Summary
Komet analysen är en effektiv metod att upptäcka DNA-skador inklusive enkel- och dubbel-strängat DNA bryter. Vi beskriver basiska och neutrala komet analyser för att mäta DNA-skador i cancerceller att utvärdera den terapeutiska effekten av kemoterapi.
Abstract
DNA-skador är ett vanligt fenomen för varje cell under dess livslängd och definieras som en förändring av den kemiska strukturen hos genomiskt DNA. Cancerbehandlingar, såsom radio- och kemoterapi, införa enorm mängd ytterligare DNA-skador, vilket leder till cellcykelarrest och apoptos att begränsa cancer progression. Kvantitativ bedömning av DNA-skador under experimentell cancerterapi är ett viktigt steg att motivera effektiviteten av en genotoxisk agent. I denna studie, vi fokuserar på en enda cell elektrofores analys, även känd som komet analysen, som kan kvantifiera enda och dubbel-strand DNA avbrott in vitro. Komet analysen är en DNA skador kvantifiering metod som är effektiv och lätt att utföra, och har låga tid/budget krav och hög reproducerbarhet. Här, belysa vi nyttan av komet analysen för en preklinisk studie genom att utvärdera genotoxiska effekten av olaparib/temozolomide kombinationsbehandling till U251 glioma celler.
Introduction
Komet analysen utvecklades först av Östling och Johanson 1984 genom att påvisa migration av DNA fragment från atomkärnor under en neutral villkor1. Tekniken utvecklades senare av Singh et al., visar att ett alkaliskt tillstånd ökade väsentligt den specificitet och reproducerbarhet av assay2. Sedan dess har neutral komet analysen mestadels används för att upptäcka dubbelsträngat DNA raster, medan den alkaliska komet-analysen är mer känsliga för mindre mängder DNA-skador, inklusive enkelrum och Dubbelrum strand DNA bryts, alkali-labila platser, DNA-DNA eller DNA-protein cross-linking och DNA single-strand raster är associerad med ofullständig excision reparation platser3,4. Båda analyserna ge visualisering av fragmenterade DNA och tillhandahålla ett okomplicerat sätt att utvärdera kvantitativt DNA-skador. Komet analysen betraktas som en känslig metod för in vitro och i vivo genetiska toxikologiska studier och är tillämplig på olika forskningsområden, som tidigt läkemedelskandidat urval, miljöövervakning, biologisk övervakning, och grundläggande forskning om DNA-skador och reparation5.
Principen om analysen är att under ett elektriskt fält, fragmenterade DNA migrerar ut ur nucleoid kroppen (även känd som ”komet huvudet”) och bildar en DNA fläck i agarosgel (även känd som ”komet tail”). Med nukleotid färgning, kan omfattningen av DNA-skador kvantifieras genom att analysera ”kometer” bildas av denna enda cell elektrofores. Beräkning av svansen nu kan ytterligare bidra till att jämföra DNA-skador bland olika experimentella grupper. Komet analysen jämfört med traditionella metoder av DNA skada upptäckt, och är direkt, känslig, billig och relativt enkel.
Strålbehandling och kemoterapi är gemensamma strategier för cancerbehandling genom att generera enda strand och dubbel strand DNA bryter i kromosomer6. Senaste befordran i DNA reparation hämmare tillåter en effektivare genotoxisk effekt genom kombinationskemoterapi, och därför minskar potentiellt systemiska biverkningar såsom anemi, infektion och benmärgen dämpning7, 8. i denna studie visade vi utredningen av en poly (ADP-ribos) (PARP) polymerashämmare, olaparib (Ola)9. PARP är en riklig nukleära protein och ansvarar för DNA base excision repair genom att bilda en poly (ADP-ribos) polymer10. Temozolomide (TMZ) är en oralt tillgänglig alkylerare och har använts för gliom patientbehandling. Genom att använda komet analysen för att kvantifiera DNA-skador, visar vi att kombinera olaparib med temozolomid djupt förbättrar de DNA-skador i glioma celler, vilket tyder på olaparib/temozolomide kombinationsbehandling är en effektiv strategi att behandla gliom, som jämfört med temozolomid ensam11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda reagenser
- 1 x PBS
- Späd 10 x 100 mL PBS med 900 mL dH 2 O och justera pH till 7,4 med hjälp av en pH-mätare. Förvara i rumstemperatur.
- Lysis lösning (LS)
- förbereda 2,5 M NaCl, 100 mM dinatrium EDTA, 10 mM Tris base och 200 mM NaOH i 900 mL dH 2 O; det vanligen tar ca 20 min att låta blandningen att helt upplösa. Justera pH till 10 med hjälp av en pH-mätare. Lägg till 1% natrium lauryl sarcosinate och 1% Triton x-100, och justera den slutliga volymen till 1000 mL. Coolt att 4 ° C i minst 30 min innan användning.
- Alkaliska elektrofores lösning (AES), pH > 13
- förbereda 200 mM NaOH och 1 mM dinatrium EDTA i 800 mL dH 2 O. Justera pH och kontrollera att det är pH > 13. Anpassa den slutliga volymen till 1000 mL. Gör fräsch före användning och kyl ned till 4 ° C i minst 30 min innan användning.
- Neutral elektrofores sollution (NES)
- förbereda 1000 mL neutral elektrofores buffert genom att blanda 100 mM Tris base och 300 mM natriumacetat till 1 000 mL dH 2 O. Justera pH till 9,0 med isättika. Coolt att 4 ° C i minst 30 min innan användning.
- DNA nederbörd lösning (DPS)
- beredning av 10 mL 7,5 M ammonium acetat lager. För 50 mL DNA nederbörd lösning, blanda 6,7 mL 7,5 M ammoniumacetat med 43,3 mL 95% etanol. Förvara i rumstemperatur.
- Färgningen lösning
- Add 1 µL 10.000 x Grön fluorescerande nukleinsyra fläcken (t.ex., SYBR Green) i 30 mL Tris-EDTA buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM dinatrium EDTA, pH 7,4) och store vid 4 ° C. skydda från ljus.
- 1% låg smälta agarosen
- smälta 1% låg smältning pekar agaros (1 g i 100 mL dH 2 O) i en mikrovågsugn. Snurra Agarens varje 15-20-s för att kontrollera att Agarens är helt smält. Placera Agarens i 37 ° C vattenbad i minst 20 min innan användning.
- Pre varma pipettspetsar
- avskuren P200 pipettspetsar smala ändar av 3 mm och varma vid 37 ° C före pipettering agaros.
2. Förbereda komet glider
- Skjut beläggning
- smälta 1% agaros (1 g i 100 mL dH 2 O) i mikrovågsugn för 2-3 min eller tills Agarens är helt smält. Doppa glas objektglas till Agarens och torka av ena sidan av bilden med en luddfri torka.
- Låg glasen på en plan yta att lufttorka eller värme vid 50 ° C för snabbare torkning; en transparent agaros film bör bildas efter torkning. Placera belagda glasen i 37 ° C före användning.
- Beredning av enda cellsuspensioner
- kultur och behandla den glioma cellen
- kultur U251 MG celler DMEM-Ham F-12 medellång kompletteras med 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 10 µg/mL streptomycin på 37 & # 176; C med 5% CO 2.
- Smälta cellerna med 1 mL trypsin för 3 min och neutralisera trypsin använder DMEM-Ham F-12 medium med FBS. Samla i 15 mL tub, snurra på 300 x g i 4 min, aspirera på medellång och avbryta celler på 2 x 10 5 celler/mL i 1 x PBS.
Obs: Cell provet bör förberedas omedelbart innan analysen och alla prover ska hanteras i en mörk eller nedtonad miljö för att förhindra DNA-skador från light. - Kombinera cellsuspension med 1% smält låg smältpunkt agaros (vid 37 ° C) i förhållandet 1:10 (v/v), blanda försiktigt genom pipettering upp och ner och omedelbart Pipettera 30 µL på ett objektglas. Använd sidan av den pipettspetsen att sprida agaros deponicell blandningen för att säkerställa att bildandet av ett tunt skikt.
- Placera bilden platt vid 4 ° C i mörker för 10 min. öka gelbildande tiden till 30 min förbättrar vidhäftning av prover i miljöer med hög luftfuktighet.
- Fördjupa bilden i 4 ° C LS i mörkret för 1 h till över natten.
- kultur och behandla den glioma cellen
3. Single Cell elektrofores
- gå vidare till alkaliska (steg 3,2) eller neutrala (steg 3.3) komet assay
- för alkaliska komet assay
- försiktigt bort bilder från LS, dränera överflödig buffert och försiktigt fördjupa i AES för 1 h 4 ° C att tillåta DNA avveckling. Hålla bilderna i mörkret.
- Lägg till pre kylda AES i elektrofores Skjut facket, överstiger inte 0,5 cm ovanför bilderna (Detta beror på storleken på enheterna som elektrofores), placera bilder inuti och täck med ett lock. Ställa nätspänningen till 1 V/cm (längd mellan elektroder) och köra i 30 min vid 4 ° C.
- Avlopp överskott elektrofores lösning från bilden. Sänk försiktigt ned bilderna två gånger i dH 2 O 5 min varje rumstemperatur.
- Sänk försiktigt diabilder i 70% etanol för 5 min i rumstemperatur. Fortsätt till steg 4.
- För neutrala komet assay
- Ta försiktigt bort bilderna från LS, dränera överflödig buffert och försiktigt fördjupa i NES under 30 minuter vid 4 ° C. hålla bilden i mörkret.
- Lägg till pre kylda neutrala elektrofores buffert i elektrofores Skjut facket, överstiger inte 0,5 cm ovanför diabilder (Detta beror på storleken på enheterna som elektrofores), placera bilder inuti och täck med ett lock. Ställer nätspänningen till 1 V/cm (längd mellan elektroder) och kör för 45 min vid 4 ° C.
- Avlopp överskott buffert från glasen. Sänk försiktigt ned bilder i DPS i 30 min i rumstemperatur.
- Sänk försiktigt ned bilder i 70% etanol i 30 min i rumstemperatur. Fortsätt till steg 4.
4. Fläcken komet bilder
- torra diabilder vid 37 ° C i 10-15 min i mörkret.
- Plats 50-100 µL grön fluorescerande nukleinsyra färgning lösning på varje torkade agaros och fläcken för 15 min i rumstemperatur i mörkret.
- Skölj glasen kort i dH 2 O och torka helt vid 37 ° C i mörker. Gå vidare till bild förvärv och analys.
5. Bild förvärv och analys
Obs: den visualisering och kvantifiering av DNA raster baseras på epifluorescence mikroskopi och komet analys programvara (se Tabell för material) 12 .
- Placera glasen på mikroskopet med en hållare. Säkerställa agarosgel vänd åt objektivet. Slumpmässigt fånga bilder från färgade komet bilder med fluorescens Mikroskop med en 10 x objektiv. Undvika kanter och områdena kring eventuella luftbubblor.
- Se till att varje komet svans fördelas horisontellt. Komet huvuden ska komma från vänster och från höger svans.
- Spara varje bild i ett binärt TIF-format med ljusa DNA fläcken och mörk bakgrund. Ladda bilder till programvara med den " Välj filer att analysera " knappen som ligger till vänster om verktygsfältet. En bild Visa fönster ska visas ( figur 1).
- Rita en mätning ram på skärmen och justera storleken i enlighet med kometen av cellen. Klicka på den " justera " för att ställa in tröskelvärdet på head, komet och svans enligt bilden och sedan på den " starta mΣtningarna " knappen ( figur 1).
- Välj en cell med ram och aktivera mätning genom att klicka med musen på den " Assay kometen " knappen; en intensitet bilden dyker upp på den " profiler " fönster med de valda mätparametrar. Resultaten kan sparas genom att klicka på den " lagra resultatet " knappen ( figur 1).
Obs: Beräknar programvaran parametrar inklusive längden på komet svansen, andelen tailed DNA, den svans (TM) och Olive svans ögonblick (OTM). Svans stunder beräknas av formlerna som följer:
- analysera minst 50 celler per behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolls beskriver ett stegvis arbetsflöde för komet assay utförande och dataanalys (figur 1). Resultaten från de basiska och neutrala komet analyserna visade att komet svansen av doxorubicin-behandlade U251 celler (1 µM, 20 h) var längre och hade högre DNA intensitet, vilket tyder på en betydande ansamling av fragmenterade DNA på grund av kemoterapi (figur 2).
Kvantitativ analys för antingen basiska eller neutrala komet analysen visade signifikant ökad komet svans bildandet efter doxorubicin behandling (figur 3A) som visar DNA-skador. Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM och t-tester användes för statistiska jämförelser. Kvantifiering av svansen nu från båda analyser bekräftas ökningen av genomsnittliga svans ögonblick: för alkaliska komet analysen, 0.134 ± 0.0448 (n = 52) vs. 13.84 ± 1.325 (n = 51), p < 0,01; För neutral komet analysen, 0,596 ± 0.06668 (n = 78) vs. 9.979 ± 0,658 (n = 51), p < 0,01. Dessa data ger ett kvantifierbart index för att utvärdera DNA-skador. Dessutom förbättrade kombinationsbehandling av PARP-hämmare olaparib och temozolomide markant DNA-skador i glioma celler (figur 3 c), med en ökad längd och intensitet av komet svans signalerar. Olaparib ensam introducerade inte DNA-skador, medan det förstärkte genotoxiska effekten av den kemo agent temozolomid (DMSO, 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p < 0,01).
Figur 1 : Steg för steg guide av bildanalys med komet analys programvara. (A) i verktygsfältet för komet analys programvara. (B) alkaliska komet assay exempel: användargränssnittet för komet analys programvara består av en bild Visa och intensiteten profil data förvärv fönster. (C), bilden bakgrund, komet region och komet huvud definierades i programvaran. (D), intensiteten profiler av komet huvud (röd) och svans (grön) är ritade, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av basiska och neutrala komet analyserna. U251 glioma celler var behandlade med doxorubicin och utreds av alkaliska (övre paneler) och neutral (lägre paneler) komet analyser (skalstapeln = 10 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa uppgifter av komet svans ögonblick. (A) alkaliska komet assay data tomt. p < 0,01. (B) Neutral komet assay data tomt. p < 0,01. (C) komet assay analysen visade den synergistiska effekten av kombinationsbehandling inklusive temozolomid (TMZ) och olaparib (Ola). p < 0,01. (D) representativa bilder av glioma celler under kombinationsbehandling med temozolomid och olaparib (skalstapeln = 10 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Komet analysen är ett effektivt verktyg att mäta enkel- och dubbel-strand DNA raster på cellnivå. Analysen har tillämpats allmänt som ”golden standard” i studier avseende gentoxicitet och biologisk övervakning13, alltifrån bas lesioner, DNA antipyridinantikropp, läkemedelsutveckling och alkali känsliga platser. I den aktuella studien visade vi två distinkta stegvisa protokoll för basiska och neutrala komet analyser, respektive. Kombinera enstaka cell elektrofores, fluorescerande mikroskopi och bild tolkning, ge både alkaliska och neutrala komet analyserna kvantitativa metoder att utvärdera omfattningen av DNA skada i vitro.
Flera viktiga steg är nödvändiga för det framgångsrika genomförandet av komet analysen. Exempelvis bör vara försiktig i steg i REAGENSBEREDNING. Varje lösning bör vara färska förberedda och hållas vid lämplig temperatur under minst 30 minuter innan användning, för att förhindra endogent DNA-skador eller reparera under provberedning. Ett annat viktigt steg är utarbetandet av livskraftiga encelliga suspension. Det är viktigt att hålla Agarens vid 37 ° C före användning för att maximera cellöverlevnad under beredning av komet bilder. Cell/agaros suspensionen ska beredas omedelbart innan analysen. Med sidan av pipettspetsar för att sprida cell/agaros upphängningen bidrar till ett tunt lager av agarosgelelektrofores på bilderna, så att de flesta av cellerna kan placeras i samma fokalplan under mikroskopi. Alternativt, skrapa kanterna på bilderna med en diamantbestyckade penna för att förbättra agaros kvarstad.
Trots fördelarna med komet analysen finns det flera begränsningar av denna traditionella metod14,15. Till exempel begränsas genomströmning av komet analysen av processen av glas diabilder preparatet. I vissa tillfällen ger en åtta-vällde glasskiva en lösning för att förbättra analysen genomströmning. En annan begränsning är att komet analysen helt enkelt representerar förhållandet mellan fragmenterade DNA i cellerna. Ytterligare stödjande information krävs att grundligt skildra de cellulära förändringarna förutom DNA-skador. I så fall kunde apoptos analys, γH2A.X färgning och immunoblotting vara mycket bra att ge en grundlig analys av olika aspekter att avslöja effekten av DNA skadliga ämnen.
Det finns många program för komet bildanalys och utdata innehåller en mängd olika parametrar. De vanligaste parametrarna är längden på svansen, procentandelen av DNA i svansen och svans nu. Tail längd kan endast användas vid låga nivåer av DNA-skador, eftersom det inte tenderar att ändra när svansen är etablerade14. Därefter ökar intensiteten i svansen som skadan förstärks. Procentandelen av DNA i komet svansen är en annan användbar parameter, som är linjärt relaterad till breaking frekvensen. Svans nu kombinerar svanslängd och svans intensitet i ett enstaka värde, därför är det mest användbara och ofta använda parametern.
Komet analysen har tillämpats allmänt genotoxicitet provning och biologisk övervakning. Med utvecklingen av DNA reparation enzymhämmare kunde komet analysen ett värdefullt verktyg för att testa kombinationsbehandlingar som förbättrar resultatet av traditionell kemoterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av intramurala forskningsprogrammet NIH, NCI och CCR. Alla författare fick intramurala forskningsbidrag från NIH, NCI och CCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
- Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
- Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
- Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
- Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
- Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
- Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
- Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
