحديد خانة الاختيار.
  5. نافذة "في تعديل العرض" قم بتحديد القناة ملثمين فقط. إنشاء سطح جديد للقناة ملثمين باتباع خطوات 5.3-5.3.5.
    ملاحظة: عند هذه النقطة قد يكون من المفيد ضبط مظهر كل قناع لتسهيل تصور النموذج الثلاثي الأبعاد: حدد كل سطح، وحدد علامة التبويب لون ضبط اللون الأساسي والشفافية حسب الحاجة. عدم دمج الألوان السطحية عندما تتداخل.
  6. للحصول على البيانات الحجمي، ومع كل السطح المحدد حدد علامة التبويب الإحصائيات. في " التفصيلية " دون علامة التبويب، اختر " "متوسط القيم" " من القائمة المنسدلة. ويمكن الاطلاع على الحجم الإجمالي للسطح في مجموع العمود من الجدول الذي تم إنشاؤه-
    ملاحظة: إذا كان السطح الذي تم إنشاؤه يحتوي على شظايا الخاطئة (أي الأجزاء التي من الإشارات الخلفية ليست مستبعدة خلال تجزئة أو المناطق متقطع من السطح الرئيسي)، قد تكون ضرورية لحساب إجمالي حجم يدوياً، أو تصفية السطوح بحجم أو عدد من فوكسيلس وضمان إدراج شرائح إشارة فقط في الحساب. ويمكن الاطلاع على وحدة التخزين لكل جزء من السطح عن طريق تحديد " "كافة القيم" " من القائمة المنسدلة. تحديد كل قيمة سيجعل المنطقة المقابلة تظهر الصفراء، مما يساعد في تحديد القيم لاستبعاد-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نوعية البيانات الختامية والتحليل يتوقف إلى حد كبير على (1) السلامة ومورفولوجيا تشريح الأجنة و (2) استخدام الأجسام المضادة عالية الدقة (3) الإعداد السليم للتصوير المعلمات. سوف إرباك عملية توليد السطحية وتعوق التحليل الكمي الأجنة معطوب. أمثلة للأجنة بشكل صحيح تشريح ونظموا مبينة في الشكل 2. يمكن أن يكون تشريح الأجنة كذلك بإزالة كيس الصفار، الذي كثيرا ما سيتم ربط الأجسام المضادة غير على وجه التحديد. ومع ذلك، إزالة كيس ألمح سيجعل الأجنة أقل متانة، ولذلك ينبغي توخي الحرص أثناء التعامل مع المتلقين للمعلومات.

المزيج من الأجسام المضادة عالية الجودة وإعدادات التصوير السليم أمران ضروريان لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء الصور. يظهر الشكل 2 ألف صورة مثال استخدام أجسام مضادة ضد Nkx2-5 كعلامة مرجعية لتسمية الهلال القلب، والتجارة والنقل لتسمية تتبع نسب السكانية للفائدة (الخلايا السلف بطيني القلب والأوعية الدموية Foxa2Cre:YFP) (انظر تكميلية البيانات لملفات الصور والبيانات الخام). 19 هذه الاستراتيجية يسمح للمقارنة بين عدد معين من السكان مع منطقة الهلال القلب بأكملها. لبعض التجارب، وقد يكون من المصلحة للنظر في المجالات الفرعية فهف وأفران الموجات الدقيقة للهلال القلب. وفي هذه الحالة، فهف وأفران الموجات الدقيقة يمكن أن يكون المسمى مع Hcn4 و Islet1، على التوالي (انظر المرجع19 للصور والتحليل الكمي مع تركيبات هذه الأجسام المضادة). مع الإعداد المناسب وتركيبات الجسم المضاد الثانوي، لدينا بنجاح تصويرها وتحليلها الأنساب الثلاثة في نفس الوقت (أي أن الهلال القلب، يفب، والتردد الأول أو الثاني).

عدم القدرة على تحقيق إشارة قوية سيحد أيضا القدرة على إنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد عالية الدقة، كما أنه سوف يصبح من الصعب إزالة الإشارات الخلفية من الأسطح النهائية. وفي هذه الحالات، ينبغي توخي الحذر عند تعديل صورة أشعة غاما (أثناء مرحلة ما قبل المعالجة، الشكل 2، ج 2، 2N، 2O) أو سطح مستوى العتبة (خلال جيل السطحية خوارزمية، الرقم 2، 2 ح، ل 2 ) وينبغي أن تستخدم إعدادات مماثلة لجميع الصور داخل تجربة. عدم القيام بذلك سيؤدي إلى عدم اتساق البيانات الحجمي أنه سيكون من غير المناسب لاستخدامه لمقارنة مباشرة. في كثير من الأحيان، يمكن إزالة السطوح الخاطئة الناتجة عن الإشارات الخلفية من خلال حجم تصفية (الشكل 2 طاء، 2J)، على الرغم من أن القيام بذلك من الصور عالية-الخلفية سيكون صعباً دون أن تفقد الأجزاء السطحية صحيح كذلك.

Figure 1
رقم 1: الجدول الزمني التجريبي والخطط- التجربة (أ) أكمله، من التزاوج لتحليل البيانات، يمكن القيام في أسبوعين تقريبا. يتم جمع الأجنة في الصباح في اليومال 8 بعد الجماع (E8.25) لتحليل المرحلة الهلال القلب (ب). مرة واحدة ثابتة، يتم حظر الأجنة والملون مع الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي قبل تصاعد. وتقام الأجنة مع شرائح مجهرية القياسية وكوفيرسليبس، باستخدام الشريط على الوجهين كفاصل (ج). وتوضع الأجنة في قطره تتلاشى المضادة في اتجاه عرض (ج) العلوي وخفضت ساترة ببطء على الشريط (ج) أقل. يتم إجراء التصوير [كنفوكل] وتحليل الصور لتوليد صور عالية الدقة z-المكدس (د) ونماذج السطحية ثلاثية الأبعاد (E). التردد، إضعاف الرأس؛ CC، الهلال القلب؛ A، والأمامية؛ ف، اللاحق؛ AF، تتلاشى المضادة. هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: معالجة الصور [كنفوكل] التدرجي و 3D السطح جيل- (أ) [كنفوكل]-سلسلة z تحميل في طريقة عرض المجلد. قناة الإشارة (Nkx2-5) هو المحدد (ب) وشدة وضبط غاما (ج) قبل البدء في "إنشاء الأسطح" الخوارزمية. يتم اختيارها بعد منطقة الاهتمام المحددة (د)، ومستوى التفاصيل السطحية (E). سطح الأولى (و) ثريشولديد تشمل جميع الإشارات الحقيقية في السطح (ز). ثم يتم إجراء تصفية لإزالة أجزاء صغيرة خلفية (ح) تعطي سطحاً مرجع نهائي (أنا). عن طريق تحديد سطح الإشارة (J)، القناة مقارنة (يفب) يمكن أن تتكرر وملثمين (K). كثافة وغاما لهذه القناة ثم يتم تعديلها (L) قبل إنشاء سطح ثانية عن طريق نفس تسلسل الخطوات (M, N). الحجم الإجمالي لكل سطح يحسب تلقائياً ويمكن مقارنتها كمياً وبصريا (س، علما بأن عدم دمج الألوان السطحية عندما تتداخل). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول أعلاه توضح استراتيجية من أجل الحصول على بيانات كمية من الصور عالية الجودة جبل كاملة الفلورة الماوس بعد زرع الأجنة. عند القيام بشكل صحيح، يمكن استخدام البيانات الحجمي ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها من خلال هذه الخطوات للتحليل المقارن والمتعدد الجوانب لعدة مجالات ضمن الجنين. إشارة السطحية إخفاء النهج المذكور بشكل خاص عند التحقيق في خلية رواية السكان بالمقارنة مع الهياكل مرجعية راسخة.

أننا نعتقد أن هذا النهج يوفر ميزة واضحة على النهج القائمة. جبل كاملة الفلورة مع التصوير واسع المجال يمكن أن تقدم معلومات على مستوى الأنسجة لكنه يفتقر إلى قرار الخلوية. على العكس من ذلك، يمكن أن تعطي الفلورة مقاطع المسلسل مفصلة المستوى الخلوي القرار، على الرغم من أن هذه البيانات تفتقر إلى ميزة ثلاثية الأبعاد لتصوير جبل كله. بينما تصوير ثلاثي الأبعاد [كنفوكل] يعالج أوجه القصور هذه، وعدد قليل من المستخدمين الاستفادة من إمكانات هذه البيانات الكمية، ويحدونا الأمل في أن لدينا بروتوكول سيتيح المزيد من الباحثين الاستفادة الكاملة من البيانات التي يجمعونها.

هنا، وقد تجسد هذا النهج استخدام علامة Nkx2-5 تحدد الهلال القلب وفحص وجود خلايا تتبع النسب Foxa2Cre:YFP في هذا المجال. ومع ذلك، نظراً للقدرة على صورة الأنساب ثلاثة على الأقل في نفس الوقت والبيانات الثلاثة-البعد عالية الدقة التي تم إنشاؤها، هذا البروتوكول سيكون الأرجح مفيدة للباحثين في العديد من المجالات. ونحن نقترح أنه يمكن تطبيق هذا النهج على متعددة المراحل الجنينية، ونظم الجهاز والأنساب من خلال إدخال تعديلات طفيفة على البروتوكول استناداً إلى الاحتياجات المحددة للنظام. في تجربتنا، أن هذا البروتوكول لا تنطبق مباشرة على مجموعة من العصور الجنينية (E6.5-E9.5 كحد أدنى) مع إجراء تعديلات محدودة. 19 لا واجهتنا مسائل مع نفاذية أو اختراق جسم في الأجنة كبيرة كما أنها E9.5 مع الزمن الحضانة المذكورة، على الرغم من أننا نتوقع أنه مع أنسجة أثخن أو أكثر كثافة هذه سيتعين أن يكون ممدود لتحقيق اختراق كامل.

تحليل ووصف هنا أجرى باستخدام حزمة برمجيات المسجلة ملكية، ولكن يمكن تكييفها للقيام بها في حزم الملكية البديل الأمثل للتعامل مع البيانات الكبيرة. وبدلاً من ذلك، أنابيب مماثلة يمكن بسهولة تنفيذها باستخدام اللغات الحاسوبية أو حزم برمجيات المصدر المفتوح، مما يؤدي إلى التطور السريع لقاعدة بيانات بروتوكولات قابل للمشاركة. سوف سرعة النهوض بالمجال نمو شبكة عالمية من العلماء، مع إمكانية الوصول إلى أدوات متاحة مجاناً وبروتوكولات للحصول على الصور، وتحليل، وزيادة إمكانية تكرار نتائج الدراسات. 17

في تجربتنا، القيود الرئيسية لهذا النهج تتصل بعمق التصوير، خاصة بالنسبة للمراحل الجنينية في وقت لاحق، وسوف تعتمد اعتماداً كبيرا على التفاصيل الدقيقة للفحص المجهري الإعداد المستخدمة. وبالمثل، كيف يتم تحميل عينات لتصوير سوف تعتمد على الاحتياجات المحددة للمستخدم. وقد وجدنا أن وضع منطقة الفائدة الأقرب إلى العدسة يحسن عمق التصوير ويقلل الإشارات الخلفية، ونقترح استخدام الطبقات الشريط على الوجهين للتركيب، كما أنها تمكن المستخدمين من إنشاء غرفة لتناسب احتياجاتها الخاصة. استخدام المستندة إلى والغليسيرول تركيب وسائط مع كاشف تتلاشى المضادة، واكويليبراتينج عينات في هذه الوسائط قبل التركيب، ينصح بشدة قمع فوتوبليتشينج. وأخيراً، العينات المستخدمة في هذا التحليل تقريبا شفافة؛ المستخدمين قد تحتاج إلى تضمين خطوات المقاصة لأكثر تقدما في المراحل الجنينية أو أجزاء الأنسجة، أو أورجانويدس، وتحديد أفضل مسح بروتوكول لتطبيق محدد يتطلب الاختبار التجريبي.

وفي حالة القلب morphogenesis، يمكن أن تستخدم أساليب التصوير المختلفة. بينما يتم استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] هنا، ورقة الخفيفة الميكروسكوب مناسبة جيدة للغاية لهذه الدراسات بسبب السرعة والقرار، والإشارات إلى الضجيج نسبة الصورة المكتسبة. 20 ونتوقع زيادة توافر هذه التكنولوجيا الجديدة المضي قدما بفائدة وثراء من نهج التصوير مماثلة. وبالمثل، النهوض المستمر بالصحفيين الفلورسنت والأصباغ،22 وصباغات21 الثقافة الجنين يعيش23،24 سوف تؤدي إلى هذه الدراسات التي تتحرك على أربعة أبعاد، مضيفاً أن عنصر الوقت، و العائد بعد مزيد من المعلومات حول كيفية الجنينية هياكل النموذج أثناء التطوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI R56 HL128646 وصحة الطفل مينديتش ومعهد التنمية (متشدي) في إيسمس (بدون تاريخ). E.B. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة/NIDCR منحة T32 HD075735. أجرى التحليل المجهري والصورة في "صميم مجهرية" في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء، التي يدعمها معهد السرطان تيش في جبل سيناء P30 CA196521 – منحة دعم مركز السرطان في الجزء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt probe Roboz RS-9580
Forceps Roboz RS-8100
Fine forceps Roboz RS-5015
Dissection scissors Roboz RS-5912
Saponin Sigma Aldrich 84510
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A8022
Triton RPI A4490
Goat anti-Nkx2-5 Santa Cruz Biotech sc-8697 Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP abcam ab13970 Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1 abcam ab109517 Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4 Millipore AB5808 Used at 1:100
488 anti-chicken Jackson Immunoresearch 703-546-155 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat Thermo Fisher Scientific A21432 Used at 1:500
647 anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-606-152 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI Sigma Aldrich D9542
n-Propyl gallate Sigma Aldrich 2370 Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides VWR Scientific 48311-703
22x22 mm coverslips VWR Scientific 48366-227
Imaris 8.4.1 Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
  2. Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
  3. Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
  4. Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
  5. Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
  6. Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
  7. Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
  8. Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
  10. Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
  11. Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
  12. Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
  13. Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
  14. Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
  15. Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
  16. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
  17. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
  18. Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
  19. Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
  20. Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  22. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
  23. Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
  24. Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).

Tags

علم الأحياء التنموي، 128 مسألة، مجهرية [كنفوكل]، وتحليل الصور، التصوير الكمي، organogenesis، قلب التنمية، الجنين الماوس
تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardot, E., Tzavaras, N., Benson, D. More

Bardot, E., Tzavaras, N., Benson, D. L., Dubois, N. C. Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (128), e56446, doi:10.3791/56446 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter