Summary
Questo protocollo descrive un metodo semplice per la registrazione simultanea di co-localizzato l'elettroencefalografia (EEG) e multi-laminare locale campo potenziale in un ratto anestetizzato. Un foro della bava nel cranio per l'inserimento di un microelettrodo è indicato per produrre distorsione trascurabile del segnale EEG.
Abstract
Sebbene l'elettroencefalografia (EEG) è ampiamente usato come una tecnica non invasiva per la registrazione di attività neurale del cervello, la nostra comprensione della neurogenesi di EEG è ancora molto limitata. Potenziali di campo locale (LFPs) registrati tramite un microelettrodo precomposto in grado di fornire un resoconto più dettagliato dell'attività neurale simultanea attraverso diversi strati corticali nella neocorteccia, ma la tecnica è dilagante. Combinando misurazioni EEG e LFP in un modello preclinico può notevolmente migliorare la comprensione dei meccanismi neurali coinvolti nella generazione dei segnali EEG e facilitare la derivazione di un modello matematico più realistico e biologicamente accurata di EEG. Una procedura semplice per l'acquisizione di EEG simultanee e co-localizzati e precomposto LFP segnali nel roditore anestetizzato è presentata qui. Inoltre abbiamo studiato se i segnali EEG sono stati influenzati significativamente da un foro della bava nel cranio per l'inserimento di un microelettrodo. I nostri risultati indicano che il foro della bava ha un impatto trascurabile sulle registrazioni di EEG.
Introduction
È generalmente accettato che LFPs registrato tramite microelettrodi principalmente riflettono la somma ponderata dei sincronizzato attività sinaptica eccitatoria e inibitoria di popolazioni neurali piramidale locali1,2,3 , 4. la nostra recente ricerca ha dimostrato che il profilo del segnale LFP potrebbe essere suddiviso in componenti di eccitazione ed inibizione5,6. Tuttavia, come LFP è normalmente misurato tramite una procedura invasiva, non è adatto per la maggior parte degli studi del cervello umano.
D'altra parte, l'EEG è una tecnica non invasiva per misurare l'attività elettrica del cervello. È ampiamente usato come uno strumento diagnostico per alcuni tipi di malattie neurologiche come l'epilessia e come strumento di ricerca in studi cognitivi umani. Nonostante la sua popolarità, una limitazione importante di EEG è l'incapacità di interpretare i suoi profili temporali proprio in termini di segnali neurali sottostanti7,8,9.
Sempre più, modelli matematici di EEG sono stati sviluppati per migliorare la comprensione del cervello funzione10,11,12,13,14,15. La maggior parte dei modelli esistenti di EEG sono sviluppata basata su montaggio caratteristiche del dominio di frequenza del modello preveduto uscita allo spettro di dati EEG durante attività spontanea, e pochissimi modelli di EEG possono generare potenziali evocati sensitivi realistici. In questo contesto, registrazioni simultanee di EEG e LFP fornirà importanti informazioni e vincoli per lo sviluppo di modelli matematici più accurata del EEG.
Per soddisfare questa esigenza per registrazioni simultanee di esplorare ulteriormente l'origine neurale di EEG, abbiamo sviluppato una metodologia per registrare simultaneamente EEG e precomposto LFP segnali nella neocorteccia di ratto anestetizzato. L'installazione è simile al precedente simultanee EEG/LFP studi condotti in primati16,17. Abbiamo studiato ulteriormente l'effetto di un foro della bava trapanato il cranio su registrazioni di EEG che circonda il buco, confrontando bilaterale registrazioni di EEG (cioè, un emisfero con un foro della bava, l'altro emisfero intatto) in assenza di sensoriale stimolazione. I nostri risultati dimostrano che le registrazioni simultanee di EEG/LFP possono essere condotta semplice ed efficace, con poca distorsione del segnale EEG dal foro della bava nel cranio.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con i regolamenti del British Home Office (animali (procedure scientifiche) Act, 1986) e approvati dal comitato etico di ricerca presso l'Università di Reading, Regno Unito.
1. animale preparazione
Nota: Femmina Lister Hooded ratti sono stati usati per tutti gli esperimenti. Si tratta di una procedura non-sopravvivenza.
- Registrare il peso del ratto su scala di laboratorio.
- Anestetizzare il ratto in una camera con isoflurano 5% e un tasso di flusso di ossigeno di 1 L/min.
- Posto il ratto su un supporto stereotassica con un tovagliolo di carta sotto il suo corpo e con i suoi denti che riposa tramite la barra di morso... Il tovagliolo di carta facilita l'inserimento di un pad termico (Vedi punto 2.3) e prendere eventuali escrementi dal ratto durante l'esperimento.
- Amministrare isoflurano continuamente tramite un cono di naso di plastica dura montato sul morsetto naso per adattatore di ratto ad una concentrazione del 3% con un tasso di flusso di ossigeno di 0,5 L/min. Connetti il cono ad un sistema di anestetico di piccolo animale isoflurano.
2. intervento chirurgico
- Inserire un rilievo di riscaldamento termostatico sotto il tovagliolo di carta su cui è appoggiato il ratto, proteggere la testa del ratto con due barre di orecchio e monitorare la temperatura corporea utilizzando un termometro rettale.
- Radere la parte superiore della testa del ratto.
- Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la secchezza della cornea.
- Prima di esporre il cranio, applicare gocce di lidocaina al cuoio capelluto e massaggiare delicatamente sulla pelle.
- Fare un'incisione mediana di circa 2-3 cm sul cuoio capelluto utilizzando un bisturi per esporre la superficie del cranio.
- Separare con cura il temporalis muscolo controlaterale al pad whisker essere stimolato dal cranio utilizzando uno Jacquette Scaler e un paio di forcipe di dissezione seghettato e curvo. Pulire il cranio con tamponi di cotone ogniqualvolta sia necessario.
- Utilizzando una seta intrecciato, sutura non assorbibile, legare il muscolo separato per il cuoio capelluto con un nodo stretto e poi legare la sutura saldamente al telaio stereotassiche18.
- Utilizzare coordinate stereotassiche per individuare la corteccia barile, 2,5 mm caudale al bregma e 6 mm laterale alla linea mediana19. Disegnare un punto nella posizione della corteccia somatosensoriale usando una matita o un pennarello.
-
Praticare un foro della bava nella posizione contrassegnata utilizzando un trapano odontoiatrico. Per impedire il surriscaldamento durante la perforazione di cranio, applicare una soluzione salina sterile (sodio cloruro 0,9%) all'area di lavoro ogni 10-15 s. Il processo di perforazione comporta i seguenti 3 passi:
- Un foro di diametro < 2 mm nel cranio con una punta #4 (0.055 di diametro). Fare attenzione a non per forare la dura madre.
- Sottile il fondo del foro di traslucidità utilizzando un trapano con n. 1/4 (0,019 di diametro).
- Utilizzare un ago da 27 G di perforare il dura per consentire l'inserimento di un microelettrodo.
- Trasferire il ratto, fissato su un telaio stereotassica, una gabbia di Faraday montato sulla cima di una workstation di isolamento delle vibrazioni.
- Collegare un morsetto del sensore ossimetro collegato a un'unità di controllo di Ossimetro da zampa posteriore del ratto per monitorare continuamente i seguenti parametri fisiologici: frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, saturazione arteriosa di ossigeno, distensione di impulso e la distensione del respiro. Questi parametri sono stati continuamente visualizzati sul monitor di un PC, che riflette la condizione fisiologica e la profondità anestetica del ratto.
- Sostituire il cono di naso di plastica dura per la somministrazione di isoflurano e il morsetto di naso per adattatore di ratto con un attimo di respiro microflex con un cono di naso morbido trasparente che è modificato (Figura 1A) per consentire la stimolazione whisker facile da parte del baffo cuscinetto senza compromettere la somministrazione di isoflurano.
- Inserire due elettrodi stimolanti in acciaio inox al pad whisker esposti dal cut-out sul cono di naso.
- Collegare gli elettrodi stimolanti per uno stimolatore di corrente isolato.
- Sollevare la pelle della linea mediana del collo con il forcipe e fare un 1 ~ incisione di 2 cm con le forbici pronte per il posizionamento degli elettrodi di riferimento. Fare attenzione a non per tagliare il tessuto muscolare.
3. co-localizzati EEG/LFP Setup
- Pulire e asciugare il teschio che circonda il foro della bava con un batuffolo di cotone.
- Posizionare con cura la pasta conduttiva di EEG su un lato piatto di un elettrodo di ragno di EEG. Lasciare un piccolo foro chiaro della pasta EEG sull'elettrodo per consentire un microelettrodo precomposto passare attraverso il foro senza contatto con la pasta e l'elettrodo di ragno ragno. Questo impedisce il contatto elettrico fra l'elettrodo di EEG e il microelettrodo.
- Allineare l'elettrodo di ragno per il foro della bava nel cranio, con la pasta di EEG rivolto verso il cranio.
- Premere delicatamente l'elettrodo di ragno sul cranio, rendendo costante contatto con il cranio attraverso la pasta di EEG. Rimuovere qualsiasi pasta oscurando il foro della bava utilizzando un ago di una siringa.
- Rimuovere la pasta eccessiva di EEG oltre la periferia dell'elettrodo ragno affinché il contatto tra l'elettrodo di ragno e il cranio è spazialmente vincolato alla dimensione dell'elettrodo (Figura 1B).
Figura 1: impostazioni generali per la registrazione simultanea di EEG/LFP. (A), il programma di installazione è costituito da un cono di naso modificato per facilità di stimolazione pad whisker sotto anestesia isoflurano, due elettrodi stimolanti inseriti il whisker pad, un elettrodo di ragno posizionato sul cranio sopra il barilotto corteccia controlaterale per gli elettrodi di stimolazione, un multi-canale microelettrodo inserito nella corteccia barile attraverso l'elettrodo di ragno e gli elettrodi di riferimento posizionata all'interno di un'incisione sul retro collo del ratto. (B) una vista attraverso il microscopio dell'elettrodo ragno saldamente posizionato sul cranio di pasta di EEG. Il microelettrodo è inserito in un foro della bava trapanato il cranio sotto l'elettrodo di ragno. Il cuoio capelluto è trattenuto dal filo chirurgico (sutura) legato alla cornice stereotassica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Striscio pasta EEG sull'elettrodo di riferimento per l'EEG e posizionarlo in modo sicuro all'interno l'incisione sul retro collo del ratto.
- Collegare gli elettrodi EEG al preamplificatore tramite uno splitter di segnale passivo per segnali a bassa impedenza (Figura 2). Assicurarsi che l'impedenza dell'elettrodo ragno è inferiore a 5 kΩ. Se non lo è, controllare che la pasta di EEG è in buon contatto con il cranio e l'elettrodo è saldamente premuto alla pasta di EEG. Se necessario, aggiungere più pasta di EEG.
- Montare un braccio micromanipolatore sul telaio stereotassica. Collegare un microelettrodo lineare di 16 canali (100 µm spaziatura, zona di ogni sito 177 µm2) un headstage acuta 16 canali ritagliato in modo sicuro sul braccio di un micromanipolatore.
- Striscio EEG incollando gli elettrodi di riferimento per l'EEG e microelettrodo, poi metterli in modo sicuro all'interno l'incisione (Figura 1A).
- Regolare l'angolazione del braccio micromanipolatore affinché il microelettrodo è perpendicolare alla superficie corticale. Questo angolo è normalmente compresa tra 25-35 °.
- Abbassare il microelettrodo sotto un microscopio ruotando le manopole micromanipolatore, in modo che la punta del microelettrodo è puntata sulla piccola apertura nella parte inferiore del foro della bava fino a quando l'elettrodo superiore appena penetra la superficie corticale. Cura deve essere presa per evitare di costringere il microelettrodo sulla superficie del dura come questo spezzerebbe l'elettrodo.
- Coppia il microelettrodo di 16 canali a un preamplificatore collegato a un'unità di acquisizione dati tramite un cavo in fibra ottica (Figura 2).
- Accendere il computer collegato all'unità, l'unità di acquisizione dati e il preamplificatore. Attivare la casella di stimolatore.
- Inserire il microelettrodo normalmente alla superficie corticale girando lentamente la manopola di z-asse del micromanipolatore ad una profondità di 1.500 µm20.
- Micro-regolare la profondità applicando un treno di stimolo al pad whisker e osservando la LFP evocate 16 canali sul monitor di un PC utilizzando il software dell'unità di acquisizione dati installato sul PC. Con attenzione ruotare la manopola di asse z sul micromanipolatore finché non si verifica l'ampiezza più alta la LFP evocati nei dintorni di canale 7 (come questo coincide con strato IV della corteccia).
Nota: L'installazione di elettrodi EEG Ipsi-laterale: per alcuni esperimenti, un secondo elettrodo di ragno è stato disposto sul lato ipsi-laterale del cranio intatto sopra la corteccia di canna. Questa configurazione ha permesso bilaterale EEG registrazione durante lo stato di riposo studiare l'effetto del foro della bava sul segnale EEG.
Nota: La procedura chirurgica per impostare l'elettrodo EEG è identica a quello descritto sopra, tranne che durante il passo 2.6, il muscolo di temporalis su ciascun lato della testa è stato separato dal cranio, suturato indietro e legato saldamente al lato corrispondente del la cornice stereotassica.
Nota: L'installazione simultanea di EEG/LFP è anche identico a quello descritto sopra, con un ulteriore passaggio che un secondo elettrodo di ragno è caricato con la pasta di EEG, poi premuto saldamente al cranio sopra la corteccia barile ipsi-laterale.
Figura 2. Un diagramma di flusso del segnale. Il ratto è posizionato all'interno di una gabbia di Faraday. Gli elettrodi di stimolazione ricevano comandi dalla casella stimolatore controllata dall'unità di acquisizione dati attraverso il suo software installato su un PC. Il segnale neurale registrato dal microelettrodo è trasmesso ad un pre-amplificatore all'interno della gabbia di Faraday. Per il pre-amplificatore attraverso uno splitter di segnale viene trasmesso il segnale neurale registrato dalla sonda di EEG. Il pre-amplificatore è collegato all'unità di acquisizione dati all'esterno della gabbia di Faraday tramite un cavo in fibra ottica. I dati neurali sono quindi memorizzati su un'unità locale sul PC, mentre possono anche essere visualizzati su un monitor di PC. Un sistema mobile piccolo animale isoflurano amministra isoflurano all'esterno della gabbia di Faraday. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. elettrostimolazione e registrazioni neurale
Nota: La frequenza di campionamento per tutti i dati neurali è 24,41 kHz con risoluzione a 16 bit. Una versione di prova è costituito da una singola stimolazione elettrica all'inizio della prova. Ogni prova dura 10 s, che è anche l'intervallo Inter-stimolo (ISI). Ogni stimolo è un impulso quadrato corrente di 1,2 mA durata 0,3 ms per bilaterali esperimenti per studiare l'effetto del foro della bava, continuo stato di 250 di riposo s è anche registrato.
- Aprire il software di registrazione sul computer in uso.
- Caricare il circuito corretto per l'esperimento selezionando 'Carico Project...' dal menu a tendina di 'OpenProject'. (Figura 3) verrà visualizzata una nuova finestra ('WorkBench').
Figura 3. Un display del software GUI per l'unità di acquisizione dati Permette il circuito appropriato per essere caricato, parametri di stimolazione da impostare e dei dati registrati e visualizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Creare una nuova directory (chiamata un 'serbatoio' dal software) per archiviare le registrazioni neurale.
- Fare clic su 'File' dalla parte superiore della finestra e selezionare 'Data Task Management'. Apparirà una nuova finestra ('gestione del serbatoio').
- Nella finestra 'Gestione del serbatoio', premere il tasto destro del mouse per visualizzare un menu. Selezionare 'Crea nuovo serbatoio'. Verrà visualizzata la finestra di un'altra nuova finestra ('creare dati serbatoio').
- Nella finestra 'Creare dati Tank', selezionare il percorso dove si prevede di creare una nuova directory di dati e immettere il nome della nuova directory. Quindi premere 'OK'. Questa finestra scomparirà.
- La nuova directory verrà visualizzato nella finestra 'Gestione del serbatoio' ma in grigio. Registrare questa directory facendo clic destro su di esso e selezionare 'Registro Tank' dal menu a discesa. Una stella rossa e una freccia verde verrà visualizzata a sinistra del nome della nuova directory che è ora in nero (Figura 4).
- Annullare la registrazione di qualsiasi directory precedente non è in uso facendo clic destro nella finestra 'Gestione del serbatoio' e selezionare 'Aggiorna elenco serbatoio' nel menu a discesa.
- Fare clic su 'OK' per chiudere la finestra di 'Gestione del serbatoio'.
Figura 4: un display del software GUI mostrando una directory di dati registrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Registrare la nuova directory in 'Scope' per visualizzare segnali neurali durante l'esperimento.
- Fare clic sull'icona 'Scope' nella finestra 'OpenProject'. Apparirà una nuova finestra ('Scope').
- Fare clic destro del mouse nella finestra 'Scope' e selezionare 'Aggiorna elenco serbatoio' nel menu a discesa. Il nuovo nome della directory verrà visualizzati in grigio.
- Fare clic su nuova directory. Una stella rossa e una freccia verde verrà visualizzata a sinistra del nome della nuova directory che è ora in nero.
- Impostare i parametri per l'acquisizione dati sperimentali nella finestra 'WorkBench' cliccando su 'Setup' dalla parte superiore della finestra. Apparirà una nuova finestra. Selezionare 'Sweep ciclo', impostare la lunghezza del processo e il numero di prove per essere registrato.
- Verificare che la casella di stimolatore è acceso.
- Premere il tasto 'Record' nella finestra 'WorkBench'. Apparirà una nuova finestra. Immettere il nome del file di dati si desidera salvare per la sperimentale eseguire ma non colpita il pulsante di ritorno in questa fase, come la necessità di parametri di registrazione EEG da istituire.
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Impostare i parametri di registrazione EEG utilizzando l'interfaccia utente grafica (GUI) del pre-amplificatore. Toccare lo schermo (ovunque) del preamplificatore per attivare lo schermo. Selezionare 'Unlock' per sbloccare il display (Figura 5).
- Premere l'icona a sinistra nella 2: EEG' pannello. Apparirà un nuovo display.
- Premere 'Accoppiamento' e selezionare 'AC'.
- Premere 'Ref Mode' e selezionare 'Local'.
- Premere 'Tasso di Samp' e selezionare 25 KHz'.
- Premere 'OK' per tornare alla visualizzazione originale.
Figura 5: The GUI sul preamplificatore. Esso consente di EEG registrazione parametri (ad esempio, la frequenza di campionamento e riferimento preferenza) da impostare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Verificare l'impedenza dell'EEG/delle sonde premendo l'icona centrale nella 2: EEG' pannello. Se troppo alto, è possibile aggiungere ulteriori EEG pasta alla sonda. Premere 'OK' per tornare alla visualizzazione originale.
- Aspetta 20 s per evitare di registrare la fluttuazione iniziale delle registrazioni EEG.
- Tornare al monitor del PC (dopo l'attesa di s 20) e premere il tasto 'Invio' sulla tastiera. L'EEG e i segnali LFP saranno registrati.
5. analisi dei dati
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Pre-elaborare i segnali LFP ed EEG evocati su una base di prova-di-prova attenendosi alla seguente procedura.
- Spostare indietro i dati neurali nel tempo di 20 campioni (equivalenti a 0,82 ms). Questo è il ritardo prodotto dal circuito utilizzato per raccogliere dati neurali in TDT stessa. Spostando i dati, il punto di tempo zero è allineato all'insorgenza dello stimolo.
- Rimuovere il manufatto di stimolo sostituendo i dati neurali da 0 a 1 ms con una linea retta che collega i dati punto a 0 ms con il punto di dati a 1 ms.
- Zero-media ogni prova sottraendo il valore medio del segnale neurale 200 ms prima dell'inizio di stimolo.
- Filtro passa-basso i dati inferiori a 800 Hz utilizzando un ordine dith 4 filtro tipo Butterworth IIR in entrambe le direzioni per evitare l'introduzione di qualsiasi spostamento temporale nei dati.
- Allineamento dei dati multi-laminare attraverso gli animali. Per i dati di ogni animale LFP, applicare l'attuale densità di origine inversa (spline iCSD, fonte raggio R = 0,5 mm) analisi21 con un filtro gaussiano (λ = 50 µm) per individuare lo strato IV lavello1, che è dato dalla più grande picco negativo che si verificano in una corticale profondità sotto la superficie pial entro il ms 15 prima dell'inizio dello stimolo. Il CSD e il corrispondente LFP, dati poi sono allineati secondo loro posizioni lavandino attraverso gli animali. Il lavandino comune si trova nel livello IV, ~ 600 µm sotto la superficie pial.
- Dopo l'allineamento, utilizzare canali 2, 7 e 12 di LFP realigned come rappresentanti delle risposte neurali di supragranular, granulare e infragranular strati, rispettivamente nella corteccia barile.
- Calcolare che la media evocata LFP ed EEG calcolando i dati pre-elaborati oltre 100 prove.
- Per studiare l'effetto del foro della bava nell'EEG, esempio su EEG segnali a 1.000 Hz e calcolare la densità spettrale di potenza (PSD) per la contra-laterale (con un buco nel cranio) e ipsi-laterale (cranio intatto) registrazioni elettrodo ragno sopra un periodo s 250 di stato di riposo. PSD è computato da 0,1-100 Hz in Matlab che utilizza la funzione 'pmtm', che si basa sul metodo multitaper22.
- Dividere l'intervallo di frequenza nelle seguenti bande di frequenza ben noto: Delta (δ): 0,1-4 Hz, Theta (): 4-8 Hz, Alfa (α): 8-13 Hz, Beta (β): 13-31 Hz, Gamma (γ): 31-100 Hz. calcolare la PSD medio all'interno di ogni banda.
- All'interno di ogni banda di frequenza, calcolare la differenza normalizzata in PSD, Perr, tra il contra - e l'EEG ipsi-laterale usando l'equazione:
dove Pc e Pio sono la media PSD della contra-ipsi-laterali ed EEG, rispettivamente nella banda di frequenza di interesse. - All'interno di ogni banda di frequenza, è possibile eseguire un esempio di uno t-test per verificare l'ipotesi che non esiste nessuna differenza significativa (al livello di significatività 0,05) tra il PSD del segnale EEG registrato dai due emisferi.
Representative Results
Dati da 4 ratti erano in media per ottenere tempo medio serie ove applicabile. L'ampiezza della risposta evocata EEG, noto anche come l'evento relativo potenziale (ERP), è in genere molto inferiore a quella della LFP. Figura 6 Mostra la media ERP e LFP in supragranular, granulare e infragranular strati della corteccia barile, rispettivamente. La band di errore in ogni trama è l'errore standard corrispondente. Si vede che ERP è circa 10 volte più piccolo della LFP evocate.
Figura 6: dire (n = 4) segnali neurali di ERP, supragranular, granulare e infragranular LFP. Ombra indica errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Confronti delle dinamiche temporali di ERP e LFP sono mostrati nella Figura 7. Sovrapposizione diretta di ERP e la supragranular LFP in figura 7A illustra l'ordine delle differenze di ampiezza tra questi due tipi di segnali neurali. Per confrontare la dinamica temporale, sia ERP e LFP sono normalizzati rispetto alla loro ampiezza di picco negativo. Figura 7B e 7C mostrano che l'ERP normalizzato sovrapposto con il supragranular normalizzato LFP e normalizzato LFP granulare, rispettivamente.
Si vede dalla figura 7B che i picchi di P1 e N1 per ERP sono più in ritardo rispetto i picchi corrispondenti della LFP nello strato supragranular. Tuttavia, i profili temporali di questi due segnali neurali sono simili, con P1 precedente N1. D'altra parte, il profilo temporale di ERP è nettamente diverso da quello del granulare (livello IV della corteccia barile) LFP (Figura 7). La cosa importante non sono immagini speculari uno da altro, con granulare LFP dominato da un singolo picco negativo (che riflette un grande lavandino in strato corticale IV), mentre ERP consisteva principalmente di due picchi con polarità opposta.
Figura 7: confronto tra la dinamica temporale di ERP e LFP. (A) ERP (linea continua) sovrapposto con supragranular LFP (linea tratteggiata). Ombra indica errore standard. (B) normalizzato ERP (linea continua) sovrapposto con normalizzato supragranular LFP (linea tratteggiata). (C) normalizzato ERP (linea continua) sovrapposto con LFP granulare normalizzato (linea tratteggiata). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il segnale ERP è stato misurato tramite un elettrodo di ragno collocato sul cranio con un foro della bava perforato in esso. Per studiare l'effetto del foro su registrazioni EEG, un altro elettrodo di ragno è stato disposto sul cranio intatto sopra la corteccia barile ipsi-laterale. Cura è stata presa per garantire che le impedenze degli elettrodi due spider erano comparabili in grandezza regolando la quantità di pasta di EEG utilizzato. Dati da quattro ratti (che erano non i ratti stessi usati in precedenza) sono presentati qui.
Figura 8 Mostra le registrazioni di EEG stato riposa simultanee da entrambi gli elettrodi di un ratto, con 100 s i dati visualizzati in Figura 8Ae i dati nel riquadro rettangolare (20 s) vengono espansi in Figura 8B. I due segnali EEG in gran parte co-variano, all'interno di una gamma simile di ampiezza. Figura 9 Mostra il PSD dei quattro ratti, con la riga superiore utilizzando una scala lineare sull'asse di frequenza e la riga inferiore utilizzando una scala logaritmica sull'asse frequenza per fornire una visualizzazione espansa nella gamma di frequenza più bassa. Dalla Figura 9, non sembra essere coerente bias in PSD attraverso gli oggetti. Ciò è stata confermata effettuando uno-campione t-test sulle differenze normalizzate in PSD media nelle bande di cinque frequenza, illustrato nella Figura 10. Nessuno delle differenze PSD normalizzate in queste bande di frequenza sono stati significativamente diverso da zero (p = 0.32, 0.46, 0.85, 0,69 e 0,97, rispettivamente).
Figura 8: registrazioni EEG bilaterale. (A) cranio EEG registrazione durante il riposo dello stato con un foro della bava nel cranio (nero) e una registrazione simultanea di EEG nell'emisfero opposto con il cranio intatto (grigio). (B) espansa Mostra delle forme d'onda all'interno della cornice rettangolare in (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: densità spettrale (PSD) di potenza del contra-(blu) e l'EEG ipsi-laterale (rosso). Ogni colonna Mostra il PSD per un ratto. Il pannello superiore utilizza la scala di frequenza lineare, mentre i pannelli di fondo utilizzano scala logaritmica frequenza per consentire il PSD nella gamma di frequenza inferiore possano essere visualizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: analisi di gruppo. Normalizzata la differenza tra la contra - e il PSD ipsi-laterale con le bande di cinque frequenza: Delta, Theta, Alpha, Beta e Gamma. Ogni barra Mostra le differenze medie normalizzate all'interno della banda di frequenza, con l'errore standard indicato come barra di errore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Abbiamo descritto una procedura sperimentale per la registrazione simultanea dei segnali EEG e LFP co-localizzati di un ratto anestetizzato isoflurano in risposta alla stimolazione di whisker pad. Un microelettrodo è stato inserito nella neocorteccia attraverso un'apertura nell'elettrodo di ragno di EEG che è stata stata allineata con un foro della bava nel cranio. L'elettrodo è stato fissato al cranio da un conduttivo e incollare adesivo EEG23. Il cono di naso utilizzato per l'amministrazione di isoflurane è stato modificato in modo che gli elettrodi di stimolazione potrebbero essere inserito nel riquadro whisker con facilità.
La pasta di EEG era efficace a montaggio elettrodo ragno saldamente al cranio, fornendo al contempo eccellente conduttività elettrica per tutta la giornata sperimentale senza la necessità di ulteriore applicazione della pasta. Ha sostituito l'uso indesiderabile di colla per fissare la periferia dell'elettrodo ragno al cranio, come colla è non conduttivo e può aumentare l'impedenza dell'elettrodo se corre tra il cranio e l'elettrodo. Pasta di EEG ha un numero di vantaggi sopra gel di EEG, che è difficile forma intorno al foro della bava e può seccare durante l'esperimento, con conseguente scarso segnali EEG.
Il ratto è stato inserito all'interno di una gabbia di Faraday, rumore elettrico a causa dell'ambiente era notevolmente attenuata. Tuttavia, a volte il segnale neurale era ancora piuttosto rumoroso. Nella maggior parte dei casi, questo è stato causato dall'elettrodo di riferimento non saldamente posizionato e pertanto dovevano essere ri-regolato o EEG più pasta usata. Un altro problema comune era che la LFP evocate era piccola in ampiezza. Questo potrebbe essere dovuto il microelettrodo non posizionato al centro della regione corticale attivata dagli elettrodi stimolanti. Invece di re-inserire il microelettrodo, che poteva causare più danni ai neuroni locali, ci siamo adattati solitamente la posizione degli elettrodi stimolanti del tampone whisker fino ad un'ampiezza ragionevole la LFP (> 3 mV) ha potuto essere osservato.
Uno dei limiti della tecnica è la scarsa risoluzione spaziale dell'elettrodo ragno, che ha un diametro di 6 mm. Questo è grande rispetto alle dimensioni del cranio del ratto. Purtroppo, l'elettrodo di ragno usato qui è il più piccolo disponibile per l'acquisto. Sarebbe auspicabile ridurre il diametro dell'elettrodo ragno per 2-4 mm, aumentando così la specificità spazio delle registrazioni di EEG, facendo il confronto tra il segnale EEG e la supragranular LFP segnale meno ambiguo.
Diversi passaggi critici nel protocollo necessitano di particolare attenzione. La prima è l'inserimento del microelettrodo attraverso il foro della bava. Come la dura madre altrimenti è intatta, la precisione dell'inserimento è cruciale. Una leggera resistenza alla punta dell'elettrodo di solito significa che l'elettrodo non è posizionato correttamente. Essa deve essere sollevata, posizione regolata e reinserito. Il secondo è la posizione del cono di naso il ratto. Non deve essere troppo allentato, come isoflurano scapperà dal cono. Esso inoltre non deve essere troppo stretto, poiché ciò può ostruire le narici del ratto e causare difficoltà di respirazione. Particolare attenzione è necessaria anche per garantire che l'ampiezza della registrazione EEG è molto più piccolo (solitamente 5-10 volte più piccolo) che la registrazione del canale superiore LFP. Se sono simili, è un'indicazione che la sonda di EEG è entrato in contatto diretto o indiretto con il microelettrodo. Un contatto indiretto è solitamente attraverso il liquido spinale cerebrale (CSF) che a volte si riempie il foro praticato nel cranio. La conducibilità del CSF è in genere 100 volte quella del cranio24,25. Così, se il livello di CSF all'interno del foro della bava è sufficientemente elevato, può fare contatto con l'elettrodo di ragno. Per evitare questo problema, il foro deve essere pulito frequentemente con spugne di cotone super assorbente come la spears di assorbimento.
L'effetto di un foro della bava (diametro < 2 mm) nel cranio sull'EEG registrazione che circonda il buco è stato studiato da un altro elettrodo di ragno sul cranio intatto in cima la corteccia barile ipsi-laterale per poter effettuare registrazioni EEG bilaterale potrebbero essere paragonate. I risultati mostrati in Figura 9 e Figura 10, suggeriscono l'effetto di essere insignificante presso il livello di significatività 0,05. Altri fattori che influenzano l'ampiezza del EEG comprendono quanto bene la pasta di EEG era in contatto con il cranio, come ditta l'elettrodo è stato premuto per la pasta e l'estensione spaziale della pasta EEG sul cranio.
Vale anche la pena notare che il protocollo descritto qui registrato EEG del cranio, che è diverso dal cuoio capelluto EEG utilizzato negli studi umani di EEG. Il cuoio capelluto agisce come un resistore o un filtro passa-basso, che consentirà di ridurre il rapporto segnale-rumore del EEG registrazione ulteriormente.
Infine, il confronto tra la dinamica temporale del ERP e che la LFP evocati attraverso strati corticali suggeriscono che potenziali evocati somatosensoriali riflettano meglio la LFP nello strato supragranular della corteccia di quello nel granulare e infragranular strati. Questo è in accordo con il nostro precedente lavoro6, dimostrando che il segmento iniziale (P1) di ERP è imparentato con l'attuale ritorno derivanti dall'afflusso dell'avvenimento della corrente sinaptica eccitatoria nello strato granulare, mentre la successiva diminuzione ( N1) in ERP può essere collegata l'arrivo in ritardo dei segnali II/III e/o feedforward thalamic strati afferente alla corticale da strati corticali più profondi. In conclusione, le registrazioni simultanee di EEG/LFP possono migliorare la comprensione della Genesi neurale dell'EEG e facilitare la modellizzazione matematica di EEG in termini di segnali neurali attraverso strati corticali.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Andrew Cripps e l'unità di BioResource presso l'Università di Reading. Questa ricerca è stata finanziata dal BBSRC (concessione numero: BB/K010123/1). Dati associati a questo lavoro sono liberamente disponibili da Y.Z., (ying.zheng@reading.ac.uk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Lister Hood rats | Charles Rivers | ||
| Spider electrode | Unimed Electrode Supplies Ltd | SCS24-426 | |
| EEG paste: Ten20 | Unimed Electrode Supplies Ltd | 10-20-S | |
| Stereotaxic holder with dual micromanipulator arms: Dual Manipulator Stereotaxic Frame with 18° Ear Bars | WPI (World Precision Instruments) | 502603 | |
| Isoflurane | National Vet Services Limited | 50878 | |
| Hard plastic nose cone: Anasthesia Gas Mask for Rat | WPI | 502054 | |
| Small animal isoflurane anaesthetic system | WPI | EZ-B800A | |
| Thermostatic heating pad: Rat Blanket System 230V | Harvard Apparatus UK | 50-7221-F | |
| Ophthalmic ointment: Optixcare eye lube | Viovet | 203865 | |
| Lidocaine Hydrochloride (Injection 2%) | Larkmead Vets | ||
| Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, Hollow | WPI | 503421 | |
| Serrated and curved dissecting forceps | WPI | 15915 | |
| Braided silk, non-absorbable suture: Mersilk Suture W502H | National Vet Services Limited | 153746 | |
| Dental drill: BONE MICRO DRILL SYST 230 VAC | Harvard Apparatus UK | 72-4860 | |
| Sterile Saline: Sodium chloride 0.9% | Animalcare Ltd | 14K26BT | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #4 | Harvard Apparatus UK | 72-4958 | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #1/4 | Harvard Apparatus UK | 72-4962 | |
| Faraday cage | Newport Corporation | VIS-FDC-3600 | |
| Vibration isolation workstation: Vision IsoStation | Newport Corporation | M-VIS3660-RG4-325A | |
| Oximeter Control Unit and sensor: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp. | WPI | O15001 | |
| Transparent soft nose cone: Microflex Non-Rebreathing Unit with a Rat Nosecone | WPI | EZ-103A | |
| Stainless steel stimulating electrodes | PlasticsOne | E363/1/SPC | |
| Isolated current stimulator | Made in House | ||
| 16-channel micro-electrode, 100 μm spacing, area of each site 177 μm2 | NeuroNexus | A1x16-10mm-100-177-A16 | |
| 16-channel acute headstage | Tucker David Technologies Inc., TDT | RA16AC-Z | |
| Pre-Amplifier: Z-Series 64-Channel Neuro-Digitizing Preamp | TDT | PZ5-64 | |
| Passive signal splitter: 32-Channel Splitter Box for PZ5 | TDT | S-BOX_PZ5 | |
| Data acquisition unit: RZ2 BioAmp Processor. Z-Series 4-DSP ultra high performance processor | TDT | RZ2-4 | |
| Software for Neurophysiology: OpenEX | TDT | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Absorption spears | Fine Sicence Tools | 18105-01 |
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