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Immunology and Infection

मापने इंफ्लूएंजा को निष्क्रिय एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को एक (H3N2) मानव सीरा में Microneutralization परख द्वारा MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग कर वायरस

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

इंफ्लूएंजा बेअसर एंटीबॉडी इंफ्लूएंजा संक्रमण के संरक्षण के साथ सहसंबंधी बनाना । Microneutralization परख मानव सीरा में एंटीबॉडी को बेअसर उपाय है और अक्सर इंफ्लूएंजा मानव सीरोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया । हम एक microneutralization MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख समकालीन 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (titers) वायरस इंफ्लूएंजा टीकाकरण या संक्रमण के बाद एंटीबॉडी H3N2 बेअसर उपाय का वर्णन ।

Abstract

hemagglutinin के खिलाफ एंटीबॉडी बेअसर (हा) इंफ्लूएंजा वायरस के मुख्य प्रतिरक्षा तंत्र माना जाता है कि इंफ्लूएंजा संक्रमण के लिए सुरक्षा के साथ संबद्ध । Microneutralization (MN) परख अक्सर मानव सीरा में इंफ्लूएंजा टीकाकरण या संक्रमण के बाद एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को निष्क्रिय उपाय किया जाता है । मादीने डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं MN परख के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल सब्सट्रेट हैं । हालांकि, वर्तमान में घूम 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (H3N2) इंफ्लूएंजा वायरस बदल रिसेप्टर बाध्यकारी विशिष्टता हासिल कर ली है । इस MDCK-SIAT1 सेल लाइन के साथ बढ़ α-2, 6 sialic गैलेक्टोज moieties सतह पर इन समकालीन ए (infectivity) वायरस के लिए पारंपरिक MDCK कोशिकाओं की तुलना में सुधार H3N2 और अधिक वफादार प्रतिकृतियां प्रदान करने के लिए सिद्ध किया है । यहां, हम एक MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं है कि इन समकालीन एक (H3N2) वायरस एंटीबॉडी titers को बेअसर करने के लिए अनुकूलित किया गया है का उपयोग परख का वर्णन । इस प्रोटोकॉल में, गर्मी निष्क्रिय एंटीबॉडी युक्त सीरा पहले प्रश्नपत्र पतला कर रहे हैं, तो १०० TCID५०इंफ्लूएंजा के एक (H3N2) वायरस के साथ मशीन के लिए सीरा में एंटीबॉडी को वायरस से बाइंड करने की अनुमति । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को फिर वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण करने के लिए जोड़ रहे हैं, और ३७ ° c, 5% CO2 पर 18-20 h के लिए तैयार करने के लिए एक (H3N2) वायरस MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अनुमति देते हैं । रातोंरात गर्मी के बाद, प्लेटें तय कर रहे है और एक अच्छी तरह से वायरस की मात्रा में एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) विरोधी का उपयोग कर मात्रा है इंफ्लूएंजा एक nucleoprotein (एनपी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी । बेअसर एंटीबॉडी titer वायरस infectivity के ≥ ५०% अवरोध प्रदान करता है कि उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने के पारस्परिक के रूप में परिभाषित किया गया है ।

Introduction

इंफ्लूएंजा वायरस के लिए हर साल मानव आबादी में रुग्णता और मृत्यु का कारण जारी है । हा इंफ्लूएंजा वायरस की प्रमुख सतह ग्लाइकोप्रोटीन है । एंटीबॉडी लक्ष्यीकरण हा बेअसर मुख्य प्रतिरक्षा तंत्र है कि इंफ्लूएंजा संक्रमण1,2के संरक्षण के साथ संबद्ध हैं । Hemagglutination निषेध (हाय) परख और MN परख दो व्यापक रूप से मानव सीरा में इंफ्लूएंजा संक्रमण या3टीकाकरण के बाद एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं । हाय परख उपाय एंटीबॉडी लाल रक्त कोशिकाओं के वायरस hemagglutination के निषेध और एक किराए की परख माना जाता है । हाय के विपरीत, एमएन परख सीधे मानव सीरा में एंटीबॉडी के स्तर को मापने कर सकते है कि कोशिका संस्कृतियों में इंफ्लूएंजा संक्रमण बेअसर । MDCK कोशिकाओं को अक्सर इंफ्लूएंजा वायरस अलगाव और एमएन परख4में प्रयोग किया जाता है ।

इंफ्लूएंजा वायरस लगातार प्रतिजनी बहाव और बदलाव से गुजरना, हा प्रोटीन है कि वायरस के रिसेप्टर बाइंडिंग विशिष्टता को बदल सकते है पर उत्परिवर्तन प्राप्त । २०१४ के बाद से, एक (H3N2) वायरस के नए समूहों उभरा और मौजूदा मौसम तक प्रसारित करने के लिए जारी रखा । इन वायरस के अधिकांश आनुवंशिक समूह 3 सी. 2a और 3 सी. 3. के आधार पर वंशावली विश्लेषण के लिए कर रहे है हा प्रोटीन । परिसंचारी 3 सी. 2a वायरस के कई hemagglutinate लाल रक्त कोशिकाओं को कम करने की क्षमता थी और इसलिए हाय परख द्वारा विशेषता नहीं किया जा सकता है5। बेअसर परख इन वायरस है कि6hemagglutinate नहीं करने के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि इन समकालीन एक (H3N2) वायरस के पहले एक (H3N2) वायरस के साथ तुलना में रिसेप्टर बाइंडिंग गुणों को बदल दिया है और संस्कृति संचित उत्परिवर्तनों और बहुरूपता जब में पारित करने के लिए करते हैं इन विट्रो सेल संस्कृतियों7,8,9। पारंपरिक MDCK कोशिकाओं के साथ तुलना में, MDCK-SIAT1 Matrosovich एट अल द्वारा विकसित एक सेल लाइन है. मानव α2, 6-sialtransferase (SIAT1) के सीडीएनए के साथ MDCK कोशिकाओं के स्थिर अभिकर्मक के माध्यम से । यह सेल लाइन α2 की बढ़ी हुई मात्रा, 6-sialic गैलेक्टोज moieties और α2 की घटी हुई मात्रा, 3-sialic एसिड moieties पैरेंट MDCK कोशिकाओं से10की तुलना में व्यक्त करता है । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं MDCK कोशिकाओं11की तुलना में एक (H3N2) वायरस के लिए अलगाव की दर में सुधार करने के लिए दिखाया गया है । हाल ही में, लिन एट अल । ने बताया कि नई 3 सी के लिए उभरा. 2a और 3 सी. 3 ए मानव (H3N2) इंफ्लूएंजा वायरस, अधिक वफादार वायरस प्रतिकृतियां और बेहतर वायरस infectivity जब वायरस MDCK-SIAT1 सेल लाइनों में MDCK कोशिकाओं के साथ तुलना में कल्चरित थे प्राप्त किए गए थे7। इस प्रकार, MDCK-SIAT1 कोशिकाओं बेहतर MN परख में उपयुक्त है एक (H3N2) वायरस के हाल के समूहों को एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की विशेषता है ।

यहां हम एक MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख का वर्णन करने के लिए समकालीन 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (H3N2) मानव सीरा में वायरस एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए । या तो अंडे या कोशिकाओं में उगाया वायरस इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है । गर्मी निष्क्रिय एंटीबॉडी युक्त सीरा पहले प्रश्नपत्र पतला कर रहे हैं, तो १०० TCID५०/well इंफ्लूएंजा एक (H3N2) वायरस के साथ मशीन के लिए सीरा में एंटीबॉडी वायरस को बांधने की अनुमति । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को फिर वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण करने के लिए जोड़ रहे हैं, और ३७ ° c, 5% CO2 पर 18-20 h के लिए मशीन के लिए अनुमति देने के लिए एक (H3N2) वायरस MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को संक्रमित और दोहराने । रात भर के बाद, प्लेटें तय कर रहे है और एक अच्छी तरह से वायरस की राशि एक विरोधी का उपयोग कर एलिसा द्वारा मात्रा है इंफ्लूएंजा एक एनपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी । एनपी का पता लगाने वायरस के संक्रमण की उपस्थिति और एंटीबॉडी बेअसर के अभाव को इंगित करता है । बेअसर एंटीबॉडी titer वायरस infectivity के ≥ ५०% अवरोध प्रदान करता है कि उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने के पारस्परिक के रूप में परिभाषित किया गया है ।

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Protocol

सभी इंफ्लूएंजा वायरस उचित जैव सुरक्षा स्तर आवश्यकताओं (बीएसएल-2 या उच्चतर) सूक्ष्मजीवविज्ञानी और जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं (BMBL)12पर जैव सुरक्षा में परिभाषित के अनुसार संभाला जाना चाहिए ।

1. रिएजेंट और शुरू सामग्री की तैयारी

  1. तैयार MDCK-SIAT1 कोशिकाओं और बाँझ कोशिका संस्कृति मध्यम
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज के साथ ५०० मिलीलीटर का उपयोग कर MDCK-SIAT1 सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें, 10% v/वी हीट भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) निष्क्रिय, 2 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1 मिलीग्राम/एमएल G418 सल्फेट (उदा., geneticin), और १०० µ g/ml streptomycin (वैकल्पिक) के साथ १०० U/एमएल पेनिसिलिन । एक ०.२ µ मीटर ताकना-आकार झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन द्वारा निष्फल । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं में प्लाज्मिड स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए G418 सल्फेट जोड़ा जाता है ।
    2. MDCK-SIAT1 कक्ष रेखा तैयार करें । एक १६२ सेमी2-ऊतक संस्कृति कुप्पी (एस) में बाँझ सेल संस्कृति मीडिया के 30 मिलीलीटर युक्त, बीज कुप्पी के साथ 2-२.५ x 106 MDCK-SIAT1 कोशिकाओं और 5% सह में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन2 2 दिनों के लिए; यह ऊतक-संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID) दृढ़ संकल्प और MN परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
      नोट: MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को डॉ एम Matrosovich, Marburg, जर्मनी10द्वारा कृपया प्रदान की गई । यह सेल लाइन भी व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. DMEM उच्च ग्लूकोज का ५०० मिलीलीटर, ०.३% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) भिन्न V, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, और 20 मिमी HEPES का उपयोग कर बाँझ वायरस प्रचार मीडिया तैयार करें । एक ०.२ µ मीटर ताकना-आकार झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन द्वारा निष्फल ।
  3. तैयार ०.७५% (v/v) गिनी पिग लाल रक्त कोशिकाओं (gpRBCs) फॉस्फेट में ०.०१ मीटर पंजाबियों युक्त खारा (पंजाब), पीएच ७.२ पर ।
  4. DMEM उच्च ग्लूकोज, 1% गोजातीय एल्ब्युमिन अंश वी (BSA), १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, और 20 मिमी HEPES का उपयोग कर बाँझ वायरस मंदक तैयार करें । एक ०.२ µm ताकना आकार झिल्ली के साथ निस्पंदन द्वारा निष्फल, और प्रत्येक परख के लिए नए सिरे से तैयार करते हैं ।
  5. शीत कोशिका निर्धारण को ८०% के रूप में तैयार करें ठंडा एसीटोन (०.०१ एम पंजाबियों, पीएच ७.२) ।
  6. पंजाब (०.०१ एम पंजाब पीएच ७.२) और ०.३% (वी/वी) के बीच-20 का उपयोग कर धो बफर तैयार करें ।
  7. पंजाब (०.०१ एम पंजाब, पीएच ७.२), ०.३% (वी/वी) के बीच-20, और 5% गैर-वसा शुष्क दूध का उपयोग करके एंटीबॉडी मंदक तैयार करें ।
  8. का प्रयोग करें विरोधी इंफ्लूएंजा एक NP माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी क्लोन A1 और A3 पूल के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी। अनुमापन द्वारा निर्धारित इष्टतम एकाग्रता में एंटीबॉडी मंदक में पतला ।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडीके रूप में बकरी विरोधी माउस आईजीजी संयुग्मित हार्स मूली peroxidase (एचआरपी) का प्रयोग करें । अनुमापन द्वारा निर्धारित इष्टतम एकाग्रता में एंटीबॉडी मंदक में पतला ।
  10. ओ-phenylenediamine dihydrochloride (ओपीडी) में ०.०५ एम फास्फेट साइट्रेट बफर में पीएच 5 का उपयोग peroxidase सब्सट्रेट तैयार करें । ०.०५ एम फॉस्फेट साइट्रेट बफर को भंग करके तैयार करें 1 कैप्सूल/100 एमएल के H2हे. भंग 1 ओपीडी गोली (10 मिलीग्राम)/उपयोग करने से पहले तुरंत फॉस्फेट साइट्रेट बफर के 20 मिलीलीटर ।
  11. ओपीडी स्टॉप सॉल्यूशनके रूप में सल्फर एसिड का ०.५ मीटर प्रयोग करें । एक रासायनिक डाकू में 18 एम सल्फर एसिड स्टॉक की 28 मिलीलीटर ९७२ मिलीलीटर के लिए एक एच2में जोड़ें ।
  12. मानव और पशु सीरा का उपचार
    1. हीट ५६ डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान में MN परख में इस्तेमाल 30 मिनट के लिए पहले परख के लिए मानव सीरा निष्क्रिय । तुरंत उपयोग करें या यदि आवश्यक हो, तो 24 घंटे से अधिक के लिए 4 ° c पर गल सीरा की दुकान; यदि अब भंडारण अवधि की जरूरत है, स्टोर सीरा पर जमे हुए-20 ° c या ठंडा ।
    2. पशु सीरा रिसेप्टर नष्ट एंजाइम (रडे) और गर्मी के रूप में इस प्रकार के रूप में परख से पहले निष्क्रिय के साथ MN परख में इस्तेमाल किया समझो ।
      1. गल सीरा एक ३७ ˚ सी पानी में स्नान तो बर्फ पर जगह है । मिश्रण 1 रडे के 3 संस्करणों के साथ पशु सीरम नमूना की मात्रा । ३७ ˚ सी पर मशीन 18-20 एच के लिए ।
      2. हीट निष्क्रिय रडे ५६ ˚ सी पर सीरा 30 मिनट के लिए इलाज किया । पंजाबियों के 6 खंड जोड़ें, एक अंतिम पूर्व के लिए प्रत्येक नमूने के लिए पीएच ७.२ 1:10 के कमजोर पड़ने । यदि आवश्यक हो, तो 24 घंटे से अधिक के लिए 4 ° c पर गल सीरा की दुकान; यदि अब भंडारण अवधि की जरूरत है, स्टोर सीरा पर जमे हुए-20 ° c या ठंडा ।
        नोट: पशु सीरा विभिंन sialic एसिड glycans जो इंफ्लूएंजा वायरस के लिए बाध्य कर सकते है और इंफ्लूएंजा के बंधन को रोकना विशेष विरोधी हा एंटीबॉडी शामिल हो सकते हैं । इसलिए, यह रडे करने के लिए आवश्यक है सभी पशु सीरा से पहले MN परख करने के लिए इन गैर विशिष्ट वायरल हा bindings सीरम नमूनों को हटाने के लिए ।

2. MDCK के पारित होने-SIAT1 सेल संस्कृति

नोट: सभी सेल संस्कृतियों एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए संक्रमण को रोकने के ।

  1. सेल कल्चर मीडियम को १६२ सेमी2 कुप्पी में सेल monolayer से नहीं कर सकते । monolayer को trypsin-EDTA के साथ कुल्ला करके कोशिकाओं को Trypsinize । सेल monolayer को कवर करने के लिए 5 एमएल trypsin-EDTA जोड़ें । ३७ ° c पर मशीन, 5% सह2 जब तक monolayer अलग (5-10 मिनट) । MDCK के 15 मिलीलीटर-SIAT1 सेल संस्कृति मीडिया trypsinized कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक कुप्पी को जोड़ने के लिए, पिपेट ऊपर और नीचे अलग कोशिकाओं के लिए ।
  2. सेल की गिनती और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer और trypan ब्लू का प्रयोग करें । बीज नई १६२ सेमी2 ऊतक संस्कृति 2 के साथ सेल संस्कृति मीडिया के 30 मिलीलीटर-2.5 x 106 कोशिकाओं/flask और ३७ ° c पर2 TCID और MN परख में उपयोग के लिए 2 दिनों के लिए 5% सह के साथ गर्मी से युक्त कुप्पी में कोशिकाओं । बीज कोशिकाओं पर 4-5 x10 6 कोशिकाओं/कुप्पी और 5%सह 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन वायरस के प्रसार में उपयोग के लिए 2 दिनों के लिए ।
    नोट: यदि छोटे या लंबे समय तक संस्कृति अवधि वांछित हैं तो सीडिंग घनत्व को समायोजित किया जा सकता है । वायरस के प्रसार के लिए, कोशिकाओं को १००% से अधिक प्रवाह तक पहुंच जाना चाहिए । ऊतक संस्कृति संक्रमण खुराक (TCID) और MN परख के लिए, कोशिकाओं पर होना चाहिए ७५-९५% प्रवाह (चित्र 1) ।

3. MDCK-SIAT1 कोशिकाओं में एक (H3N2) वायरस का प्रसार

नोट: एक (H3N2) वायरस 10-11 दिन पुरानी embryonated मुर्गी के अंडों में मानकप्रोटोकॉल3, या MDCK-SIAT1 सेल संस्कृतियों के अनुसार या तो प्रचारित किया जा सकता है । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं वायरस टीका के लिए १००% से अधिक प्रवाह तक पहुंच जाना चाहिए । वायरस बीज स्टॉक इनोक्युलम के कई कमजोर पड़ने के साथ inoculated जा सकता है । सबसे अच्छा फसल हा और infectivity के साथ इनोक्युलम कमजोरियां आगे MN परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. सेल संस्कृति मध्यम से सेल monolayer (> 100% प्रवाह) १६२ सेमी2 कुप्पी में निकालें । monolayer दो बार बाँझ ०.०१ एम पंजाबियों, पीएच ७.२, और खिचड़ी भाषा के 15 मिलीलीटर के साथ धो लो ।
  2. नियंत्रण के रूप में 1 कुप्पी लेबल और वायरस प्रचार प्रसार मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ें । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कुप्पी की मशीन । इस कुप्पी अछूता छोड़ दो और वायरस के प्रचार के दिन 1 के बाद तुलना के लिए उपयोग करें ।
  3. कुप्पी (ओं) के लिए बाँझ वायरस प्रचारक मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ ° c, 5% CO2पर सभी कुप्पी (एस) मशीन । गल इंफ्लूएंजा वायरस स्टॉक के कमरे के तापमान पर तो बर्फ पर जगह की एक शीशी । वायरस प्रचार प्रसार मीडिया के साथ लक्ष्य कमजोर पड़ने के लिए पतला ।
    नोट: लक्ष्य कमजोरियां वायरस शेयरों की हा titers के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । एक 1:1000 पतला इनोक्युलम तैयार करने के लिए, वायरस के १०० µ एल जोड़ने के लिए बाँझ वायरस प्रचार प्रसार मीडिया के ९.९ मिलीलीटर. धीरे उलटा, एक 1:1000 पतला इनोक्युलम के लिए धीरे पलटना, बाँझ वायरस प्रचार प्रसार मीडिया के 9 मिलीलीटर के लिए 1:100 कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर निकालें । बर्फ पर जगह ।
  4. मशीन से नियंत्रण कुप्पी के अलावा सभी कुप्पी निकालें । वायरस प्रचार मीडिया MDCK-SIAT1 कोशिकाओं की कुप्पी (ओं) से निकालें और पतला वायरस के 10 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक कुप्पी लगाना । 1 एच के लिए ३७ ° c, 5% सह2 पर कुप्पी मशीन, कुप्पी (ओं) हर 15 मिनट घूर्णन ।
  5. कुप्पी (s) से इनोक्युलम की 5 मिलीलीटर निकालें और 1 µ g/mL TPCK-trypsin युक्त 15 मिलीलीटर वायरस प्रोपेगेशन मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करें । ३७ ° c, 5% CO2 , 16-18 h के लिए कुप्पी (s) की मशीन ।
  6. रात भर की गर्मी के बाद, 100X माइक्रोस्कोप आवर्धन के तहत कुप्पी (ओं) का निरीक्षण और कोशिकाओं पर cytopathic प्रभाव (सीपीई) के लिए देखो । कुप्पी (s) से वायरस supernatant की 15-17 मिलीलीटर निकालें, और 2 µ g/mL TPCK-trypsin युक्त नए सिरे से तैयार वायरस प्रोपेगेशन मीडिया के 15-17 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें ।
  7. ३७ ° c, 5% CO2पर कुप्पी की मशीन । monolayer के सीपीई की निगरानी (सेल नियंत्रण कुप्पी के साथ तुलना करके) और समय अवधि (हर 4 एच) के साथ ०.७५% gpRBC फसल तक की जाँच करें.
    1. एक हा ९६-अच्छी तरह से microtiter प्लेट की स्थापना की । ०.०१ एम पंजाबियों के ५० µ एल जोड़ें, पीएच ७.२ वेल्स A2-A12 और B2-बी 12 (डुप्लिकेट), और वेल्स H1-नियंत्रण के लिए H12 के लिए ।
    2. वायरस supernatant के १०० µ l को a1 और A2 में जोड़ें, a1 और B1 से A12 और बी 12 के माध्यम से 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें. A12 और बी 12 में मिलाने के बाद ५० µ l को त्यागें । ५० µ l को ०.७५% gpRBCs की पंक्तियों A, B और H में जोड़ें ।
    3. प्लेट नल और 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
      1. एक ४५ ° से ६० ° कोण पर ९६-well microtiter प्लेट झुकाव द्वारा वायरस supernatant के हा निर्धारित करें ।
      2. hemagglutination के लिए प्लेटें पढ़ें; वायरस के सबसे कमजोर है कि पूरा hemagglutination प्राप्त विशिष्ट वायरस के लिए हा अनुमापन अंत बिंदु माना जाता है । वायरस के हा titer के रूप में पूरा hemagglutination के साथ उच्चतम वायरस कमजोर पड़ने के पारस्परिक रिकॉर्ड ।
        नोट: पंक्ति में बसे कोशिकाओं एच (नियंत्रण) शुरू "चल" चाहिए और एक छोटे से अश्रु आकार गुरुत्वाकर्षण के कारण फार्म । नियंत्रण कुओं में कोशिकाओं तक प्रतीक्षा करें चल खत्म, तो वायरस अनुमापन कुओं में आरबीसी बटन पढ़ें । उन है कि प्रदर्शन आरबीसी बटन और "भागो", hemagglutination हासिल नहीं है । वायरस के उच्चतम कमजोर पड़ने का पता लगाएँ कि पूरी तरह से वायरस के अंत बिंदु हा titer के रूप में hemagglutination रोकना.
  8. फसल वायरस जब वायरस संस्कृति के पठार के हा या वायरस संस्कृति लक्ष्य हा (उदाहरण के लिए, > 16 हाओ) तक पहुंच जाता है, लेकिन इससे पहले कि सेल monolayer के लिए महत्वपूर्ण सीपीई प्रदर्शित शुरू होता है ।
    1. ३०० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में वायरस संस्कृति supernatant केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस पर सेलुलर मलबे गोली । एक साफ ट्यूब करने के लिए वायरस फसल युक्त स्पष्ट supernatant हस्तांतरण । Aliquot एक उपयोग बाँझ क्रायोजेनिक शीशियों में वायरस फसल युक्त supernatant और पर तुरंत स्थिर-७० डिग्री सेल्सियस या ठंडा ।
      नोट: वायरस MN परख के लिए इस्तेमाल किया शेयरों उच्च संक्रामक titer और ंयूनतम दोषपूर्ण कणों होना चाहिए । वायरस शेयरों के ंयूनतम कमजोर पड़ने के लिए १०० TCID५०/५० µ एल को प्राप्त करने के लिए MN परख 1:100 है ।
      नोट: मार्लोन परख में इस्तेमाल किया वायरस स्टॉक गल और जम नहीं होना चाहिए ।

4. वायरस के TCID का निर्धारण

  1. दिन 1: वायरस अनुमापन
    1. कमरे के तापमान पर वायरस की एक शीशी गल जाए और तुरंत बर्फ पर लगाएं ।
    2. दो अलग शुरुआती कमजोर पड़ने पर वायरस का परीक्षण करें: 10-2 और 10-3। 10-2 कमजोर पड़ने के लिए वायरस मंदक के ९.९ मिलीलीटर के लिए १०० µ एल जोड़ें । 10-3 कमजोर पड़ने के लिए वायरस मंदक के ९.० एमएल के लिए 10-2 कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. दो microtiter प्लेट का प्रयोग (प्लेट 1 के लिए 10-2 कमजोर पड़ने और 2 प्लेट 10-3 कमजोर पड़ने के लिए), ९६-well microtiter प्लेट के कॉलम 1 के अलावा सभी कुओं के लिए १०० µ एल वायरस मंदक के जोड़ें ।
    4. प्रदर्शन ½ लॉग10 कमजोर पड़ने वालों (10-2, 10-२.५, 10-3, आदि.) । स्तंभ 1 में सभी कुओं को कमजोर पड़ने शुरू वायरस के १४६ µ एल जोड़ें और कॉलम 11 (चित्रा 2) के माध्यम से कॉलम 1 से ४६ µ एल प्रश्नपत्र हस्तांतरण । कुओं के बीच पिपेट युक्तियां बदलें । कॉलम 11 मिश्रण के बाद, ४६ µ एल कमजोर पड़ने के साथ सुझावों को त्यागें ।
    5. कक्ष नियंत्रण (प्रतिलिपि) के रूप में स्तंभ 12 का उपयोग करें; इसमें केवल वायरस मंदक हैं । ३७ ° c, 5% CO 2 पर 1 h के लिए मशीन।
  2. दिन 1: MDCK-SIAT1 कोशिकाओं की तैयारी
    नोट: MDCK-SIAT1 सेल monolayer पहुंचना चाहिए ७५-९५% TCID और MN परख के लिए प्रवाह । १ १६२-सेमी 2 कुप्पी पर ९५% प्रवाह पर्याप्त कोशिकाओं बीज को उपज चाहिए ~ 4-5 microtiter प्लेटें ।
    1. संस्कृति मीडिया में FBS को दूर करने के लिए 20 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ ७५-९५% धाराप्रवाह monolayer धो लें । निम्नानुसार कोशिकाओं को Trypsinize.
      1. monolayer बाँझ पंजाबियों के साथ कुल्ला, 7 मिलीलीटर trypsin-EDTA सेल monolayer कवर करने के लिए जोड़ें । monolayer अलग (लगभग 5-10 मिनट) तक कुप्पी फ्लैट और ३७ ° c, 5%सह 2 पर मशीन रखना । प्रत्येक trypsinized कोशिकाओं युक्त कुप्पी के लिए वायरस मंदक के 7 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. FBS को निकालने के लिए कोशिकाओं को वायरस मंदक से धोएं ।
      1. धीरे कोशिकाओं को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट । ५०-एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित; वायरस मंदक के साथ ट्यूब भरें ।
      2. 5 मिनट के लिए ४८५ x g पर केंद्रापसारक वायरस मंदक, ताजा ५० मिलीलीटर वायरस मंदक के साथ बदलने के लिए, और 5 मिनट के लिए ४८५ x g पर केंद्रापसारक । खिचड़ी भाषा वायरस मंदक और ताजा वायरस मंदक (10 मिलीलीटर/गोली reसस्पेंड करने के लिए) के साथ प्रतिस्थापित ।
    3. कक्ष गणना और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer और trypan नीला का उपयोग करें । १.५ x 105 कोशिकाओं/एमएल के लिए वायरस मंदक के साथ सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
    4. पतला MDCK-SIAT1 कोशिकाओं के १०० µ एल जोड़ें microtiter प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए (१.५ x 104 कोशिकाओं/ ३७ ° c, 5% CO2 में 18-20 h के लिए मशीन ।
  3. 2 दिन: एलिसा
    1. कोशिकाओं का निर्धारण
      1. मध् यम को microtiter प्लेट्स से निकाल लें । एक अच्छी तरह से धो २०० µ के साथ पंजाब के एल । जोड़ें ३०० µ एल ठंडा ८०% एसीटोन के लिए एक अच्छी तरह से और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । निर्धारण को दूर करें और प्लेटों को शुष्क हवा की अनुमति दें ।
    2. एलिसा
      1. प्राथमिक एंटीबॉडी अतिरिक्त
        नोट: विरोधी इंफ्लूएंजा एक एनपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एलिसा में प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में अतिरिक्त में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । MN में एंटीबॉडी titrations प्रदर्शन करके प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रत्येक बहुत के लिए इष्टतम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का निर्धारण । प्राथमिक एंटीबॉडी एकाग्रता है कि अधिक से अधिक और पृष्ठभूमि अनुपात के लिए सबसे अच्छा संकेत के साथ का चयन करें ।
        1. विरोधी इंफ्लूएंजा एक NP मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) एंटीबॉडी मंदक में लक्ष्य एकाग्रता को पतला (1:1000 के एक लक्ष्य कमजोर पड़ने के लिए µ एंटीबॉडी के 30 मिलीलीटर के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के 30 मंदक एल जोड़ने के लिएउदा ) ।
        2. धो प्लेट धो बफर के ३०० µ एल के साथ 3 बार । एक अच्छी तरह से १०० µ एल पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
      2. माध्यमिक एंटीबॉडी अतिरिक्त
        नोट: बकरी विरोधी माउस आईजीजी संयुग्मित करने के लिए घोड़े मूली peroxidase (एचआरपी) एलिसा में माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में अतिरिक्त में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । एंटीबॉडी titrations प्रदर्शन करके माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रत्येक बहुत के लिए इष्टतम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का निर्धारण । उच्च में माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता का चयन करें और पृष्ठभूमि अनुपात के लिए सबसे अच्छा संकेत के साथ.
        1. बकरी विरोधी माउस आईजीजी संयुग्मित को एचआरपी एंटीबॉडी (माध्यमिक एंटीबॉडी) को एंटीबॉडी मंदक में लक्ष्य एकाग्रता को पतला (जैसे ७.५ µ एल माध्यमिक एंटीबॉडी के 30 मिलीलीटर के लिए एंटीबॉडी मंदक के एक लक्ष्य 1:4000 कमजोर पड़ने के लिए जोड़ें) ।
        2. प्लेट धो 3 ३०० µ एल धोने बफर के साथ बार । जोड़ें १०० µ एल पतला माध्यमिक एंटीबॉडी एक अच्छी तरह से । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
      3. सब्सट्रेट इसके अलावा और प्लेट रीडिंग
        1. ३०० µ एल वॉश बफर और एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ पर नल के साथ 5 बार प्लेटें धो लें ।
        2. नए सिरे से तैयार सब्सट्रेट के १०० µ एल जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से और रंग विकास संतृप्तियों और सेल नियंत्रण कुओं के ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) < 0.2 तक कमरे के तापमान पर गर्मी ।
        3. सभी कुओं को रोकने के समाधान के १०० µ एल जोड़ें । एक microplate spectrophotometer का उपयोग कर ४९० एनएम पर कुओं के आयुध डिपो पढ़ें ।
  4. TCID ५० गणना
    1. औसत आयुध डिपो४९० की गणना कक्ष नियंत्रण (स्तंभ 12) ।
    2. एक आयुध डिपो के साथ अच्छी तरह से किसी भी परीक्षण पर विचार४९० से अधिक दो बार औसत आयुध डिपो के रूप में सीसी कुओं के४९० "सकारात्मक"; अंयथा, यह "नकारात्मक" माना जाता है ।
    3. रीड-Muench विधि13का उपयोग कर वायरस के TCID५० की गणना ।
      1. प्रत्येक कमजोर पड़ने पर सकारात्मक और नकारात्मक की संख्या निर्धारित करें ।
      2. "संचई धनात्मक", "संचई ऋणात्मक", "अनुपात", और "% धनात्मक" को तालिका 1में illustrated के रूप में परिकलित करें ।
      3. दिखा कमजोर पड़ने के बीच "आनुपातिक दूरी" की गणना > 50% सकारात्मक और कमजोर पड़ने < 50% सकारात्मक दिखा निंनलिखित का उपयोग:
        Equation 1
        नोट: ½ लॉग कमजोर पड़ने के लिए सुधार कारक ०.५ है । उदाहरण के लिए, तालिका 1: (८० − 50)/(80 − 20) x ०.५ = ०.२५
      4. वायरस TCID५० गणना कमजोर पड़ने के लिए आनुपातिक दूरी जोड़कर दिखा रहा है > ५०% सकारात्मक ।
        नोट: उदाहरण के लिए, तालिका 2में, TCID५० 10-5 + (-०.२५) = 10-५.२५है । नोट इस वायरस का TCID५० प्रति १०० µ l (या 10-५.२५/१०० µ l) है ।
    4. वायरस कमजोर पड़ने की गणना. MN परख के लिए, २०० TCID के लिए वायरस पतला५०/१०० µ एल (समकक्ष १०० TCID५०/५० µ एल के लिए अच्छी तरह से प्रति) ।
      नोट: तालिका 1में उदाहरण में, 1 TCID५० 10-५.२५ में १०० µ एल, और कमजोर पड़ने २०० TCID५०/१०० µ एल प्राप्त करने के लिए गणना के आधार पर 1:891 है: २०० x 10-५.२५ = 10-२.९५ = 1/10२.९५ = 1 /८९१

5. एमएन परख MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग

  1. दिन 1: परीक्षण और नियंत्रण सीरा तैयारी और प्लेट लेआउट
    1. गल सीरा में ३७ ° c पानी में स्नान करें और गल जाने के तुरंत बाद निकालें । Aliquot की मात्रा का परीक्षण करने की जरूरत है कि सीरा; मूल सीरा के 10 µ एल की एक ंयूनतम स्वेटर में एक वायरस के साथ परीक्षण की जरूरत है । यदि संभव हो तो डुप्लिकेट में सीरा परीक्षण ।
    2. हीट एक ५६ डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान के रूप में कदम 1.12.1 में 30 मिनट के लिए मानव सीरा को निष्क्रिय । आइस पोस्ट हीट निष्क्रियता पर सीरा प्लेस, एक 1:10 पूर्व कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए सीरा के लिए वायरस मंदक जोड़ें ।
    3. रडे उपचार और पूर्व पतला पशु सीरा को 1:10 प्रति 1.12.2 नियंत्रण के लिए उपयोग करने के लिए ।
      नोट: गल और इलाज मानव और पशु सीरा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता से अधिक नहीं 24 h. सीरा पर जमे हुए संग्रहीत किया जाना चाहिए-20 ° c या ठंडा अगर अब भंडारण अवधि की जरूरत है पहले परख करने के लिए ।
    4. एक वायरस के साथ परीक्षण करने के लिए, जोड़ें १०० µ l 1:10 पतला सीरा स्तंभ A1 करने के लिए A10 (चित्र 4) । स्तंभ 11 और 12 (आरेख 4) को छोड़कर, ५० µ l को वायरस मंदक की पंक्तियों B से H तक जोड़ें । 2-फ़ोल्ड सीरियल कमजोर पड़ने से पंक्ति a से h तक, और अंतिम ५० µ l को पंक्ति h पर छोड़ें (चित्र 4) ।
      नोट: जब एकाधिक वायरस का परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, सीरा titer ट्यूबों में पतला किया जा सकता है । सीरम के कमजोर पड़ने, सीरम titer निर्धारित करने के प्रयोजन के लिए, अच्छी तरह से एक में 1:10 है, अच्छी तरह से बी 1:20, अच्छी तरह से सी 1:40, अच्छी तरह से डी 1:80, अच्छी तरह से ई 1:160, अच्छी तरह से एफ 1:320, खैर जी 1:640, अच्छी तरह से एच 1:1280 (चित्रा 4)
    5. वायरस नियंत्रण के लिए, वेल्स A12, बी 12, C12, और D12 (कोई सीरा) के लिए वायरस मंदक के ५० µ एल जोड़ें । सेल नियंत्रण के लिए, E12, F12, G12, और H12 (कोई वायरस, नहीं सीरा) के लिए मंदक वायरस के १०० µ एल जोड़ें ।
    6. कंट्रोल सीरा के लिए (उदाहरण के लिए, फेर्रेट सीरा नियंत्रण), पतला नियंत्रण सीरा के १०० µ l को अच्छी तरह से एक कॉलम 11 और जोड़ें ५० µ एल वायरस मंदक के कुओं B11-H11 । धारावाहिक नीचे पतला ।
    7. कवर प्लेटें, ३७ ° c पर मशीन, 5% सह2 जब तक वायरस के अलावा के लिए तैयार है ।
  2. दिन 1: वायरस के अलावा
    1. वायरस मंदक के साथ १०० TCID५०/५० µ एल को पतला करें ।
    2. सभी कुओं के लिए ५० µ एल पतला वायरस जोड़ें, पीछे अनुमापन (बीटी) प्लेटों पर कॉलम 11 के अलावा और सेल नियंत्रण वेल्स E12, F12, G12, और सभी प्लेटों पर H12 (चित्रा 4) । उन प्लेटों के लिए नियंत्रण सीरा के साथ कॉलम 11 में, कॉलम 11 में वायरस जोड़ें ।
    3. वापस अनुमापन (बीटी)
      1. डुप्लिकेट प्लेटों के एक सेट के कॉलम 11 में एक बीटी शामिल करें (उदाहरण के लिए, प्लेट 1a और 1b) । स्तंभ 11 में सभी कुओं में वायरस मंदक के ५० µ l को जोड़ें । पहले वेल (A11) के लिए १०० TCID५०/५० µ l पर वायरस के ५० µ l को जोड़ें । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स ।
      2. 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने को पूरा करने के लिए उत्तराधिकारी कुओं को ५० µ l को मिलाएं और स्थानांतरित करें । वायरस ले जाने से बचने के लिए कुओं के बीच पिपेट सुझावों को बदलें । अच्छी तरह से H11 से ५० µ l को त्यागें ।
      3. १०० µ करने के लिए अंतिम वॉल्यूम लाने के लिए स्तंभ 11 के लिए वायरस मंदक के ५० µ l जोड़ें l. मिश्रण करने के लिए प्लेटों नल.
    4. ३७ ° c, 5% सह 1 एच के लिए2 पर मशीन प्लेट ।
    5. प्रदर्शन MDCK-SIAT1 सेल इसके अलावा 1 दिन और 2 दिन पर एलिसा के रूप में ४.२ चरणों में वर्णित है और ४.३ (५.३ और ५.४ में भी वर्णित है)
  3. दिन 1: MDCK-SIAT1 सेल इसके अलावा
    1. चरण ४.२ में वर्णित के रूप में MDCK-SIAT1 कक्षों को तैयार करें । जोड़ें १०० µ l MDCK-SIAT1 कोशिकाओं पर १.५ x 105 कोशिकाओं/एमएल के लिए एक अच्छी तरह से (१.५ x 104 कोशिकाओं/ ३७ ° c, 5% सह2 पर प्लेटें 18-20 एच के लिए मशीन ।
  4. 2 दिन: एलिसा
    1. रात भर की गर्मी के बाद, दूसरे दिन पर, ८०% ठंड एसीटोन के साथ कोशिकाओं को ठीक के रूप में ४.३ कदम में वर्णित है ।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी अतिरिक्त
      1. प्लेट धो 3 ३०० µ एल धोने बफर के साथ बार । विरोधी इंफ्लूएंजा एक NP मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) इष्टतम एकाग्रता के रूप में एंटीबॉडी मंदक में अनुमापन द्वारा निर्धारित करने के लिए पतला (1:1000 के एक लक्ष्य कमजोर पड़ने के लिए µ एंटीबॉडी के 30 मिलीलीटर के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के 30 मंदक एल जोड़ने के लिएउदा ) ।
        नोट: १०० प्राथमिक एंटीबॉडी के µ एल प्रति कुआं की आवश्यकता है । ~ प्रति प्लेट 10 मिलीलीटर की जरूरत है ।
      2. एक अच्छी तरह से १०० µ एल पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी अतिरिक्त
      1. धो प्लेटें ३०० µ एल धोने बफर के साथ 3 बार । बकरी विरोधी माउस आईजीजी संयुग्मित करने के लिए एचआरपी एंटीबॉडी (माध्यमिक एंटीबॉडी) एंटीबॉडी मंदक में लक्ष्य एकाग्रता को पतला (जैसे ७.५ µ के एल जोड़ने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के 30 मिलीलीटर एंटीबॉडी मंदक के लिए एक लक्ष्य 1:4000.)
        नोट: १०० माध्यमिक एंटीबॉडी के µ एल के प्रति ९६ अच्छी तरह से आवश्यक है । ~ प्रति प्लेट 10 मिलीलीटर की जरूरत है ।
      2. जोड़ें १०० µ एल पतला माध्यमिक एंटीबॉडी एक अच्छी तरह से । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    4. सब्सट्रेट इसके अलावा और प्लेट रीडिंग
      1. प्लेटें धो ३०० µ एल धोने बफर के साथ 5 बार और एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछ पर नल ।
      2. एक अच्छी तरह से और कमरे के तापमान पर जब तक वायरस नियंत्रण कुओं एक आयुध डिपो४९० = ०.८-3 तक पहुंचने के लिए नए सिरे से तैयार सब्सट्रेट के १०० µ एल जोड़ें एक कम पृष्ठभूमि आयुध डिपो४९० पर कक्ष नियंत्रण के साथ < 0.2 ।
      3. सभी कुओं को रोको समाधान के १०० µ एल जोड़ें । एक microplate spectrophotometer का उपयोग कर ४९० एनएम पर कुओं के आयुध डिपो पढ़ें ।
  5. डेटा विश्लेषण
    नोट: MN गणना प्रत्येक प्लेट के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित होते हैं ।
    1. प्रत्येक सीरम नमूने के बेअसर एंटीबॉडी titer निर्धारित करें ।
      1. प्रत्येक प्लेट के लिए ५०% वायरस बेअसर के आयुध डिपो की४९० कट-ऑफ की गणना निम्न समीकरण का उपयोग कर:
        Equation 2
        नोट: यहां बेअसर कटौती के = ५०% बंद । पारस्परिक सीरम कमजोर पड़ने के साथ सबसे कमजोर पड़ने वाले४९० आयुध डिपो के साथ कम ५०% की कटौती से (≥ ५०% निषेध) माना जाता है कि सीरम नमूने के लिए बेअसर एंटीबॉडी titer (चित्रा 5).
    2. जांच करें कि कक्ष नियंत्रण कुओं एक आयुध डिपो४९० < 0.2 और वायरस नियंत्रण कुओं है एक आयुध डिपो४९० = ०.८-3 ।
    3. प्रत्येक परख में वायरस infectivity (100x TCID५०) वायरस बीटी द्वारा सत्यापित करें । बीटी की स्वीकार्य सीमा ५०, १००, या २०० TCID है । यदि चरण 4.4.2 में परिभाषित के रूप में एक ही कट-ऑफ का उपयोग कर, सबसे अधिक वायरस कमजोर पड़ने से ऊपर ओडी के साथ बीटी स्तंभ में कटौती बंद कुओं में होना चाहिए E11, F11, G11.
      नोट: सीरम सकारात्मक नियंत्रण 2-पिछले परीक्षणों में प्राप्त मूल्यों की तह के भीतर titers देना चाहिए । नकारात्मक सीरम नियंत्रण के आयुध डिपो४९० वायरस नियंत्रण के लिए स्वीकार्य के समान होना चाहिए ।

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Representative Results

वायरस शेयरों के infectivity का निर्धारण एमएन परख में पहला कदम है । चित्रा 2 प्लेट लेआउट वायरस शेयरों के TCID५० निर्धारित करने के लिए दिखाता है । अज्ञात infectivity के साथ वायरस स्टॉक के लिए, वायरस एकाधिक पूर्व-कमजोर पड़ने से titrated जा सकता है, उदाहरण के लिए दोनों 10-2 और 10-3, क्रम में सबसे अच्छा अनुमापन वक्र पर कब्जा करने के लिए वायरस की infectivity की गणना । इस वायरस को MN परख में इस्तेमाल किया मात्रा १०० TCID५०/well (५० µ एल) मानकीकृत किया जाना चाहिए । वायरस शेयरों की ंयूनतम कमजोर पड़ने के लिए एक १०० TCID५०/well हासिल 1:100 है ।


चित्रा 3 एक MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख के महत्वपूर्ण कदम का वर्णन । गर्मी निष्क्रिय सीरा ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में चित्रा 4में सचित्र के रूप में सीरियल पतला कर रहे हैं । १०० TCID५०/५० µ एल वायरस तो एक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है । 1 ज मशीन के बाद एंटीबॉडी में सीरा बाइंड वायरस के लिए अनुमति देने के लिए, १०० µ एल के १.५ x 105 कोशिकाओं/MDCK-SIAT1 कोशिकाओं के एमएल एक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं । इष्टतम परिणामों के लिए, MDCK-SIAT1 कोशिकाओं पर होना चाहिए ७५-९५% प्रवाह (चित्रा 1) दोनों TCID५० और MN परख के लिए । प्लेटें तो ३७ ° c, 5% CO 2 पर 18-20 h के लिए मशीनहैं । रात भर के बाद, एक अच्छी तरह से पता चला है और एक विरोधी इंफ्लूएंजा एक एनपी एलिसा (चित्रा 3) द्वारा मात्रा में वायरस की राशि ।

एक अच्छी तरह से आयुध डिपो में वायरस के संक्रमण की मात्रा और MDCK-SIAT1 कोशिकाओं में प्रश्नपत्र पतला युक्त सीरा की उपस्थिति में प्रतिकृति बेअसर एंटीबॉडी का प्रतिनिधित्व करता है । यह सीरा कमजोर पड़ने वालों (चित्रा 5) के खिलाफ साजिश रची जा सकती है । उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने कि ≥ ५०% बेअसर हासिल की पारस्परिक सीरम नमूने के लिए एंटीबॉडी titer माना जाता है । चित्र 5 एक/हांगकांग/4801/2014 एक (H3N2) 3 सी. 2a वायरस पूर्व और बाद इंफ्लूएंजा टीकाकरण के खिलाफ परीक्षण युग्मित सीरा के साथ 2 रोगियों से परिणाम के उदाहरण हैं । रोगी 1 पूर्व टीकाकरण सीरा के साथ, सीरा कमजोर पड़ने से कोई भी वायरस के संक्रमण (चित्रा 5, हल्के नीले रंग वक्र) बाधित और इसलिए नकारात्मक माना जाता है (< 10) । इसके विपरीत, इस रोगी से टीकाकरण सीरा के बाद वायरस प्रतिकृति बाधित, टीकाकरण को बेअसर एंटीबॉडी प्रेरित का संकेत है । इस सीरा के तीसरे कमजोर पड़ने से ५०% की कटौती से नीचे सबसे अधिक कमजोर पड़ने वाला है, इस प्रकार इस रोगी के बाद टीकाकरण titer का ४० (चित्रा 5, डार्क ब्लू वक्र) है । इसकी तुलना में, दूसरे रोगी पूर्व टीकाकरण से सीरम ३२० के एक titer में पूर्व मौजूदा एंटीबॉडी बेअसर होता है. टीकाकरण के बाद, titer > 1, 280 की वृद्धि हुई । इस मामले में, एक 1:10 पूर्व में सीरम के कमजोर पड़ने, कोई एंटीबॉडी अंत titer प्राप्त किया गया था । सीरम फिर से एक उच्च पूर्व कमजोर पड़ने पर परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि अंत titer प्राप्त करने के लिए ।

Figure 1
चित्र 1 . MDCK-SIAT1 सेल कल्चर. MDCK-SIAT1 कोशिकाओं । (क) MDCK-SIAT1 धाराप्रवाह monolayer (> 100% के लिए प्रवाह) वायरस टीका के लिए; (ख) MDCK-SIAT1 कोशिकाओं के साथ लॉग चरण में ७५-९५% TCID५० और MN परख के लिए प्रवाह ।

Figure 2
चित्र 2 . TCID प्लेट लेआउट । वायरस infectivity TCID५०द्वारा निर्धारित किया जाता है । वायरस स्टॉक पूर्व 10 से पतला है-2, और फिर एक कमजोर पड़ने प्रति ½ लॉग में प्रश्नपत्र पतला 10-7 (कॉलम 1-11), पर 8 कमजोर पड़ने प्रति दोहराने (पंक्ति a-H) । स्तंभ 12 कक्ष केवल नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । वायरस स्टॉक के TCID५० रीड-Muench विधि का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्र 3 . MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख के योजनाबद्ध । ५० µ एल हीट-निष्क्रिय सीरा के प्रश्नपत्र 2 गुना पतला ९६-वेल्स प्लेट्स में हैं । ५० एक (H3N2) वायरस के १०० TCID५० के µ एल तो एक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं । प्लेटें 1 ज के लिए ३७ ° c पर मशीन है वायरस और एंटीबॉडी के बंधन की अनुमति है । फिर १.५ x 104 MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं । प्लेटें ३७ ° c, 5% CO2पर 18-20 h के लिए मशीन हैं । रातोंरात मशीन के बाद, प्लेटें धोया और तय कर रहे हैं, एक अच्छी तरह से वायरस की राशि एक विरोधी का उपयोग कर एलिसा द्वारा मात्रा है इंफ्लूएंजा एक एनपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी । सीरा एंटीबॉडी titers वायरस नियंत्रण और सेल नियंत्रण द्वारा परिभाषित कट-नापसंद के आधार पर गणना कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . MN परख प्लेट लेआउट । गर्मी निष्क्रिय सीरा 1:10 में पूर्व पतला कर रहे हैं, तो प्रश्नपत्र 2-९६ में पतला गुना-अच्छी तरह से प्लेटें कॉलम 1-10 में । वायरस नियंत्रण (केवल वायरस और कक्ष, कोई सीरा) और कक्ष नियंत्रण (केवल कक्ष, कोई वायरस और कोई सीरा नहीं) स्तंभ 12 में हैं । स्तंभ 11 वापस अनुमापन या नियंत्रण सीरा के लिए उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . ए/हांगकांग/4801/2014 एक (H3N2) वायरस MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग कर के खिलाफ परीक्षण मानव सीरा के MN परख परिणाम । दो रोगियों से सीरा पूर्व और बाद 2016-17 मौसमी इंफ्लूएंजा टीकाकरण के खिलाफ परीक्षण किया गया एक/हांगकांग/4801/2014 एक (H3N2) वायरस MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग कर । बेअसर titers उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने कि ≥ ५०% वायरस बेअसर प्राप्त करने के पारस्परिक, के रूप में प्रत्येक वक्र पर तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं । रोगी 1: पूर्व टीकाकरण titer < 10, पश्चात टीकाकरण titer ४०; रोगी 2: पूर्व टीकाकरण titer ३२०, बाद टीकाकरण titer > 1, 280 ।

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Discussion

MN परख मुख्य परख इंफ्लूएंजा सीरोलॉजी के लिए इस्तेमाल के लिए इंफ्लूएंजा संक्रमण या टीकाकरण के बाद एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का पता लगाने में से एक है । Titers MN परख से उत्पंन अक्सर कई इंफ्लूएंजा seroepidemiology अध्ययन के प्राथमिक परिणाम के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । MN परख भी व्यापक रूप से सीरो निदान के लिए उपयोग किया जाता है, और टीके immunogenicity के मूल्यांकन । अंतरराष्ट्रीय अंतर प्रयोगशाला अध्ययन MN कई प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन की परख की तुलना करने के लिए आयोजित किया गया है14।

हाय के विपरीत, MN परख के लिए सीधे कार्यात्मक एंटीबॉडी कि कोशिका संस्कृति में वायरस संक्रमण बेअसर कर सकते है मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है । वहां MN दुनिया भर क्षेत्र प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया परख के विभिंन रूपों रहे हैं । पढ़ा-परख के बाहर (यानी, एंटीबॉडी बेअसर की उपस्थिति में वायरस infectivity की कमी) के वायरस एनपी एंटीबॉडी की एलिसा ठहराव पर आधारित हो सकता है, हा वायरस, या bliss-एक अच्छी तरह से में वायरस सजीले टुकड़े के दाग के ठहराव एंटीबॉडी और सेल संस्कृतियों में14,15में मशीन की उपस्थिति में वायरस के बाद संक्रमण । फ्लोरोसेंट के विभिंन रूपों आधारित पट्टिका कमी बेअसर परख (जैसे, ध्यान में कमी परख और ViroSpot परख) अक्सर इंफ्लूएंजा वायरस क्षेत्र के बड़ी संख्या के प्रतिजनी लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल कर रहे है अलग, आंशिक रूप से कम वायरस के कारण इन परख में आवश्यक राशि15,16। मानव सीरोलॉजी में इंफ्लूएंजा को एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन के लिए, 2 दिन एलिसा आधारित MN परख विश्व स्वास्थ्य संगठन द्वारा सिफारिश की है (डब्ल्यूएचओ) ग्लोबल इंफ्लूएंजा निगरानी नेटवर्क इंफ्लूएंजा के सीरम निदान के लिए3। इस विधि भी व्यापक रूप से सीरो-जानपदिक रोग विज्ञान अध्ययन और एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन इंफ्लूएंजा टीकाकरण के बाद में प्रयोग किया जाता है । यह मुख्य रूप से इंफ्लूएंजा हा सतह प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का पता लगाता है और इसलिए कार्यात्मक तनाव विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगा सकते हैं ।

यहां, हम एक 2 दिन एलिसा-एमएन परख आधारित है कि MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का इस्तेमाल का वर्णन । इस परख मानव सीरा में समकालीन एक (H3N2) वायरस को बेअसर एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अनुकूलित है । कई महत्वपूर्ण कदम जब MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग कर MN परख प्रदर्शन पर विचार किया जाना चाहिए । कोशिका रेखा में मानव αSIAT1 सीडीएनए की स्थिरता को बनाए रखने के लिए सबसे पहले, MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को G418 सल्फेट युक्त कल्चर मीडिया में गद्यांश किया जाना चाहिए. G418 सल्फेट (जैसे, geneticin) मीडिया में वायरस के प्रसार और MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख के दौरान की आवश्यकता नहीं है । MN परख में प्रयुक्त कोशिकाओं ७५ के साथ लॉग विकास चरण में होना चाहिए-९५% प्रवाह । दूसरा, अच्छा वायरस स्टॉक के क्रम में सफल MN परख बाहर ले जाने के लिए आवश्यक हैं । वायरस स्टॉक उच्च infectivity के रूप में TCID५० अनुमापन और दोषपूर्ण कणों की एक ंयूनतम राशि से मापा जाना चाहिए । वायरस शेयरों के ंयूनतम कमजोर पड़ने १०० TCID५०/well वायरस को प्राप्त करने के बराबर या 1:100 से अधिक होना चाहिए । हालांकि दोनों अंडा और कोशिका मार्ग वायरस MN परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, MDCK-SIAT1 सेल लाइन 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (H3N2) वायरस7प्रचार के लिए बेहतर आनुवंशिक स्थिरता का कहना है । वायरस के प्रसार, हा और ना वायरस के शेयरों के जीन के बाद सुनिश्चित करें कि कोई अंडा या सेल संस्कृति रूपांतरित उत्परिवर्तनों कुंजी प्रतिजनी साइटों है कि परख में इस्तेमाल किया वायरस के antigenicity में परिवर्तन का कारण हो सकता है पर पेश कर रहे है अनुक्रम होना चाहिए । तीसरा, संक्रामक प्रत्येक परख में इस्तेमाल वायरस की राशि ध्यान से titrated होना चाहिए, और प्रत्येक परख में एक वायरस के लिए एक वापस अनुमापन के शामिल किए जाने के साथ सत्यापित । बहुत अधिक परख में इस्तेमाल किया वायरस कम हो सकता है एंटीबॉडी titers का पता लगाया और परख की संवेदनशीलता को कम । इसी तरह, बहुत कम परख में इस्तेमाल किया वायरस कमजोर कुलपति संकेतों और उच्च पृष्ठभूमि (CC), और झूठी सकारात्मक परिणाम का कारण होगा । इस प्रकार, यह प्रदर्शन की निगरानी करने के लिए परख में उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सीरा शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब एक ही सीरा का उपयोग कर एकाधिक वायरस के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की तुलना, यह सुनिश्चित करें कि सभी वायरस के वापस titrations एक स्वीकार्य सीमा के भीतर है महत्वपूर्ण है ।

MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख संवेदनशील और समकालीन 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का पता लगाने में विशिष्ट है (H3N2) मानव सीरा में इंफ्लूएंजा वायरस, antigenically सहित एक (H3N2) वायरस6बहती है । यह परख 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (H3N2) वायरस निष्क्रिय इंफ्लूएंजा टीकाकरण के बाद5,17,18के लिए टीका मानव सीरा पैनलों का मूल्यांकन किया गया है । हालांकि, के रूप में इंफ्लूएंजा वायरस के लिए उत्परिवर्तनों कि वायरस के antigenicity और रिसेप्टर बाइंडिंग गुणों को बदल सकते है और प्रतिजनी बहाव का कारण है, निरंतर प्रयासों के लिए मौजूदा इंफ्लूएंजा सीरोलॉजी परख का अनुकूलन करने के लिए बनाए रखने के लिए आवश्यक है प्राप्त करने के लिए जारी संवेदनशीलता और विशिष्टता नए उभरते इंफ्लूएंजा वायरस की विशेषता के लिए आवश्यक है ।

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Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट में हितों का टकराव नहीं है । इस प्रकाशन में निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखकों के वे है और जरूरी नहीं कि रोग नियंत्रण और रोकथाम और अनुदान एजेंसी के लिए केंद्रों के विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Acknowledgments

हम dr. Xiuhua लू, डॉ फेंग लियू, और सुश्री एशले बरोज के लिए इस पांडुलिपि की तैयारी में उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा और सहायता के लिए सीडीसी प्रभाग के इंफ्लूएंजा से धंयवाद । हम चित्रा 3के ग्राफिक्स की तैयारी में उनकी सहायता के लिए सीडीसी के विभाजन से डॉ एड्रियन रेबर धंयवाद । अन्त में, हम MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए डॉ॰ एम. Matrosovich, Marburg, जर्मनी का धन्यवाद करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

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References

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संक्रामक रोग १२९ अंक एक (H3N2) इंफ्लूएंजा वायरस MDCK-SIAT1 microneutralization TCID बेअसर एंटीबॉडी उन्मुक्ति
मापने इंफ्लूएंजा को निष्क्रिय एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को एक (H3N2) मानव सीरा में Microneutralization परख द्वारा MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग कर वायरस
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