Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måle influensa nøytralisere antistoff Svar å A(H3N2) virus i menneskelig Sera av Microneutralization søk ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

Influensa nøytraliserende antistoffer samsvarer med beskyttelse av influensa infeksjoner. Microneutralization analyser måler nøytraliserende antistoffer i menneskelig sera, og brukes ofte til influensa menneskelige serologi. Vi beskriver en microneutralization analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler for å måle nøytraliserende antistoff titers moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus etter influensa vaksinasjon eller infeksjon.

Abstract

Nøytraliserende antistoffer mot hemagglutinin (HA) av influensavirus er betraktet som den viktigste immune mekanismen som samsvarer med beskyttelse for influensa infeksjoner. Microneutralization (MN) analyser brukes ofte til å måle nøytraliserende antistoff tiltak i menneskelige sera etter influensa vaksinasjon eller infeksjon. Madine Darby hjørnetann nyre (MDCK) celler er brukte cellen substrater for MN analyser. Men endret for tiden sirkulerer 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) influensa virus har fått reseptor bindende spesifisitet. MDCK-SIAT1 celle linje med økt α-2,6 sialic galaktose moieties på overflaten har vist seg for å gi forbedret infectivity og mer trofast replikeringer enn konvensjonelle MDCK celler for disse moderne A(H3N2) virus. Her beskriver vi en MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler som er optimalisert for å kvantifisere nøytraliserende antistoff titers disse moderne A(H3N2) virus. I denne protokollen, er varme inaktivert sera inneholder nøytraliserende antistoffer først serielt utvannet, deretter inkubert med 100 TCID50/godt av A(H3N2) influensavirus tillate antistoffer i sera binde til virus. MDCK-SIAT1 celler er da lagt til virus-antistoff blanding, og ruges i 18-20 h på 37 ° C, 5% CO2 å tillate A(H3N2) virus å infisere MDCK-SIAT1 celler. Etter natten inkubasjon plater er fast og mengden av virus i hver godt er kvantifisert ved enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) bruker anti-influensa en nucleoprotein (NP) monoklonale antistoffer. Nøytralisere antistoff titer er definert som den resiproke verdien av den høyeste serum fortynning som gir ≥50% hemming av virus infectivity.

Introduction

Influensavirus fortsetter å forårsake sykelighet og dødelighet i befolkningen hvert år. HA er den store overflaten glykoprotein av influensavirus. Nøytraliserende antistoffer målretting HA er den viktigste immune mekanismen som samsvarer med beskyttelse av influensa infeksjon1,2. Hemagglutination hemming (HI) analyser og MN analyser er to metoder som er mye brukt til å måle antistoff tiltak i menneskelige sera etter influensa infeksjon eller vaksinasjon3. HI analysen er måler antistoffer hemming av virus hemagglutination av røde blodlegemer og en surrogat analysen. I motsetning til Hei, kan MN analysen direkte måle nivåene av antistoffer i menneskelig sera som nøytraliserer influensa infeksjon i cellekulturer. MDCK celler brukes ofte influensa virus isolert og MN søk4.

Influensavirus gjennomgå stadig antigen drift og SKIFT, anskaffe mutasjoner på HA proteiner som kan endre reseptor bindende spesifisitet av virus. Siden 2014, nye klynger A(H3N2) virus dukket opp og fortsatte å sirkulere til inneværende sesong. Fleste av disse virusene tilhører genetisk gruppe 3C.2a og 3C.3a basert på fylogenetisk analyse av HA proteiner. Mange av sirkulerende 3C.2a virus hadde redusert evne til å hemagglutinate røde blodlegemer og derfor ikke kan være preget av HI analyser5. Nøytralisering analyser må brukes til å måle antistoff svarene på disse virusene som ikke hemagglutinate6. Videre har studier vist at disse moderne A(H3N2) virus har endret reseptor bindingsegenskapene sammenlignet med tidligere A(H3N2) virus og pleier å akkumulere kultur tilpasset mutasjoner og polymorfisme når passaged i i vitro celle kulturer7,8,9. Sammenlignet med konvensjonelle MDCK celler, er MDCK-SIAT1 en celle linje utviklet av Matrosovich et al. gjennom stabil transfection MDCK celler med cDNA av menneskelig α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Denne cellen linje uttrykker økte mengder α2, 6-sialic galaktose moieties og redusert mengden α2, 3-sialic syre moieties enn overordnet MDCK celler10. MDCK-SIAT1 celler har vist seg for å forbedre isolasjon priser for A(H3N2) virus sammenlignet MDCK celler11. Lin et al. nylig rapportert at nylig dukket opp 3C.2a og 3C.3a menneskelig A(H3N2) influensa virus, mer trofast virus replikeringer og bedre virus infectivity ble oppnådd når virus ble dyrket i MDCK-SIAT1 cellelinjer sammenlignet med MDCK celler7. Dermed er MDCK-SIAT1-celler bedre egnet i MN analyser som karakteriserer antistoff svar til siste klynger A(H3N2) virus.

Her beskriver vi en MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler for å måle antistoff svar til moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus i menneskelig sera. Virus vokst i egg eller celler kan brukes i denne analysen. Varme inaktivert sera inneholder nøytraliserende antistoffer er først serielt utvannet, deretter inkubert med 100 TCID50/vel av A(H3N2) influensavirus tillate antistoffer i sera binde til virus. MDCK-SIAT1 celler er da lagt til virus-antistoff blanding, og ruges i 18-20 h på 37 ° C, 5% CO2 å tillate A(H3N2) virus å infisere MDCK-SIAT1 celler og gjenskape. Etter natten inkubasjon platene er løst og mengden av virus i hver brønn er kvantifisert ved en ELISA bruker anti-influensa A NP monoklonale antistoffer. Gjenkjenning av NP indikerer tilstedeværelse av virusinfeksjon og fravær av nøytralisere antistoffer. Nøytralisere antistoff titer er definert som den resiproke verdien av den høyeste serum fortynning som gir ≥ 50% hemming av virus infectivity.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle influensavirus skal håndteres i henhold til riktig biosikkerhet behovsnivåer (BSL-2 eller høyere) som definert i fravær av smittefarlige stoffer på mikrobiologisk og biomedisinsk Laboratories (BMBL)12.

1. forberedelse av reagenser og utgangsmaterialet

  1. Forberede MDCK-SIAT1 celler og sterile celle kultur medium
    1. Forberede MDCK-SIAT1 celle kultur medium med 500 mL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med høy glukose, 10% v/v varme inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvate, 1 mg/mL G418 sulfat (f.eks, geneticin), og 100 U/ml penicillin med 100 µg/mL streptomycin (valgfritt). Sterilisere ved filtrering gjennom en 0,2 µM pore-størrelse membran. G418 sulfat legges til sikre plasmider stabilitet i MDCK-SIAT1-celler.
    2. Forberede MDCK-SIAT1 celle linjen. I 162 cm2- vev kultur flask(s) inneholder 30 mL steril celle kultur medier, frø flasker med 2-2,5 x 106 MDCK-SIAT1-celler og ruge på 37 ° C i 5% CO2 for 2 dager; Dette vil bli brukt til vev-kultur smittsomme dose (TCID) besluttsomhet og MN analyser.
      Merk: MDCK-SIAT1 celler ble vennlig levert av Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland10. Denne cellen linjen kan også fås kommersielt (se Tabell for materiale).
  2. Forberede sterilt virus forplantning media 500 mL DMEM høy glukose, 0,3% bovin serum albumin (BSA) brøkdel V, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 20 mM HEPES. Sterilisere ved filtrering gjennom en 0,2 µM pore-størrelse membran.
  3. Forberede 0,75% (v/v) marsvin røde blodlegemer (gpRBCs) i fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 0,01 M PBS, ved pH 7.2.
  4. Forberede den sterile virus fortynner DMEM høy glukose, 1% Bovine Albumin brøkdel V (BSA), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 20 mM HEPES. Sterilisere ved filtrering med en 0,2 µm pore-størrelse membran og forberede fersk hver analysen.
  5. Forberede den kalde celle bindemiddel som 80% kaldt aceton i PBS (0,01 M PBS, pH 7.2).
  6. Forberede den vaske bufferen med PBS (0,01 M PBS pH 7.2) og 0,3% (v/v) tween-20.
  7. Forberede den antistoff fortynner bruker PBS (0,01 M PBS, pH 7.2), 0,3% (v/v) mellom-20 og 5% ikke-fett tørr melk.
  8. Bruke anti-influensa A NP musen monoklonalt antistoff klone A1 og A3 basseng som primære antistoff. Fortynne i antistoffer fortynningsmiddel på optimal konsentrasjon som titrering.
  9. Bruk geit anti-musen IgG konjugert til hest reddik peroxidase (HRP) som sekundær antistoff. Fortynne i antistoffer fortynningsmiddel på optimal konsentrasjon som titrering.
  10. Forberede peroxidase underlaget med o- phenylenediamine dihydrochloride (OPD) i 0,05 M fosfat citrate buffer ved pH 5. Klargjør 0,05 M fosfat citrate buffer ved oppløsning 1 kapsel/100 mL vaskebuffer H2O. oppløse 1 OPD tavle (10 mg) / 20 mL fosfat citrate buffer umiddelbart før bruk.
  11. Bruk 0,5 M av svovelsyre som den OPD stopp løsning. Legge til 28 mL av 18 M svovelsyre lager 972 mL vaskebuffer H2O i kjemisk hette.
  12. Behandling av mennesker og dyr sera
    1. Varme Deaktiver menneskelige sera brukes i MN analyser i et vannbad på 56 ° C i 30 min før analysen. Bruke umiddelbart eller eventuelt lagre tinte sera ved 4 ° C i mer enn 24 timer; Hvis det kreves lengre lagringsperiode, lagre sera frosset på 20 ° C eller kaldere.
    2. Behandle dyr sera brukes i MN analyser med reseptor ødelegge enzym (RDE) og varme deaktivere før analysen som følger.
      1. Tine sera i et 37 grader vannbad og plasser på is. Bland 1-volum av dyr serum prøve med 3 mengder RDE. Ruge på 37 grader for 18-20 h.
      2. Varme Deaktiver RDE behandlet sera på 56 grader for 30 min. legge 6 mengder PBS, pH 7.2 hvert utvalg for en siste før fortynning av 1:10. Eventuelt lagre tinte sera ved 4 ° C i mer enn 24 timer; Hvis det kreves lengre lagringsperiode, lagre sera frosset på 20 ° C eller kaldere.
        Merk: Dyr sera kan inneholde ulike sialic syre glykaner som kan binde til har influensa virus og hemmer binding av influensa-spesifikke anti-HA antistoffer. Derfor er det nødvendig å RDE behandle alle dyr sera før MN analyser fjerne disse uspesifisert viral HA dokumentordnere i serumprøver.

2. tidens MDCK-SIAT1 cellekultur

Merk: Alle cellekulturer må utføres i en biologisk sikkerhet regjering å hindre forurensning.

  1. Dekanter celle kultur medium fra celle monolayer i 162 cm2 flasker. Trypsinize cellene av skylling monolayer med trypsin-EDTA. Legge til 5 mL trypsin-EDTA å dekke celle monolayer. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 til monolayer løsner (5-10 min). Legge til 15 mL av MDCK-SIAT1 celle kultur medier hver kolbe som inneholder trypsinized celler, pipette opp og ned for å skille celler.
  2. Bruk hemocytometer og trypan blå å bestemme cellen teller og levedyktighet. Frø cellene i nye 162 cm2 vev kultur kolber inneholder 30 mL av celle kultur media med 2-2,5 x 106 celler /flask og ruge på 37 ° C med 5% CO2 for 2 dager for bruk i TCID og MN analyser. Frø cellene på 4-5 x 106 celler/kolbe og ruge på 37 ° C med 5% CO2 for 2 dager for bruk i virus forplantning.
    Merk: Seeding tetthet kan justeres hvis kortere eller lengre kultur perioder er ønsket. For virus forplantning, celler skal nå over 100% confluency. For vev kultur infeksjon Dose (TCID) og MN analyser, skal cellene være på 75-95% confluency (figur 1).

3. overføring av A(H3N2) virus i MDCK-SIAT1 celler

Merk: A(H3N2) virus kan overføres enten i 10-11 dag gamle embryonated høna egg etter standard protokoll3eller MDCK-SIAT1 celle kulturer. MDCK-SIAT1 celler skal nå over 100% confluency for virus vaksinering. Virus frø aksjer kan være inokulert med flere fortynninger av inoculum. Den inoculum fortynninger med beste innhøstingen HA og infectivity kan brukes til videre MN analyser.

  1. Fjerne celle kultur medium fra cellen monolayer (> 100% confluency) i 162 cm2 flasker. Vask monolayer to ganger med 15 mL steril 0,01 M PBS, pH 7.2, og Dekanter.
  2. Etikett 1 kolbe som kontroll og legge til 20 mL virus forplantning media. Inkuber kolbe på 37 ° C med 5% CO2. La denne kolbe urørt og bruk for sammenligning etter dag 1 av virus forplantning.
  3. Legge til 10 mL steril virus forplantning media i flask(s) og ruge alle flask(s) ved 37 ° C, 5% CO2. Tine ampuller av influensa virus lager ved romtemperatur og plasser på is. Fortynn med virus forplantning media å fortynninger mål.
    Merk: Målet fortynninger kan justeres basert på HA titers virus aksjer. For å forberede en 1:1000 fortynnet inoculum, legge 100 µL av viruset til 9.9 mL steril virus forplantning media. Invertere forsiktig, fjerne 1 mL av 1: 100 fortynning til 9 mL steril virus overføring medier, invertere forsiktig for en 1:1000 fortynnet inoculum. Plasser på isen.
  4. Fjern alle flasker unntatt kontroll kolbe fra inkubator. Fjerne virus forplantning media fra flask(s) MDCK-SIAT1 celler og vaksinere hver kolbe med 10 mL utvannet virus. Inkuber flasker på 37 ° C, 5% CO2 1t, roterende flask(s) hvert 15 min.
  5. Fjerne 5 mL av inoculum fra flask(s) og erstatte med 15 mL virus forplantning media som inneholder 1 µg/mL TPCK-trypsin. Inkuber flask(s) ved 37 ° C, 5% CO2 16-18 h.
  6. Etter den natten inkubering, observere flask(s) under 100 X mikroskop forstørrelse og se etter cytopathic effekter (CPE) på cellene. Fjerne 15-17 mL virus supernatant fra flask(s), og Erstatt med 15-17 mL nylagde virus forplantning media som inneholder 2 µg/mL TPCK-trypsin.
  7. Inkuber flasker på 37 ° C, 5% CO2. Overvåke CPE av monolayer (sammenligning celle kontroll kolbe) og sjekk HA regelmessig (hver 4 h) med 0,75% gpRBC til harvest.
    1. Definere en HA 96-brønnen microtiter plate. Legge til 50 µL av 0,01 M PBS, pH 7.2 brønner A2 - A12 og B2 - B12 (duplikater), og brønner H1 - H12 for kontroll.
    2. Legge til 100 µL av viruset supernatant A1 og A2, utføre en 2-fold føljetong fortynning fra A1 og B1 til A12 og B12. Kaste 50 µL etter blande i A12 og B12. Legge til 50 µL av 0,75% gpRBCs rader A, B og H.
    3. Trykk platen og ruge ved romtemperatur 1t.
      1. Bestemme HA virus supernatant ved å vippe 96-brønnen microtiter plate på en 45° 60° vinkel.
      2. Lese plater for hemagglutination; den høyeste fortynning av virus som oppnår full hemagglutination anses HA titrering endepunktet for bestemte virus. Registrere den resiproke verdien av den høyeste virus fortynning med komplett hemagglutination som HA titer av viruset.
        Merk: De utlignede RBCs i raden H (kontroller) start "kjører" og danne en liten tåre-form på grunn av tyngdekraften. Vente til RBCs kontroll brønner er ferdig Les kjører, så RBC knappene viruset titrering brønner. De som viser RBC knapper og "Kjør", oppnå ikke hemagglutination. Finn den høyeste fortynning av virus som fullstendig hemmer hemagglutination som endepunktet HA titer av viruset.
  8. Høste viruset når HA virus kultur flyer eller virus kultur når målet HA (for eksempel > 16 HAU), men før cellen monolayer begynner å vise betydelige CPE.
    1. Sentrifuge virus kulturen supernatant på 300 x g i 10 min på 4 ° C pellets mobilnettet rusk. Overføre avklart nedbryting inneholder virus innhøstingen slik rent. Aliquot nedbryting som inneholder viruset høste inn engangs sterilt kryogene ampuller og fryse umiddelbart ved-70 ° C eller kaldere.
      Merk: Virus aksjer brukes for MN analyser bør ha høy smittsomme titer og minimal defekt partikler. Minimum fortynning av virus oppnå 100 TCID50/50 µL for MN analysen er 1: 100.
      Merk: Virus aksjer brukes i MN analyser bør ikke være Tint og refrozen.

4. fastsettelse av TCID av Virus

  1. Dag 1: Virus titrering
    1. Tine ampuller av virus ved romtemperatur og umiddelbart sted på is.
    2. Teste viruset på to ulike Start fortynninger: 10-2 og 10-3. Legge til 100 µL av viruset 9.9 mL virus fortynningsmiddel for 10-2 fortynning. Legge til 1 mL av 10-2 fortynning 9.0 mL virus fortynningsmiddel for 10-3 fortynning.
    3. Bruker to være ferdig innen plater (plate 1 for 10-2 fortynning) og plate 2 for 10-3 fortynning, legge til 100 µL av viruset fortynningsmiddel alle brønnene bortsett fra kolonne 1 av 96-brønnen microtiter plate.
    4. Utføre ½log10 fortynninger (10-210-2.5, 10-3, osv). Legg 146 µL av viruset starter fortynning alle brønner i kolonne 1 og overføre 46 µL serielt fra kolonne 1 gjennom kolonnen 11 (figur 2). Endre pipette-spisser mellom brønner. Etter miksing kolonnen 11, forkaste tips med 46 µL fortynning.
    5. Bruke kolonne 12 som cellen kontroll (CC); den inneholder bare virus fortynner. Inkuber 1t ved 37 ° C, 5% CO2.
  2. Dag 1: Forberedelse av MDCK-SIAT1 celler
    Merk: MDCK-SIAT1 celle monolayer skal nå 75-95% confluency for TCID og MN analyser. En 162 cm2 kolbe på 95% confluency skal gi nok celler frøet ~ 4-5 microtiter plater.
    1. Vask 75-95% confluent monolayer med 20 mL PBS fjerne FBS i kultur media. Trypsinize cellene som følger.
      1. Skyll monolayer med sterilt PBS, legge til 7 mL trypsin-EDTA å dekke celle monolayer. Lå kolbe flat og ruge på 37 ° C, 5% CO2 til monolayer løsner (ca 5-10 min). Legge til 7 mL av virus fortynningsmiddel hver kolbe som inneholder de trypsinized cellene.
    2. Vask cellene med virus fortynner fjerne FBS.
      1. Pipetter forsiktig opp og ned for å skille cellene. Overføre cellene til en 50-mL konisk rør; Fyll røret med virus fortynner.
      2. Sentrifuge 485 x g for 5 min. Decant viruset fortynningsmiddel, erstatte med fersk 50 mL virus fortynningsmiddel, og sentrifuge 485 x g for 5 min. Decant viruset fortynningsmiddel og erstatte med fersk virus fortynner (10 mL/kolbe) å resuspend pellet.
    3. Bruk hemocytometer og trypan blå for å bestemme celletall og levedyktighet. Justere celle konsentrasjonen av viruset fortynningsmiddel til 1,5 x 105 celler/mL.
    4. Legg 100 µL av fortynnet MDCK-SIAT1 celler i hver brønn av være ferdig innen platene (1,5 x 104 celler/godt) og dekke platene. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 18-20 h.
  3. Dag 2: ELISA
    1. Fiksering av celler
      1. Fjerne mediet fra være ferdig innen platene. Vask hver med 200 µL av PBS. Legger 300 µL kaldt 80% aceton hver brønn og ruge ved romtemperatur for 10 min. fjerne bindemiddel og tillate platene til luft tørr.
    2. ELISA
      1. Primære antistoff tillegg
        Merk: Anti-influensa A NP monoklonalt antistoff bør brukes i overkant som det primære antistoffet ELISA. Bestemme den optimale antistoff fortynning for hver masse primære antistoffer ved å utføre antistoff titrations i MN. Velg den primære antistoff konsentrasjonen i overkant og med beste signal bakgrunn forhold.
        1. Fortynne anti-influensa A NP monoklonalt antistoff (primære antistoff) å målet konsentrasjonen i antistoffer fortynningsmiddel (f.eks legge 30 µL primære antistoff til 30 mL antistoff fortynningsmiddel for en målet fortynning av 1:1000).
        2. Vask plater 3 ganger med 300 µL av vaskebuffer. Tilsett 100 µL utvannet primære antistoff hver brønn. Inkuber ved romtemperatur 1t.
      2. Sekundær antistoff tillegg
        Merk: Goat anti musen IgG konjugert til hesten reddik bør peroxidase (HRP) brukes i overkant som sekundær antistoffer i ELISA. Bestemme den optimale antistoff fortynning for hver masse sekundære antistoffer ved å utføre antistoff titrations. Velg sekundær antistoff konsentrasjonen i overkant og beste signal bakgrunn forhold.
        1. Fortynne geit anti-musen IgG konjugert til HRP antistoff (sekundær antistoff) å målet konsentrasjonen i antistoffer fortynningsmiddel (f.eks legge 7.5 µL av sekundær antistoff 30 mL antistoff fortynningsmiddel for en målet 1: 4000 fortynning).
        2. Vask platene 3 ganger med 300 µL vaskebuffer. Tilsett 100 µL utvannet sekundære antistoff hver brønn. Inkuber ved romtemperatur 1t.
      3. Substrat tillegg og plate lese
        1. Vask platene 5 ganger med 300 µL vaskebuffer og trykk på en lofri tørke.
        2. Tilsett 100 µL av nylagde substrat hver brønn og Inkuber ved romtemperatur før farge utviklingen saturates og optisk densitet (OD) av cellen kontroll < 0,2.
        3. Legge til 100 µL av stopp løsning på alle brønnene. Lese OD brønner på 490 nm bruker et microplate spektrofotometer.
  4. TCID 50 beregning
    1. Beregne medianen OD490 celle kontrollene (kolonne 12).
    2. Vurdere en test med en OD490 større enn to ganger medianen OD490 av CC som "positiv"; ellers anses det "negative".
    3. Beregne TCID50 av viruset benytter Reed-Muench metoden13.
      1. Bestemme antall positive og negative på hver fortynning.
      2. Beregne den "kumulativ positiv", "Kumulativ negative", "Ratio" og "% positiv" som vist i tabell 1.
      3. Beregne "proporsjonal avstand" mellom fortynning viser > 50% positive og fortynning viser < 50% positiver bruke følgende:
        Equation 1
        Merk: Korrigeringsfaktoren for ½ Logg fortynning er 0,5. For eksempel i tabell 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0,5 = 0,25
      4. Beregne viruset TCID50 ved å legge til proporsjonal avstand fortynning viser > 50% positiv.
        Merk: For eksempel i tabell 2TCID50 er 10-5+(-0.25) = 10-5.25. Merk dette er TCID50 av viruset per 100 µL (eller 10-5.25/100 µL).
    4. Beregne virus fortynning. For MN analyser, fortynne viruset til 200 TCID50/100 µL (tilsvarer 100 TCID50/50 µL per brønn).
      Merk: I eksemplet i tabell 11 TCID50 er 10-5.25 i 100 µL og fortynning å oppnå 200 TCID50/100 µL er 1:891 basert på beregninger: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102,95 = 1 / 891

5. MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler

  1. Dag 1: Test og kontrollere sera forberedelse og plate oppsett
    1. Tine sera i 37 ° C vannbad og fjerne umiddelbart etter tining. Aliquot mengden av sera som skal testes; minimum 10 µL av opprinnelige sera er nødvendig å teste med en virus i singlet. Test sera duplikater hvis mulig.
    2. Varme Deaktiver de menneskelige sera i 30 min i et 56 ° C vannbad som i trinn 1.12.1. Sted sera på is post varme inaktivering, legge den virus fortynningsmiddel til sera å oppnå en 1:10 før fortynning.
    3. RDE behandler og pre fortynne dyr sera 1:10 bruke Kontroller per 1.12.2.
      Merk: Tinte og behandlet mennesker og dyr sera kan lagres på 4 ° C for lenger enn 24 h. Sera skal lagres frosset ved 20 ° C eller kaldere hvis lengre lagringsperiode er nødvendig før analysen.
    4. For å teste med en virus, Legg 100 µL 1:10 utvannet sera kolonner A1 til A10 (Figur 4). Legge til 50 µL av viruset fortynningsmiddel rader B til H, unntak kolonnene 11 og 12 (Figur 4). Utføre en 2-fold føljetong fortynning fra rader A til H, og forkaste de siste 50 µL på rad H (Figur 4).
      Merk: Når flere virus er skal testes, sera kan bli fortynnet i titer rør. Fortynning av serum, for hensikten med å bestemme serum titer, i godt A er 1:10, vel B 1:20, vel C 1:40, godt D 1:80, vel E 1:160, vel F 1:320, godt G 1:640, godt H 1:1,280 (Figur 4).
    5. For virus kontroll, legge 50 µL av virus fortynner brønner A12, B12, C12 og D12 (ingen sera). Cellekontroll, legge til 100 µL av virus fortynner brønner E12, F12, G12 og H12 (ingen virus, ingen sera).
    6. For kontrollsera (for eksempel oppspore sera kontroller), kan du legge 100 µL av utvannet kontrollsera vel en kolonne 11 og legge til 50 µL av viruset fortynningsmiddel brønner B11 - H11. Serial fortynne ned.
    7. Dekke platene, ruge på 37 ° C, 5% CO2 til du er klar for virus tillegg.
  2. Dag 1: Virus tillegg
    1. Fortynne viruset til 100 TCID50/50 µL med virus fortynner.
    2. Legge til 50 µL utvannet virus i alle brønnene, bortsett fra kolonnen 11 tilbake titrering (BT) platene og celle kontroll brønnene E12, F12, G12 og H12 på alle platene (Figur 4). For disse plater med kontrollsera i kolonnen 11, legge virus kolonne 11.
    3. Tilbake titrering (BT)
      1. Inkluder en BT i kolonnen 11 i et sett av like plater (for eksempel plate 1A og 1B). Legge til 50 µL av viruset fortynningsmiddel alle brønner i kolonnen 11. Legge til 50 µL av viruset på 100 TCID50/50 µL i den første brønnen (A11). Bland ved pipettering opp og ned.
      2. Bland og overføre 50 µL påfølgende brønner utføre 2-fold føljetong fortynninger. Endre pipette-spisser mellom brønner å unngå virus bære-over. Kast 50 µL fra godt H11.
      3. Legge til 50 µL av viruset fortynningsmiddel kolonne 11 å bringe det siste bindet 100 µL. Trykk platene å blande.
    4. Inkuber plater på 37 ° C, 5% CO2 1t.
    5. Utføre MDCK-SIAT1 celle tillegg på dag 1 og ELISA på dag 2 som beskrevet i trinn 4.2 og 4.3 (også beskrevet i 5.3 og 5.4)
  3. Dag 1: MDCK-SIAT1 celle tillegg
    1. Forberede MDCK-SIAT1 cellene som beskrevet i trinn 4.2. Legge til 100 µL MDCK-SIAT1 celler på 1,5 x 105 celler/mL i hver brønn (1,5 x 104 celler/vel). Inkuber platene på 37 ° C, 5% CO2 18-20 h.
  4. Dag 2: ELISA
    1. Etter natten incubation, den andre dagen, fikse cellene med 80% kaldt aceton som beskrevet i trinn 4.3.
    2. Primære antistoff tillegg
      1. Vask platene 3 ganger med 300 µL vaskebuffer. Fortynne anti-influensa A NP monoklonalt antistoff (primære antistoff) til optimal konsentrasjon som bestemmes av titrering i antistoff fortynner (f.eks legge 30 µL primære antistoff til 30 mL antistoff fortynningsmiddel for en målet fortynning av 1:1000).
        Merk: 100 µL primære antistoff kreves per brønn. ~ 10 mL kreves per plate.
      2. Tilsett 100 µL utvannet primære antistoff hver brønn. Inkuber ved romtemperatur 1t.
    3. Sekundær antistoff tillegg
      1. Vask plater 3 ganger med 300 µL vaskebuffer. Fortynne Bukken anti musen IgG konjugert til HRP antistoff (sekundær antistoff) mål konsentrasjonen i antistoff fortynner (f.eks legge 7.5 µL av sekundær antistoff 30 mL antistoff fortynningsmiddel for et mål 1: 4000.)
        Merk: 100 µL sekundære antistoff kreves per 96 godt. ~ 10 mL kreves per plate.
      2. Tilsett 100 µL utvannet sekundære antistoff hver brønn. Inkuber ved romtemperatur 1t.
    4. Substrat tillegg og plate lese
      1. Vask platene 5 ganger med 300 µL vaskebuffer og trykk på lofri tørke.
      2. Tilsett 100 µL av nylagde substrat hver brønn og Inkuber ved romtemperatur før virus kontroll brønnene nå et OD490 = 0,8 - 3, celle kontrollen på en lav bakgrunn OD490 < 0,2.
      3. Legge til 100 µL av stopp løsning på alle brønnene. Lese OD brønner på 490 nm bruker et microplate spektrofotometer.
  5. Dataanalyse
    Merk: MN beregningene er angitt for hver plate individuelt.
    1. Bestemme den nøytraliserende antistoff titer av hver serum prøve.
      1. Beregne OD490 cut-off av 50% virus nøytralisering for hver plate ved hjelp av følgende ligning:
        Equation 2
        Merk: Her x = 50% av nøytralisering cut-off. Den gjensidige serum fortynning tilsvarer den høyeste fortynning med OD490 regnes mindre enn 50% av cut-off (≥50% hemming) nøytralisering antistoff titer for at serum prøven (figur 5).
    2. Kontroller at celle kontroll brønnene har et OD490 < 0,2 og virus kontroll brønnene har et OD490 = 0,8 - 3.
    3. Kontroller virus infectivity i hver analysen (100 x TCID50) av virus BT. akseptable verdier BT er 50, 100 eller 200 TCID. Hvis bruker samme cut-off som definert i trinn 4.4.2, skal det høyeste virus fortynning i kolonnen BT med OD over cut-off i brønner E11, F11, G11.
      Merk: Serum positiv kontrollene skal gi titers i 2-fold verdiene innhentet i den tidligere tester. OD490 i kontrollen negative serum bør være samme som observert for virus kontrollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fastsettelse av infectivity av virus aksjer er første skritt i MN analysen. Figur 2 viser oppsettet plate for å fastslå TCID50 av de virus. For virus aksjer med ukjent infectivity, kan viruset bli titreres fra flere pre fortynninger, for eksempel både 10-2 og 10-3, for å fange de beste titrering kurven beregner infectivity av viruset. Hvor virus brukt i MN analysen bør være standardisert til 100 TCID50/well (50 µL). Minimum fortynning av virus oppnå en 100 TCID50/vel er 1: 100.


Figur 3 beskriver viktige trinnene av en MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler. Inaktivert sera er seriell-fortynnet i 96-brønnen plater som vist i Figur 4. 100 TCID50/50 µL virus legges deretter i hver brønn. Når 1t inkubasjon tillate antistoffer i sera binde til virus, 100 µL av 1,5 x 105 celler/mL av MDCK-SIAT1 celler er lagt til i hver brønn. For optimale resultater skal MDCK-SIAT1 celler på 75-95% confluency (figur 1) for både TCID50 og MN analyser. Platene er deretter ruges i 18-20 h på 37 ° C, 5% CO2. Etter natten inkubasjon mengden av virus i hver brønn oppdages og kvantifisert ved en anti-influensa A NP ELISA (Figur 3).

OD i hver representerer også mengden av smitte og replikering i MDCK-SIAT1 celler i nærvær av serielt utvannet sera inneholder nøytraliserende antistoffer. Det kan tegnes mot sera fortynninger (figur 5). Den resiproke verdien av den høyeste serum fortynning som oppnådd ≥50% nøytralisering anses antistoff titer for serum prøven. Figur 5 viser eksempler på resultatene fra 2 pasienter med sammenkoblede sera testet mot A/HongKong/4801/2014 A(H3N2) 3C.2a virus pre- og post-influensa vaksinering. Med pasient 1 pre-vaksinasjon sera, ingen av sera fortynninger hemmet virusinfeksjon (figur 5, lys blå kurve), og derfor regnes som negative (< 10). Derimot hemmet etter vaksinasjon sera fra denne pasienten virus replikering, indikerer vaksine indusert nøytraliserende antistoffer. Den tredje fortynning av denne sera er den høyeste fortynning under 50% cut-off, således denne pasienten har en etter vaksinasjon titer 40 (figur 5, mørk blå kurve). Til sammenligning inneholder serum fra den andre pasienten pre-vaksinasjon eksisterende nøytralisere antistoffer i en titer 320. Etter vaksinasjon, titer økt til > 1280. I dette tilfellet på en 1:10 pre fortynning av serum, ingen antistoff slutten titer ble oppnådd. Serum bør testes på en høyere før fortynning re for å oppnå slutten titer.

Figure 1
Figur 1 . MDCK-SIAT1 cellekultur. MDCK-SIAT1 celler. (A) MDCK-SIAT1 confluent monolayer (> 100% confluency) for virus inoculation; (B) MDCK-SIAT1 celler i loggen fase med 75-95% confluency TCID50 og MN analyser.

Figure 2
Figur 2 . TCID plate oppsett. Virus infectivity bestemmes av TCID50. Virus lager er pre utvannet til 10-2, og deretter serielt utvannet på en ½ logg per fortynning til 10-7 (kolonne 1-11), på 8 gjentak per fortynning (rad A -H). Kolonnen 12 brukes som eneste cellekontroll. TCID50 av virus aksjen kan beregnes med metoden Reed-Muench.

Figure 3
Figur 3 . Skjematisk av MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler. 50 µL av inaktivert sera er serielt 2-fold utvannet i 96-wells platene. 50 µL av 100 TCID50 A(H3N2) virus legges deretter i hver brønn. Platene er ruges ved 37 ° C i 1 time å tillate binding av virus og antistoff. Deretter 1,5 x 104 MDCK-SIAT1-celler er lagt i hver brønn. Platene er ruges i 18-20 h på 37 ° C, 5% CO2. Etter natten inkubasjon plater er vasket og fast, mengden av virus i hver brønn er kvantifisert ved en ELISA bruker anti-influensa A NP monoklonale antistoffer. Sera antistoff titers beregnes basert på avskjær definert av virus kontroller og celle kontroller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . MN analysen plate oppsettet. Inaktivert sera er pre utvannet på 1:10, deretter serielt 2-fold fortynnet i 96-brønnen plater i kolonne 1-10. Virus kontroller (virus og celler, ingen sera) og celle kontroller (celler, ingen virus og ingen sera) er i kolonne 12. Kolonnen 11 brukes tilbake titrering eller kontroll-sera. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . MN analyseresultatene av menneskelig sera testet mot A/HongKong/4801/2014 A(H3N2) virus benytter MDCK-SIAT1 celler. Sera fra to pasienter pre- og post-2016-17 sesongens influensa vaksinering ble testet mot A/HongKong/4801/2014 A(H3N2) virus benytter MDCK-SIAT1 celler. Nøytralisering titers er resiproke til det høyeste serum fortynning som oppnår ≥50% virus nøytralisering, angitt med piler på hver kurve. Pasient 1: pre-vaksinasjon titer < 10 etter vaksinasjon titer 40; pasienten 2:pre-vaksinasjon titer 320, etter vaksinasjon titer > 1280.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MN analysen er en av de viktigste analyser brukes for influensa serologi for å oppdage antistoff svar etter influensa infeksjon eller vaksinasjon. Titers generert fra MN analyser er ofte brukt som primære utfallet av mange influensa seroepidemiology studier. MN analyser er også mye brukt for gjennomføre-diagnose og evaluering av vaksine immunogenisitet. Internasjonale mellom laboratorium studier har vært gjennomført for å sammenligne MN analyser utført i flere laboratorier14.

I motsetning til Hei, er MN analysen laget for å måle direkte funksjonelle antistoffer som kan nøytralisere virusinfeksjon i cellekultur. Det finnes ulike former for MN analyser i feltet over hele verden. Avlesing av analyser (dvs., reduksjon av virus infectivity i nærvær av nøytralisere antistoffer) kan være basert på ELISA kvantifisering av virus NP antistoffer, HA kvantifisering av viruset, eller immuno flekker av virus plaketter i hver brønn følgende virusinfeksjon i nærvær av antistoffer og inkubasjon i cellen kulturer14,15. Ulike former for lysstoffrør-baserte plakk reduksjon nøytralisering analyser (f.eks, fokus reduksjon analyser og ViroSpot analyser) brukes ofte til antigen karakteristikk av store antall influensa virus feltet isolert, delvis på grunn av lav viruset beløpet som kreves i disse søk15,16. Karakterisering av antistoff Svar å influensa i menneskelig serologi, 2-dagers ELISA basert MN analysen er anbefalt av Verdens helseorganisasjon (WHO) global influensa overvåkingen nettverket for serologisk diagnostisering av influensa3. Denne metoden er også mye brukt i gjennomføre-epidemiologi studier og evaluering av antistoff svar etter influensa vaksinering. Det påviser primært antistoffer mot influensa HA overflaten protein og derfor finner funksjonelle stammen spesifikke antistoffer.

Her beskriver vi en 2-dagers ELISA-baserte MN analysen som benytter MDCK-SIAT1 celler. Denne analysen er optimalisert for å oppdage nøytraliserende antistoffer mot moderne A(H3N2) virus i menneskelig sera. Flere kritiske trinn bør vurderes når utføre MN søk ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler. Først skal MDCK-SIAT1 celler være passaged i kultur medier som inneholder G418 sulfat for å opprettholde stabiliteten i den menneskelige αSIAT1 cDNA i cellen linje. G418 sulfat (f.eks, geneticin) er ikke nødvendig i media under virus forplantning og MN søk ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler. Cellene som brukes i MN analyser bør være Logg vekstfase med 75-95% confluency. Andre, gode virus er avgjørende for å utføre vellykkede MN analyser. Virus aksjer bør ha høy infectivity målt ved TCID50 titrering og et minimum av defekte partikler. Minimum fortynning av virus oppnå 100 TCID50/vel virus bør være lik eller større enn 1: 100. Selv om både egg og celle passaged virus kan brukes i MN analyser, MDCK-SIAT1 celle linje opprettholder bedre genetisk stabilitet for å spre 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus7. Etter virus forplantning, bør HA og NA gener av de virus ble sekvensert for å sikre at ingen egg eller celle kultur tilpasset mutasjoner er introdusert på viktige antigen nettsteder som kan forårsake endringer i antigenicity av viruset brukt i analysen. Tredje hvor mye smittsomme virus brukt i hver analysen bør være nøye titreres og bekreftet med inkluderingen av en tilbake titrering for hver virus inne hver analysen. For mye virus brukt i analysen kan senke antistoff titers oppdaget og redusere følsomheten til analysen. Likeledes, får for lite virus brukt i analysen svake VC signaler og høy bakgrunner (CC) og falske positive resultater. Derfor er det viktig å ta riktige positive og negative kontrollsera i analyser til å overvåke ytelsen. Når sammenlignende antistoff Svar å flere viruser benytter de samme sera, er det viktig å sikre at tilbake titrations av alle virus er innenfor et akseptabelt område.

MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler er følsom og bestemt på å oppdage antistoff svar til moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) influensavirus i menneskelig sera, inkludert antigenically drev A(H3N2) virus6. Denne analysen har blitt brukt til å evaluere vaksinert menneskelige sera paneler for 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus etter inaktivert influensa vaksinasjon5,17,18. Men som har influensa virus fortsette å erverve mutasjoner som kan endre antigenicity og reseptor Bindingsegenskapene for virus og forårsake antigen drift, er kontinuerlig innsats nødvendig å optimalisere eksisterende influensa serologi analyser for å opprettholde den sensitivitet og spesifisitet nødvendig å karakterisere nye nye influensavirus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer noen interessekonflikt. Funn og konklusjoner i denne publikasjonen er de av forfatterne, og representerer ikke nødvendigvis synet av Centers for Disease Control og Prevention og finansiering byrået.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu og Ms. Ashley Burroughs fra influensa divisjon av CDC for deres kritisk gjennomgang og hjelp i forberedelsene til denne oppgaven. Vi takker Dr. Adrian Reber fra influensa divisjon av CDC for hans hjelp forberede grafikken Figur3. Til slutt, vi takker Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland for å gi MDCK-SIAT1-celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine? Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
  3. WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf (2011).
  4. Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, discussion 73-34 39-51 (1999).
  5. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1 2017-2018 (2017).
  6. Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
  7. Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
  8. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment? J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  9. Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
  12. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
  13. Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
  14. Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
  15. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
  16. van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
  17. WHO. Recommended composition of infleunza virus vaccines for use in the 2015-2016 northern heamisphere infleunza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en 2015-2016 (2015).
  18. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1 2016-2017 (2016).

Tags

Infeksjonssykdommer problemet 129 A(H3N2) influensa virus MDCK-SIAT1 microneutralization TCID nøytraliserende antistoff immunitet
Måle influensa nøytralisere antistoff Svar å A(H3N2) virus i menneskelig Sera av Microneutralization søk ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson,… More

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson, S., Holiday, C., Levine, M. Z. Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells. J. Vis. Exp. (129), e56448, doi:10.3791/56448 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter