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Immunology and Infection

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

Anticuerpos neutralizantes de la gripe se correlacionan con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización medir anticuerpos neutralizantes en sueros humanos y se utilizan a menudo para serología humana de influenza. Se describe un ensayo de microneutralización con células MDCK-SIAT1 para medir títulos de anticuerpos neutralizantes a contemporáneos 3C.2a 3C.3a a (H3N2) virus y después de la vacunación contra la influenza o infección.

Abstract

Anticuerpos neutralizantes contra la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe se consideran el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización (MN) se utilizan a menudo para medir respuestas de anticuerpos neutralizantes en sueros humanos después de la vacunación contra la influenza o infección. Células de riñón canino Madine Darby (MDCK) son el sustrato de células utilizadas para los ensayos de MN. Sin embargo, circula la influenza a (H3N2) 3C.2a y 3C.3a han adquirido el virus alterado especificidad de unión del receptor. La línea de células MDCK-SIAT1 con fracciones mayor α-2,6 galactosa siálicos en la superficie ha demostrado para proporcionar la mayor infectividad y repeticiones más fieles que las células MDCK convencionales para estos virus a (H3N2) contemporáneos. Aquí, describimos un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 que ha sido optimizado para cuantificar los títulos de anticuerpos neutralizantes a estos virus (H3N2) contemporáneos. En este protocolo, suero inactivado por calor que contiene anticuerpos neutralizantes es primero en serie diluido, luego se incubó con 100 TCID50/de virus de la influenza a (H3N2) para permitir que los anticuerpos en los sueros para enlazar a los virus. Células MDCK-SIAT1 se añade a la mezcla de anticuerpo del virus y se incuba durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir a (H3N2) virus infectar las células MDCK-SIAT1. Después de la incubación durante la noche, se fijan las placas y la cantidad de virus en cada bien es cuantificada por un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) utilizando anti-influenza A anticuerpos monoclonales de nucleoproteína (NP). Título de anticuerpos de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero más alta que proporciona ≥50% de inhibición de la infectividad del virus.

Introduction

Virus de la influenza siguen causan morbilidad y mortalidad en la población cada año. HA es la principal glicoproteína superficial del virus de la gripe. Anticuerpos neutralizantes contra HA son el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de la gripe infección1,2. Ensayos de hemoaglutinación inhibición (HI) y ensayos de MN son dos métodos ampliamente utilizados para medir las respuestas del anticuerpo en el suero humano después de la infección o la vacunación de la gripe3. El ensayo HI mide inhibición de anticuerpos de la hemoaglutinación virus de glóbulos rojos y es considerado un ensayo de suplente. A diferencia de los HI, el ensayo de MN puede medir directamente los niveles de anticuerpos en sueros humanos que neutralizan la infección por influenza en cultivos celulares. Células MDCK se utilizan a menudo en el aislamiento del virus influenza y ensayos de MN4.

Virus de la gripe sufren constantemente deriva antigénica y cambio, adquisición de mutaciones en proteínas HA que pueden alterar la especificidad de Unión receptor de virus. Desde 2014, nuevos clústeres de H3N2 emergieron y continuaron circulando hasta la temporada actual. La mayoría de estos virus pertenece al grupo genético 3C.2a y 3C.3a basado en el análisis filogenético de las proteínas HA. Muchos de los virus circulantes de la 3C.2a habían reducido la capacidad de hemagglutinate de glóbulos rojos y por lo tanto no pueden ser caracterizados por ensayos de HI5. Ensayos de neutralización deben utilizarse para medir las respuestas de anticuerpos para estos virus que no hemagglutinate6. Además, los estudios han demostrado que estos virus a (H3N2) contemporáneos han alterado propiedades de enlace del receptor en comparación con anteriores a (H3N2) virus y tienden a acumular cultura adaptada mutaciones y polimorfismo cuando pasados en célula en vitro las culturas7,8,9. En comparación con las células MDCK convencionales, MDCK-SIAT1 es una línea de células desarrollada por Matrosovich et al. a través de la transfección estable de células MDCK con cDNA humano α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Esta línea celular expresa cantidades crecientes de α2, moléculas de galactosa 6-siálicos y disminución de α2, moléculas de ácido 3-siálicos que el padre de las células MDCK10. Las células de MDCK-SIAT1 han demostrado para mejorar el nivel de aislamiento de virus a (H3N2) en comparación con las células MDCK11. Recientemente, Lin et al. informó que para recién emergidas 3C.2a y 3C.3a humana a (H3N2) virus de la influenza, más fieles réplicas de virus e infectividad de virus mejor fueron alcanzados cuando los virus eran cultivadas en líneas de células MDCK-SIAT1 en comparación con las células MDCK7. Así, las células de MDCK-SIAT1 son los más adecuadas en MN ensayos para caracterizar las respuestas del anticuerpo a los recientes grupos de virus a (H3N2).

Aquí se describe un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 para medir respuestas del anticuerpo a contemporáneo 3C.2a y 3C.3a a (H3N2) virus en suero humano. Virus cultivados en huevos o en las células pueden usarse en este ensayo. Suero inactivado por calor que contiene anticuerpos neutralizantes es primero en serie diluido, luego se incubó con 100 TCID50/bien de influenza a (H3N2) para permitir que los anticuerpos en los sueros para enlazar con el virus. Células MDCK-SIAT1 se añade a la mezcla de anticuerpo del virus y se incuba durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir que el virus a (H3N2) infectar las células MDCK-SIAT1 y replicar. Después de la incubación durante la noche, las placas son fijos y la cantidad de virus en cada pozo es cuantificada por un ELISA utilizando anticuerpos monoclonales de anti-influenza A NP. La detección de NP indica la presencia de infección por el virus y la ausencia de anticuerpos neutralizantes. Título de anticuerpos de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero más alta que proporciona ≥ 50% de inhibición de la infectividad del virus.

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Protocol

Todos los virus de la gripe deben ser manejados según los requerimientos de nivel de bioseguridad apropiado (BSL-2 o superior) como se define en la bioseguridad en Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)12.

1. preparación de reactivos y Material de partida

  1. Preparar las células MDCK-SIAT1 y medio de cultivo celular estéril
    1. Preparar el medio de cultivo de células MDCK-SIAT1 con 500 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) de glucosa alta, calor de 10% v/v inactivo 2 mM L-glutamina, suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1 m m, sulfato de 1 mg/mL G418 (p. ej., Geneticin) y 100 U/ml de penicilina con estreptomicina 100 de μg/mL (opcional). Esterilizar por filtración a través de una membrana de tamaño de poro de 0.2 μm. Se agrega sulfato de G418 para asegurar la estabilidad del plásmido en las células MDCK-SIAT1.
    2. Preparar la línea de células MDCK-SIAT1 . 162 cm2- Deutsch de cultivo de tejidos que contienen 30 mL de medio de cultivo de células estériles, frascos con 2 a 2.5 x 106 MDCK-SIAT1 células de semillas e incubar a 37 ° C en 5% CO2 durante 2 días; Esto se utilizará para la determinación de dosis infecciosa (TCID) del cultivo de tejidos y MN ensayos.
      Nota: Las células MDCK-SIAT1 fueron proporcionadas amablemente por el Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemania10. Esta línea celular también se puede obtener comercialmente (véase la Tabla de materiales).
  2. Preparar los medios de propagación de virus estéril usando 500 mL de glucosa alta DMEM, 0.3% albúmina de suero bovino (BSA) fracción V, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 μg/mL y 20 mM HEPES. Esterilizar por filtración a través de una membrana de tamaño de poro de 0.2 μm.
  3. Preparar 0,75% (v/v) de células de sangre rojas de conejillo de Indias (gpRBCs) en tampón fosfato salino (PBS) que contiene PBS de 0,01 M, pH 7.2.
  4. Prepare el diluyente estéril virus con DMEM alta glucosa, 1% V de fracción de albúmina bovina (BSA), 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 μg/mL y 20 mM HEPES. Esterilizar por filtración con una membrana de tamaño de poro 0.2 μm y prepararse fresca para cada ensayo.
  5. Preparar el fijador celular frío como acetona fría de 80% en PBS (PBS de 0,01 M, pH 7,2).
  6. Preparar el tampón de lavado con PBS (0.01 M PBS pH 7.2) y 0.3% (v/v) de tween-20.
  7. Preparar el diluyente de anticuerpos utilizando PBS (PBS de 0,01 M, pH 7,2), 0.3% (v/v) de tween-20 y no 5% grasa leche en polvo.
  8. Utilice anti-influenza A NP ratón anticuerpo monoclonal, clon A1 y A3 piscina como el anticuerpo primario. Diluir con el diluyente en la concentración óptima determinada por titulación de anticuerpos.
  9. Cabra de uso anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa de rábano de caballo (HRP) como el anticuerpo secundario. Diluir con el diluyente en la concentración óptima determinada por titulación de anticuerpos.
  10. Preparar el sustrato de la peroxidasa con o- fenilendiamina dihidrocloruro (OPD) en tampón de citrato fosfato de 0.05 M a pH 5. Preparar el tampón de citrato fosfato de 0,05 M disolviendo 1 cápsula/100 mL desionizada H2O. disolver 1 OPD tableta (10 mg) y 20 mL de tampón de citrato fosfato inmediatamente antes del uso.
  11. Utilizar de 0,5 M de ácido sulfúrico como la OPD para la solución. Agregar 28 mL de stock de ácido sulfúrico de 18 M a 972 mL desionizada H2O en una campana química.
  12. Tratamiento de los sueros humanos y animales
    1. Inactive por calor los sueros humanos utilizados en los ensayos de MN en un baño de agua a 56 ° C por 30 min antes del ensayo. Usar inmediatamente o si es necesario, almacenar sueros descongelados a 4 ° C por no más de 24 h; Si es necesario el período de almacenamiento, almacenar sueros congelados a-20 ° C o más fríos.
    2. Tratar los sueros animales utilizados en los ensayos de MN con Receptor destrucción enzimática (RDE) e Inactive por calor antes de la prueba como sigue.
      1. Descongelar el suero en un baño de agua de 37 ° c y luego coloque en hielo. Mezclar 1 volumen de muestra de suero animal con 3 volúmenes de RDE. Incubar a 37 ° c durante 18-20 h.
      2. Inactive por calor el RDE tratado los sueros a 56 ° c para 30 min 6 añadir volúmenes de PBS, pH 7.2 a cada muestra para la dilución final de 1:10. Si es necesario almacenar los sueros descongelados a 4 ° C por no más de 24 h; Si es necesario el período de almacenamiento, almacenar sueros congelados a-20 ° C o más fríos.
        Nota: Sera Animal puede contener diversos glicanos de ácido siálico que pueden enlazar para la ha del virus de la influenza e inhiben el atascamiento de influenza específico anti-HA anticuerpos. Por lo tanto, es necesario RDE tratar todos los sueros de animales antes de los ensayos de MN para eliminar estas carpetas HA virales no específico en las muestras de suero.

2. paso de cultivo de células MDCK-SIAT1

Nota: Todas las culturas de célula deben realizarse en un gabinete para prevenir la contaminación de seguridad biológica.

  1. Decante el medio de cultivo de células de la monocapa de células en2 frascos de 162 cm. Trypsinize las células aclarando la monocapa con tripsina-EDTA. Añadir 5 mL de tripsina-EDTA para cubrir la monocapa celular. Incubar a 37 ° C, 5% CO2 hasta que la monocapa desprende (5-10 min). Añadir 15 mL de medio de cultivo de células MDCK-SIAT1 a cada frasco que contenga células tripsinizaron, pipeta hacia arriba y hacia abajo para separar las células.
  2. Utilizar un hemocitómetro y trypan azul para determinar que el recuento y viabilidad. Las células en frascos de cultivo de tejidos2 de 162 cm nuevo que contiene 30 mL de medio de cultivo celular con 2-2.5 x 106 células /flask de la semilla e incubar a 37 ° C con 5% CO2 durante 2 días para el uso en ensayos de TCID y MN. Células en 4-5 x 106 células/frasco de semillas e incubar a 37 ° C con 5% CO2 durante 2 días para el uso en la propagación de virus.
    Nota: La densidad de siembra puede ajustarse si se desean que los períodos de mayor o menor cultura. Para la propagación del virus, las células deben llegar a más de 100% confluencia. Para los ensayos de cultivo de tejidos infección dosis (TCID) y MN, las células deben de confluencia de 75-95% (figura 1).

3. propagación de virus a (H3N2) en las células MDCK-SIAT1

Nota: A (H3N2) virus puede propagar cualquier día de 10-11 en viejo embrionados gallina huevos según protocolo estándar3o células MDCK-SIAT1 culturas. Las células de MDCK-SIAT1 deben llegar a más de 100% confluency para la inoculación del virus. Las existencias de semillas de virus pueden ser inoculadas con varias diluciones de inóculo. Las diluciones de inóculo con la mejor cosecha HA e infectividad pueden utilizarse para ensayos de MN más.

  1. Retire el medio de cultivo de células de la monocapa celular (> 100% confluencia) en frascos de 162 cm2 . Lavar la monocapa dos veces con 15 mL de PBS estéril de 0,01 M, pH 7.2 y decantar.
  2. Etiqueta 1 frasco como control y añadir 20 mL de medio de propagación de virus. Incube el frasco a 37 ° C con 5% CO2. Dejar este matraz sin tocar y utilizar para la comparación después de 1 día de la propagación de virus.
  3. Añadir 10 mL de medio de propagación de virus estéril a la Deutsch e incubar todos Deutsch a 37 ° C, 5% CO2. Descongelar un vial de existencias de virus de influenza a temperatura ambiente y luego coloque en hielo. Diluir con los medios de propagación de virus a las diluciones de destino.
    Nota: Objetivo diluciones pueden ajustarse basado en títulos HA de las poblaciones de virus de. Para preparar una 1: 1000 diluida inóculo, añada 100 μl de virus a 9,9 mL de medio de propagación de virus estéril. Invertir suavemente, retirar 1 mL de dilución 1: 100 a 9 mL de medio de propagación de virus estéril, invierta suavemente para un inóculo de 1: 1000 diluida. Coloque en hielo.
  4. Retire todos los matraces excepto el frasco de control de la incubadora. Retire el medio de propagación de virus de Deutsch de células MDCK-SIAT1 e inocular cada frasco con 10 mL de virus diluido. Incube los frascos a 37 º C, 5% CO2 para 1 h, rotando el Deutsch cada 15 minutos.
  5. Extraer 5 mL de inóculo de la Deutsch y reemplazar con medios de propagación de virus de 15 mL que contiene 1 μg/mL de tripsina TPCK. Incubar el Deutsch a 37 ° C, 5% CO2 para 16-18 h.
  6. Después de la incubación durante la noche, observar el Deutsch bajo 100 X magnificación del microscopio y buscar efectos citopáticos (CPE) en las células. Retire 15-17 mL de sobrenadante del virus de la Deutsch y reemplazar con 15-17 mL de medio de propagación de virus recién preparada que contiene 2 μg/mL de tripsina TPCK.
  7. Incube los frascos a 37 º C, 5% CO2. Supervisar el CPE de la monocapa (en comparación con el frasco de control de la célula) y Compruebe la HA periódicamente (cada 4 h) con 0,75% gpRBC hasta la cosecha.
    1. Configurar una placa de microtitulación de 96 HA-bien. Añadir 50 μl de PBS de 0,01 M, pH 7,2, en pocillos A2 - A12 y B2 - B12 (duplicados) y los pozos H1 - H12 para control.
    2. Añadir 100 μl de sobrenadante de virus a A1 y A2, realizar una dilución seriada 2 veces de A1 y B1 a través de la A12 y B12. Descartar 50 μl después de mezclar en A12 y B12. Añadir 50 μl de 0,75% gpRBCs a las filas A, B y H.
    3. Toque en la placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      1. Determinar HA del virus sobrenadante inclinando la placa de microtitulación de 96 pocillos en un 45° ángulo de 60°.
      2. Leer las placas para la hemaglutinación; la mayor dilución del virus que logra hemoaglutinación completa se considera el punto de final de titulación HA del virus específico. Grabar el recíproco de la dilución de virus más alta con hemaglutinación completa como el título de la HA del virus.
        Nota: Los hematíes colocados en fila H (controles) deben empezar a "correr" y forma una pequeña lágrima debido a la gravedad. Espere hasta los glóbulos rojos en el control de pozos acabado entonces correr, Lee los botones de RBC en el virus pozos de valoración. Aquellos que presentan botones de RBC y "ejecutar", no logran hemaglutinación. Localice la mayor dilución del virus que inhiben completamente la hemaglutinación como el punto final HA título del virus.
  8. El virus de la cosecha cuando la HA de la cultura de virus mesetas o la cultura del virus alcanza el objetivo HA (por ejemplo, > 16 HAU), pero antes la célula monocapa comienza a mostrar importante CPE.
    1. Centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 10 min a 4 ° C para que sedimenten los detritos celulares de cultivo de virus. Transferir el sobrenadante clarificado con la cosecha de virus a un tubo limpio. Alícuota del sobrenadante que contiene el virus de la cosecha en viales criogénicos estériles de un solo uso y congelar inmediatamente a-70 ° C o más frío.
      Nota: Las poblaciones de virus utilizadas para los ensayos de MN deben tener alto título infeccioso y mínimas partículas defectuosas. La dilución mínima de poblaciones de virus para alcanzar 100 TCID5050 μL para el ensayo de MN es 1: 100.
      Nota: Las poblaciones de virus utilizadas en los ensayos de MN deben no descongelar y congelar.

4. determinación de TCID de Virus

  1. Día 1: Titulación de Virus
    1. Descongelar un vial de virus a temperatura ambiente y colocar inmediatamente en hielo.
    2. Probar el virus en dos diluciones diferentes de partida: 10-2 y 10-3. Añadir 100 μl de virus a 9,9 mL de diluyente para la dilución-2 10 virus. Añadir 1 mL de la dilución-2 10 a 9,0 mL de diluyente por 10-3 dilución de virus.
    3. Uso de microtitulación dos placas (placa de 1 de 10-2 dilución) y placa 2 para dilución de 10-3 , agregar 100 μl de diluyente de virus a excepción de la columna 1 de la placa de microtitulación de 96 pocillos.
    4. Realizar diluciones de10 ½log (10-2, 10-2.5, 10-3, etc.). Añadir μl 146 del virus a partir de dilución a los pocillos en la columna 1 y 46 μl de transferencia en serie de la columna 1 a través de la columna 11 (figura 2). Puntas de pipeta los cambio entre pozos. Después de mezclar la columna 11, desechar las puntas con la dilución 46 μl.
    5. Utilice la columna 12 como el Control de la célula (CC); sólo contiene diluyente de virus. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
  2. Día 1: Preparación de las células de MDCK-SIAT1
    Nota: La monocapa de células MDCK-SIAT1 debe alcanzar 75-95% de confluencia para los ensayos de TCID y MN. Un frasco de 162 cm2 95% confluencia debe producir suficientes células para semilla ~ 4-5 placas de microtitulación.
    1. Lavar la monocapa confluente de 75-95% con 20 mL de PBS para eliminar la FBS en los medios de cultivo. Trypsinize las células como sigue.
      1. Lavar la monocapa con PBS estéril, añadir 7 mL de tripsina-EDTA para cubrir la monocapa celular. Coloque el matraz plano e incubar a 37 ° C, 5% CO2 hasta que la monocapa desprende (aproximadamente 5-10 min). Agregar 7 mL de diluyente de virus a cada frasco que contiene las células trypsinized.
    2. Lavar las células con diluyente virus para quitar el FBS.
      1. ¡Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células. Transferir las células a un tubo cónico de 50 mL; llenar el tubo con diluyente de virus.
      2. Centrifugue a 485 x g durante 5 min, decantar el virus diluyente, reemplazar con diluyente de virus fresca 50 mL y centrifugue a 485 x g por 5 min, decantar el virus diluyente y reemplazar con diluyente virus fresco (10 mL/frasco) para Resuspender el precipitado.
    3. Utilizar un hemocitómetro y trypan azul para determinar el recuento de células y la viabilidad. Ajustar la concentración de la célula con el diluyente a 1.5 x 105 células/mL de virus.
    4. Añada 100 μl de células MDCK-SIAT1 diluidas en cada pocillo de las placas de microtitulación (1.5 x 104 células/pocillo) y cubrir las placas. Incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 18-20 h.
  3. Día 2: ELISA
    1. Fijación de las células
      1. Retire el medio de las placas de microtitulación. Lave cada uno con 200 μL de PBS. Añadir frío 80% acetona de 300 μl a cada pozo e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos retirar el fijador y deje secar las placas al aire.
    2. ELISA
      1. Adición del anticuerpo primario
        Nota: Puede usarse en exceso de anticuerpo monoclonal de anti-influenza A NP como el anticuerpo primario en ELISA. Determinar la dilución óptima del anticuerpo para cada lote de anticuerpos primarios mediante la realización de valoraciones de anticuerpos en MN. Seleccionar la concentración de anticuerpo primario que está en exceso y con la mejor relación señal a fondo.
        1. Diluir la gripe NP de un anticuerpo monoclonal (anticuerpo primario) a la concentración de destino en el diluyente de anticuerpos (p. ej. Añadir 30 μl de anticuerpo primario a 30 mL de diluyente para la dilución de la meta de 1: 1000 del anticuerpo).
        2. Lavar las placas 3 veces con 300 μL de tampón de lavado. Añadir el anticuerpo primario diluido de 100 μl a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      2. Adición del anticuerpo secundario
        Nota: Cabra anti ratón IgG conjugado con rábano peroxidasa (HRP) se debe utilizar en exceso como anticuerpo secundario en ELISA. Determinar la dilución óptima del anticuerpo para cada lote de anticuerpos secundarios mediante la realización de valoraciones de anticuerpos. Seleccionar la concentración de anticuerpo secundario en exceso y con la mejor relación señal a fondo.
        1. Diluir la cabra anti-ratón que IgG conjugado al anticuerpo (anticuerpo secundario) de la HRP hasta la concentración objetivo en el diluyente de anticuerpos (p. ej. 7.5 añadir μl del anticuerpo secundario a 30 mL de diluyente para la dilución de 1:4000 objetivo del anticuerpo).
        2. Lavar los platos 3 veces con 300 μL de tampón de lavado. Añadir el anticuerpo secundario diluido de 100 μl a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      3. Adición de sustrato y lectura de la placa
        1. Lavar las placas 5 veces con 300 μL de tampón de lavado y el golpecito en un paño libre de pelusas.
        2. Añadir 100 μl de sustrato recién preparada a cada pozo e incubar a temperatura ambiente hasta que satura el desarrollo del color y la densidad óptica (OD) de los pocillos de control celular < 0,2.
        3. Añada 100 μl de solución de parada en todos los pocillos. Leer el OD de los pozos a 490 nm usando un espectrofotómetro para microplacas.
  4. Cálculo de TCID 50
    1. Calcular la mediana de OD490 de los controles de celda (columna 12).
    2. Considerar cualquier prueba con un OD490 mayor que dos veces la mediana OD490 de los pozos CC como "positivo"; de lo contrario, se considera "negativo".
    3. Calcular el TCID50 del virus usando el método Reed-Muench del13.
      1. Determinar el número de positivos y negativos en cada dilución.
      2. Calcule la "acumulado positivo", "Acumulado negativo", "Relación" y "% positiva" como ilustrado en la tabla 1.
      3. Calcular la "distancia proporcional" entre la muestra dilución > 50% positivos y el demostrar de dilusión < 50% positivos utilizando lo siguiente:
        Equation 1
        Nota: El factor de corrección por dilución log ½ es de 0,5. Por ejemplo, en la tabla 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. Calcular el virus TCID50 añadiendo la distancia proporcional a la dilución con > 50% positivos.
        Nota: por ejemplo, en la tabla 2, TCID50 es 10-5+(-0.25) = 10-5.25. Nota que esto es TCID50 del virus por 100 μl (o 10-5.25100 μL).
    4. Calcular la dilución de virus. Para los ensayos de MN, diluir el virus a 200 TCID50100 μl (equivalente a 100 TCID5050 μL por pocillo).
      Nota: En el ejemplo en la tabla 1, 1 TCID50 es 10-5.25 en 100 μl, y la dilución para conseguir 200 TCID50100 μl es 1:891 basado en los cálculos: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102.95 = 1 / 891

5. MN ensayo con células MDCK-SIAT1

  1. Día 1: Prueba y control de sueros preparación y placa de diseño
    1. Descongelar los sueros en baño de agua de 37 ° C y retirar inmediatamente después de descongelarla. Alícuota de la cantidad de suero que debe probarse; se necesita un mínimo de 10 μl del suero original para probar con un virus en la camiseta. La prueba sera por duplicado si es posible.
    2. Inactive por calor el suero humano por 30 min en un baño de agua de 56 ° C como en el paso 1.12.1. Lugar sera de hielo post inactivación del calor, añadir el diluyente de virus sera para lograr un 1:10 dilución previa.
    3. RDE tratar y pre-diluir los sueros animales a 1:10 para controles por 1.12.2.
      Nota: Sera descongelada y tratado humana y animal puede almacenarse a 4 ° C para no que 24 h. sueros deben guardarse congelada a-20 ° C o más frío si más largo período de almacenamiento es necesario antes de la prueba.
    4. Para probar con un virus, añadir 100 μL 1:10 diluido sera a columnas de A1 a A10 (figura 4). Añadir 50 μl de diluyente de virus a las filas de B por H, excepto columnas 11 y 12 (figura 4). Realizar una dilución seriada 2 veces de filas A H y deseche la última 50 μL en la columna H (figura 4).
      Nota: Cuando varios virus para ser probado, sera se puede diluir en tubos de título. La dilución de suero, para el propósito de determinar el título del suero, en el bien A es 1:10, bien B 1:20, bien C 1:40, bien D 1: 80, bien E 1: 160, bien F 1:320, bien G 1: 640, bien 1:1,280 de H (figura 4).
    5. Para el control de virus, añadir 50 μl de diluyente de virus a pozos A12, B12, C12 y D12 (no suero). Para el control de la célula, añadir 100 μl de diluyente de virus a pozos E12, F12, G12 y H12 (no virus, no sera).
    6. Para los sueros de control (por ejemplo, controles de sueros de hurón), añada 100 μl de los sueros control diluido bien una columna 11 y añadir 50 μl de diluyente de virus a pozos B11 - H11. Serie diluida hacia abajo.
    7. Las placas de la cubierta, incubar a 37 ° C, 5% CO2 hasta que esté listo para la incorporación de virus.
  2. Día 1: Además de Virus
    1. Diluir el virus con el virus de diluyente 100 TCID5050 μl.
    2. Añadir virus diluido de 50 μl a todos los pocillos, excepto columna 11 en las placas de valoración posterior (BT) y los pocillos de control celular E12, F12, G12 y H12 en todas las placas (figura 4). Para las placas con sueros de control en la columna 11, añadir virus a columna 11.
    3. Valoración posterior (BT)
      1. Incluyen un BT en la columna 11 de un juego de placas duplicadas (por ejemplo, la placa 1A y 1B). Añadir 50 μl de diluyente de virus a todos los pozos en la columna 11. Añada 50 μl del virus en 100 TCID5050 μL para el primer pozo (A11). Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
      2. Mezclar y transferir 50 μl a los pozos sucesivos para realizar diluciones seriadas 2 veces. Cambiar las puntas de pipetas entre pozos para evitar la transferencia de virus. Descartar 50 μl de H11 bien.
      3. Añadir 50 μl de diluyente a columna 11 para llevar el volumen final a 100 μl. de virus golpee las placas para mezclar.
    4. Incube las placas a 37 ° C, 5% CO2 para 1 h.
    5. Realizar la adición de células MDCK-SIAT1 el día 1 y ELISA en el día 2 como se describe en los pasos 4.2 y 4.3 (también descrito en 5.3 y 5.4)
  3. Día 1: Además de células MDCK-SIAT1
    1. Preparar las células de MDCK-SIAT1 como se describe en el paso 4.2. Añadir las células MDCK-SIAT1 de 100 μl a 1.5 x 105 células/mL a cada pozo (1.5 x 104 células/pocillo). Incubar las placas a 37 ° C, 5% CO2 para 18-20 h.
  4. Día 2: ELISA
    1. Después de la incubación durante la noche, en el segundo día, fijar las células con acetona fría 80% tal como se describe en el paso 4.3.
    2. Adición del anticuerpo primario
      1. Lavar los platos 3 veces con 300 μL de tampón de lavado. Diluir la gripe NP de un anticuerpo monoclonal (anticuerpo primario) a la concentración óptima determinada por titulación en diluyente de anticuerpos (p. ej. Añadir 30 μl de anticuerpo primario a 30 mL de diluyente para la dilución de la meta de 1: 1000 del anticuerpo).
        Nota: se requiere bien, 100 μl de anticuerpo primario. ~ se necesitan 10 mL por placa.
      2. Añadir el anticuerpo primario diluido de 100 μl a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    3. Adición del anticuerpo secundario
      1. Lavar las placas 3 veces con 300 μL de tampón de lavado. Diluir la cabra anti ratón IgG conjugada con HRP anticuerpo (anticuerpo secundario) a la concentración objetivo en diluyente de anticuerpos (p. ej. 7.5 añadir μl del anticuerpo secundario a 30 mL de diluyente para un 1:4000 blanco de anticuerpos.)
        Nota: 100 μl del anticuerpo secundario es requerido por 96. ~ se necesitan 10 mL por placa.
      2. Añadir el anticuerpo secundario diluido de 100 μl a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Adición de sustrato y lectura de la placa
      1. Lavar las placas 5 veces con 300 μL de tampón de lavado y el golpecito en paño libre de pelusas.
      2. Añadir 100 μl de sustrato recién preparada para cada bien e incubar a temperatura ambiente hasta los pozos de control de virus un OD490 = 0.8 - 3, con el control de la célula en un bajo fondo OD490 < 0,2.
      3. Añada 100 μl de la solución de parada en todos los pocillos. Leer el OD de los pozos a 490 nm usando un espectrofotómetro para microplacas.
  5. Análisis de datos
    Nota: Los cálculos de MN se determinan para cada placa individualmente.
    1. Determinar el título de anticuerpos neutralizantes de cada muestra de suero.
      1. Calcular el límite de490 OD de neutralización de virus de 50% para cada placa con la siguiente ecuación:
        Equation 2
        Nota: Aquí x = 50% del corte de neutralización. La dilución de suero recíproco correspondiente a la dilución más alta con OD490 menos del 50% del corte (≥50% de inhibición) se considera el título de anticuerpos de neutralización para esa muestra de suero (figura 5).
    2. Comprobar que los pocillos de control celular una OD490 < 0,2 y los pozos de control de virus tienen un OD490 = 0.8 - 3.
    3. Verifique que la infectividad del virus en cada ensayo (100 x TCID50) por virus BT la gama aceptable de BT es de 50, 100 o 200 TCID. Si usa el mismo corte tal como se define en el paso 4.4.2, la mayor dilución del virus en la columna de BT con OD por encima de la corte debe ser en los pocillos E11, F11, G11.
      Nota: Los sueros de control positivo deben dar títulos en 2 de los valores obtenidos en las pruebas anteriores. OD490 del control suero negativo debe ser similar al observado para el control de virus.

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Representative Results

Determinación de la infectividad de las cepas de virus es el primer paso en el ensayo de MN. La figura 2 ilustra el diseño de la placa para determinar el TCID50 de las cepas de virus. De las poblaciones de virus con infectividad desconocido, el virus puede titularse de múltiples diluciones previas, por ejemplo tanto 10-2 y 10-3, para capturar la mejor curva de valoración para calcular la capacidad infectiva del virus. La cantidad de virus utilizada en el ensayo de MN debe ser estandarizada 100 TCID50/well (50 μL). La dilución mínima de poblaciones de virus para lograr un 100 TCID50/bien es 1: 100.


Figura 3 describe los pasos críticos de un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1. Suero inactivado por calor es serie diluida en placas de 96 pocillos como se ilustra en la figura 4. 100 virus de μl de5050 TCID se añaden a cada pocillo. Después de 1 h de incubación para permitir que el anticuerpo sera unen al virus, se añaden 100 μl de 1.5 x 105 células/mL de células MDCK-SIAT1 a cada pocillo. Para obtener resultados óptimos, las células MDCK-SIAT1 deben estar en la confluencia de 75-95% (figura 1) para los análisis de MN y TCID50 . Luego se incuban las placas durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2. Después de la incubación durante la noche, la cantidad de virus en cada pozo es detectada y cuantificada por ELISA anti-influenza A NP (figura 3).

El OD en cada bien representa la cantidad de virus de la infección y replicación en las células MDCK-SIAT1 en presencia de suero en serie diluido que contiene anticuerpos neutralizantes. Pueden ser graficado contra las diluciones de los sueros (figura 5). El recíproco de la dilución de suero más alta que logra ≥50% neutralización se considera el título del anticuerpo de la muestra de suero. Figura 5 contiene ejemplos de los resultados de 2 pacientes con sueros apareados probados contra el a (H3N2) A/Hong Kong/4801/2014 3C.2a pre y post gripe vacuna contra el virus. Con sueros de paciente 1 vacunación previa, ninguna de las diluciones de sueros inhibieron la infección del virus (figura 5, la curva azul clara) y por lo tanto se considera negativo (< 10). En cambio, tras la vacunación sera de este paciente inhibe replicación del virus, que indica vacunación inducido por anticuerpos neutralizantes. La tercera dilución de este suero es la dilución más alta debajo de la corte de 50%, así este paciente tiene un título tras la vacunación de 40 (figura 5, la curva azul oscurezca). En comparación, el suero de la segunda pre-vacunación paciente contiene preexistentes de neutralizar anticuerpos en un título de 320. Después de la vacunación, el título aumentó a > 1.280. En este caso, en un 1:10 la dilución de suero, no título del anticuerpo del final fue alcanzado. El suero debe analizarse nuevamente a la mayor dilución previa para alcanzar el título final.

Figure 1
Figura 1 . Cultivo de células MDCK-SIAT1. Células de MDCK-SIAT1. (A) monocapa confluente MDCK-SIAT1 (> 100% confluencia) para la inoculación del virus; (B) MDCK-SIAT1 células en fase logarítmica con 75-95% de confluencia para el análisis de MN y TCID50 .

Figure 2
Figura 2 . Diseño de placa TCID. Infectividad de los virus está determinada por TCID50. Virus es previamente diluido a 10-2y luego en serie diluido en un registro ½ por dilución al 10-7 (columna 1-11), a 8 repeticiones por dilución (columna A -H). Columna 12 se utiliza como el único control de la célula. TCID50 de la población de virus puede ser calculada usando el método Reed-Muench.

Figure 3
Figura 3 . Esquema del ensayo de MN con células MDCK-SIAT1. 50 μl del suero inactivado con calor en serie se diluyen 2 en placas de 96 pozos. 50 μl de 100 TCID50 de virus a (H3N2) se añaden a cada pocillo. Las placas se incuban a 37 ° C durante 1 hora permitir a la Unión del virus y anticuerpos. Entonces 1.5 x 104 MDCK-SIAT1 células se añaden a cada pocillo. Las placas se incuban por 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2. Después de la incubación durante la noche, las placas son lavadas y fijo, la cantidad de virus en cada pozo es cuantificada por un ELISA utilizando anticuerpos monoclonales de anti-influenza A NP. Títulos de anticuerpos de los sueros se calculan basándose en cortes definidos por controles de virus y la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . El diseño de la placa de ensayo de MN. Suero inactivado por calor es previamente diluido al 1:10, entonces en serie 2 diluido en placas de 96 pocillos en columna 1-10. Controles de virus (virus y células solamente, no sera) y celular (células solamente, sin virus y no sera) están en la columna 12. Columna 11 se utiliza para sueros control o valoración posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Los resultados del ensayo de MN de sueros humanos probaron contra virus a (H3N2) A/Hong Kong/4801/2014 con células MDCK-SIAT1. Sueros de vacunación contra la influenza estacional pre- y post-2016-17 dos pacientes fueron probados contra virus a (H3N2) A/Hong Kong/4801/2014 con células MDCK-SIAT1. Títulos de neutralización son el recíproco de la dilución de suero más alta que logra la neutralización de virus de ≥50%, según lo indicado por las flechas en cada curva. Paciente 1: vacunación previa título < título tras la vacunación 10, 40; paciente 2:pre-título vacunación 320, el título tras la vacunación > 1.280.

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Discussion

El ensayo de MN es uno de los principales análisis utilizados para serología influenza para detectar respuestas de anticuerpos después de la infección por influenza o vacunación. Títulos generados a partir de ensayos de MN se utilizan a menudo como el resultado primario de muchos estudios de seroepidemiología de la influenza. Análisis de MN son también ampliamente utilizados para sero diagnóstico y la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna. Se han realizado estudios internacionales inter-laboratorio para comparar ensayos de MN en múltiples laboratorios14.

En contraste con HI, el ensayo de MN es diseñado para medir directamente anticuerpos funcionales que pueden neutralizar la infección del virus en cultivo celular. Hay varias formas de MN ensayos utilizados en los laboratorios de campo alrededor del mundo. La lectura de los ensayos (es decir, reducción de la infectividad del virus en presencia de anticuerpos neutralizantes) puede basarse en la cuantificación de ELISA de anticuerpos del virus de NP, cuantificación de la HA del virus, o inmuno-tinción de las placas de virus en cada pozo después de la infección de virus en la presencia de anticuerpos e incubación en culturas de célula14,15. Distintas formas de ensayos de neutralización de la reducción placa base fluorescente (p. ej., enfoque reducción ensayos y ensayos ViroSpot) a menudo se utilizan para la caracterización antigénica de un gran número de aislamientos de campo virus influenza, en parte debido al virus bajo cantidad requerida en estos ensayos de15,16. Para la caracterización de las respuestas del anticuerpo a la gripe en humana serología, la prueba de ELISA de 2 días basado en MN ensayo recomendado por la red de vigilancia de influenza global de Organización Mundial de la salud (OMS) para el diagnóstico serológico de influenza3. Este método es también ampliamente utilizado en estudios sero-epidemiológicos y la evaluación de las respuestas de anticuerpos tras la vacunación contra la influenza. Detecta fundamentalmente anticuerpos contra la gripe HA proteína superficial y por lo tanto pueden detectar anticuerpos específicos de tensión funcionales.

Aquí, describimos un día 2 ensayo de MN basados en ELISA que utiliza las células MDCK-SIAT1. Este ensayo está optimizado para la detección de anticuerpos neutralizantes al virus a (H3N2) contemporáneos en suero humano. Varios pasos críticos deben considerarse al realizar MN ensayos con células MDCK-SIAT1. En primer lugar, las células de MDCK-SIAT1 deben ser pasadas en medios de cultivo que contiene sulfato de G418 para mantener la estabilidad del cDNA humano αSIAT1 en la línea celular. Sulfato de G418 (e.g., geneticin) no es necesaria en los medios de comunicación durante la propagación de virus y MN ensayos con células MDCK-SIAT1. Las células utilizadas en los ensayos de MN deben ser en fase de crecimiento logarítmica con 75-95% de confluencia. Las poblaciones de virus en segundo lugar, bueno son esenciales para llevar a cabo ensayos exitosos de MN. Las poblaciones de virus deben tener alta infectividad medida por TCID50 titulación y una mínima cantidad de partículas defectuosas. La dilución mínima de cepas de virus a lograr 100 TCID50/bien virus debe ser igual o mayor que 1: 100. Aunque el huevo y la célula pasados virus pueden ser utilizados en ensayos de MN, línea de células MDCK-SIAT1 mantiene mejor estabilidad genética para la propagación de virus de a (H3N2) 3C.2a y 3C.3a7. Después de la propagación de virus, genes HA y NA de las poblaciones de virus deben ser secuenciados para asegurarse de que no hay cultura de huevo o célula adaptadas mutaciones introducen en sitios clave antigénicos que pueden causar cambios en la antigenicidad del virus utilizado en el ensayo. En tercer lugar, la cantidad de virus infecciosos utilizados en cada ensayo debe ser cuidadosamente graduado y se verificó con la inclusión de una valoración posterior para cada virus en cada ensayo. Demasiado virus utilizado en el análisis puede reducir los títulos de anticuerpos detectados y la sensibilidad del ensayo. Asimismo, virus muy poco utilizado en el ensayo hará las señales débiles de VC y altos fondos (CC) y falsos positivos. Por lo tanto, es importante incluir sueros control positivos y negativos adecuados en los ensayos para supervisar el rendimiento. Al comparar las respuestas del anticuerpo a múltiples virus usando el mismo sera, es fundamental para asegurar que atrás valoraciones de todos los virus dentro de un rango aceptable.

El ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 es sensible y específico en la detección de respuestas del anticuerpo a 3C.2a contemporáneo y 3C.3a virus de la influenza a (H3N2) en suero humano, incluyendo antigénicamente desvió a (H3N2) virus6. Este análisis se ha utilizado para evaluar los sueros humanos vacunados paneles a los virus a (H3N2) 3C.2a y 3C.3a siguiendo inactivados influenza vacunación5,17,18. Sin embargo, como de gripe virus continúan adquirir mutaciones que pueden alterar la antigenicidad y propiedades de enlace del receptor del virus y causar deriva antigénica, se necesitan esfuerzos continuos para optimizar el análisis de serología influenza existentes con el fin de mantener la sensibilidad y especificidad necesaria para caracterizar el nuevo virus de influenza emergentes.

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Disclosures

Los autores no divulgan ningún conflicto de interés. Los resultados y conclusiones en esta publicación son las de los autores y no representan necesariamente las opiniones de los centros para el Control y prevención y la Agencia de financiación.

Acknowledgments

Agradecemos a Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu y Sra. Ashley Burroughs de la división de Influenza de los CDC para su revisión crítica y la asistencia en la preparación de este manuscrito. Agradecemos al Dr. Adrian Reber de la división de Influenza de los CDC para su asistencia en la preparación de los gráficos de la figura 3. Por último, agradecemos a Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemania para proporcionar las células MDCK-SIAT1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

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References

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