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Developmental Biology

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56446
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5,6, 1,2,3
1Cell, Developmental, and Regenerative Biology Department, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Microscopy Core, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

यहां, हम पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और छवि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-प्रारंभिक चरण माउस भ्रूण के मात्रात्मक volumetric विश्लेषण आधारित है । हम गुणात्मक और मात्रात्मक विकास के दौरान हृदय संरचनाओं का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में इस तकनीक मौजूद है, और यह व्यापक रूप से अन्य अंग प्रणालियों के लिए अनुकूलनीय हो सकता है कि प्रस्ताव.

Abstract

इमेजिंग तकनीक कभी आगे बढ़ाने का उपयोग भ्रूण के विकास की हमारी वृद्धि की समझ के लिए मोटे तौर पर योगदान दिया है । पूर्व आरोपण विकास और organogenesis अनुसंधान के दो क्षेत्रों है कि इन अग्रिमों से बहुत लाभांवित किया है, डेटा की उच्च गुणवत्ता के कारण है कि सीधे इमेजिंग पूर्व आरोपण भ्रूण या पूर्व vivo अंगों से प्राप्त किया जा सकता है । जबकि पूर्व आरोपण भ्रूण विशेष रूप से उच्च स्थानिक संकल्प के साथ डेटा उपज है, बाद में चरणों गया है कम तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए उत्तरदाई है । भाग्य मानचित्रण या आनुवंशिक वंश अनुरेखण के साथ संयोजन में ज्ञात भ्रूण संरचनाओं के लिए उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी या volumetric डेटा प्राप्त करने morphogenetic embryogenesis के दौरान जगह लेने की घटनाओं का एक अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए अनुमति देगा ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण है कि लेबलिंग, दृश्य के लिए अनुमति देता है, और विकासशील कार्डियक वर्धमान, एक प्रमुख दिल के विकास के दौरान गठित संरचना के भीतर जनक कोशिका आबादी के ठहराव । दृष्टिकोण इस तरह से बनाया गया है कि कोशिका और ऊतक दोनों स्तर की जानकारी प्राप्त की जा सकती है । फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण का प्रयोग, इस प्रोटोकॉल इस प्रकार के दौरान विशिष्ट जनक आबादी के स्थानीयकरण और संगठन का विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करने, कार्डियक वर्धमान के तीन आयामी स्थानिक पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है दिल के विकास के इस महत्वपूर्ण चरण । महत्वपूर्ण बात, संदर्भ एंटीबॉडी का उपयोग कार्डियक वर्धमान के लगातार मास्किंग और वर्धमान के भीतर क्षेत्रों के बाद मात्रात्मक माप के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल केवल जल्दी दिल के विकास की एक विस्तृत परीक्षा में सक्षम नहीं होगा, लेकिन साथ रूपांतरों जल्दी somite स्टेज माउस भ्रूण को गेसट्रुला में सबसे अंग प्रणालियों के लिए लागू किया जाना चाहिए ।

Introduction

organogenesis का अध्ययन लंबे समय से विकासशील भ्रूण में morphogenetic घटनाओं के अवलोकन पर भरोसा किया है । ये अध्ययन अक्सर फ्लोरोसेंट रंजक या परिभाषित संदर्भ आबादी के लेबलिंग के साथ संयोजन में रिपोर्टर अनुरेखण वंश के उपयोग पर निर्भर करते हैं । 1 इन लेबल्स की सापेक्ष स्थितियों की तुलना करके, जानकारी को मूल, आंदोलन, या ब्याज की जनसंख्या के अंतिम योगदान पर बटोरा जा सकता है । प्रत्यारोपण और भाग्य मानचित्रण प्रयोगों या तो रूपात्मक स्थलों या गैर में रंजक के इंजेक्शन का उपयोग-gram वंश ब्याज की कोशिकाओं के प्रारंभिक बिंदु को परिभाषित करने के लिए, जो तब विकसित भ्रूण के लिए योगदान की जांच कर रहे हैं । 2 , 3 , 4 , 5 आनुवंशिक वंश-प्रयोग अनुरेखण अच्छी तरह से परिभाषित रिपोर्टर alleles कि प्रयोगात्मक हेरफेर के बिना सेल आबादी लेबल के लिए उपयोग किया जाता है के साथ एक ही अवधारणा का उपयोग करें । इन तरीकों की कुंजी के लिए निर्धारित करने की क्षमता है, उच्च स्थानिक संकल्प के साथ, प्रयोगात्मक और संदर्भ लेबल के स्थानों । इन दृष्टिकोणों से पूर्व आरोपण विकास और explant organogenesis अध्ययन में बकाया प्रगति की उपज हुई है. ६ , 7 , 8 , 9

आबाद हार्ट morphogenesis की विकासात्मक घटनाएँ हाल के वर्षों में अच्छी तरह से बताई जा रही हैं. अनुसंधान के इस क्षेत्र में प्रमुख खोजों में से 10 एक जनक आबादी है कि अद्वितीय मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है की एक संख्या का वर्णन है । 11 इन आबादियों में शामिल है पहली और दूसरी दिल के खेतों (FHF और SHF), जो भ्रूण के पूर्वकाल की ओर में कार्डियक वर्धमान के भीतर मौजूद हैं (ई) ८.२५ माउस के विकास के दिन । 12 इन आबादियों अक्सर व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के संयोजन के माध्यम से जांच कर रहे हैं, जो ऊतक स्तर की जानकारी प्रदान करता है, और धारावाहिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख, जो उच्च सेलुलर संकल्प प्रदान करता है, लेकिन केवल के साथ अनुभाग दो आयामी स्थानिक जानकारी । 13 इस प्रकार, जबकि इन अध्ययनों से बहुत दिल के विकास की हमारी समझ को उंनत किया है, उपलब्ध तरीकों morphogenesis की गहराई मात्रात्मक विश्लेषण में इन चरणों के दौरान सीमित है, की जांच करने के दृष्टिकोण के लिए की जरूरत बनाने एक पूरे जीव के स्तर पर इन आबादियों के संगठन ।

दोनों फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी छवि विश्लेषण में हाल ही में प्रगति उच्च संकल्प और रिश्तेदार आसानी से सीटू में कोशिकाओं और संरचनाओं के उच्च प्रवाह एल्गोरिथम पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देते हैं, इस प्रकार जटिल के विस्तृत अध्ययन के लिए जिस तरह से फ़र्श सेलुलर संरचनाओं । 14 अभिकलनी शक्ति की वृद्धि और बड़े डेटा के प्रबंधन एल्गोरिदम के विकास के साथ, दोनों इमेजिंग डेटा के आकार की घातीय वृद्धि को संभालने के लिए आवश्यक-सेट, विश्लेषण अब पूरी तरह से स्वचालित किया जा सकता है । इमेजिंग डेटा-सेट्स के 15 स्वचालित विश्लेषण में निष्पक्ष होने का लाभ होता है, लेकिन यह केवल इनपुट डेटासेट की गुणवत्ता के रूप में विश्वसनीय है; यह आवश्यक है, तो, कि सर्वोत्तम प्रथाओं अधिग्रहण और छवि पूर्व प्रसंस्करण के दौरान उच्चतम गुणवत्ता, निष्पक्ष विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है । 16 प्रोटोकॉल पूरी तरह से स्वचालित और reproducibility के लिए साझा किया जा सकता है, और मालिकाना सॉफ्टवेयर द्वारा इस्तेमाल एल्गोरिदम आसानी से पुस्तकालयों के माध्यम से उपलब्ध आधुनिक स्वामित्व या खुले स्रोत के साथ परिचित है जो वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं डेवलपर उपकरण । 17

निंनलिखित प्रोटोकॉल organogenesis के एक अच्छी तरह से परिभाषित मॉडल पर इस तरह के विश्लेषण करने के लिए आवश्यक कदम बताते हैं, हृदय विकास के दौरान कार्डियक वर्धमान के गठन । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे करने के लिए (1) फसल और टुकड़े कार्डियक वर्धमान स्टेज भ्रूण, (2) संदर्भ के लिए पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन (Nkx2-5) और प्रयोगात्मक (Foxa2Cre: YFP18,19) मार्करों, (3) तैयार और छवि फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर भ्रूण, और अंत में (4) का विश्लेषण और जिसके परिणामस्वरूप छवियों उन्नत तीन आयामी दृष्टिकोण का उपयोग कर. जबकि कार्डिएक वर्धमान एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है यहां, उचित संशोधन के साथ, इस प्रोटोकॉल गेसट्रुला में कई वंश के विश्लेषण के लिए जल्दी somite चरण भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यहां बताए गए सभी तरीकों को माउंट सिनाई स्थित Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी ने मंजूरी दी है ।

< p class = "jove_title" > 1. हार्वेस्टिंग और कार्डियक वर्धमान स्टेज भ्रूण प्रसंस्करण

  1. मेट एक उपजाऊ महिला माउस के साथ एक उपजाऊ स्टड पुरुष ।
    2. एक योनि शयन प्लग की उपस्थिति के लिए
  2. जांच एक कुंद जांच या संदंश का उपयोग कर । प्लग का पता लगाने के दिन पर दोपहर भ्रूण माना जाता है दिन (E) ०.५ (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a पूर्ण समयरेखा के लिए).
    नोट: प्लग के लिए सुबह में जांच की जानी चाहिए, के रूप में वे दिन भर खो रहे हैं ।
  3. 8 वें दिवस (ई 8.25) की सुबह पर, सह 2 सांस लेना, या स्थानीय और संस्थागत नियमों के अनुसार द्वारा गर्भवती बांध बलिदान ।
    नोट: सटीक समय तनाव निर्भर हो सकता है और आकृति विज्ञान द्वारा empirically निर्धारित किया जाना चाहिए.
  4. ७०% इथेनॉल के साथ माउस के पेट स्प्रे क्षेत्र को साफ करने और छप्पर को कम करने । दोनों त्वचा और शरीर की दीवार के माध्यम से एक उदर चीरा प्रदर्शन करके आंत बेनकाब ।
  5. गर्भाशय का पता लगाने और ध्यान से जानवर से पूरे गर्भाशय सींग हटा दें । एक ओवीडक्ट के ऊपर काटने से शुरू, गर्भाशय से वसा दूर ट्रिमिंग करते हुए ग्रीवा अंत करने के लिए आगे बढ़ने । गर्भाशय ग्रीवा के माध्यम से कट और अंय ओवीडक्ट के ऊपरी छोर तक जारी रखने के लिए, पूरे गर्भाशय जारी काटने ।
  6. जगह फॉस्फेट के साथ एक 10 सेमी डिश में गर्भाशय-खारा (पंजाबियों, पीएच ७.४) दूर अतिरिक्त रक्त धोने के लिए । प्रत्येक deciduum के बीच mesometrium को काटने से गर्भाशय को उप-टुकड़े है, जिसमें भ्रूण होता है । ताजा पंजाबियों के साथ एक 6 सेमी डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण ।
    7. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत
  7. , decidual ऊतक से दूर गर्भाशय ऊतक निकालने के लिए ठीक संदंश (#5) का उपयोग करें ।
  8. संदंश का उपयोग कर, ध्यान से भ्रूण के आधे deciduum की नोक टुकड़ा पता चलता है । deciduum चुटकी भ्रूण बाहर धक्का और ध्यान से भ्रूण बाहर खींचने के लिए ।
  9. भ्रूण (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 1b ) की आकृति को क्षति पहुंचाए बिना जितना संभव हो extraembryonic ऊतकों को टुकड़े दूर कर सकता है ।
  10. एक अंतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ताजा पंजाबियों और बर्फ पर जगह के साथ भ्रूण जगह । दोहराने 1.7-1.9 शेष भ्रूण को जारी रखने से पहले के लिए ।
  11. महाप्राण पंजाबियों और पंजाबियों के साथ एक बार कुल्ला । महाप्राण पंजाब.
    नोट: भ्रूण को हानिकारक या सुखाने के बिना यथासंभव अधिक से अधिक पंजाबियों को निकालने की कोशिश करें । समाधान के मैनुअल हटाने के सभी चरणों में सिफारिश की है भ्रूण के नुकसान से बचने के लिए ।

  12. में 1 ज के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ भ्रूण ठीक नोट: भ्रूण की रात तय की जा सकती है (O/N) 4 & #176; C.
  13. तीन बार पंजाबियों के साथ कुल्ला । भ्रूण को 4 & #176 पर रखें; C जब तक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार.
    नोट: बिंदु रोकें । भ्रूण को सुरक्षित रूप से 4 & #176; C पर कई हफ्तों के लिए पंजाब में संग्रहित किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस सना

< p class = "jove_content" > नोट: नीचे दी गई मशीन शर्तों को विभिन्न कार्यक्रम को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । कोमल मिलाते हुए या सभी लंबी गर्मी कदम के लिए कमाल का उपयोग की सिफारिश की है ।

  1. पंजाबियों को हटाने और ब्लॉकिंग बफर की 1 मिलीलीटर (०.५% saponin, पंजाब में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)) जोड़ें ।
  2. से कम 4 ज पर आर टी की मशीन । यह भी किया जा सकता है O/N पर 4 & #176; C.
  3. अवरुद्ध बफर निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण बफर अवरुद्ध में पतला जोड़ें । /4 पर मशीन O/N & #176; C.
    नोट: उपयोग एंटीबॉडी और सुझाव दिया कमजोर पड़ने के विवरण के लिए सामग्री अनुभाग देखें । एंटीबॉडी कमजोरियां empirically निर्धारित की जानी चाहिए । कार्डियक वर्धमान के लिए एक संदर्भ दाग के रूप में Nkx2-5 के उपयोग की सिफारिश की है, और बहाव छवि विभाजन और विश्लेषण कदम के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. आकांक्षा द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें ।
  5. धो 1 एच प्रत्येक के लिए 3 बार ०.१% ट्राइटन के साथ पंजाब में ।
  6. निकालें धोने और द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण बफर अवरुद्ध में पतला जोड़ें । आरटी पर 3 एच के लिए मशीन । यह भी किया जा सकता है O/N पर 4 & #176; C.
  7. 1 एच प्रत्येक के लिए 3 बार धो पंजाब में ०.१% ट्राइटन के साथ । यह भी किया जा सकता है O/N पर 4 & #176; C.
  8. Counterstain with 4 & #39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के लिए पंजाबियों में 10 min.
    नोट: इस counterstain माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक साथ किया जा सकता है.
  9. 5 मिनट के लिए 2 बार धो दो पंजाब में ०.१% ट्राइटन के साथ प्रत्येक ।
  10. धीरे एंटी में भ्रूण निलंबित-बढ़ते मीडिया (2% डब्ल्यू/वी एन-Propyl gallate (nPG), ९०% ग्लिसरॉल, 1x पंजाबियों, फीका; अधिक जानकारी के लिए सामग्री अनुभाग देखें) । equilibrate करने के लिए पहले से कम 1 ज की अनुमति दें बढ़ते । धीरे झटका ट्यूब समय पर मदद करने के लिए भ्रूण विरोधी फीका समाधान में ड्रॉप ।
    नोट: बिंदु रोकें । भ्रूण विरोधी में कई दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है जब तक तैयार करने के लिए माउंट और छवि समाधान फीका ।
< p class = "jove_title" > 3. माइक्रोस्कोपी

  1. के लिए बढ़ते भ्रूण या तो डबल-स्टिक टेप या सिलिकॉन स्पेसिंग का उपयोग बढ़ते के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करते हैं । अगर डबल-स्टिक टेप का उपयोग कर, के बारे में 15-20 mm के बारे में 5-6 परतों के दो समानांतर ढेर कर अलग । इससे भ्रूण को स्थान देने के लिए पर्याप्त जगह छोड़नी होगी और coverslip (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ) को सुरक्षित रखा जाएगा ।
  2. प्लेस a 15 & #181; डबल-स्टिक टेप के बीच, स्लाइड पर विरोधी के एल ड्रॉप फीका । ध्यान से एक भ्रूण स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: एक से अधिक भ्रूण को स्लाइड पर रखा जा सकता है । हालांकि, बाद के अभिविन्यास चरण कई भ्रूण के साथ और अधिक कठिन हैं, और लंबी इमेजिंग अवधि फोटो-ब्लीचिंग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
    3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत
  3. ठीक संदंश का उपयोग कर, स्थिति भ्रूण ऐसी है कि पूर्वकाल पक्ष स्लाइड की लंबी धुरी के साथ कतार में शरीर धुरी के साथ स्लाइड से दूर चेहरे । See < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C बढ़ते सेटअप के एक योजनाबद्ध के लिए.
  4. ध्यान से नमूना पर एक coverslip डबल छड़ी टेप के ढेर पर एक तरफ आराम से जगह और संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे coverslip कम जब तक यह अंय टेप संपर्क ।
    नोट: चरण ३.३ और ३.४ इमेजिंग के लिए भ्रूण का सही अभिविंयास सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । पूर्वकाल दिशा के पीछे के साथ coverslip कम करके, भ्रूण रोल नहीं करना चाहिए और कार्डियक वर्धमान क्षेत्र स्लाइड, जो एक औंधा माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए आदर्श है से दूर उंमुख रहना होगा ।
  5. एक पिपेट का उपयोग करने के लिए स्लाइड और coverslip के बीच अतिरिक्त विरोधी फीका जोड़ने के लिए भंडारण/इमेजिंग.
    6. के दौरान बाहर मरने से नमूना रखने के लिए
< p class = "jove_title" > 4. फोकल इमेजिंग

  1. उच्चतम आवर्धन उद्देश्य है कि पूरे कार्डियक वर्धमान क्षेत्र के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर छवियों को देखने के एक क्षेत्र में कब्जा कर लिया जाएगा । x-y-z voxel आयामों को निर्धारित करने के लिए Nyquist नमूना दरों का उपयोग करें । सबसे सूक्ष्मदर्शी निर्माताओं के पास एक & #34 होगा; ऑप्टिमाइज़ & #34; बटन Nyquist नमूना सुनिश्चित करने के लिए.
    नोट: Nkx2 के लिए धुंधला-5 यहां फायदेमंद है, के रूप में यह पूरे कार्डियक वर्धमान क्षेत्र चित्रित जाएगा । छोटे Z-कदम आकार (नमूना) बेहतर 3 डी मॉडलिंग परिणाम निकलेगा, लेकिन कुछ नमूनों के लिए अधिग्रहण समय और/या ब्लीचिंग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  2. मानक श्रेष्ठ-इमेजिंग पद्धतियों का उपयोग करते हुए इमेजिंग पैरामीटर्स सेट करें । अर्थात्, प्रत्येक fluorophore के लिए अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात को प्राप्त करने और लाभ और ऑफसेट स्तर है कि संकेत संतृप्त बिना एक व्यापक गतिशील रेंज उपज का चयन करने के लिए सबसे कम संभव लेजर तीव्रता का उपयोग करें.
    नोट: सीधे तुलना की जाएगी नमूनों के बीच इमेजिंग पैरामीटर के साथ संगत हो । यह बहाव 3d विश्लेषण और ठहराव.
    3. के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है
< p class = "jove_title" > 5. छवि विश्लेषण और मात्रात्मक 3d मॉडलिंग

< p class = "jove_content" > नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, छवियों Imaris सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । इसी तरह के विश्लेषण वैकल्पिक संकुल का उपयोग संभव हो सकता है । नीचे वर्णन एक संदर्भ चैनल ( यानी Nkx2-5) और एक प्रयोगात्मक चैनल ( यानी YFP) के लिए विश्लेषण पाइपलाइन शामिल हैं । अतिरिक्त चैनल इन चरणों की पुनरावृत्ति के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है । एक उदाहरण dataset प्रदान किया गया है जो नीचे विश्लेषण को दोहराने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

  1. लोड कच्चे छवि डेटा सेट Imaris Arena दृश्य और खुला फ़ाइल में वांछित भ्रूण के लिए पार देखने में । डेटा 3 डी दृश्य में मिप (अधिकतम) मोड में लोड करना चाहिए । प्रदर्शन समायोजन विंडो खोलें और केवल संदर्भ चैनल का चयन करें.
  2. बेहतर दृश्य के लिए आवश्यक हो तो छवि की दहलीज समायोजित करें । इस विश्लेषण के लिए, यदि संकेत-से-शोर अनुपात विभाजन के लिए बहुत कम है, तो गामा समायोजित करें ।
    नोट: यदि गामा सुधार, जो गैर रेखीय समायोजन कर रहे हैं, समायोजित छवियों तीव्रता माप या तुलना के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है । इस स्तर पर आप आगे की छवि पूर्व प्रसंस्करण प्रदर्शन कर सकते हैं (यानी रोशनी सुधार, गाऊसी कलंक या अन्य फ़िल्टरिंग), यदि आपके संकेत करने के लिए शोर अनुपात संतोषजनक नहीं है. यदि आप पूर्व-संसाधन करना चुनते हैं, तो आपको अपने डेटासेट के सभी चित्रों के लिए समान पूर्व-संसाधन चरण करने होंगे.
  3. संदर्भ चैनल सतह एल्गोरिथ्म संवाद का उपयोग कर के लिए एक नई सतह बनाएँ ।
    1. & #34; खंड केवल एक क्षेत्र का हित & #34; चेकबॉक्स.
    2. बाउंड बॉक्स क्षेत्र को समायोजित करें ताकि यह ब्याज के क्षेत्र (रॉय, यानी कार्डियक वर्धमान क्षेत्र) के रूप में संदर्भ दाग से delineated के रूप में शामिल है ।
    3. स्रोत चैनल ड्रॉपडाउन मेनू से संदर्भ चैनल का चयन करें । (z voxel आकार के बराबर) स्मूथिंग के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग सामांयतया पर्याप्त है लेकिन अनुभवजंय ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है । इस विश्लेषण के लिए, आधा z voxel-आकार के बराबर स्मूथिंग का उपयोग करें ।
    4. पूर्ण तीव्रता से थ्रेसहोल्ड प्रदर्शन करते हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि सरफ़ेस चैनल सिग्नल से आगे नहीं बढ़ा है, स्लाइडर्स का उपयोग करके निचली सीमा समायोजित करें ।
      नोट: कुछ छवियों के लिए जहां कोशिकाओं को आसानी से delineated जा सकता है, आप शामिल कर सकते हैं & #34; भाजित छू वस्तुओं & #34; एल्गोरिथ्म, आगे पृष्ठभूमि से अपने संकेत अलग करने के लिए.
    5. ऑब्जेक्ट्स को voxel संख्या या वॉल्यूम द्वारा फ़िल्टर करें, और पृष्ठभूमि (छोटा या Nkx2-5 क्षेत्र के बाहर के क्षेत्रों में पाया) ऑब्जेक्ट्स जो एल्गोरिथ्म जनरेट किया गया हो सकता है । एल्गोरिथ्म समाप्त करें.
  4. नई बनाई गई सतह का उपयोग कर, प्रयोगात्मक चैनल के लिए एक नकाबपोश चैनल बनाएँ ।
    1. सतह (ओं) के साथ चयनित, & #34 चुनें; मास्क चयन... & #863; & #34; फ़ंक्शन से संपादित करें विंडो.
    2. ( यानी YFP) के प्रायोगिक चैनल का चयन करें । मास्क & #34 लागू करने से पहले यह सुनिश्चित कर लें कि & #34;D uplicate चैनल है; चेकबॉक्स चुना हुआ है ।
  5. प्रदर्शन समायोजन विंडो में केवल नकाबपोश चैनल का चयन करें । चरणों का पालन करके मास्क्ड चैनल के लिए एक नई सतह बनाएँ 5.3-5.3.5.
    नोट: इस बिंदु पर यह प्रत्येक मुखौटा की उपस्थिति को समायोजित करने के लिए 3 डी मॉडल के दृश्य को सुविधाजनक बनाने में सहायक हो सकता है: प्रत्येक सतह का चयन करें और रंग टैब का चयन करें । आधार रंग और पारदर्शिता आवश्यकतानुसार समायोजित करना । जब छा.
    6. सतह रंग मर्ज नहीं
  6. volumetric डेटा प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक चयनित सतह के साथ सांख्यिकी टैब का चयन करें । म & #34;D etailed & #34; उप-टैब, चुन & #34; औसत मान & #34 ड्रॉप-डाउन मेनू से; सतह का कुल वॉल्यूम जनरेटेड तालिका के योग स्तंभ में पाया जा सकता है ।
    नोट: यदि जनरेटेड सतह में गलत अंशों ( यानी अंश जो पृष्ठभूमि संकेत से हैं, जो मुख्य सतह से विखण्डन या क्षेत्रों के दौरान बहिष्कृत नहीं किए गए हैं), तो इसे मैन्युअल रूप से कुल मात्रा की गणना करने के लिए आवश्यक हो सकता है, या वॉल्यूम या voxels की संख्या के आधार पर सतहों को फ़िल्टर करें और यह सुनिश्चित कर सके कि परिकलन में केवल संकेत सेगमेंट ही शामिल हों. सतह के प्रत्येक भाग के लिए मात्रा का चयन करके पाया जा सकता है & #34; सभी मान & #34; ड्रॉप-डाउन मेनू से । प्रत्येक मूल्य का चयन कर देगा इसी क्षेत्र पीले दिखाई देते हैं, जो मूल्यों को बाहर करने के लिए निर्धारित करने में एड्स ।

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Representative Results

अंतिम डेटा और विश्लेषण की गुणवत्ता पर बहुत निर्भर करता है (1) अखंडता और विच्छेदित भ्रूण की आकृति विज्ञान, (2) उच्च विशिष्टता एंटीबॉडी के उपयोग, और (3) इमेजिंग मापदंडों का उचित सेटअप. क्षतिग्रस्त भ्रूण सतह पीढ़ी प्रक्रिया को मिल जाएगा और मात्रात्मक विश्लेषण में बाधा । ठीक से विदारक और मंचन भ्रूण के उदाहरण चित्रा बीसी में दिखाए जाते हैं । भ्रूण को और अधिक जर्दी थैली, जो एंटीबॉडी अक्सर गैर विशेष रूप से बांध जाएगा हटाने के द्वारा विच्छेदित किया जा सकता है । हालांकि, जर्दी थैली के हटाने भ्रूण कम मजबूत कर देगा, तो ध्यान बहाव से निपटने के दौरान लिया जाना चाहिए ।

उच्च गुणवत्ता एंटीबॉडी और उचित इमेजिंग सेटिंग्स के संयोजन के लिए उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । चित्रा 2a एक उदाहरण के लिए एक संदर्भ मार्कर के रूप में Nkx2-5 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए कार्डियक वर्धमान लेबल छवि से पता चलता है, और GFP एक वंश ब्याज की जनसंख्या का पता लगाया (Foxa2Cre: YFP वेंट्रिकुलर हृदय जनक कोशिकाओं) (पूरक देखें रॉ छवि और डेटा फ़ाइलों के लिए डेटा) । 19 यह रणनीति संपूर्ण कार्डियक वर्धमान क्षेत्र के साथ दी गई जनसंख्या की तुलना के लिए अनुमति देती है । कुछ प्रयोगों के लिए, यह ब्याज की FHF और कार्डियक वर्धमान के SHF उपडोमेन की जांच करने के लिए हो सकता है । इस मामले में, FHF और SHF Hcn4 और Islet1 के साथ लेबल किया जा सकता है, क्रमशः (संदर्भ19 छवियों और इन एंटीबॉडी संयोजन के साथ मात्रात्मक विश्लेषण के लिए देखें). उपयुक्त सेटअप और माध्यमिक एंटीबॉडी संयोजन के साथ, हम सफलतापूर्वक imaged है और तीन वंश समवर्ती (यानी हृदय वर्धमान, YFP, और पहली या दूसरी HF) का विश्लेषण किया ।

मजबूत संकेत प्राप्त करने के लिए अक्षमता भी उच्च विश्वास 3 डी मॉडल उत्पन्न करने की क्षमता को सीमित करेगा, के रूप में यह अंतिम सतहों से पृष्ठभूमि संकेत को दूर करने के लिए मुश्किल हो जाएगा. इन मामलों में, छवि गामा का समायोजन करते समय देखभाल की जानी चाहिए (पूर्व-प्रोसेसिंग के दौरान, चित्र b, 2c, 2N, 2O) या सरफ़ेस थ्रेशोल्ड (surface जनरेशन एल्गोरिथ्म के दौरान, चित्र 2g, 2H, 2L ) और इसी तरह की सेटिंग्स एक प्रयोग के भीतर सभी छवियों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । ऐसा करने में विफलता असंगत volumetric डेटा का परिणाम होगा जो प्रत्यक्ष तुलना के लिए उपयोग करने के लिए अनुपयुक्त होगा । अक्सर, गलत पृष्ठभूमि संकेत से उत्पन्न सतहों आकार फ़िल्टरिंग (चित्रा 2I, 2J) के माध्यम से हटाया जा सकता है, हालांकि उच्च पृष्ठभूमि छवियों से ऐसा करने के रूप में अच्छी तरह से सही सतह टुकड़े को खोने के बिना मुश्किल हो जाएगा.

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक समय और योजनाबद्ध. (क) संपूर्ण प्रयोग, सहवास से लेकर डाटा विश्लेषण तक, लगभग दो सप्ताह में किए जा सकते हैं. भ्रूण 8वें दिन पोस्ट शयन (ई 8.25) कार्डियक वर्धमान स्टेज विश्लेषण (बी) के लिए पर सुबह में एकत्र कर रहे हैं । एक बार तय हो, भ्रूण और अवरुद्ध प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ बढ़ते पहले दाग रहे हैं । भ्रूण मानक माइक्रोस्कोपी स्लाइड और coverslips के साथ बढ़ रहे हैं, एक स्पेसर के रूप में डबल पक्षीय टेप का उपयोग (ग) । भ्रूण विरोधी की एक बूंद में रखा जाता है प्रदर्शित उंमुखीकरण में फीका (सी, ऊपरी) और एक coverslip धीरे टेप पर कम है (सी, कम) । फोकल इमेजिंग और छवि विश्लेषण उच्च संकल्प z-ढेर छवियों (D) और 3 डी सतह मॉडल (ई) उत्पंन करने के लिए किया जाता है । HF, सिर गुना; CC, कार्डियक वर्धमान; एक, पूर्वकाल; P, पीछे; वायुसेना, विरोधी क्षीण. स्केल बार्स १०० µm हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Stepwise फोकल छवि प्रसंस्करण और 3 डी सतह पीढ़ी । (A) फोकल z-श्रृंखला वॉल्यूम दृश्य में लोड । संदर्भ चैनल (Nkx2-5) का चयन किया जाता है (ख) और तीव्रता और गामा समायोजित (सी) शुरू करने से पहले (सी) सतहों बनाने के एल्गोरिथ्म । ब्याज का क्षेत्र (D) चयनित होने के बाद, और सतह विवरण के स्तर को चुना जाता है (E) । आरंभिक सतह (F), सरफ़ेस (G) में सभी ट्रू सिग्नल शामिल करने के लिए थ्रेशोल्ड है । फ़िल्टरिंग तो एक अंतिम संदर्भ सतह (मैं) उपज के लिए छोटे पृष्ठभूमि अंशों (H) को निकालने के लिए किया जाता है । संदर्भ सतह (J) का चयन करके, तुलना चैनल (YFP) को डुप्लिकेट और नकाबपोश (K) किया जा सकता है । इस चैनल के लिए तीव्रता और गामा तो कदम (एम, एन) के एक ही अनुक्रम के माध्यम से एक दूसरी सतह पैदा करने से पहले (एल) फिर समायोजित कर रहे हैं । प्रत्येक सतह के लिए कुल मात्रा स्वचालित रूप से गणना की है और दोनों मात्रात्मक और नेत्रहीन की तुलना में किया जा सकता है (हे, ध्यान दें कि सतह रंग नहीं विलय जब ओवरलैप) । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के बाद आरोपण माउस भ्रूण से मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक रणनीति का वर्णन । जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, 3 डी volumetric डेटा इन चरणों के माध्यम से उत्पंन भ्रूण के भीतर एक से अधिक डोमेन के तुलनात्मक और चौराही विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सतह संकेत मास्किंग दृष्टिकोण वर्णित विशेष रूप से उपयोग की है जब अच्छी तरह से स्थापित संदर्भ संरचनाओं के साथ तुलना में उपंयास सेल आबादी की जांच ।

हमें विश्वास है कि इस दृष्टिकोण मौजूदा दृष्टिकोण पर एक विशिष्ट लाभ प्रदान करता है । वाइड फील्ड इमेजिंग के साथ पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऊतक स्तर की जानकारी की पेशकश कर सकते है लेकिन सेलुलर संकल्प का अभाव है । इसके विपरीत, धारावाहिक वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विस्तृत सेलुलर स्तर के संकल्प दे सकते हैं, हालांकि इन आंकड़ों पूरे माउंट इमेजिंग के तीन आयामी लाभ की कमी है । जबकि तीन आयामी फोकल इमेजिंग इन कमियों पते, कुछ उपयोगकर्ताओं को इस डेटा की मात्रात्मक क्षमता का लाभ ले, और हमें उंमीद है कि हमारे प्रोटोकॉल और अधिक शोधकर्ताओं डेटा वे इकट्ठा का पूरा लाभ लेने के लिए अनुमति देगा ।

यहां, इस दृष्टिकोण को कार्डियक वर्धमान चित्रित के लिए मार्कर Nkx2-5 का उपयोग कर उदाहरण गया है और Foxa2Cre की उपस्थिति की जांच: YFP वंश-कि डोमेन में कोशिकाओं का पता लगाया । हालांकि, करने की क्षमता के कारण छवि को कम तीन वंश समवर्ती और उच्च संकल्प तीन आयाम डेटा उत्पंन, इस प्रोटोकॉल की संभावना कई क्षेत्रों में शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा । हम प्रस्ताव है कि इस दृष्टिकोण कई भ्रूण चरणों, अंग प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है, और प्रणाली की विशिष्ट जरूरतों के आधार पर प्रोटोकॉल के लिए मामूली समायोजन के माध्यम से वंश । हमारे अनुभव में, इस प्रोटोकॉल सीधे भ्रूण उंर की एक सीमा के लिए लागू है (कम से कम ई 6.5 ई 9.5) सीमित रूपांतरों के साथ । 19 हम में पारगम्यता या एंटीबॉडी प्रवेश के साथ मुद्दों का सामना नहीं किया है के रूप में बड़े के रूप में ई 9.5 के रूप में मशीन समय सूचीबद्ध है, हालांकि हम उम्मीद करते हैं कि मोटा या घने ऊतकों के साथ इन करने के लिए पूर्ण प्रवेश को प्राप्त करने के लिए विस्तृत होगा.

विश्लेषण यहां वर्णित एक मालिकाना सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, लेकिन वैकल्पिक स्वामित्व बड़े डेटा से निपटने के लिए अनुकूलित संकुल में प्रदर्शन किया जा अनुकूलित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, इसी तरह की पाइपलाइन आसानी से अभिकलनी भाषाओं या खुले स्रोत सॉफ्टवेयर संकुल, जो एक साझा प्रोटोकॉल डेटाबेस के तेजी से विकास के लिए नेतृत्व करेंगे का उपयोग कर लागू किया जा सकता है । वैज्ञानिकों के एक वैश्विक नेटवर्क के विकास, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरण और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के लिए उपयोग के साथ, तेजी से क्षेत्र अग्रिम और अध्ययन के reproducibility में वृद्धि होगी । 17

हमारे अनुभव में, इस दृष्टिकोण के लिए प्रमुख सीमा इमेजिंग गहराई से संबंधित था, विशेष रूप से बाद में भ्रूण चरणों के लिए, और भारी सूक्ष्म सेटअप के विशेष पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया जा रहा है । इसी तरह, कैसे नमूने इमेजिंग के लिए घुड़सवार है उपयोगकर्ता की विशिष्ट आवश्यकताओं पर निर्भर करेगा । हमने पाया है कि ब्याज के निकटतम लेंस के क्षेत्र रखने इमेजिंग गहराई में सुधार और पृष्ठभूमि संकेत घटाता है, और हम बढ़ते के लिए स्तरित डबल पक्षीय टेप का उपयोग सुझाव है, क्योंकि यह उपयोगकर्ताओं को सक्षम बनाता है एक चैंबर बनाने के लिए कि उनकी विशिष्ट आवश्यकताओं फिट बैठता है । एक ग्लिसरॉल का प्रयोग-आधारित बढ़ते मीडिया के साथ एक विरोधी फीका reagent, और equilibrating नमूने बढ़ते से पहले इस मीडिया में, अत्यधिक photobleaching को दबाने की सिफारिश की है । अंत में, इस विश्लेषण में प्रयुक्त नमूने लगभग पारदर्शी हैं; उपयोगकर्ताओं को और अधिक उन्नत भ्रूण चरणों, ऊतक टुकड़े, या organoids के लिए समाशोधन चरणों को शामिल करने की आवश्यकता हो सकती है, और किसी दिए गए आवेदन के लिए सबसे अच्छा समाशोधन प्रोटोकॉल का निर्धारण अनुभवजंय परीक्षण की आवश्यकता होगी.

कार्डियक morphogenesis के मामले में, विभिन्न इमेजिंग विधियों का उपयोग किया जा सकता है । जबकि फोकल माइक्रोस्कोपी यहां प्रयोग किया जाता है, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी बहुत अच्छी तरह से गति, संकल्प, और अधिग्रहण छवि का संकेत करने के लिए शोर अनुपात की वजह से इन अध्ययनों के लिए अनुकूल है । 20 हम इस नई प्रौद्योगिकी की वृद्धि की उपलब्धता और उपयोगिता और समान इमेजिंग दृष्टिकोण की समृद्धि अग्रिम की उंमीद है । इसी तरह, फ्लोरोसेंट पत्रकारों,21 chromophores, रंजक,22 और जीवित भ्रूण संस्कृति23,24 की सतत प्रगति चार आयामों को ले जाने के इन अध्ययनों को बढ़ावा मिलेगा, समय का तत्व जोड़ने, और कैसे भ्रूण संरचनाओं के विकास के दौरान फार्म के बारे में अभी तक अधिक जानकारी उपज ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIH/NHLBI R56 HL128646 और Mindich बाल स्वास्थ्य और विकास संस्थान (MCHDI) ISMMS (जवाबतलब) द्वारा वित्त पोषित किया गया । E.B. एक NIH/NIDCR प्रशिक्षु T32 HD075735 द्वारा समर्थित है । सूक्ष्म और छवि विश्लेषण माउंट सिनाई, जो भाग में माउंट सिनाई P30 CA196521 में Tisch कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित है पर Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में माइक्रोस्कोपिक कोर पर प्रदर्शन किया गया था-कैंसर केंद्र सहायता अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt probe Roboz RS-9580
Forceps Roboz RS-8100
Fine forceps Roboz RS-5015
Dissection scissors Roboz RS-5912
Saponin Sigma Aldrich 84510
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A8022
Triton RPI A4490
Goat anti-Nkx2-5 Santa Cruz Biotech sc-8697 Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP abcam ab13970 Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1 abcam ab109517 Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4 Millipore AB5808 Used at 1:100
488 anti-chicken Jackson Immunoresearch 703-546-155 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat Thermo Fisher Scientific A21432 Used at 1:500
647 anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-606-152 Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI Sigma Aldrich D9542
n-Propyl gallate Sigma Aldrich 2370 Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides VWR Scientific 48311-703
22x22 mm coverslips VWR Scientific 48366-227
Imaris 8.4.1 Bitplane

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References

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Bardot, E., Tzavaras, N., Benson, D. L., Dubois, N. C. Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (128), e56446, doi:10.3791/56446 (2017).

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