Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.
Abstract
השימוש של טכניקות הדמיה-להתקדם תרמה באופן כללי להבנת התפתחות מוגברת. התפתחות טרום השרשה המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות שני תחומי מחקר זה לי כמיותרים במידה רבה ההתפתחויות הללו, בשל האיכות הגבוהה של נתונים שניתן להשיג ישירות מהדמיה טרום השרשה עוברי או ex-vivo האיברים organogenesis. בעוד טרום השרשה עוברי הניבו נתונים עם רזולוציה מרחבית גבוהה במיוחד, בשלבים מאוחרים יותר היו פחות נוטה שחזור תלת מימדי. קבלת נתונים תלת-ממד או נפחי איכותיים למבני עובריים מוכר בשילוב עם גורל מיפוי או מעקב אחר שושלת היוחסין הגנטי יאפשר ניתוח מקיף יותר של morphogenetic ההתרחשויות במהלך מופרה.
פרוטוקול זה מתאר גישה כולה-הר immunofluorescence המאפשר תיוג, ויזואליזציה של כימות של קדמון אוכלוסיות תאים בתוך הלב הסהר המתפתח, מבנה מפתח יצרו במהלך התפתחות הלב. הגישה מיועד כזה דרך שני תאים, רקמות-מידע ברמת שניתן להשיג. מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות עיבוד תמונה, פרוטוקול זה מאפשר שחזור מרחבי תלת מימדי של הסהר הלב, ובכך מספק את היכולת לנתח את לוקליזציה וארגון של אוכלוסיות ספציפיות קדמון במהלך שלב קריטי זה של התפתחות הלב. חשוב, השימוש של נוגדנים ההפניה מאפשרת מיסוך רצופים של הסהר הלב ו מדידות כמותיים הבאים של אזורים בתוך הסהר. פרוטוקול זה בלבד לא תאפשר בדיקה מקיפה של התפתחות הלב מוקדמת, אך עם עיבודים צריך להיות רלוונטי ברוב מערכות איברים ב- gastrula כדי מוקדם somite הבמה העכבר העובר.
Introduction
המחקר של organogenesis יש זמן הסתמך על התצפית של אירועים morphogenetic העובר המתפתח. מחקרים אלה לעתים קרובות לסמוך על השימוש של צבעי פלורסנט או שושלת היוחסין כתבים עקיבה בשילוב עם תיוג של אוכלוסיות הפניה מוגדרים. 1 על ידי השוואת היחסיים של תוויות אלה, מידע שאפשר לקרוא את המקור, תנועה או תרומתו האולטימטיבית של אוכלוסיה של עניין. השתלת וניסויים מיפוי גורל להשתמש ציוני מורפולוגיים או הזרקה של חומרי צבע לתוך שושלות שאינם תאי כדי להגדיר את נקודת ההתחלה של תאים מעניינים, אשר לאחר מכן נבדק על תרומה העובר מפותחות. 2 , 3 , 4 , 5 ניסויים גנטיים שושלת היוחסין-עקיבה משתמשים במושג זהה עם אללים כתב מוגדרים היטב המשמשים תווית אוכלוסיות תאים ללא מניפולציה ניסויית. מפתח גישות אלה הוא היכולת לקבוע, עם רזולוציה מרחבית גבוהה, את מיקומם של ניסיוני והתוויות הפניה. גישות אלה הניבו התקדמות בטיפול בהתפתחות טרום השרשה, explant organogenesis מחקרים. 6 , 7 , 8 , 9
האירועים התפתחותית העומדים מורפוגנזה הלב כבר מתואר יותר ויותר בשנים האחרונות. 10 אחת התגליות הגדולות באזור זה של המחקר הוא התיאור של מספר אוכלוסיות קדמון ניתן להבחין על ידי ביטוי של סמנים ייחודיים. 11 אוכלוסיות אלה כוללים את הראשון ואת שדות הלב השני (FHF ו- SHF), אשר נמצאים בתוך הסהר לב לצד הקדמי של העובר ביום עובריים (E) 8.25 ההתפתחות העכבר. 12 אוכלוסיות אלה נבדקים לעתים קרובות באמצעות שילוב של wide-מיקרוסקופיית שדה, אשר מספק מידע ברמת הרקמות ולאחר חלוקתה סדרתי עם מבחני immunofluorescence, אשר מציע ברזולוציה הסלולר גבוהה אבל רק מימדי מידע מרחבי. 13 כך, בעוד מחקרים אלה קידמו מאוד את ההבנה שלנו של התפתחות הלב, השיטות הזמינות מוגבלת עומק ניתוח כמותי של מורפוגנזה בשלבים אלה, יוצרים את הצורך גישות לבחון ארגון של אוכלוסיות אלה ברמה כל-אורגניזם.
האחרונים מאפשרים ההתקדמות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של תפוקה גבוהה אלגוריתמית שחזורים של תאים ומבנים בחיי עיר בקלות יחסית, ובכך לסלול את הדרך ללימודי מפורט של המתחם מבנים הסלולר. 14 עם העלייה של כוח חישובית ופיתוח אלגוריתמים ניהול נתונים גדול, שני הצורך להתמודד עם הגידול המעריכי של הגודל של הדמיה ערכות נתונים, ניתוח יכול עכשיו להיות אוטומטי לחלוטין. 15 ניתוח אוטומטי של ערכות נתונים הדמיה יש את היתרון של להיות לא משוחד, אבל זה רק אמינים ככל שאיכות ערכת הנתונים קלט; זה הכרחי, אז כי מומלצות משמשים במהלך רכישת ועיבוד תמונה מראש כדי להבטיח את האיכות הגבוהה ביותר, ניתוח לא משוחדת. 16 פרוטוקולים יכול להיות אוטומטי לחלוטין, משותפת עבור הפארמצבטית, האלגוריתמים בשימוש תוכנה קניינית הם בקלות זמין דרך ספריות כדי לשמש על ידי מדענים שיש להם היכרות עם קניינית מודרני או פתוח כלי פיתוח. 17
הפרוטוקול הבא מסביר את הצעדים הדרושים לביצוע ניתוח כזה על מודל אחד מוגדרת היטב של organogenesis, היווצרות של הסהר לב במהלך הפיתוח הלב. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) הקציר, לנתח בשלב חרמש לב עוברי, (2) לבצע את כל הר immunofluorescence לעיון (Nkx2-5) ו ניסיוני סמנים (18,Foxa2Cre:YFP19), (3) הכנה של תמונה העוברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ולבסוף (4) לנתח ולכמת את התמונות המתקבלות באמצעות גישות תלת-ממדי מתקדם. בעוד הסהר הלב משמש דוגמה כאן, עם השינוי המתאים, פרוטוקול זה עשוי לשמש לניתוח של שושלות מרובים ב- gastrula כדי עוברים שלב somite בשלב מוקדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני.
1-קציר, עיבוד עוברי הבמה הסהר לב
- חבר עכבר נקבה פורייה עם גבר חטוב פורייה. הכנס
- בדיקת נוכחות של הזדווגות הנרתיק באמצעות בדיקה בוטה או מלקחיים. בצהרי היום של זיהוי הכנס נחשב מתחלקים היום (ה) 0.5 (ראה איור 1A עבור ציר הזמן מלאה).
הערה: תקעים צריך להיבדק על בבוקר, כאשר הם הולכים לאיבוד לאורך כל היום. - בבוקר של היום ה 8 (E8.25), להקריב את הסכר בהריון על ידי שאיפת 2 CO, או לפי תקנות מקומיות ומוסדיים.
הערה: תזמון מדויק יכול להיות תלויות מתח, צריך להיקבע מדעית על ידי מורפולוגיה. - תרסיס בבטן של העכבר עם 70% אתנול כדי לנקות את האזור ולצמצם את שפיכת. לחשוף את הקרביים על-ידי ביצוע חתך בבטן דרך העור והן לגוף החומה.
- אתר הרחם ולאחר הסר בזהירות את הצופר הרחם כולו מהחיה. התחל על ידי חיתוך מעל oviduct אחד, זמירה שומן מן הרחם תוך כדי שתמשיך עד הסוף צוואר הרחם. לחתוך צוואר הרחם והמשיכו לקצה העליון של oviduct אחרים, חיתוך כדי לשחרר את הרחם כולה. תבשיל
- מקום הרחם ב 10 ס"מ עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) כדי לשטוף את הדם עודף. תת לנתח את הרחם על ידי גזירה את mesometrium בין כל deciduum, אשר מכיל את העוברים. להעביר את העוברים מאכל 6 ס מ עם PBS טריים.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, השתמש בסדר מלקחיים (#5) כדי להסיר את רקמת הרחם מן הרקמה decidual.
- באמצעות מלקחיים, פורסים בזהירות את קצה חצי עובריים deciduum כדי לחשוף את העובר. לצבוט את deciduum כדי לדחוף את העובר החוצה, משוך בזהירות את העובר.
- לפרק רקמות extraembryonic הרחק ככל האפשר מבלי להזיק המורפולוגיה של העובר ( איור 1B).
- להשתמש פיפטה העברה כדי למקם את העוברים בצינור 1.5 mL עם PBS טריים ומניחים על קרח. חזור על 1.7-1.9 העוברים הנותרים לפני שתמשיך.
- לשאוב PBS, שטיפה פעם אחת עם PBS. האחות PBS.
הערה: נסה להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מבלי להזיק או ייבוש העוברים. הסרה ידנית של פתרונות מומלץ על כל הצעדים כדי למנוע אובדן של העוברים. - תיקון העוברים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS עבור 1 h RT.
הערה: עוברי ניתן לתקן לילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס - שטיפה שלוש פעמים עם PBS. לשמור עוברי ב 4 ° C עד מוכן להמשיך עם immunofluorescence.
הערה: השהה נקודה. עוברי ניתן בבטחה לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
2. Immunofluorescence Staining
הערה: התנאים הדגירה בהמשך יכול להיות מותאם כדי להכיל את לוחות זמנים שונים. השימוש עדין טלטולים או נדנדה עבור כל שלבי דגירה ארוך מומלץ.
- להסיר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של מאגר חסימה (סאפונין 0.5%, 1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS).
- דגירה לפחות 4 h RT. ניתן גם לבצע זאת O/N ב- 4 מעלות צלזיוס
- להסיר חסימה מאגר ולהוסיף תערובת נוגדן ראשוני מדולל במאגר חסימה. דגירה O/N ב 4 º C
הערה: ראה חומרים סעיף לתיאור של נוגדנים בשימוש והציע דילולים. נוגדן דילולים צריך להיקבע מדעית. השימוש Nkx2-5 כמו כתם הפניה עבור הסהר הלב מומלץ, הוא דמות מפתח כדי במורד הזרם פילוח וניתוח צעדים. - להסיר נוגדנים הראשי על-ידי שאיפה.
- 3 פעמים בשביל 1 h כל עם 0.1% Triton ב- PBS.
- להסיר שטיפת ולהוסיף תערובת נוגדנים משניים מדולל במאגר חסימת. תקופת דגירה של 3 h RT. ניתן גם לבצע זאת O/N ב- 4 מעלות צלזיוס
- שטיפת 3 פעמים עבור 1 h כל עם 0.1% Triton ב- PBS. ניתן גם לבצע זאת O/N ב- 4 מעלות צלזיוס
- Counterstain עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ב- PBS במשך 10 דקות
הערה: counterstain זה יכול להתבצע בו זמנית עם נוגדנים משניים. - שטיפת פי 2 עבור חמש דקות כל עם 0.1% Triton ב- PBS.
- לאט להשעות את העוברים במדיה אנטי-לדעוך הרכבה (מספר n-Propyl 2% w/v (npg ב), 90% גליצרול, 1 x PBS; ראה סעיף חומרים לפרטים נוספים). מאפשרים equilibrate לפחות שעה לפני הרכבה. בעדינות קפיצי צינור מעת לעת כדי לסייע עוברי לתוך פתרון לדעוך אנטי-
הערה: השהה נקודה. עוברי ניתן לאחסן במשך מספר ימים בפתרון אנטי לדעוך עד מוכן הר ותמונה.
3. הרכבה העוברים על מיקרוסקופ
- הכן מיקרוסקופ שקופיות עבור הרכבה באמצעות הקלטת כפול-מקל או מפרידי סיליקון. אם באמצעות הקלטת כפול-מקל, להפוך שתי ערימות מקבילים של 5-6 שכבות כ 15-20 מ מ אחד מהשני. זה ישאיר מספיק מקום כדי למקם את העוברים ולאבטח את coverslip ( איור 1C).
- במקום טיפת 15 µL לדעוך אנטי על השקופית, בין הקלטת כפול-מקל. להעביר בזהירות העובר אחת לשקופית.
הערה: ניתן להניח עובר אחד או יותר בשקופית. עם זאת, השלבים הבאים התמצאות קשים יותר עם העוברים ולאחר זמן הדמיה משכים עלול להוביל הלבנת-צילום- - תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מלקחיים בסדר, מיקום העובר כך הצד הקדמי פונה הרחק השקופית הכוללת ציר הגוף בהתאם לציר הארוך של השקופית. ראה איור 1C סכימטי של ההתקנה של הרכבה.
- הצב בזהירות coverslip על המדגם על ידי נח בצד אחד במחסנית אחת כפול-מקל דבק באמצעות מלקחיים להורדת בעדינות את coverslip עד זה יוצר קשר את הקלטת אחרים.
הערה: השלבים 3.3 ו- 3.4 הם קריטיים כדי להבטיח את הכיוון הנכון של העובר עבור הדמיה. על-ידי הורדת את coverslip לאורך הצד האחורי לכיוון הקדמי, העובר לא צריך לגלגל ותישאר האזור חרמש לב אוריינטציה הרחק השקופית, אשר הינו אידיאלי עבור הדמיה-מיקרוסקופ הפוך. - השתמש פיפטה כדי להוסיף לדעוך אנטי נוספים בין שקופיות coverslip כדי למנוע את הדגימה מת במהלך אחסון/הדמיה-
4. הדמיה קונאפוקלית
תמונות- רכוש באמצעות המטרה ההגדלה הגבוהה ביותר המאפשרת עבור האזור חרמש כל הלב להיות בשבי אחד שדה ראייה. השתמש המחירים הדגימה של נייקוויסט כדי לקבוע מידות voxel x-y-z. רוב היצרנים מיקרוסקופ יהיו " לייעל את " הלחצן כדי לוודא הדגימה של נייקוויסט.
הערה: צביעת Nkx2-5 הוא מועיל, כמו זה יגדירו את האזור כולו חרמש הלב. Z-צעד קטן מידות (oversampling) תניב תוצאות עיצוב טוב יותר בתלת-מימד, אבל עלול להוביל רכישת המורחבת פעמים ו/או הלבנת עבור דגימות. - להגדיר הדמיה פרמטרים באמצעות שיטות הדמיה הכי סטנדרטי. כלומר, להשתמש את עוצמת הלייזר אפשרי הנמוך כדי להשיג יחס אות לרעש טוב עבור כל fluorophore ואת לבחור רווח לקזז רמות המניבים טווח דינמי רחב ללא להרוות את האות.
הערה: להיות עקבי עם הדמיה פרמטרים בין דגימות יושוו ישירות. זה חשוב במיוחד עבור ניתוח תלת-ממד הזרם ו כמת.
5. בתמונה ניתוח כמותי בתלת-מימד
הערה: עבור פרוטוקול זה, תמונות נותחו באמצעות חבילת התוכנה Imaris. ניתוח דומה ייתכן באמצעות חבילות חלופי. התיאור שלהלן מכסה את הצינור ניתוח עבור ערוץ הפניה (דהיינו Nkx2-5) וערוץ אחד ניסיוני (קרי YFP). ערוצים נוספים ניתן לנתח באמצעות שינון של השלבים. ערכת נתונים דוגמה היה בתנאי זה יכול לשמש כדי לשכפל את הניתוח שלהלן.
- לטעון תמונת raw ערכות נתונים לתוך תצוגה Imaris ארנה, פתח קובץ עבור העובר הרצוי בתצוגת Surpass. הנתונים צריכים לטעון בתצוגה תלת-ממדית במצב (מרבית) MIP. לפתוח את החלון התאמה תצוגה ובחר רק את הערוץ הפניה.
- להתאים את הסף של התמונה במידת הצורך עבור כדי שתראי טוב יותר. ניתוח זה, להתאים את הגמא אם יחס אות לרעש נמוכה מדי עבור פילוח.
הערה: אם ביצוע תיקונים גמא, שהן התאמות לא לינאריות, לתמונות שעברו התאמה אינם יכולים לשמש עבור עוצמת מדידות או השוואות. בשלב זה ניתן לבצע עוד טרום עיבוד תמונה (כלומר תאורה תיקונים, טשטוש לפי עקומת גאוס או סינון אחרים), אם את יחס אות לרעש שלך לא משביעת רצון. אם תבחר לעשות עיבוד קדם, עליך לבצע אותם שלבים טרום עיבוד לכל התמונות ב- dataset שלך. - ליצור משטח חדש עבור הערוץ הפניה באמצעות הדיאלוג אלגוריתם השטח.
- בחר " קטע רק האזור של עניין " תיבת סימון.
- להתאים את האזור התיבה התוחמת יכלול אזור עניין (ROI, כלומר האזור חרמש הלב) כפי שסומנו על-ידי הפניה הכתם.
- בחרו בערוץ הפניה מתוך התפריט הנפתח ערוץ המקור. הגדרת ברירת המחדל עבור Smoothing (שווה לגודל voxel z) מספיקה בדרך כלל, אך עשויים לדרוש אופטימיזציה אמפירי. לניתוח זה, השתמש בהחלקת שווה לגודל חצי z voxel-.
- בצע סף באינטנסיביות מוחלטת. כדי להבטיח כי השטח לא להרחיב מעבר האות ערוץ, להתאים את הגבול התחתון באמצעות המחוונים.
הערה: לתמונות מסוים שבו התאים יכולים מאפשרת בקלות, באפשרותך לכלול " פיצול לגעת אובייקטים " אלגוריתם, עוד יותר להפריד את האות שלך רקע. - סינון אובייקטים לפי מספר voxel או נפח, ולדחות את אובייקטי הרקע (קטן או שנמצאו באזורים מחוץ לאזור Nkx2-5) אולי יש להפיק את האלגוריתם. לסיים את אלגוריתם ה-
- באמצעות השטח החדש שנוצר, ליצור ערוץ רעולי פנים עבור הערוץ ניסיוני.
- Surface(s) שנבחר, ובחר " מסיכת Sel. ͟ " הפונקציה מתוך חלון עריכה.
- בחר ערוץ ניסיוני של הריבית (כלומר YFP). ודא " לשכפל ערוץ לפני החלת מסיכת " תיבת הסימון מסומנת.
- , התאמת תצוגת חלון בחר רק את הערוץ רעולי פנים. ליצור משטח חדש עבור הערוץ רעולי פנים על-ידי ביצוע השלבים 5.3-5.3.5.
הערה: בשלב זה עשוי להיות שימושי להתאים את המראה של כל מסכה כדי להקל על הפריט החזותי של דגם התלת-ממד: בחר כל אחד מממדי ובחר את צבע בכרטיסיית התאמת צבע הבסיס והשקיפות כנדרש. משטח צבעים אל תמזג באופן בלתי צפוי כאשר חפפו. - כדי לקבל את הנתונים נפחי, עם כל השטח שנבחר, בחר את הכרטיסיה סטטיסטיקה. ב " מפורט " תת בכרטיסיה, בחר " ממוצע של ערכים " מתוך התפריט הנפתח. הנפח הכולל של פני השטח ניתן למצוא בעמודה סכום של העניינים שייווצר.
הערה: אם המשטח שנוצר מכיל קטעים שגויים (קרי שברי כי הרקע אות לא נכללים בתקופת פילוח או אזורים מקוטע מהמשטח הראשי), ייתכן צורך לחשב את הנפח הכולל באופן ידני, או לסנן את המשטחים לפי נפח או מספר voxels ולהבטיח כי רק אות מקטעי כלולים בחישוב. ניתן למצוא את עוצמת הקול עבור כל חלק של פני השטח על-ידי בחירה " כל הערכים " מתוך התפריט הנפתח. בחירת כל ערך יגרום האזור המקביל מופיעים צהוב, אשר מסייע בקביעת ערכי כדי לא לכלול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איכות ניתוח והנתונים הסופי תלוי במידה רבה מורפולוגיה של העוברים גזור, (2) השימוש של נוגדנים גבוה ירידה לפרטים (3) התקנה נכונה של הדמיה פרמטרים של תקינות (1). עוברי פגום לבלבל את תהליך יצירת משטח ומעכבים אנליזה כמותית. דוגמאות של עוברי כראוי גזור, בשלבים מוצגים באיור 2B. העוברים יכול ניסויים נוספים על-ידי הסרת שק החלמון, שבה נוגדנים לעתים קרובות ילכוד הלא ספציפית. עם זאת, הסרה של שק החלמון יהפכו את העוברים פחות חזקים, אז כדאי לשים לב במהלך הטיפול במורד הזרם.
השילוב של איכות גבוהה נוגדנים והגדרות ההדמיה נכונה מכריעים להשגת יחס אות לרעש גבוה תמונות. איור 2A מראה תמונה לדוגמה באמצעות נוגדנים נגד Nkx2-5 כסמן הפניה תווית הסהר הלב, ואת GFP לתווית שושלת לעקוב אחר אוכלוסיית לעניין (Foxa2Cre:YFP חדרית לב וכלי דם ובתאים) (ראה משלימה נתונים עבור קבצי תמונה ונתונים גולמיים). 19 אסטרטגיה זו מאפשרת ההשוואה של אוכלוסיה נתונה עם האזור כולו חרמש הלב. עבור ניסויים, זה עשוי להיות עניין לבחון את תחומי משנה FHF ו- SHF של הסהר הלב. במקרה זה, FHF ואת SHF ניתן שכותרתו עם Hcn4 ו- Islet1, בהתאמה (ראה התייחסות19 תמונות וניתוח כמותי עם אלה שילובים נוגדנים). עם ההתקנה המתאים, שילובים נוגדנים משניים, לנו יש בהצלחה עם תמונה וניתח שלוש שושלות במקביל (קרי הסהר לב YFP, HF הראשון או השני).
חוסר יכולת להשיג קליטה טובה גם יגביל את היכולת להפיק מודלים 3D בוודאות גבוהה, כפי יהפוך קשה להסיר את הרקע אות משטחים הסופי. במקרים אלו, כדאי לשים לב בעת התאמת הגמא בתמונה (במהלך מראש עיבוד, איור 2B, 2 ג, 2N 2O) או משטח סף (במהלך אלגוריתם, איור 2G, משטח דור 2 H, 2 ל' ) ואת הגדרות דומות אמור לשמש לכל התמונות בתוך ניסוי. כך תגרום נתונים לא עקביים נפח, זה יהיה לא הולם לשימוש עבור השוואה ישירה. לעתים קרובות, משטחים מוטעים הנובע רקע האות ניתן להסירו באמצעות גודל סינון (איור 2I, 2J), למרות בכך מתמונות גבוהה-הרקע יהיה קשה מבלי לאבד את השטח מקטרתו גם כן.
איור 1: ציר הזמן ניסיוני ובתרשימים. (א) כל ניסוי, מן הזיווג כדי ניתוח נתונים, יכול להתבצע בעוד כשבועיים. עוברי נאספים בבוקר על 8th היום פוסט הזדווגות (E8.25) לניתוח לב הבמה חרמש (B). ברגע קבוע, העוברים הם חסמו, מוכתם נוגדנים והמשניים לפני הרכבה. העוברים הם רכובים בעזרת שקופיות מיקרוסקופ רגיל coverslips, באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי כמו כרווח (C). עוברי מוצבים טיפה של אנטי-עמעום הכיוון המוצג (ג, עליון), coverslip לאט הוא הוריד על הקלטת (C, נמוך יותר). הדמיה קונאפוקלית וניתוח התמונה מבוצעות כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה z-מחסנית (ד) ודגמי תלת-ממד משטח (E). HF, קיפול הראש; CC, הלב הסהר; A, קדמי; P, אחורי; AF, אנטי לדעוך. גודל ברים הם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: עיבוד תמונה קונאפוקלית Stepwise ותלת מימד פני הדור. (א) קונאפוקלית z-סדרת טעון בתצוגת אמצעי האחסון. הערוץ הפניה (Nkx2-5) הוא הנבחר (B) ואת עוצמת גמא מותאם (C) לפני שמתחילים את האלגוריתם יצירת משטחים. לאחר האזור עניין הוא הנבחר (D), ואת רמת הפירוט משטח נבחר (E). השטח הראשונית (F) היא thresholded כדי לכלול כל אות אמת על פני השטח (G). הסינון מתבצע ואז להסיר את הרקע קטן קטעים (H) להניב משטח הייחוס האחרון (אני). על-ידי בחירת השטח הפניה (J), התעלה השוואה (YFP) שניתן יהיה לשכפל, רעולי פנים (K). העוצמה ואת גמא עבור הערוץ הזה הם מכן מותאם (L) לפני יצירת משטח השני דרך אותו רצף של צעדים (M, N). הנפח הכולל עבור כל משטח מחושב באופן אוטומטי ולא ניתן להשוות באופן כמותי והן מבחינה ויזואלית (O, שימו לב: משטח צבעים אל תמזג באופן בלתי צפוי כאשר חופף). גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנ ל מתאר אסטרטגיה להשגת נתונים כמותיים מתמונות באיכות גבוהה כל הר immunofluorescence של העוברים העכבר שלאחר ההשתלה. כאשר מבוצעת כהלכה, הנתונים הנפחי 3D שנוצר הצעדים הללו יכול לשמש לניתוח השוואתי של intersectional של תחומים מרובים בתוך העובר. האות משטח מיסוך הגישה המתוארת היא של שימוש מסוים כאשר חוקרים אוכלוסיות תאים הרומן בהשוואה ומבוססת הפניה מבנים.
אנו מאמינים כי גישה זו מציע יתרון משמעותי על פני הגישות הקיימות. Immunofluorescence הר שלם עם הדמיה שדה רחב יכול להציע מידע ברמת רקמות אבל חסר רזולוציה הסלולר. לעומת זאת, immunofluorescence סעיפים טורי יכול לתת נתונים היסטוריים הסלולר ברמת רזולוציה, למרות נתונים אלה חוסר היתרון הר שלם הדמיה תלת מימדי. בעוד תלת מימדי הדמיה קונאפוקלית כתובות חסרונות אלה, שמעטים לנצל הפוטנציאל הכמותי של נתונים אלה, אנו מקווים כי הפרוטוקול שלנו יאפשר לחוקרים יותר לנצל את מלוא הנתונים שהם אוספים.
. הנה, גישה זו יש כבר דוגמה באמצעות הסמן Nkx2-5 ניסחו הסהר לב ולבחון את הנוכחות של Foxa2Cre:YFP עקב אחר שושלת היוחסין תאים בתוך תחום זה. עם זאת, בשל היכולת תמונה לפחות שלוש שושלות במקביל ואת הנתונים שלוש-ממד ברזולוציה גבוהה שנוצר, פרוטוקול זה צפוי להיות שימושי לחוקרים בתחומים רבים. אנו מציעים כי גישה זו יכול להיות מיושם העובריים, מערכות איברים מרובים של שושלות באמצעות התאמות קלות בפרוטוקול בהתאם לצרכים הספציפיים של המערכת. מניסיוננו, פרוטוקול זה ישימה ישירות על טווח הגילאים עובריים (E6.5-E9.5 לכל הפחות) עם עיבודים מוגבלת. 19 לא נתקלנו בעיות עם חדירות או נוגדן חדירה של העוברים גדול כמו E9.5 עם הזמן הדגירה מפורט, אך אנו מצפים כי עם רקמות עבה או צפופה אלה צריך להיות מוארך כדי להשיג חדירה מלאה.
ניתוח הנתונים המתוארים כאן בוצעה באמצעות חבילת תוכנה קניינית, אך ניתן להתאים להתבצע חלופי חבילות תוכנה קניינית אופטימיזציה עבור טיפול גדול-נתונים. לחלופין, צינורות דומה ניתן בקלות ליישם באמצעות שפות חישובית או חבילות תוכנה קוד פתוח, אשר יוביל להתפתחות מהירה של מסד נתונים של הפרוטוקולים ניתן לשיתוף. הצמיחה של רשת גלובלית של מדענים, עם גישה אל כלי זמינה בחופשיות ופרוטוקולים עבור ייבוא תמונות וניתוח, במהירות לקידומם של ולהגדיל את הפארמצבטית של מחקרים. 17
מניסיוננו, המגבלה העיקרית לגישה זו היה קשור עומק הדמיה, במיוחד עבור מאוחר יותר העובריים, ולא יהיה תלוי במידה רבה הפרטים של ההתקנה מיקרוסקופ בשימוש. באופן דומה, כמה דוגמאות הם רכובים עבור הדמיה תיקבע בהתאם לצרכים הספציפיים של המשתמש. אנחנו גילינו כי הצבת האזור עניין הקרוב העדשה משפר את עומק הדמיה ומקטינות רקע אות, אנו ממליצים להשתמש בשכבות סרט הדבקה דו-צדדי להרכבת, שכן היא מאפשרת למשתמשים ליצור חדר שמתאים לצרכים הספציפיים שלהם. השימוש מבוסס-גליצרול הרכבה מדיה עם ריאגנט אנטי-עמעום ולאחר equilibrating דגימות בתקשורת זו לפני הרכבה, מומלץ מאוד לדכא את photobleaching. בסופו של דבר, הדגימות ניתוח זה הם כמעט שקופים; משתמשים ייתכן שיהיה צורך לשלב פעולות חישוף יותר מתקדם העובריים, שברי רקמת או organoids, קביעת הטוב ביותר ניקוי פרוטוקול עבור יישום נתון ידרוש בדיקה אמפירית.
במקרה של מורפוגנזה הלב, ניתן להשתמש בשיטות הדמיה שונות. בעוד מיקרוסקופיה קונפוקלית משמש כאן, מיקרוסקופ אור גיליונות הוא מתאים היטב עבור מחקרים אלה בשל מהירות, רזולוציה, יחס אות לרעש של התמונה נרכשת. 20 אנו מצפים הזמינות מוגברת של הטכנולוגיה החדשה הזו כדי לקדם את תוכנית השירות ועושרה של גישות הדמיה דומה. באופן דומה, קידום רציפה של כתבים פלורסנט,21 בראשון, צבעי,22 ,23,תרבות העובר לחיות24 יוביל מחקרים אלו עוברים בארבעה ממדים, הוספת הרכיב של זמן, ואת מניב עדיין מידע נוסף אודות הטופס מבנים איך עובריים במהלך הפיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי NIH/NHLBI R56 HL128646 ואת בריאות הילד Mindich מכון לפיתוח (MCHDI) ב ISMMS (כדי N.D.). אי. בי נתמכת של NIH/NIDCR Traineeship T32 HD075735. מיקרוסקופ וניתוח התמונה בוצעה בתוך ליבת מיקרוסקופ בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני, אשר נתמך בחלקה על-ידי מכון הסרטן ה"טיש הר CA196521 P30 סיני – סרטן מרכז תמיכה גרנט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
