Summary
Hier beschrijven we een protocol voor hele mount immunofluorescentie en beeld-gebaseerde kwantitatieve volumetric analysis van vroege fase muis embryo's. Wij presenteren deze techniek als een krachtige aanpak van kwalitatief en kwantitatief cardiale structuren beoordelen tijdens de ontwikkeling, en voor te stellen dat het wellicht grote schaal aan te passen aan andere orgaansystemen.
Abstract
Het gebruik van steeds voortschrijdende beeldvormingstechnieken heeft over het algemeen bijgedragen aan onze toegenomen kennis van embryonale ontwikkeling. Pre-implantatieontwikkeling en organogenese zijn twee gebieden van onderzoek die sterk van deze voorschotten, als gevolg van de hoge kwaliteit van de gegevens die kan worden verkregen profiteerden hebben vanuit imaging pre-implantatie embryo's of ex vivo organen. Pre-implantatie embryo's hebben opgeleverd gegevens met vooral hoge ruimtelijke resolutie, zijn latere stadia geweest minder vatbaar voor driedimensionale wederopbouw. Kwalitatief hoogwaardige 3D- of volumetrische gegevens voor bekende embryonale structuren in combinatie met lot toewijzing of genetische afkomst tracering te verkrijgen zal zorgen voor een meer uitgebreide analyse van de morfogenetische evenementen die plaatsvinden tijdens de embryogenese.
Dit protocol beschrijft een geheel-mount immunofluorescentie aanpak waarmee de labeling, visualisatie en kwantificering van progenitor cel populaties binnen de ontwikkelingslanden cardiale halve maan, een belangrijke structuur gevormd tijdens de ontwikkeling van het hart. De aanpak is zodanig ontworpen dat zowel cel - en weefsel-niveau-informatie kan worden verkregen. Confocal microscopie en beeldverwerking kunt, dit protocol voor driedimensionale ruimtelijke wederopbouw van de cardiale crescent, waardoor de mogelijkheid om het analyseren van de lokalisatie en de organisatie van specifieke voorlopercellen populaties tijdens deze kritieke fase van de ontwikkeling van het hart. Nog belangrijker is, zorgt het gebruik van referentie antilichamen voor opeenvolgende maskeren van de cardiale halve maan en latere kwantitatieve metingen van gebieden binnen de halve maan. Dit protocol wordt niet alleen ingeschakeld met een grondig onderzoek van de vroege ontwikkeling van het hart, maar met aanpassingen gelden de meeste orgaansystemen in het gastrula vroege Somiet stadium muis embryonale.
Introduction
De studie van de organogenese heeft lang vertrouwd op waarneming van morfogenetische gebeurtenissen in het zich ontwikkelende embryo. Deze studies is vaak afhankelijk van het gebruik van fluorescente kleurstoffen of lineage tracering verslaggevers in combinatie met het labelen van gedefinieerde referentie populaties. 1 door de relatieve posities van deze labels te vergelijken, informatie kan worden opgedaan op de oorsprong, beweging of uiteindelijke bijdrage van een bevolking van belang. Transplantatie en lot toewijzing experimenten kunnen morfologische monumenten of injectie van verf in niet-sporenvormende lineages definiëren van het startpunt van de cellen van belang, die vervolgens voor bijdrage aan het ontwikkelde embryo worden onderzocht. 2 , 3 , 4 , 5 genetische afkomst-tracing experimenten gebruik hetzelfde concept met welomschreven verslaggever allelen die worden gebruikt om de label-cel populaties zonder experimentele manipulatie. Sleutel tot deze benaderingen is de mogelijkheid om te bepalen, met hoge ruimtelijke resolutie, de locaties van de experimentele en verwijzing labels. Deze benaderingen hebben opmerkelijke vooruitgang in de pre-implantatieontwikkeling opgeleverd en organogenese studies explant. 6 , 7 , 8 , 9
De ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan hart morfogenese zijn steeds goed beschreven in de afgelopen jaren geweest. 10 één van de belangrijke ontdekkingen op het gebied van onderzoek is de beschrijving van een aantal voorlopercellen populaties die kunnen worden onderscheiden door de expressie van unieke markers. 11 deze populaties zijn de eerste en de tweede hart velden (FHF en SHF), die aanwezig is binnen de cardiale halve maan aan de voorste zijde van het embryo ten embryonale dage (E) 8,25 van muis ontwikkeling zijn. 12 deze populaties worden vaak onderzocht door een combinatie van breed-gebied microscopie, waarmee weefsel-niveau informatie, en seriële afdelen met immunofluorescentie testen, die hoge cellulaire resolutie maar alleen biedt tweedimensionale ruimtelijke informatie. 13 aldus, terwijl deze studies zeer ons begrip van de ontwikkeling van het hart geavanceerde hebben, de beschikbare methoden hebben beperkte diepgaande kwantitatieve analyse van genuitdrukking tijdens deze fasen, maken de noodzaak voor benaderingen te onderzoeken de organisatie van deze populaties op het niveau van een geheel-organisme.
De recente vooruitgang in zowel confocale microscopie en 3D beeldanalyse voorzien in een hoge resolutie en hoge gegevensdoorvoer algoritmische reconstructies van de cellen en structuren in situ met relatief gemak, dus de weg vrijmaakt voor gedetailleerde studies van complex cellulaire structuren. 14 met de toename van rekenkracht en de ontwikkeling van grote-data beheren algoritmen, beide nodig om de exponentiële toename van de grootte van de imaging gegevenssets, analyses kunnen nu volledig geautomatiseerd worden. 15 geautomatiseerde analyse van beeldvorming-gegevensverzamelingen, heeft het voordeel dat onbevooroordeelde, maar het is alleen zo betrouwbaar als de kwaliteit van de input dataset; het is dan ook absoluut noodzakelijk dat best practices worden gebruikt tijdens de verwerving en voorbehandeling van de afbeelding om de hoogste kwaliteit, onbevooroordeelde analyse. 16 kunnen protocollen volledig geautomatiseerd en gedeelde voor de reproduceerbaarheid en de algoritmen die worden gebruikt door propriëtaire software gemakkelijk beschikbaar zijn via bibliotheken worden gebruikt door wetenschappers hebben vertrouwdheid met moderne farmaceutische of open-source Ontwikkelaarshulpmiddelen. 17
Het volgende protocol legt de nodige stappen om dergelijke analyses uit te voeren op één welbepaalde model van organogenese, de vorming van de cardiale halve maan tijdens de ontwikkeling van het hart. Specifiek, dit protocol wordt beschreven hoe u (1) oogst en ontleden van cardiale halve maan fase embryo's, (2) uit te voeren gehele mount immunofluorescentietest voor verwijzing (Nkx2-5) en experimentele (Foxa2Cre:YFP18,19) markeringen, (3) bereiden en beeld van de embryo's met behulp van de confocal microscopie, en ten slotte (4) analyseren en kwantificeren van de resulterende afbeeldingen met behulp van geavanceerde driedimensionale benaderingen. Terwijl de cardiale halve maan wordt gebruikt als voorbeeld hier, met passende wijziging, kan dit protocol worden gebruikt voor analyse van meerdere lineages in gastrula op vroege Somiet fase embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Icahn School of Medicine op Mount Sinai.
1. opruiming en verwerking cardiale Crescent fase embryo's
- een vruchtbare vrouwelijke muis met een vruchtbare stud mannelijke metgezel. Check
- voor de aanwezigheid van een vaginale copulatie plug met een botte sonde of pincet. 'S middags op de dag van plug detectie wordt beschouwd als embryonale dag (E) 0,5 (Zie figuur 1A voor volledige tijdlijn).
Opmerking: Stekkers moeten worden gecontroleerd op in de ochtend, zoals ze verloren overdag zijn. - Op de ochtend van de 8 e dag (E8.25), offeren de zwangere dam bij CO 2 inademing, of overeenstemming met de lokale en institutionele regelgeving.
Opmerking: Exacte timing kan spanning afhankelijk en empirisch moet worden bepaald door de morfologie. - Spray de buik van de muis met 70% ethanol om het gebied schoon en minimaliseren vergieten. De ingewanden bloot door het uitvoeren van een abdominale incisie via de huid en lichaam muur.
- Zoek de baarmoeder en verwijder voorzichtig de hele baarmoeder Hoorn van het dier. Begin met het snijden boven één oviduct, trimmen van vet uit de buurt van de baarmoeder terwijl u verdergaat naar het cervicale einde. Doorsnijden van de baarmoederhals en blijven de bovenkant van de andere oviduct, snijden om los van de hele baarmoeder.
- Plaats de baarmoeder in een 10 cm schotel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) overtollige bloed wegwassen. Sub ontleden de baarmoeder door het snijden van de mesometrium tussen elke deciduum, waarin de embryo's. Transfer van de embryo's naar een 6 cm schotel met verse PBS.
- Onder een Microscoop dissectie, fijne pincet (#5) te gebruiken voor het verwijderen van de baarmoeder weefsel uit de buurt van het decidual weefsel.
- Met pincet, snijd zorgvuldig het puntje van de embryonale helft van de deciduum te onthullen van het embryo. De deciduum om te duwen van het embryo uit en trek voorzichtig het embryo uit knijpen.
- Weg extraembryonic weefsels zo veel mogelijk te ontleden zonder beschadiging van de morfologie van het embryo ( figuur 1B).
- Kunt een pipet overdracht plaats van de embryo's in een tube 1,5 mL met verse PBS en plaats op het ijs. 1.7-1.9 Herhaal voor de resterende embryo's voordat u doorgaat.
- Aspirate PBS en spoel een keer met PBS. PBS gecombineerd.
Opmerking: Probeer zoveel PBS mogelijk om zonder te verwijderen beschadigen of drogen van de embryo's. Handmatige verwijdering van oplossingen wordt aanbevolen bij alle maatregelen om te voorkomen dat het verlies van embryo's. - Fix embryo's met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS voor 1 h op RT.
Opmerking: Embryo's kunnen worden vastgesteld (O/N) overnachting bij 4 ° C. - Spoel driemaal met PBS. Houden van embryo's bij 4 ° C tot klaar om te gaan met immunofluorescentie.
Opmerking: Pauze punt. Embryo's kunnen worden veilig opgeslagen in PBS bij 4 ° C voor verscheidene weken.
2. Immunofluorescentie Staining
Opmerking: de onderstaande incubatieomstandigheden kunnen worden aangepast aan verschillende schema's. Gebruik van zacht schudden of schommelen voor alle stappen van de lange incubatie wordt aanbevolen.
- Verwijderen van PBS en voeg 1 mL blokkeerbuffer (0,5% saponine, 1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS).
- Broeden ten minste 4 uur op RT. Dit kan ook gebeuren O/N bij 4 ° C.
- Verwijder blokkeerbuffer en voeg primair antilichaam mengsel verdund in blokkeerbuffer. Incubeer O/N bij 4 ° C.
Opmerking: Zie materialen sectie voor beschrijving van antilichamen gebruikt en stelde verdunningen. Verdunningen van het antilichaam moeten empirisch worden bepaald. Het gebruik van Nkx2-5 als een referentie-vlek voor de cardiale halve maan wordt aanbevolen en is de sleutel tot downstream beeld segmentatie en analyse stappen. - Verwijderen van primaire antilichamen door aspiratie.
- Was 3 keer voor 1 h met 0,1% Triton in PBS.
- Wassen verwijderen en toevoegen van secundair antilichaam mengsel verdund in blokkeren buffer. Incubeer gedurende 3 uur op RT. Dit kan ook gebeuren O/N bij 4 ° C.
- Was 3 keer voor 1 h met 0,1% Triton in PBS. Dit kan ook gebeuren O/N bij 4 ° C.
- Counterstain met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PBS voor 10 min.
Opmerking: Deze counterstain kan worden uitgevoerd gelijktijdig met secundair antilichaam. - Wassen 2 keer voor 5 min met 0,1% Triton in PBS.
- Schorten langzaam embryo's in anti-fade montage media (2% w/v n-Propyl gallate (nPG), 90% glycerol, 1 x PBS; Zie de sectie van de materialen voor meer details). Laat equilibreer ten minste 1 uur vóór montage. Zachtjes flick buis regelmatig om te helpen embryo's anti-fade oplossing vallen.
Opmerking: Pauze punt. Embryo's kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen in anti-fade oplossing tot klaar om te monteren en afbeelding.
3. Montage van embryo's voor microscopie
- voorbereiden Microscoop dia's voor montage met dubbel-stick tape of siliconen afstandhouders. Als met behulp van dubbel-stick tape, moet u twee parallelle stapels van 5-6 lagen ongeveer 15-20 mm uit elkaar. Dit laat voldoende ruimte is om de plaats van de embryo's en veilig het dekglaasje aan ( Figuur 1 c).
- Breng een druppel van de 15 µL van anti-fade op de dia, tussen de dubbel-stick tape. Één embryo zorgvuldig overbrengen in de dia.
Opmerking: meer dan één embryo kan op een dia worden geplaatst. De latere oriëntatie stappen zijn echter moeilijker met meerdere embryo's en lange imaging duur kan leiden tot foto-bleken. - Onder een dissectie Microscoop met fijne pincet, plaats het embryo zodanig dat de voorste kant uit de buurt van de dia met de as van het lichaam in overeenstemming met de lengteas van de dia gezichten. Zie Figuur 1 c voor een schematische voorstelling van de montage setup.
- Op het monster zorgvuldig plaatst door één kant op één stapel van dubbel-stick tape rusten en het gebruik van pincet zachtjes lager het dekglaasje aan totdat het contact op met de andere tape een dekglaasje aan.
Opmerking: Stap 3.3 en 3.4 zijn essentieel voor het waarborgen van de correcte oriëntatie van het embryo voor imaging. Door het verlagen van het dekglaasje aan langs de posterior anterior richting, het embryo niet lanceren en de cardiale wassende regio blijft uit de buurt van de dia, die ideaal is voor beeldvorming op een omgekeerde Microscoop georiënteerde. - Gebruiken een pipet toe te voegen extra anti-vervagen tussen de dia en dekglaasje aan om te voorkomen dat het monster tijdens opslag/imaging uitsterven.
4. Confocale Imaging
- ophaal beelden met behulp van de hoogste doelstelling van vergroting die het mogelijk maakt voor de hele cardiale wassende regio worden vastgelegd in één gezichtsveld. Nyquist samplingfrequenties gebruiken om te bepalen van de afmetingen van de x-y-z voxel. De meeste fabrikanten van Microscoop zal hebben een " optimaliseren " knop om Nyquist bemonstering.
Opmerking: Kleuring voor Nkx2-5 is voordelig hier, aangezien het zal de hele cardiale wassende regio af te bakenen. Z-stap kleinere (oversampling) beter 3D modellering resultaten zal opleveren, maar kan leiden tot uitgebreide overname tijden en/of bleken voor sommige monsters. - Instellen imaging parameters met behulp van Best imaging standaardprocedures. Namelijk, gebruiken de laagste mogelijke laser-intensiteit te bereiken goede signal-to-noise verhouding voor elk fluorophore en kies winst niveaus die een breed dynamisch bereik zonder het verzadigen van de signaal opbrengst gecompenseerd.
Opmerking: Verenigbaar met imaging parameters tussen monsters die direct moeten worden vergeleken. Dit is vooral belangrijk voor downstream 3D analyse en kwantificering.
5. Analyse en kwantitatieve 3D Modeling
Opmerking: Voor dit protocol, werden beelden geanalyseerd met behulp van het softwarepakket Imaris. Soortgelijke analyse mogelijk met behulp van alternatieve pakketten. De onderstaande beschrijving heeft betrekking op de analyse pijpleiding voor een referentie-kanaal (dat wil zeggen Nkx2-5) en een experimenteel kanaal (d.w.z. YFP). Extra kanalen kunnen worden geanalyseerd door middel van herhaling van deze stappen. Een voorbeeld-dataset is mits die kunnen worden gebruikt voor het repliceren van de onderstaande analyse.
- Raw-afbeeldingen datasets in Imaris Arena weergave laden en open bestand voor gewenste embryo Surpass volgens. Gegevens te laden in 3D-weergave in de MIP (max) modus. Open het venster beeldscherm aanpassing en selecteer alleen de verwijzing kanaal.
- Pas de drempel van de afbeelding indien nodig voor betere visualisatie. Voor deze analyse, passen de gamma als de signal-to-noise verhouding te laag voor segmentatie is.
Opmerking: Als het uitvoeren van gamma correcties, die niet-lineaire aanpassingen, de aangepast afbeeldingen niet worden gebruikt voor intensiteit metingen of vergelijkingen. In dit stadium kunt u verdere pre beeldverwerking (d.w.z. verlichting correcties, Gaussiaans vervagen of andere vormen van filtering), als uw signal-to-noise verhouding niet bevredigend is. Als u ervoor kiest te doen van de voorbehandeling, moet u de dezelfde voorbewerkend stappen uitvoeren voor alle afbeeldingen in uw dataset. - Maakt een nieuwe oppervlak voor de referentie-kanaal met behulp van de oppervlakte algoritme dialoog.
- Selecteer de " Segment alleen een regio van belang " checkbox.
- De begrenzende vak regio zodanig aanpassen dat het bevat de regio van belang (ROI, d.w.z. het cardiale wassende gebied), zoals afgebakend door de referentie-vlek.
- Selecteer het kanaal van de verwijzing van het bronkanaal dropdown menu. De standaardinstelling voor effenen (gelijk aan de grootte van de voxel z) is meestal voldoende maar empirische optimalisatie kan vereisen. Voor deze analyse, gladmaken gelijk is aan de z voxel-helft.
- Uitvoeren drempelmethode door absolute intensiteit. Om ervoor te zorgen dat het oppervlak niet verder dan het signaal van de zender reiken doet, het aanpassen van de ondergrens met behulp van de schuifregelaars.
Opmerking: Voor bepaalde beelden waar de cellen kunnen gemakkelijk worden afgebakend, u kunt opnemen de " split aanraken van objecten " algoritme, verder scheiden van uw signaal van achtergrond. - Filter objecten door voxel nummer of volume, en verwerpen (kleine of gevonden in gebieden buiten het gebied Nkx2-5) achtergrondobjecten die het algoritme zou hebben gegenereerd. Afwerking van het algoritme.
- Met behulp van de zojuist gemaakte oppervlak, maken een gemaskerde kanaal voor de experimenteel kanaal.
- Met het schijfoppervlak geselecteerd, kies het " masker Sel... ͟ " functie van het bewerkingsvenster.
- Selecteer de experimenteel kanaal van belang (d.w.z. YFP). Zorg ervoor dat het " kanaal dupliceren alvorens masker " selectievakje is aangevinkt.
- In the Display aanpassing venster selecteert u alleen het gemaskeerde kanaal. Maken van een nieuw oppervlak voor het gemaskerde kanaal door na 5.3-5.3.5 stappen.
Opmerking: Op dit punt kan het handig zijn om de vormgeving van elk masker om de visualisatie van het 3D-model: Selecteer elk oppervlak en de kleur tab. aanpassen de basiskleur en de transparantie zoals nodig. Oppervlakte kleuren doen niet samenvoegen wanneer overlapt. - De volumetrische om gegevens te verkrijgen, met elk oppervlak geselecteerd, selecteer het tabblad Statistieken. In de " gedetailleerd " sub tab, kies " gemiddelde waarden " uit de drop-down menu. Het totale volume van het oppervlak kan worden gevonden in de kolom van de som van de gegenereerde tabel.
Opmerking: Als de gegenereerde oppervlak bevat foutieve fragmenten (d.w.z. fragmenten die achtergrond signaal niet tijdens segmentatie of gebieden discontinue van het belangrijkste oppervlak uitgesloten zijn), het kan noodzakelijk zijn voor het berekenen van het totale volume handmatig, of filteren van de oppervlakken door volume of aantal voxels en ervoor te zorgen dat alleen signaal segmenten zijn opgenomen in de berekening. Het volume voor elk gedeelte van het oppervlak kan worden gevonden door te selecteren " alle waarden " uit de drop-down menu. Elke waarde te selecteren zal de corresponderende regio geel, die helpt bij het bepalen van de waarden te sluiten verschijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kwaliteit van de laatste gegevens en analyse hangt sterk (1) de integriteit en de morfologie van de ontleed embryo's, (2) het gebruik van hoge specificiteit antilichamen en (3) de juiste instelling van de imaging parameters. Beschadigde embryo's zal verwarren de oppervlakte generatie proces en een belemmering vormen voor kwantitatieve analyse. Voorbeelden van goed ontleed en geënsceneerde embryo's worden weergegeven in figuur 2B. De embryo's kunnen verder door het verwijderen van de dooierzak, die antilichamen vaak niet-specifiek binden zal worden ontleed. Echter, verwijdering van de dooierzak zal maken de embryo's minder robuust, dus zorg moet worden genomen tijdens de behandeling van de stroomafwaarts.
De combinatie van hoge kwaliteit antilichamen en juiste beeldvorming instellingen zijn essentieel voor het bereiken van hoge signaal-/ ruisverhouding beelden. Figuur 2A toont een beeld van de voorbeeld met behulp van antilichamen tegen Nkx2-5 als referentie merkstof aan label de cardiale crescent, en GFP label een bloedlijn getraceerd bevolking van belang (Foxa2Cre:YFP ventriculaire cardiovasculaire voorlopercellen) (Zie aanvullende gegevens voor raw beeld en gegevens-bestanden). 19 deze strategie voorziet in de vergelijking van een bepaalde populatie met de hele cardiale wassende regio. Voor sommige experimenten wellicht het van belang zijn voor het onderzoeken van de FHF en SHF subdomeinen van de cardiale halve maan. In dit geval de FHF en SHF kan gelabeld zijn met Hcn4 en Islet1, respectievelijk (zie referentie19 voor afbeeldingen en kwantitatieve analyse met deze antilichaam combinaties). Met de juiste instelling en secundair antilichaam combinaties, hebben we met succes beeld en gelijktijdig drie geslachten (dat wil zeggen de cardiale halve maan, YFP en eerste of tweede HF) geanalyseerd.
Onvermogen om een sterk signaal Beperk ook de mogelijkheid om het genereren van hoge vertrouwen 3D-modellen, naarmate het zal moeilijk te verwijderen achtergrond signaal van de definitieve oppervlakken. In deze gevallen moet worden gezorgd bij het aanpassen van het gamma afbeelding aan (tijdens de voorbehandeling, figuur 2B, 2 C, 2N, 2O) of oppervlakte drempelmethode (tijdens oppervlakte generatie algoritme, Figuur 2 g, 2 H, 2 L ) en soortgelijke instellingen moeten worden gebruikt voor alle afbeeldingen in een experiment. Niet te doen zal leiden tot inconsistente volumetrische gegevens die ongepast om te gebruiken voor directe vergelijking zou zijn. Vaak, kunnen foutieve oppervlakken die voortvloeien uit de achtergrond signaal worden verwijderd door grootte filteren (figuur 2I, 2J), hoewel het doen van hoge-achtergrond beelden zonder verlies van de ware oppervlakte fragmenten ook moeilijk zal zijn.
Figuur 1: Experimental tijdlijn en schema's. (A) het hele experiment, van paring tot data-analyse, kan worden uitgevoerd in ongeveer twee weken. Embryo's zijn verzameld in de ochtend op de 8th dag post copulatie (E8.25) voor analyse van de cardiale halve maan fase (B). Zodra vastgesteld, zijn de embryo's geblokkeerd en gekleurd met primaire en secundaire antilichamen vóór montage. Embryo's zijn gemonteerd met standaard microscopie glijbanen en coverslips, met behulp van dubbelzijdige tape als een spacer (C). Embryo's worden geplaatst in een druppel anti-fade in de weergegeven oriëntatie (C, bovenste) en een dekglaasje aan langzaam wordt verlaagd op de band (C, lager). Confocale beeldvorming en beeldanalyse worden uitgevoerd voor het genereren van hoge resolutiebeelden van de z-stack (D) en 3D-oppervlak modellen (E). HF, hoofd vouwen; CC, cardiale crescent; A, anterior; P, posterieure; AF, anti-vervagen. Schaal bars zijn 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: stapsgewijze confocal beeldverwerking en 3D-oppervlak generatie. (A) Confocal z-serie geladen in de weergave van het volume. Het kanaal van de verwijzing (Nkx2-5) is geselecteerde (B) en de intensiteit en de gamma aangepast (C) voordat het algoritme maken oppervlakken. Nadat de regio van belang geselecteerd (D), en het oppervlakte detailniveau is wordt gekozen (E). De oorspronkelijke oppervlakte (F) is thresholded met alle ware signaal in het oppervlak (G). Filteren wordt vervolgens uitgevoerd om te verwijderen van kleine achtergrond fragmenten (H) opleveren een definitieve verwijzing oppervlak (ik). Door het selecteren van het oppervlak van de verwijzing (J), het kanaal van de vergelijking (YFP) kan worden gedupliceerd en gemaskeerd (K). De intensiteit en de gamma voor dit kanaal zijn dan aangepast (L) voor het genereren van een tweede oppervlak via dezelfde volgorde van stappen (M, N). Het totale volume voor elk oppervlak wordt automatisch berekend en kan worden vergeleken, zowel in kwantitatief als in visueel (O, merk op dat oppervlak kleuren niet samenvoegen doen wanneer overlapt). Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bovenstaande protocol beschrijft een strategie voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens uit afbeeldingen van hoge kwaliteit hele mount immunofluorescentie van de muis na implantatie embryo's. Wanneer goed uitgevoerd, kan de 3D volumetrische gegevens gegenereerd door deze stappen worden gebruikt voor vergelijkende en intersectional analyse van meerdere domeinen binnen het embryo. De oppervlakte signaal maskeren beschreven aanpak is vooral nuttig bij het onderzoeken van nieuwe cel populaties in vergelijking met gevestigde referentiestructuren.
Wij zijn van mening dat deze benadering een verschillend voordeel over bestaande benaderingen biedt. Hele mount immunofluorescentie met breed-gebied beeldvorming kan weefsel-niveau informatie maar mist cellulaire resolutie bieden. Omgekeerd, immunofluorescentie van seriële secties kan geven gedetailleerde resolutie van de mobiele-niveau, hoewel deze gegevens geen het driedimensionale voordeel voor hele mount imaging. Terwijl driedimensionale confocal imaging deze tekortkomingen richt, weinig gebruikers van het kwantitatieve potentieel van deze gegevens profiteren, en we dat hopen zal ons protocol toestaan meer onderzoekers ten volle te profiteren van de gegevens die zij verzamelen.
Hier, heeft deze aanpak is geïllustreerd met behulp van de markering Nkx2-5 de cardiale halve maan af te bakenen en onderzoeken de aanwezigheid van Foxa2Cre:YFP afkomst-getraceerd cellen binnen dat domein. Echter, als gevolg van de mogelijkheid om het imago van ten minste drie geslachten gelijktijdig en de gegenereerde gegevens voor de drie-dimensie van hoge resolutie, dit protocol zal wellicht nuttig aan onderzoekers op vele terreinen. Wij stellen voor dat deze aanpak kan worden toegepast op meerdere embryonale stadia orgaansystemen en lineages door kleine aanpassingen aan het protocol gebaseerd op de specifieke behoeften van het systeem. In onze ervaring, is dit protocol is direct van toepassing op een reeks van embryonale leeftijden (E6.5-E9.5 minimaal) met beperkte aanpassingen. 19 we heb niet ondervonden problemen met permeabiliteit of antilichaam penetratie in embryo's zo groot als E9.5 met de tijd van de incubatie wordt vermeld, hoewel we verwachten dat met dikker of dichtere weefsels deze hoefde te worden langwerpige om volledige penetratie.
De hier beschreven analyse werd uitgevoerd met behulp van een private softwarepakket, maar kan worden aangepast om te worden uitgevoerd in alternatieve private software geoptimaliseerd voor grote-gegevensverwerking. Als alternatief, soortgelijke pijpleidingen kunnen gemakkelijk worden geïmplementeerd met computationele talen of open-source softwarepakketten, die tot de snelle ontwikkeling van een deelbare protocollen-database leiden zal. De groei van een wereldwijd netwerk van wetenschappers, met toegang tot de vrij beschikbare hulpmiddelen en protocollen voor Beeldacquisitie en analyse, zal snel het veld verder en verhogen de reproduceerbaarheid van studies. 17
In onze ervaring, de grote limiet van deze benadering was gerelateerd aan imaging diepte, vooral voor later embryonale stadia, en zal sterk afhankelijk zijn van de specifieke kenmerken van de installatie van de microscopie wordt gebruikt. Evenzo, hoe monsters zijn gemonteerd voor imaging zal afhangen van de specifieke behoeften van de gebruiker. We hebben geconstateerd dat de regio van belang zich het dichtst bij de lens te brengen verbetert imaging diepte en achtergrond signaal vermindert, en raden we u aan gelaagde dubbelzijdige tape voor montage, zoals het kan gebruikers maken een kamer die past bij hun specifieke behoeften. Gebruik van een gebaseerde glycerol montage media met een anti-vervagen-reagens, en zo monsters in deze media voor montage, wordt sterk aanbevolen om photobleaching onderdrukken. Ten slotte, de monsters gebruikt in deze analyse zijn bijna transparant; gebruikers wellicht clearing stappen nemen voor meer geavanceerde embryonale stadia, weefsel fragmenten of organoids, en het bepalen van beste clearing protocol voor een bepaalde toepassing vereist empirisch testen.
In het geval van cardiale morfogenese, kunnen verschillende beeldvormende methoden worden gebruikt. Terwijl confocale microscopie hier gebruikt wordt, is licht vel microscopie uitermate geschikt voor deze studies vanwege de snelheid, resolutie en signaal-/ ruisverhouding van de verworven afbeelding. 20 we verwachten dat de toegenomen beschikbaarheid van deze nieuwe technologie aan het verder op het nut en de rijkdom van soortgelijke imaging benaderingen. Ook de voortdurende vooruitgang van fluorescerende verslaggevers,21 chromophores, kleurstoffen,22 en live-embryocultuur23,24 zal leiden tot deze studies naar vier dimensies, het toevoegen van het element van tijd, en opbrengst nog meer informatie over hoe embryonale structuren vorm tijdens de ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de NIH/NHLBI R56 HL128646 en de Mindich Child Health Development Institute (MCHDI) op ISMMS (naar N.D.). E.B. wordt ondersteund door een NIH/NIDCR stage T32 HD075735. Microscopie en beeld-analyse werd uitgevoerd de microscopie kern aan de School of Medicine van Icahn op Mount Sinai, die gedeeltelijk wordt ondersteund door de Tisch Cancer Institute op Mount Sinai P30 CA196521-kanker centrum steun verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
