Summary
혜성 분석 결과 단일과 이중 가닥 DNA를 포함 하 여 DNA 손상 나누기를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 화학 요법의 치료 효과 평가 하기 위해 암 세포의 DNA 손상을 측정을 설명 합니다.
Abstract
DNA 손상의 수명 동안은 각 셀에 대 한 일반적인 현상이 며 genomic DNA의 화학 구조에의 한 변경으로 정의 됩니다. 암 치료, 라디오-및 화학 요법 같은 엄청난 양의 추가 DNA 손상, 세포 주기 검거와 apoptosis 제한 암 진행을 이끌어 소개. 실험적인 암 치료 기간 동안 DNA 손상의 정량적 평가 차적인 에이전트의 효율성을 정당화 하기 위해 중요 한 단계입니다. 이 연구에서 우리는 단일 셀 전기 이동 법 분석 결과, 일컬어 혜성 분석 결과, 단일 계량 수 있는에 집중 하 고 이중 가닥 DNA 생체 외에서휴식. 혜성 분석 결과 DNA 손상 부 량 효율적이 고, 실행 하기 쉬운 낮은 시간/예산 요구 및 높은 재현성. 여기, 우리 U251 glioma 셀에 olaparib/temozolomide 조합 치료의 차적인 효과 평가 하 여 전 임상 연구에 대 한 혜성 분석 결과의 유틸리티를 강조 표시 합니다.
Introduction
혜성 분석 결과 처음 개발 되었다 Ostling와 요한슨에 의해 1984 년에 DNA의 마이그레이션 중립 조건1아래 핵에서 조각으로. 기술은 나중 싱 외., 보여주는 알칼리 상태를 실질적으로 특이성 및 재현성 분석 결과2의 증가 의해 개발 되었다. 그 이후, 중립 혜성 분석 결과 주로 데 반면에 알칼리 성 혜성 분석 결과 DNA 손상, 싱글 등의 작은 금액에 대 한 더 민감한 이중 가닥 DNA 틈, 알칼리 정한 사이트, DNA-DNA 이중 가닥 DNA 틈, 검색 또는 DNA-단백질 cross-linking 그리고 DNA 단일 가닥 나누기 불완전 절단과 관련 된 사이트3,4복구. 두 분석 된 DNA의 시각화를 허용 하 고 양적 DNA 손상을 평가 하는 간단한 방법을 제공. 혜성 분석 결과 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전 독성 연구를 위한 중요 한 방법으로 간주 되 고 초기 약물 후보 선택, 환경 모니터링, 인간의 biomonitoring 다른 연구 분야에 적용 됩니다. 그리고 기본 DNA 손상에 연구 하 고5를 복구.
분석 결과의 원리가 이다 전기 분야에서 조각난된 DNA는 핵양체 몸에서 (일컬어 "혜성 머리") 마이그레이션합니다와 agarose 젤 (일컬어 "혜성 꼬리")에서 DNA 얼룩을 형성. 뉴클레오티드 얼룩과 DNA 손상의 범위 "혜성"이 단일 셀 전기 이동 법에 의해 형성을 분석 하 여 측정할 수 있습니다. 꼬리 순간의 계산 더 비교 다른 실험적인 그룹 간의 DNA 손상 시킬 수 있습니다. DNA 손상 탐지의 전통적인 방법에 비해, 혜성 분석 결과 이며 직접, 민감한, 저렴 한, 상대적으로 간단한.
방사선 치료와 chemotherapies 단일 가닥을 생성 하 여 암 치료에 대 한 일반적인 전략은와 이중 가닥 DNA는 염색체6에 나누기. DNA 복구 억제제의 최근 발전 조합 화학요법에 의해 더 효과적인 차적인 효과 허용 하 고 따라서 잠재적으로 빈 혈, 감염, 골 수 억제7, 같은 조직의 부작용을 감소 8.이 연구에서 우리는 많은 (ADP-ribose) (PARP) 억제제, olaparib (Ola)9의 조사 했다. PARP 풍부한 핵 단백질 이며 많은 (ADP-ribose) 폴리머10을 형성 하 여 DNA 기본 절단 복구에 대 한 책임입니다. Temozolomide (TMZ)는 구두로 사용 가능한 alkylating 에이전트 이며 glioma 환자 치료를 위해 널리 이용 되는. DNA 손상 척도를 혜성 분석 결과 사용 하 여 우리는 olaparib/temozolomide 조합 치료 glioma, 치료 하는 효과적인 전략을 제안 glioma 세포에서 DNA 손상 향상 결합 olaparib temozolomide 깊이 설명 temozolomide 혼자11와 비교.
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Protocol
1. 시 약 준비
- 1 x PBS
- 900 mL dH 2 O 100 mL 10 x PBS를 희석 하 고 pH 미터를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정. 실내 온도에 상점.
- 세포 솔루션 (LS)
- 2.5 M NaCl, 100 m m disodium EDTA, 10 mM Tris 자료, 및 900 mL dH 2 O 200 m m NaOH 준비, 그것은 일반적으로 완전 해산을 혼합 수 있도록 약 20 분 걸립니다. 10 pH 미터를 사용 하 여 pH를 조정 합니다. 추가 1% 나트륨 lauryl sarcosinate 및 1% 트라이 톤 X-100 1000 mL를 최종 볼륨을 조정. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 쿨.
- 알칼리 성 전기 이동 법 솔루션 (AES), pH > 13
- 200 m m NaOH와 1 m m disodium EDTA 800 mL dH 2 O. 조정 산도 준비 하 고 pH는 > 13. 1000 mL를 최종 볼륨을 조정 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 냉각.
- 중립 전기 sollution (NES)
- 빙 초 산 100 mM Tris 기지와 300 mM 아세트산 나트륨 1000 mL dH 2 O. 조절 pH 9.0 혼합 하 여 준비 1000 mL 중립 전기 이동 법 버퍼. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 쿨.
- DNA 강수량 솔루션 (DPS)
- 10 mL 7.5 M 암모늄 아세테이트 주식의 준비. DNA 강수량 솔루션 50 ml, 6.7 mL 7.5 M 염화 아세테이트 43.3 mL 95% 에탄올 혼합. 실내 온도에 상점.
- 얼룩 솔루션
- 추가 1 µ L 10000 녹색 형광 핵 산 얼룩 (예를 들어, SYBR 녹색) 30 mL 트리 스-EDTA 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m disodium EDTA, pH 7.4)에 게 x 4 ° C. 보호에서 빛.
- 1% 낮은 녹는 agarose
- 1% 낮은 녹는 포인트 agarose (1 g 100 mL dH 2 O) 전자 레인지에 녹여. 모든 15-20 s는 agarose는 완전히 녹은 것을 확인 하는 agarose를 소용돌이 친다. 사용 하기 전에 적어도 20 분 동안 37 ° C 물 목욕에는 agarose를 놓습니다.
- 미리 따뜻한 피 펫 팁
- P200 피 펫 팁의 좁은 끝 3 mm와 37 ° C에서 따뜻한 agarose를 pipetting 전에 잘라.
2. 혜성 슬라이드 준비
- 코팅 슬라이드
- 는 agarose는 완전히 녹은 때까지 또는 2-3 분 동안 전자 레인지에 녹여 1 %agarose (1 g 100 mL dH 2 O). 유리 현미경 슬라이드는 agarose 찍어와 보풀 지우기를 사용 하 여 슬라이드의 한 면을 닦아 내십시오.
- 누워 건조 또는 빠른 건조를 위해 50 ° C에가 열 하는 평평한 표면에 슬라이드; 건조 후 투명 agarose 필름을 형성 한다. 사용 하기 전에 37 ° C에 코팅된 슬라이드 배치.
- 단일 셀 정지의 준비
- 문화와 치료 glioma 셀
- DMEM 햄 F-12 매체 10 보충에 U251 MG 셀 문화 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 및 37 & #에서 10 µ g/mL 스 176; 5% CO 2와 C.
- 3 분, 1 mL의 트립 신을 사용 하 여 셀을 소화 하 고 중화 FBS와 DMEM 햄 F-12 매체를 사용 하 여 트립 신. 수집 15 mL 튜브에 4 분에 대 한 300 x g에서 회전, 매체, 발음 및 1 x PBS에서 2 x 10 5 셀/mL에서 셀 중단.
참고: 셀 샘플 분석 결과 시작 하기 전에 바로 준비 해야 하 고 모든 샘플에서에서 DNA 손상을 방지 하기 위해 어두운 또는 흐리게 환경에서 처리 되어야 합니다. - 결합 세포 현 탁 액 비율 (37 ° C)에서 1% 녹은 낮은 융 점 agarose 1:10 (v/v), 아래로, pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 즉시 슬라이드에 30 µ L 플라스틱. 사용의 측면에 얇은 층의 형성을 위해 agarose/셀 혼합 확산 피 펫 팁.
- 10 분 30 분 하 고 시간을 증가 향상 높은 습도 환경에서 샘플의 준수 어둠 속에서 4 ° C에서 플랫 슬라이드 장소.
- 담가 하룻밤 1 h에 대 한 어둠 속에서 4 ° c LS 슬라이드.
- 문화와 치료 glioma 셀
3. 단일 셀 전기
- 알칼리 (3.2 단계)를 진행 또는 중립 (단계 3.3) 혜성 시험
- 알칼리 혜성 분석 결과 대 한
- 부드럽게 LS에서 슬라이드를 제거, 배수 초과 버퍼, 그리고 부드럽게 4에서 1 h 동안 AES에 젖어 ° C DNA 해제 수 있도록입니다. 어둠 속에서 슬라이드를 계속.
- 전기 슬라이드 트레이에 추가 미리 냉장된 AES (이 전기 단위의 크기에 따라 달라 집니다) 슬라이드 위에 0.5 c m를 초과 하지 않는, 내부 슬라이드와 모자와 함께 커버. 전원 공급 전압 1 V/cm (전극 사이의 길이)을 설정 하 고 4 시 30 분에 대 한 실행 ° c.
- 슬라이드에서 드레인 과잉 전기 솔루션입니다. DH 2 O 각 실 온에서 5 분에 두 번 슬라이드를 담가 부드럽게.
- 부드럽게 슬라이드 실 온에서 5 분 동안 70% 에탄올에 젖어. 4 단계를 수행 하십시오.
- 중립 혜성 분석 결과 대 한
- 부드럽게 LS에서 슬라이드를 제거 초과 버퍼, 배수와 부드럽게 4 시 30 분에 대 한 NES에 젖어 ° C. 계속 어둠 속에서 슬라이드. 전기 이동 법 슬라이드 트레이에서
- 추가 미리 냉장된 중립 전기 이동 법 버퍼 (이 전기 단위의 크기에 따라 달라 집니다) 슬라이드 위에 0.5 c m를 초과 하지 않는, 내부 슬라이드와 모자와 함께 커버. 전원 공급 전압 1 V/cm (전극 사이의 길이)을 설정 하 고 4에서 45 분 동안 실행 ° c.
- 드레인 슬라이드에서 초과 버퍼입니다. 실 온에서 30 분에 대 한 DPS에서 슬라이드를 담가 부드럽게.
- 부드럽게 실 온에서 30 분 동안 70% 에탄올에 슬라이드를 담가. 4 단계를 수행 하십시오.
4. 혜성 슬라이드 얼룩
- 어둠 속에서 10-15 분 동안 37 ° C에서 슬라이드 건조.
- 장소 50-100 µ L 녹색 형광 핵 산 각에 솔루션 얼룩 말린 agarose 및 어둠 속에서 실 온에서 15 분 동안 얼룩.
- DH 2 O에서에서 간단히 슬라이드를 헹 구 고 완전히 어둠 속에서 37 ° C에서 건조. 이미지 수집 및 분석 진행.
5. 이미지 수집 및 분석
참고: 시각화와 DNA 나누기의 정량화는 기반 epifluorescence 현미경 검사 법 및 혜성 분석 소프트웨어 (재료의 표 참조) 12 .
- 슬라이드 홀더를 가진 현미경에 슬라이드를 놓습니다. Agarose 젤 대물 렌즈에 직면 하 고 있는지 확인 합니다. 무작위로 10 배 대물 렌즈와 형광 현미경을 사용 하 여 스테인드 혜성 슬라이드에서 이미지를 캡처하십시오. 가장자리 및 어떤 공기 방울 주변 지역.
- 확인 각 혜성 꼬리 수평으로 배포 됩니다. 혜성 머리 왼쪽과 오른쪽에서 꼬리에서 발생 합니다.
- 어두운 배경에 밝은 DNA 얼룩과 이진 TIF 형식에 각 그림을 저장합니다. 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 로드는 " 파일 분석을 선택 " 도구 모음의 왼쪽에 있는 버튼. 이미지 보기 창 ( 그림 1)를 표시 합니다.
- 측정 프레임 화면에 그릴 하 고 셀의 혜성에 그것의 크기를 조정 합니다. 클릭에 " 조정 " 머리, 혜성, 그리고 이미지를 따라 꼬리의 임계값 설정 버튼을 클릭에 " 측정을 시작 " 단추 ( 그림 1).
- 프레임을 사용 하 여 셀을 선택 하 고 마우스로 클릭 하 여 측정을 활성화는 " 시험의 혜성 " 버튼, 강도 이미지에 나타난다는 " 프로필 " 선택한 측정 매개 변수 창. 클릭 하 여 결과 저장할 수 있는 " 결과 저장 " 단추 ( 그림 1).
참고: 소프트웨어 혜성 꼬리, 꼬리 DNA, 꼬리 순간 (TM)와 올리브 꼬리 순간 (OTM)의 비율의 길이 포함 하 여 매개 변수를 계산 합니다. 꼬리 순간 다음과 같이 수식으로 계산 된다:
- 50 셀 분석 치료 당.
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Representative Results
현재 프로토콜 혜성 분석 결과 실행 및 데이터 분석 (그림 1)에 대 한 단계별 워크플로 설명합니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 결과 나타났다 U251 세포 독 소 루비 취급 (1 µ M, 20 h)의 혜성 꼬리 더 오래 되었고 더 높은 DNA 강도, 화학 요법 (그림 2)으로 조각난된 DNA의 상당한 축적을 제안 했다.
중 알칼리 성 또는 중성 혜성 분석 결과 대 한 정량 분석 독 소 루비 치료 (그림 3A) DNA 손상을 나타내는 후 크게 증가 혜성 꼬리 형성을 했다. 결과 평균 ± SEM 및 t으로 제시-테스트 통계 비교를 위해 사용 되었다. 두 분석 실험에서 꼬리 순간의 부 량 확인 평균 꼬리 순간의 증가: 알칼리 성 혜성 분석 결과, 0.134 ± 0.0448에 대 한 (n = 52) 13.84 ± 1.325 대 (n = 51), p < 0.01; 중립 혜성 분석 결과, 0.596 ± 0.06668에 대 한 (n = 78) 9.979 ± 0.658 대 (n = 51), p < 0.01. 이러한 데이터 같지는 인덱스 DNA 손상 평가를 제공 합니다. 또한, PARP 억제제 olaparib의 temozolomide 조합 치료 크게 glioma 셀 (그림 3C), DNA 손상을 증가 길이와 혜성 꼬리 신호 강도 향상. 반면 화학 에이전트 temozolomide 차적인 효과 potentiated Olaparib 혼자 DNA 손상을 소개 하지 않았다 (DMSO, 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p < 0.01).
그림 1 : 혜성 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석의 단계별 가이드. (A) 혜성 분석 결과의 도구 모음 소프트웨어. 예를 들어 (B) 알칼리 혜성 분석 결과: 혜성 분석 결과 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 이미지 보기, 강도, 프로필과 데이터 수집 창 구성 됩니다. (C) 이미지 배경, 혜성, 지역과 혜성 머리는 소프트웨어에서 정의 되었다. (D) 강도 프로필 혜성 머리 (빨간색)와 꼬리 (녹색)의 각각 구성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 알칼리와 중립 혜성 분석 실험의 대표 이미지. U251 glioma 독 소 루비로 치료 했다 전지와 알칼리 (위 패널)과 중립 (낮은 패널) 혜성 분석 실험 조사 (눈금 막대 = 10 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 데이터는 혜성의 꼬리 순간. (A) 알카라인 혜성 분석 결과 데이터 플롯. p < 0.01. (B) 중립 혜성 분석 결과 데이터 플롯. p < 0.01. (C) 혜성 분석 결과 분석 공개 temozolomide (TMZ) 및 olaparib (Ola)을 포함 한 조합 치료의 시너지 효과. p < 0.01. (D) temozolomide 및 olaparib의 조합 치료 아래 glioma 셀의 대표 이미지 (눈금 막대 = 10 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
혜성 분석 결과 세포 수준에서 단일 및 이중 가닥 DNA 나누기를 측정 하는 효율적인 도구 이다. 분석 결과 연구에 관한 genotoxicity 및 biomonitoring13, 기본 병 변, DNA crosslinks, 약물 개발 및 알칼리 민감한 사이트에서까지 "황금 표준"으로 널리 적용 되었습니다. 현재 연구에서 우리가 알칼리와 중립 혜성 분석 실험에 대 한 두 가지 단계별 프로토콜 각각 보였다. 결합 하 여 단일 셀 전기 이동 법, 형광 현미경 검사 법, 및 이미지 해석, 모두 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 생체 외에서손상 DNA의 정도 평가 하는 양적 접근을 제공 합니다.
몇 가지 주요 단계는 혜성 분석 결과의 성공적인 실행을 위해 필수적입니다. 예를 들어 치료 시 약 준비의 단계에 취해야 한다. 각 솔루션을 갓 준비 하 고 내 생 적인 DNA 손상을 방지 하거나 샘플 준비 하는 동안 복구를 사용 하기 전에 적어도 30 분에 대 한 적절 한 온도에서 보관 되어야 한다. 또 다른 중요 한 단계는 실행 가능한 단일 세포 현 탁 액의 준비 합니다. 그것은 사용 하기 전에, 혜성 슬라이드의 준비 하는 동안 세포 생존을 극대화 하기 위해 37 ° C에서는 agarose를 유지 하는 것이 중요. 셀/agarose 정지는 즉시 분석 결과 시작 하기 전에 준비 되어야 한다. 피 펫 팁의 측면을 사용 하 여 셀/agarose 정지 확산 대부분 세포의 현미경 검사 법 중 같은 초점면에 배치 될 수 있습니다 있도록 슬라이드, agarose의 얇은 레이어를 달성 하기 도움이 됩니다. 필요에 따라 agarose 첨부 파일을 개선 하기 위해 다이아몬드 기울 ㄴ 펜을 사용 하 여 슬라이드의 가장자리를 긁어.
혜성 분석 결과의 장점에도 불구 하 고이 전통적인 방법14,15의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어 혜성 분석 결과의 처리량은 유리 슬라이드 준비의 과정에 의해 제한 됩니다. 어떤 경우에는 8 던 유리 슬라이드 분석 결과 처리량을 향상 시키기 위해 솔루션을 제공 합니다. 또 다른 한계는 혜성 분석 결과 단순히 셀에 조각난된 DNA의 비율을 나타냅니다. 추가 지원 정보는 철저 하 게 DNA 손상 외 세포질 변화를 묘사 해야 합니다. 이 경우에 apoptosis, γH2A.X 얼룩, 분석과 immunoblotting DNA 손상 대리인의 효과 공개를 다양 한 측면에 대 한 철저 한 분석을 제공 하기 위해 매우 도움이 될 수 있습니다.
혜성 이미지 분석에 대 한 수많은 소프트웨어 고 출력에 다양 한 다른 매개 변수가 포함 됩니다. 가장 일반적으로 사용 되는 매개 변수는 꼬리 길이 꼬리와 꼬리 순간에 DNA의 비율. 꼬리 길이 사용할 수 있습니다, DNA 손상의 수준 낮은 꼬리는 설립된14일단 변경 하는 경향이 하지 않습니다 이후. 그 후, 꼬리의 강도 피해 향상 증가 합니다. 혜성 꼬리에 DNA의 비율으로 선형 깨는 주파수에 관련 된 또 다른 유용한 매개 변수입니다. 꼬리 순간 꼬리 길이 꼬리 강도 하나의 단일 값에 결합, 따라서, 그것은 가장 유용 하 고 자주 사용 합니다.
혜성 분석 결과 genotoxicity 테스트와 인간의 biomonitoring 널리 적용 되었습니다. DNA 수리 효소 억제제의 개발, 혜성 분석 결과 전통적인 화학 요법의 결과 개선 하는 조합 치료를 테스트 하기 위한 유용한 도구를 수 있었다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH, NCI, CCR의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 모든 저자는 NIH, NCI, 및 CCR에서 교내 연구 보조금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
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