Summary
Здесь мы описываем протокол для всей горе иммунофлюоресценции и на основе изображений количественные объемный анализ зародышей мыши ранней стадии. Мы представляем этот метод как мощный подход к качественно и количественно оценить сердечных структур во время разработки и предложить, что это может быть широко адаптируемым для других органов и систем.
Abstract
Использование изображений методов, когда-либо продвижения широко способствовала нашей углубление понимания эмбрионального развития. Развитие предимплантационной и Органогенез являются две области исследований, которые значительно выиграли от этих достижений, за высокое качество данных, которые могут быть получены непосредственно от визуализации до имплантации эмбрионов или ex vivo органов. Хотя до имплантации эмбрионов привели данные с особенно высоким пространственным разрешением, более поздних стадиях были менее поддаются трехмерной реконструкции. Получение высококачественных 3D или объемных данных для известных зародышевых структур в сочетании с судьбой сопоставления или генетические линии трассировки позволит обеспечить более всесторонний анализ морфогенетических событий, происходящих во время эмбриогенеза.
Этот протокол описывает целом гора иммунофлюоресценции подход, который позволяет для маркировки, визуализации и количественной оценки прародитель клеточных популяций в пределах развивающихся сердца Полумесяца, ключевая структура формируется во время разработки сердца. Этот подход разработан таким образом, что обе на уровне клеток и тканей информация может быть получена. С помощью конфокальной микроскопии и обработки изображений, этот протокол позволяет для трехмерной пространственной реконструкция сердца Полумесяца, обеспечивая тем самым возможность анализировать локализации и организации населения конкретных прародитель во время этот критический этап развития сердца. Важно отметить, что использование ссылка антител позволяет для последовательных маскировки сердца Полумесяца и последующих количественному определению областей в течение Полумесяца. Этот протокол позволит не только подробный анализ раннего развития сердца, но с адаптации должны быть применимы к большинства органов и систем в братскую для раннего Сомит стадии эмбриона мыши.
Introduction
Изучению органогенеза долго полагалась на наблюдении за морфогенетических события развивающегося эмбриона. Эти исследования часто полагаются на использование флуоресцентных красителей или Репортеры трассировки линии в сочетании с маркировки населения определенных ссылок. 1 путем сравнения относительных позиций этих ярлыков, информацию можно почерпнуть на происхождении, движение или конечной вклад населения интерес. Трансплантация и судьба сопоставления эксперименты использовать морфологический достопримечательности или инъекции красителей в не подвижных линий для определения отправной точкой клетки интереса, которые затем проверяются на вклад развитых эмбрионов. 2 , 3 , 4 , 5 генетические эксперименты линии трассировки используйте ту же концепцию с четко репортер аллелей, которые используются для метки клеточных популяций без экспериментальных манипуляций. Ключ для этих подходов является способность определять, с высоким пространственным разрешением, местах экспериментальных и этикетки ссылку. Эти подходы дали выдающийся прогресс в развитии предимплантационной и explant органогенеза исследований. 6 , 7 , 8 , 9
Развития событий, которые лежат в основе сердца морфогенеза были все хорошо описана в последние годы. 10 одним из главных открытий в этой области исследований является описание ряда прародитель популяций, которые можно выделить выражением уникальных маркеров. 11 эти группы населения включают первого и второго сердца поля (FHF и СВЧ), которые присутствуют в пределах сердца Полумесяца на передней стороне эмбриона на эмбриональных день (E) 8,25 мыши развития. 12 этих групп населения часто рассматриваются через сочетание микроскопия поля, который обеспечивает тканевом уровне информацию и серийный секционирование с помощью иммунофлуоресцентного анализа, который предлагает высокое разрешение сотовой но только двумерные пространственной информации. 13 таким образом, хотя эти исследования значительно расширить наше понимание развития сердца, доступные методы имеют ограниченный в глубине количественный анализ морфогенеза в ходе этих этапов, создавая необходимость подходов для изучения Организация этих групп населения на уровне всего организма.
Последние достижения в области конфокальной микроскопии и анализа 3D изображений позволяют с высоким разрешением и высокой пропускной способности алгоритмической реконструкций клеток и структур на местах с относительной легкостью, проложив тем самым путь для детального изучения комплекса клеточных структур. 14 с увеличением вычислительной мощности и развития большой-управляющий алгоритмов, как необходимо обрабатывать экспоненциальное увеличение размера визуализации наборов данных, анализ может теперь быть полностью автоматизирован. 15 автоматизированный анализ визуализации наборов данных имеет преимущество быть беспристрастной, но это только так надежна, как качество входного набора данных; Это необходимо, то, что лучшие практики используются во время приобретения и предварительной обработки изображений для обеспечения высочайшего качества, объективный анализ. 16 протоколов может быть полностью автоматизирована и общие для воспроизводимости результатов, и алгоритмы, используемые проприетарное программное обеспечение, легко доступны через библиотеки для использования учеными, которые знакомы с современной собственности или открытым исходным кодом средства разработчика. 17
Следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения такого анализа на одной четко определенной модели органогенез, формирование сердца Полумесяца во время разработки сердца. В частности, этот протокол описывает (1) урожай и вскрыть сердца Полумесяца стадии эмбриона, (2) выполняет всю гору иммунофлюоресценции для справки (Nkx2-5) и экспериментальных маркеры (Foxa2Cre:YFP18,,19), (3) подготовить и изображения эмбрионов, с помощью конфокальной микроскопии и наконец (4) анализа и количественной оценки полученные изображения, используя передовые трехмерных подходов. В то время как сердечная Полумесяца используется в качестве примера здесь, с соответствующей модификации, этот протокол может использоваться для анализа нескольких линий в братскую на ранней стадии эмбрионов Сомит.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом на Icahn школе медицины на горе Синай.
1. сбора и обработки эмбрионов стадии сердечной Полумесяца
- мат плодородные женского мышь с мужчиной плодородной стад. Вилка
- проверить на наличие вагинальный совокупления с помощью тупого зонд или щипцами. Полдень в день обнаружения вилка считается эмбриональных день (E) 0.5 (см. Рисунок 1A для полной шкалы).
Примечание: Вилки должны проверяться в первой половине дня, как они потеряли в течение дня. - Утром 8-й день (E8.25), в жертву беременных дам CO 2 ингаляции, или согласно местным и институциональные положения.
Примечание: Точные сроки могут быть штамм зависимых и должно определяться морфологии эпирически. - Спрей брюшко мыши с чистой области и свести к минимуму пролития на 70% спирте. Разоблачить внутренностей, выполняя разреза брюшной полости через кожу и тело стены.
- Найдите матки и тщательно удалить весь рога матки от животных. Начало путем разрезания выше одного маточных труб, обрезки жира от матки во время разбирательства до конца шейки матки. Вырезать через шейку матки и продолжать в верхней части других маточных труб, резка выпустить всю матку.
- Место матки в 10см блюдо с фосфатом буфер солевой раствор (PBS, рН 7,4) чтобы смыть излишки крови. Югу вскрыть матки путем разрезания mesometrium между каждой deciduum, который содержит эмбрионов. Трансфер эмбрионов в 6 см блюдо со свежими PBS.
- Под микроскопом, рассечение, используйте тонкой щипцы (#5) для удаления матки ткани от децидуальной ткани.
- С помощью щипцов, тщательно срез кончик эмбриональных половины deciduum раскрыть эмбриона. Щепотка deciduum вытолкнуть эмбриона и осторожно вытащите эмбриона.
- Вскрыть прочь extraembryonic тканей насколько это возможно без повреждения морфология эмбриона ( рис. 1B).
- Использовать пипетку передачи для эмбрионов в 1,5 мл тюбик с свежим PBS и место на льду. Повторите 1,7-1,9 для оставшихся эмбрионов перед продолжением.
- Аспирата PBS и полоскания с PBS. Аспирационная PBS.
Примечание: Попробуйте удалить столько PBS как можно без повреждения или сушки эмбрионов. Ручное удаление решений рекомендуется на все шаги во избежание потери эмбрионов.
Параформальдегида (PFA) - исправить эмбрионов с 4% в PBS для 1 h на RT.
Примечание: Эмбрионов может быть исправлено на ночь (O/N) на 4 ° C. - Полоскать три раза с PBS. Держите эмбрионов при температуре 4 ° C до готовности приступить к иммунофлюоресценции.
Примечание: Точка паузы. Эмбрионы могут безопасно храниться в PBS на 4 ° C в течение нескольких недель.
2. Иммунофлюоресценции окрашивания
Примечание: инкубационных условий ниже могут быть изменены для размещения различных графиков. Рекомендуется использовать мягкий сотрясение или качалка для всех шагов длительный инкубационный.
- Удалить PBS и добавьте 1 mL блокировки буфера (сапонин 0,5%, 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS).
- Инкубировать по крайней мере 4 h на RT. Это также может быть сделано O/N на 4 ° C.
- Удалить блокирующий буфер и добавьте основное антитело смесь разбавляют в блокирующем буфере. Инкубировать O/N при 4 ° C.
Примечание: Смотрите материалы секции для описания антител используемых и предложил разведениях. Антитело разведений должна определяться эмпирически. Использование Nkx2-5 как ссылка пятно для сердца Полумесяца рекомендуется и является ключом к течению изображение сегментации и анализа шаги. - Удаление первичного антитела путем аспирации.
- Мыть 3 раза за 1 час с 0.1% Тритон в PBS.
- Удалить мыть и добавить вторичные антитела смесь разбавляют в блокировки буфера. Инкубируйте 3 h на RT. Это также может быть сделано O/N на 4 ° C.
- Мыть 3 раза за 1 час с 0.1% Тритон в PBS. Это также может быть сделано O/N на 4 ° C.
- Изображение с 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в PBS на 10 мин
Примечание: Это изображение может выполняться одновременно с вторичное антитело. - Мытье 2 раза по 5 минут с 0.1% Тритон в PBS.
- Медленно приостановить эмбрионов в средствах массовой информации против затухания монтажа (2% w/v н пропиловый галлат (НПГ), 90% глицерина, 1 x PBS; Смотрите раздел материалы для получения более подробной информации). Позволяет сбалансировать по крайней мере 1 час перед монтажом. Осторожно проведите трубки периодически, чтобы помочь эмбрионов падение в раствор анти затухания.
Примечание: Точка паузы. Эмбрионы могут храниться в течение нескольких дней в растворе анти исчезать до готовности к горе и изображения.
3. Монтаж эмбрионов для микроскопии
- подготовить Микроскоп слайды для монтажа с помощью двойной антипригарные ленты или силиконовые прокладки. При использовании двойной антипригарные ленты, сделайте две параллельные стеки 5-6 слоев около 15-20 мм друг от друга. Это будет оставить достаточно места, чтобы разместить эмбрионы и зафиксируйте coverslip ( рис. 1 c).
- Место 15 мкл капля анти затухания на слайде, между двойной антипригарные ленты. Тщательно передачи одного эмбриона на слайд.
Примечание: более одного эмбриона могут быть размещены на слайде. Однако, последующие ориентации шаги являются более сложными, с несколько эмбрионов, и долго изображений длительности может привести к фото отбеливания. - Под микроскопом рассечение, с помощью тонкой щипцы, положение эмбриона, таким образом, чтобы передняя сторона лица от слайда с оси тела в соответствии с длинной оси слайда. Смотрите Рисунок 1 c схема монтажа установки.
- Тщательно место coverslip над образца, положив одну сторону на один стек двойной антипригарные ленты и аккуратно опустите coverslip до тех пор, пока его контакты другие ленты с помощью щипцов.
Примечание: Шаги 3.3 и 3.4 имеют решающее значение для обеспечения правильной ориентации эмбриона для изображений. Снижая coverslip вдоль задней к передней направлении, эмбрион должен не ролл и сердечной Полумесяца региона будет оставаться ориентированной от слайд, который идеально подходит для изображений на инвертированным микроскопом. - Использовать пипетку для добавления дополнительных анти затухания между слайд и coverslip сохранить образец от вымирает во время хранения/обработки изображений.
4. Конфокальная томография
- получить изображения с помощью высоких увеличение цель, которая позволяет для всей сердечной Полумесяца региона быть захвачен в одном поле зрения. Для определения x-y-z voxel размеры используется частота Найквиста. Большинство производителей Микроскоп будет иметь " оптимизировать " кнопку для обеспечения выборки Найквиста.
Примечание: Пятнать для Nkx2-5 выгодно здесь, как он будет разграничить всего сердца Полумесяца региона. Меньшие размеры Z-шаг (передискретизацией) даст лучше трёхмерного моделирования результаты, но может привести к расширенной приобретение раз и/или отбеливания для некоторых образцов. - Настройка параметров с помощью стандартной практики наиболее тепловизионных изображений. А именно, используйте низкие возможности лазерной интенсивности для достижения хорошее соотношение сигнал шум для каждого Флюорофор и выбрать усиление и смещение уровни, которые дают широкий динамический диапазон без насыщения сигнал.
Примечание: Согласовываться с визуализации параметров между образцами, которые будут сравниваться непосредственно. Это особенно важно для вниз по течению 3D анализа и количественной оценки.
5. Анализ и количественная 3D моделирования изображений
Примечание: Для этого протокола изображения были проанализированы с использованием программного пакета Imaris. Аналогичный анализ может быть возможным с помощью альтернативных пакетов. Ниже описание охватывает анализ трубопровод для опорного канала (т.е. Nkx2-5) и один экспериментальный канал (т.е. рекламы ЯФП). Дополнительные каналы могут быть проанализированы через повторение этих шагов. Пример набора данных была предоставлена, может использоваться для репликации приводимый ниже анализ.
- Загрузить наборы данных raw изображений в Imaris Арена представление и открыть файл для желаемого эмбриона в режиме Surpass. Данные следует загрузить в 3D в MIP (Макс) режиме. Открыть окно настройки отображения и выбрать только канал ссылку.
- Отрегулировать порог изображения, если это необходимо для лучшей визуализации. Для этого анализа, гаммы если отношение сигнал шум является слишком низким для сегментации.
Примечание: Если выполнение гамма исправлений, которые являются нелинейные корректировки, скорректированного изображения не может использоваться для измерения интенсивности или сравнений. На этом этапе можно выполнить дальнейшие предварительной обработки изображений (т.е. освещение исправления, Гауссово размывание или других фильтрации), если ваше отношение сигнал шум не является удовлетворительным. Если вы решите сделать предварительную обработку, необходимо выполнить те же шаги предварительной обработки для всех изображений в вашем наборе. - Создать новую поверхность для опорного канала с помощью диалога поверхности алгоритм.
- Выберите " сегмент только региона интерес " флажок.
- Настроить область ограничивающего прямоугольника таким образом, чтобы он содержит области интереса (ROI, т.е. области сердца Полумесяца), как определенная ссылка пятно.
- Выберите канал ссылки в раскрывающемся меню Источник. Значение по умолчанию для сглаживания (равен размеру voxel z) обычно достаточно, но может потребовать эмпирического оптимизации. Для этого анализа, используйте сглаживания равен половине z voxel размера.
- Выполнять Бинаризация с абсолютной интенсивности. Чтобы убедиться, что поверхность не распространяется за пределы сигнала канала, отрегулируйте нижнего предела с использованием ползунков.
Примечание: Для некоторых изображений, где клетки могут быть определены легко, можно включить " Сплит трогательно объектов " алгоритм, отделить сигнал от фона. - Фильтр объектов voxel количество или объем и отклонить фон (мелкие или в районах за пределами области Nkx2-5) объектов, которые алгоритм может вызвали. Закончить алгоритм.
- С помощью вновь созданного поверхности, создайте замаскированный канал для экспериментального канала.
- С поверхность выбран, выберите " маска Sel... ͟ " функции из окна редактирования.
- Выберите экспериментальный канал интереса (то есть рекламы ЯФП). Убедитесь, что " дублировать канал перед нанесением маски " флажок.
- Окно, в настройку экрана выберите только масках канал. Создать новую поверхность, масках каналов, следуя шаги 5.3-5.3.5.
Примечание: На данном этапе это может быть полезно для настройки внешнего вида каждого маски для облегчения визуализации 3D-модели: выберите каждой поверхности и выберите цвет закладку Настройка основного цвета и прозрачности при необходимости. Поверхности цвета слияние не когда перекрываются. - Для получения объемных данных, с каждой поверхностью выбранные выберите вкладку Статистика. В " подробный " югу вкладку, выберите " средние значения " из раскрывающегося меню. Общий объем поверхности можно найти в столбце сумма сгенерированной таблице.
Примечание: Если сгенерированный поверхность содержит ошибочные фрагменты (то есть фрагменты, которые от фонового сигнала не исключаются при сегментации или районах разрывные от главной поверхности), это может быть необходимо рассчитать общий объем вручную, или фильтр поверхности объем или количество вокселей и убедитесь, что в расчет включаются только сигнал сегментов. Объем для каждой части поверхности можно найти, выбрав " все значения " из раскрывающегося меню. При выборе каждого значения будет сделать появится желтый, которая помогает в определении значения исключить соответствующий регион.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Качество конечных данных и анализа сильно зависит от (1 целостность и морфология расчлененных эмбрионов, (2) использование высокой специфичности антител, и (3) о правильной настройке параметров визуализации. Поврежденные эмбрионов посрамить процесс генерации поверхности и препятствовать количественного анализа. На рисунке 2Bприведены примеры правильно расчлененных и поставил эмбрионов. Эмбрионы могут далее расчлененный, удалив желточного мешка, к которому антитела будут часто неспецифически связывают. Однако удаление желточного мешка сделает эмбрионов менее надежные, поэтому следует соблюдать осторожность при обработке вниз по течению.
Сочетание высокого качества антител и правильной визуализации параметров имеют решающее значение для достижения высокое соотношение сигнал шум изображения. Рисунок 2A показывает пример изображения с использованием антител против Nkx2-5 как маркер ссылки метку сердца Полумесяца и GFP метку линии трассируется населения интерес (Foxa2Cre:YFP желудочков сердечно-прародитель клетки) (см. Дополнительные данные для файлов raw изображений и данных). 19 эта стратегия позволяет для сравнения данного населения с всего сердца Полумесяца региона. Для некоторых экспериментов он может быть интерес для изучения FHF и СВЧ поддомены сердца Полумесяца. В этом случае FHF и СВЧ могут быть помечены с Hcn4 и Islet1, соответственно (см. ссылку19 для изображений и количественного анализа с комбинации этих антител). С соответствующие установки и вторичные антитела комбинации мы успешно образы и проанализированы три линий одновременно (т.е. сердца Полумесяца, рекламы ЯФП и первый или второй ВЧ).
Неспособность обеспечить сильный сигнал будет также ограничивать способность генерировать 3D модели высокого доверия, как он станет трудно удалить фон сигнала от окончательного поверхностей. В этих случаях следует позаботиться при корректировке гамма (во время предварительной обработки, Рисунок 2B, 2 C, 2Н, 2О) или поверхности Бинаризация (во время поверхности поколения алгоритм, Рисунок 2 g, 2 H, 2 Л ) и аналогичные параметры должны использоваться для всех изображений в качестве эксперимента. Неспособность сделать это приведет к несогласованности объемных данных, было бы нецелесообразно использовать для прямого сравнения. Часто ошибочные поверхности результате фонового сигнала могут быть удалены путем фильтрации (Рисунок 2I, 2J), хотя делать это от высоких фоновых изображений будет трудно без потери истинной поверхности фрагментов также размер.
Рисунок 1: экспериментальный сроки и схемы. (A) весь эксперимент, от спаривания для анализа данных, может осуществляться в течение примерно двух недель. Эмбрионы собираются в утром 8th день пост совокупления (E8.25) для сердца Полумесяца стадии анализа (B). После того, как фиксированной, эмбрионы заблокирован и витражи с первичных и вторичных антител до монтажа. Эмбрионы монтируются с стандартным микроскопии слайды и coverslips, с помощью двухсторонней ленты как заполнитель (C). Эмбрионы помещаются в капле анти затухания в отображаемых ориентации (C, верхняя) и coverslip медленно опустил на ленту (C, ниже). Для создания изображений с высоким разрешением z стека (D) выполняются конфокальная томография и анализа изображений и 3D поверхности модели (E). ВЧ, глава раза; CC, сердечной Полумесяца; A, передней; P, задняя; AF, анти затухания. Масштаб гистограммы являются 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: обработка ступенчатой конфокальный изображений и 3D поверхности поколения. (A) конфокальный z серии загружаются в представлении тома. Опорного канала (Nkx2-5) является выбранный (B) и интенсивности и отрегулировать гамма (C) перед началом алгоритм создания поверхностей. После регионе интересов отдельных (D) и уровень детализации поверхности выбирается (E). Первоначальный поверхности (F) показатели включают все верно сигнал на поверхности (G). Для удаления мелких фона фрагментов (H) для получения окончательного опорная поверхность (я) затем выполняется фильтрация. Выбрав ссылку поверхности (J), сравнение канал (рекламы ЯФП) может быть повторен и масках (K). Интенсивность и гамма для этого канала, затем скорректирована (L) перед созданием второго поверхность через ту же последовательность шагов (M, N). Общий объем для каждой поверхности рассчитывается автоматически и можно сравнить, как количественно, так и визуально (O, обратите внимание, что поверхности цвета слияние не когда перекрываются). Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол выше описывает стратегию для получения количественных данных изображения высокого качества вся гора иммунофлюоресценции мыши после имплантации эмбрионов. Когда выполняется правильно, 3D объемного данные, полученные через эти шаги можно использовать для сравнительного и межсекторальный анализ нескольких доменов внутри эмбриона. Поверхности сигнал, маскируя описанный подход является особенно полезными при расследовании Роман клеточных популяций по сравнению с устоявшейся ссылаются на структуры.
Мы считаем, что такой подход предоставляет преимущество над существующих подходов. Вся гора иммунофлюоресценции с-поля изображений может предложить тканевом уровне информации, но не хватает сотовой резолюции. И наоборот иммунофлюоресценции последовательных секций может дать подробные сотовый уровне резолюции, хотя эти данные не хватает трехмерной преимущество всю гору изображений. В то время как трехмерное конфокальное изображений устраняет эти недостатки, несколько пользователей воспользоваться количественного потенциала этих данных, и мы надеемся, что наш протокол позволит больше исследователей в полной мере воспользоваться данных, которые они собирают.
Здесь этот подход был примером с помощью маркера Nkx2-5 разграничить сердца Полумесяца и проверить наличие Foxa2Cre:YFP проследить происхождение клеток внутри этого домена. Однако благодаря способности по крайней мере трех линий одновременно и данные три измерения высокое разрешение изображений, этот протокол вероятно будет полезно для исследователей во многих областях. Мы предлагаем, что этот подход может быть применен к нескольким эмбриональных стадий, органов и систем и линий через незначительные корректировки в протокол, основанный на конкретных потребностей системы. По нашему опыту этот Протокол применяется непосредственно к ряду эмбриональных возрастов (E6.5-E9.5 минимум) с ограниченным адаптации. 19 мы не сталкивались вопросы с проницаемостью или антитела проникновения в эмбрионов, как большой, как E9.5 с инкубации раз в списке, хотя мы ожидаем, что с толще и плотнее тканей эти придется быть удлиненные для достижения полного проникновения.
Анализ описанных здесь была выполнена с использованием патентованного программного обеспечения пакета, но могут быть адаптированы к быть выполнены в альтернативных собственнические пакеты, оптимизированный для обработки больших данных. Кроме того аналогичные трубопроводов может быть легко реализован с использованием вычислительных языков или пакеты открытым исходным кодом программного обеспечения, которые приведут к быстрому развитию совместного использования протоколов базы данных. Рост глобальной сети ученых, с доступом к свободно доступных инструментов и протоколов для захвата изображений и анализ, быстро заранее области и увеличить воспроизводимости исследований. 17
По нашему опыту Главное ограничение этого подхода было связано с изображения глубины, особенно для позднее эмбриональных стадий и во многом будет зависеть от специфики микроскопии установки используется. Точно так же как образцы устанавливаются для изображений будет зависеть от конкретных потребностей пользователя. Мы нашли что размещение региона интерес ближе к объективу улучшает изображения глубина уменьшается фонового сигнала, и мы предлагаем использовать слоистых двухсторонний скотч для монтажа, поскольку он позволяет пользователям создавать камеры, который соответствует их конкретным потребностям. Использование на основе глицерина монтаж СМИ с реактивом анти увядают и equilibrating образцы в этом СМИ перед установкой, рекомендуется для подавления Фотообесцвечивание. Наконец образцы, используемые в настоящем анализе почти прозрачной; пользователям может потребоваться включить расчистки шаги для более продвинутых эмбриональных стадий, фрагменты тканей или organoids, и определение лучших информационного протокола для данного приложения потребует эмпирического тестирования.
В случае сердечными морфогенеза могут использоваться различные методы обработки изображений. Хотя здесь используется конфокальная микроскопия, свет лист микроскопии очень хорошо подходит для этих исследований из-за скорости, резолюции и соотношение сигнал шум приобретенные изображения. 20 мы ожидаем увеличение доступности этой новой технологии для дальнейшего продвижения утилиты и богатство аналогичных изображений подходов. Аналогичным образом, непрерывное улучшение флуоресцентные Репортеры,21 хромофоры, красителей,22 и живой зародыш культуры23,24 приведет к эти исследования переезда в четырех измерениях, добавив элемент времени, и приносит еще больше информации о том, как эмбриональные структуры формы во время разработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH/NHLBI R56 HL128646 и Mindich детского здоровья и развития института (MCHDI) в ISMMS (для н.д.). Е.б. поддерживается HD075735 T32 стажировки NIH/NIDCR. Сердцевина микроскопии в школе медицины Icahn на горе Синай, который частично поддерживается в Tisch институт рака в Маунт Синай Р30 CA196521 – Рак центр поддержки Грант был проведен анализ микроскопии и изображения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22x22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
