Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Evaluering af In Vitro DNA skader med Comet Assay

doi: 10.3791/56450 Published: October 11, 2017

Summary

Komet assay er en effektiv metode til at påvise DNA skade herunder enkelt og dobbelt-strenget DNA pauser. Vi beskriver alkalisk og neutral komet assays for at måle DNA skader i kræftceller til at evaluere den terapeutiske effekt af kemoterapi.

Abstract

DNA-skader er et almindeligt fænomen for hver celle i løbet af sin levetid, og er defineret som en ændring af den kemiske struktur af genomisk DNA. Kræft behandlinger, såsom radio- og kemoterapi, indføre enorme mængde ekstra DNA-skader, fører til celle cyklus anholdelse og apoptose at begrænse kræft progression. Kvantitativ vurdering af DNA-skader i eksperimentel kræftbehandling er et vigtigt skridt til at retfærdiggøre effektiviteten af en genotoksisk agent. I denne undersøgelse, vi fokuserer på en enkelt celle elektroforese assay, også kendt som komet-analysen, der kan kvantificere enkelt og dobbelt-strenget DNA pauser i vitro. Komet assay er et DNA skader kvantificering metode, som er effektiv og nem at udføre, og har lav tid/budget krav og høj reproducerbarhed. Her, fremhæve vi nytten af comet assay prækliniske undersøgelser ved at evaluere genotoksisk virkning af olaparib/temozolomide kombinationsbehandling til U251 gliom celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Komet analysen blev først udviklet af Ostling og Johanson i 1984 ved at demonstrere migration af DNA fragmenter fra kerner under en neutral tilstand1. Teknikken blev senere udviklet af Singh et al., viser, at en basisk tilstand væsentligt øget specificitet og reproducerbarhed af assay2. Siden da, neutral komet analysen bruges oftest til at opdage dobbelt-strenget DNA pauser, mens basisk komet assay er mere følsomme for mindre mængder af DNA-skader, herunder enkelt og dobbeltstrenget DNA bryder, alkali-labil websteder, DNA-DNA eller DNA-protein cross-linking, og DNA enkelt-strenget pauser tilknyttet inkomplet excision reparation sites3,4. Begge assays give visualisering af fragmenterede DNA og give en enkel måde at vurdere kvantitativt DNA-skader. Komet analysen betragtes som en følsom analysemetode for in vitro og i vivo genetiske toksikologiske undersøgelser og gælder for forskellige forskningsområder, som tidlige lægemiddelkandidat udvalg, miljøovervågning, human bioovervågning, og grundlæggende forskning i DNA-skader og reparation5.

Princippet om analysen er at under et elektrisk felt, fragmenterede DNA vandrer ud af nucleoid organ (også kendt som "komet-hoved") og danner en DNA plet i agarosegel (også kendt som "komet-hale"). Med nukleotid farvning, kan omfanget af DNA-skader kvantificeres ved at analysere "kometer" dannet af denne enkelt celle elektroforese. Beregning af halen øjeblik kan yderligere hjælpe for at sammenligne DNA-skader blandt forskellige eksperimentelle grupper. Sammenlignet med traditionelle metoder til DNA skader påvisning, er comet assay direkte, følsomme, billig og forholdsvis enkel.

Strålebehandling og kemoterapier er fælles strategier til behandling af cancer ved at generere enkelt streng og dobbeltstrenget DNA pauser i kromosomer6. Den seneste avancement i DNA reparation hæmmere giver mulighed for en mere effektiv genotoksisk effekt af kombination kemoterapi, og derfor reducerer potentielt systemiske bivirkninger såsom anæmi, infektion og knoglemarv undertrykkelse7, 8. i denne undersøgelse, vi viste undersøgelsen af en poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hæmmer, olaparib (Ola)9. PARP er en rigelige nukleare protein og er ansvarlig for DNA base excision reparation ved at danne en poly (ADP-ribose) polymer10. Temozolomide (TMZ) er en mundtligt rådighed alkylating agent og har været meget udbredt for gliom patientbehandlingen. Ved hjælp af comet analysen for at kvantificere DNA-skader, vise vi at kombinere olaparib med temozolomide dybt forbedrer DNA-skader i gliom celler, hvilket tyder på olaparib/temozolomide kombinationsterapi er en effektiv strategi til at behandle gliom, sammenlignet med temozolomide alene11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberede reagenser

  1. 1 x PBS
    1. fortyndes 100 mL 10 x PBS med 900 mL dH 2 O og ph indstilles til 7.4 ved hjælp af et pH-meter. Opbevares ved stuetemperatur.
  2. Lysis løsning (LS)
    1. forberede 2,5 M NaCl, 100 mM dinatrium EDTA, 10 mM Tris base og 200 mM NaOH i 900 mL dH 2 O, det normalt tager ca 20 min til at Lad blandingen fuldt opløses. PH indstilles til 10 ved hjælp af et pH-meter. Tilføj 1% natrium lauryl sarcosinate og 1% Triton X-100, og justere den endelige mængden til 1.000 mL. Cool til 4 ° C i mindst 30 minutter før brugen.
  3. Alkalisk elektroforese løsning (AES), pH > 13
    1. forberede 200 mM NaOH og 1 mM dinatrium EDTA i 800 mL dH 2 O. Juster pH-værdien og sørg for, at det er pH > 13. Justere den endelige mængden til 1.000 mL. Gøre friske før brug og afkøles til 4 ° C i mindst 30 minutter før brugen.
  4. Neutral elektroforese sollution (NES)
    1. forberede 1.000 mL neutral elektroforese buffer ved at blande 100 mM Tris base og 300 mM natriumacetat til 1.000 mL dH 2 O. Juster til pH 9,0 med iseddike. Cool til 4 ° C i mindst 30 minutter før brugen.
  5. DNA nedbør løsning (DPS)
    1. forberedelse af 10 mL 7.5 M ammonium acetat lager. 50 mL af DNA nedbør løsning, blandes 6,7 mL 7.5 M ammoniumacetat med 43.3 mL 95% ethanol. Opbevares ved stuetemperatur.
  6. Farvning løsning
    1. tilføje 1 µL 10.000 x grøn fluorescerende nukleinsyre pletten (fx SYBR Green) i 30 mL Tris-EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM dinatrium EDTA, pH 7,4) og opbevares ved 4 ° C. Protect fra lys.
  7. 1% lavt smeltepunkt Agarosen
    1. smelte 1% lav smeltepunkt punkt Agarosen (1 g i 100 mL dH 2 O) i en mikrobølgeovn. Slyng Agarosen hver 15-20 s for at sikre at Agarosen er helt smeltet. Placer Agarosen i 37 ° C vandbad i mindst 20 min. før brug.
  8. Pre varm pipette tips
    1. afskåret smal enderne af P200 pipette tips af 3 mm og varme ved 37 ° C før pipettering agarosegelelektroforese.

2. Forberede komet glider

  1. Slide belægning
    1. smelte 1% Agarosen (1 g i 100 mL dH 2 O) i mikrobølgeovn i 2-3 min, eller indtil Agarosen er helt smeltet. Dyp glas objektglas til Agarosen og tørre én side af dias ved hjælp af en fnugfri serviet.
    2. Lægge dias på en flad overflade for at lufttørre eller varme ved 50 ° C til hurtigere tørring; en gennemsigtig Agarosen film bør være dannet efter tørring. Objektglassene belagt i 37 ° C inden brugen.
  2. Forberedelse af enkelt celle suspensioner
    1. kultur og behandle cellen gliom
      1. kultur U251 MG celler i DMEM-skinke F-12 medium suppleret med 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 10 µg/mL streptomycin på 37 & # 176; C med 5% CO 2.
      2. Fordøje celler ved hjælp af 1 mL trypsin i 3 min, og neutralisere trypsin ved hjælp af DMEM-skinke F-12 medium med FBS. Indsamle i 15 mL tube, spin på 300 x g i 4 min., Aspirér medium og suspendere celler på 2 x 10 5 celler/mL i 1 x PBS.
        Bemærk: Eksemplet celle bør fremstilles umiddelbart før du starter analysen og alle prøver skal håndteres i et mørkt eller nedtonet til at forhindre DNA skader fra lys.
      3. Kombinerer cellesuspension med 1% smeltet lavt smeltepunkt Agarosen (ved 37 ° C) i forholdet 1:10 (v/v), blandes forsigtigt af pipettering op og ned, og straks afpipetteres 30 µL på et dias. Bruge siden af den pipette tip til at sprede Agarosen/celle blandingen for at sikre, at dannelsen af et tyndt lag.
      4. Placere diaset flad ved 4 ° C i mørke for 10 min. øge den anvendte agars tid til 30 min. forbedrer overholdelse af prøver i omgivelser med høj fugtighed.
      5. Fordybe dias i 4 ° C LS i mørke i 1 time til natten.

3. Enkelt celle elektroforese

  1. fortsætte tiltrin basisk (3.2) eller neutral (trin 3.3) comet assay
  2. For basisk komet assay
    1. forsigtigt fjerne dias fra LS, dræne overskydende buffer, og forsigtigt fordybe i AES for 1 h på 4 ° C for at give mulighed for DNA afvikling. Holde dias i mørke.
    2. Tilføj pre kølet AES i bakken elektroforese dias overstiger ikke 0,5 cm over de dias (dette afhænger af størrelsen af elektroforese enheder), skal du placere dias inde og dække med en fælles landbrugspolitik. Sæt forsyningsspændingen til 1 V/cm (længde mellem elektroderne) og køre i 30 min. ved 4 ° C.
    3. Dræne overskydende elektroforese løsning fra dias. Forsigtigt fordybe dias to gange i dH 2 O i 5 min ved stuetemperatur.
    4. Fordybe forsigtigt dias i 70% ethanol i 5 min ved stuetemperatur. Fortsæt til trin 4.
  3. Til neutral komet assay
    1. forsigtigt fjerne dias fra LS, dræne overskydende buffer, og forsigtigt fordybe i NES i 30 min. ved 4 ° C. holde dias i mørke.
    2. Tilføj pre kølet neutral elektroforese buffer i bakken elektroforese dias overstiger ikke 0,5 cm over dias (dette afhænger af størrelsen af elektroforese enheder), skal du placere dias inde og dække med en fælles landbrugspolitik. Sæt forsyningsspændingen til 1 V/cm (længde mellem elektroderne) og køre i 45 min. ved 4 ° C.
    3. Dræne overskydende buffer fra dias. Forsigtigt fordybe dias i DPS i 30 min. ved stuetemperatur.
    4. Fordybe forsigtigt dias i 70% ethanol i 30 min. ved stuetemperatur. Fortsæt til trin 4.

4. Pletten komet dias

  1. tørre dias ved 37 ° C i 10-15 min i mørke.
  2. Sted 50-100 µL grøn fluorescerende nukleinsyre farvning løsning på hver tørrede Agarosen og plet i 15 min. ved stuetemperatur i mørke.
  3. Skylles dias kortvarigt i dH 2 O og tørre helt ved 37 ° C i mørke. Gå til image erhvervelse og analyse.

5. Image erhvervelse og analyse

Bemærk: visualisering og kvantificering af DNA pauser er baseret på epifluorescensmikroskop mikroskopi og comet assay software (Se Tabel af materialer) 12 .

  1. Objektglassene på mikroskop med en diasholderen. Sikre agarosegel står på mål linsen. Tilfældigt fange billeder fra farves komet dias ved hjælp af et fluorescens mikroskop med en 10 x mål linse. Undgå kanter og områderne omkring eventuelle luftbobler.
  2. Sikre hver komet hale fordeles vandret. Komet hoveder bør stamme fra venstre og hale fra højre.
  3. Gemme hvert billede i et binært TIF format med lyse DNA plet og mørk baggrund. Indlæse billeder til software ved hjælp af den " Vælg filer til at analysere " knappen, som er placeret på venstre side af værktøjslinjen. Et billede se vinduet skal vises ( figur 1).
  4. Tegne en måling ramme på skærmen og justere dens størrelse i overensstemmelse med comet af cellen. Klik på den " Juster " knap for at indstille tærsklen på hoved, comet og hale efter billedet og derefter klikke på den " Start målinger " knappen ( figur 1).
  5. Marker en celle ved hjælp af rammen og aktivere målingen ved at klikke med musen på den " Assay comet " knap; en intensitet billede dukker op på den " profiler " vindue med parametrene valgte måling. Resultaterne kan blive frelst ved at klikke på den " gemme resultatet " knappen ( figur 1).
    Bemærk: Softwaren beregner de parametre, herunder længden af comet hale, procentdelen af tailed DNA, halen øjeblik (TM) og oliven halen øjeblik (OTM). Hale øjeblikke er beregnet ved hjælp af formler som følger:
    Equation 1
    Equation 2
  6. analysere mindst 50 celler per behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol beskriver en trinvis arbejdsproces for comet assay udførelse og analyse af data (figur 1). Resultater fra alkaline og neutral komet assays viste, at kometen halen af doxorubicin-behandlede U251 celler (1 µM, 20 h) blev længere og havde højere DNA intensitet, hvilket tyder på en betydelig ophobning af fragmenterede DNA som følge af kemoterapi (figur 2).

Kvantitativ analyse for enten basiske eller neutrale komet Analysen viste signifikant øget komet hale dannelsen efter doxorubicin behandling (figur 3A) med angivelse af DNA-skader. Resultaterne præsenteres som gennemsnit ± SEM, og t-test blev anvendt til statistiske sammenligninger. Kvantificering af halen øjeblik fra begge assays bekræftet stigning på gennemsnitlig halen øjeblik: For basisk komet assay, 0.134 ± 0.0448 (n = 52) vs 13.84 ± 1.325 (n = 51), p < 0,01; For neutrale komet assay, 0.596 ± 0.06668 (n = 78) vs 9.979 ± 0.658 (n = 51), p < 0,01. Disse data giver en kvantificerbar indeks for at evaluere DNA-skader. Desuden forbedret kombinationsbehandling af PARP hæmmer olaparib og temozolomide væsentligt DNA skader i gliom celler (figur 3 c), med en øget længde og intensitet af comet hale signal. Olaparib alene ikke indførte DNA-skader, der henviser til, at det forstærkede genotoksisk effekt af kemo agent temozolomide (DMSO, 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p < 0,01).

Figure 1
Figur 1 : Trin for trin guide billede analyse ved hjælp af comet assay software. (A) værktøjslinjen i komet analysen software. (B) alkalisk komet assay som eksempel: brugergrænsefladen i komet assay software består af et billedvisning, intensitet profil og data erhvervelse vindue. (C) billedet baggrund, comet region og comet hoved var defineret i softwaren. (D) intensiteten profiler af comet hoved (rød) og hale (grøn) er afbildet, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant billeder af alkalisk og neutral komet assays. U251 gliom celler blev behandlet med doxorubicin og undersøgt af basisk (øvre paneler) og neutral (lavere paneler) comet assays (skalalinjen = 10 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative data af kometen hale øjeblik. (A) alkalisk komet assay data plot. p < 0,01. (B) Neutral komet assay data plot. p < 0,01. (C) Comet assay analyse afslørede de synergiske virkninger af kombinationsbehandling, herunder temozolomide (TMZ) og olaparib (Ola). p < 0,01. (D) repræsentative billeder af gliom celler under kombinationsbehandling af temozolomide og olaparib (skalalinjen = 10 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Komet assay er et effektivt redskab til at måle enkelt og dobbelt-strenget DNA pauser på cellulært niveau. Analysen har været almindeligt anvendt som en "golden standard" i undersøgelser vedrørende genotoksicitet og bioovervågning13, lige fra base læsioner, DNA krydsbindinger, stof udvikling og alkali følsomme steder. I den foreliggende undersøgelse viste vi to særskilte trinvise protokoller for basisk og neutral komet assays, henholdsvis. Kombinere enkelt celle elektroforese, fluorescerende mikroskopi og billede fortolkning, giver både de alkaliske og neutral komet assays kvantitative tilgange til at vurdere omfanget af DNA skade i vitro.

Flere vigtige skridt er afgørende for vellykket gennemførelse af comet assay. For eksempel skal sørges i trin af reagens. Hver løsning skal være frisk tilberedt og holdt den passende temperatur i mindst 30 min før brug, for at forhindre endogene DNA-skader eller reparere under forberedelse af prøver. Et andet vigtigt skridt er forberedelsen af levedygtige encellede suspension. Det er vigtigt at holde Agarosen ved 37 ° C før brug, for at maksimere celle overlevelse under forberedelse af comet dias. Celle/Agarosen suspension bør tilberedes umiddelbart før du starter analysen. Ved hjælp af siden af pipette tips til at sprede den celle/Agarosen suspension bidrager til opnåelse af et tyndt lag af Agarosen på dias, så at de fleste af cellerne kan være placeret i det samme brændplanet under mikroskopi. Du kan eventuelt ridse kanterne af dias ved hjælp af en diamant spids pen til at forbedre Agarosen vedhæftet fil.

Trods fordelene ved komet assay er der flere begrænsninger i denne traditionelle metode14,15. For eksempel, er gennemløb af comet analysen begrænset af processen med glas dias forberedelse. I nogle tilfælde indeholder en otte-vældede glas dias en løsning for at forbedre analysen overførselshastighed. En anden begrænsning er, at komet assay blot repræsenterer forholdet mellem den fragmenterede DNA i cellerne. Ekstra støttende oplysninger skal grundigt skildrer de cellulære ændringer udover DNA-skader. I så fald kunne apoptose analyse, γH2A.X farvning, og immunoblotting være meget nyttigt at give en grundig analyse af forskellige aspekter at afsløre effekten af DNA skade agenter.

Der er mange software til comet billedanalyse og output indeholder en række forskellige parametre. De mest almindeligt anvendte parametre er hale længde, procentdelen af DNA i halen, og halen øjeblik. Hale længde kan kun anvendes på et lavt niveau af DNA-skader, da det ikke har tendens til at ændre når halen er etableret14. Efterfølgende, øger intensiteten af halen som skaden er forbedret. Procentdelen af DNA i komet hale er en anden nyttig parameter, som det er lineært relateret til breaking frekvens. Halen øjeblik kombinerer hale længde og hale intensitet i én enkelt værdi, det er derfor, de mest nyttige og ofte anvendte parameter.

Komet assay er blevet bredt anvendt i genotoksicitet og human bioovervågning. Med udviklingen af DNA reparation enzymhæmmere kunne comet analysen et værdifuldt værktøj til afprøvning Kombinationsbehandlinger, der forbedrer resultatet af traditionel kemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af murene forskningsprogrammet NIH, national kritisk infrastruktur og CCR. Alle forfattere har modtaget murene forskning tilskud fra NIH, national kritisk infrastruktur og CCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free) TEKnova P0196
NaCl Sigma S5886
EDTA TEKnova E0308
Trizma base Sigma T1503
NaOH Sigma 72068
Sodium lauryl sarcosinate Sigma L7414
Triton X-100 Sigma 93443
Sodium acetate Sigma 32318
Glacial acetic acid Sigma 695092
Ammonium acetate Sigma A1542
SYBR Green Invitrogen S33102
Low melting point agarose Invitrogen 16520
Agarose Invitrogen 16500
95% ethanol WARNER-GRAHAM #64-17-5
Trypsin GIBICO 25300-054
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Glass tissue slides ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 63422-11
Kimwipes KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes DENVILLE
Pipette Tips SHARP
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Microwave Avanti
Waterbath PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber TREVIGEN Cometassay ES II
Power supply Bio-Rad
Incubator Quincy Lab Model 12-140E
Fluorescent microscope Zeiss LSM700
Micropipettor Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123, (1), 291-298 (1984).
  2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175, (1), 184-191 (1988).
  3. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35, (3), 206-221 (2000).
  4. Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54, (8), 502-508 (2016).
  5. Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87, (6), 949-968 (2013).
  6. Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
  7. Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
  8. Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
  9. Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116, (22), 4578-4587 (2010).
  10. Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7, (1), 20-37 (2017).
  11. Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77, (7), 1709-1718 (2017).
  12. Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534, (1-2), 15-20 (2003).
  13. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681, (1), 93-109 (2009).
  14. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26, (3), 249-261 (2004).
  15. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
Evaluering af <em>In Vitro</em> DNA skader med Comet Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).More

Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. J. Vis. Exp. (128), e56450, doi:10.3791/56450 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter