Summary
Cel migratie is essentieel voor de ontwikkeling, weefsel onderhoud en reparatie en tumorvorming en wordt gereguleerd door groeifactoren, chemokines en cytokinen. Dit protocol beschrijft de stip assay, een twee-dimensionale, onbeperkte migratie test om te beoordelen van de trekkende fenotype van geschakelde, samenhangende cel bladen in reactie op microenvironmental signalen.
Abstract
Hoewel er complexe organismen verschijnen statische, zijn hun weefsels onder een continue omzet. Als cellen leeftijd, verplaatsen sterven, en zijn vervangen door nieuwe cellen, cellen binnen weefsels in een strak georkestreerde wijze. Tijdens de ontwikkeling van de tumor, dit evenwicht wordt verstoord, en tumorcellen laat het epithelium van oorsprong te vallen van de lokale communicatie, te reizen naar verre locaties, en uiteindelijk gemetastaseerde tumoren op verre locaties. De stip-bepaling is een eenvoudige, tweedimensionale onbeperkte migratie assay, te beoordelen van de netto verkeer van cel bladen in een cel-vrije zone, en te analyseren parameters van cel migratie met behulp van time-lapse imaging. Hier, de bepaling van de dot is aangetoond door middel van een mens invasieve, Long kolonievormende borst kanker cellijn, MCF10CA1a, voor het analyseren van de cellen trekkende reactie op epidermale groeifactor (EGF), waarvan bekend is dat het kwaadaardig potentieel van borstkankercellen vergroten en de trekkende fenotype van cellen wijzigen.
Introduction
Migratie testen worden veel gebruikt om te evalueren van de invasieve en gemetastaseerde potentieel van tumor cellen in vitro. Meestal, wordt de wond of kras assay gebruikt ter beoordeling van de migratie van epitheliale bladen in een cel gewist gebied1,2,3. Voor het uitvoeren van de kras assay, cellen zijn vergulde in een enkelgelaagde en een "scratch" of cel-vrije zone wordt gemaakt met een pipet tip. De kras assay is gemakkelijk aan opstelling met algemeen beschikbare weefselkweek leveringen en multi goed platen, waardoor voor de verwerking van meerdere monsters kan worden uitgevoerd. Echter, zoals de kras is gemaakt, cellen zijn fysiek verwijderd uit de enkelgelaagde en vaak ondergaan celdood. Extracellulaire matrix gekoppeld aan de plaat is bovendien vaak beschadigd tijdens het krassen. Ook het gebruik van silicium wordt ingevoegd (zoals Ibidi kamers4) of van stencils5,6,7 kan leiden tot mechanische verstoring van de cellen en de gedeeltelijke opheffing van matrix eiwitten gebruikt voor coating de platen. Een ander nadeel van tests toezicht op sluiting van wonden of krassen is hun beperkte tijdsverloop, zoals cel migratie kan alleen worden geanalyseerd totdat de kras is gesloten.
Bij het uitvoeren van de bepaling van de stip, zijn cellen vergulde als een circulaire kolonie op een bekleed of niet gestreken plaat8. De reden voor deze beplating strategie is het verkrijgen van cel bladen met gedefinieerde randen, die kunnen migreren of binnenvallen in de omliggende gebieden met cel-vrij zonder verstoring van de cultuur door verwijdering van cellen of inzetstukken. Het algemene doel van de bepaling van de dot is te observeren van de migratie van cel bladen zoals gemeten door de verplaatsing van de rand of kolonie diameter, alsmede uitvoeren time-lapse imaging voor het analyseren van de trekkende fenotype van cellen in een hogere spatio-temporele resolutie.
Cel migratie kan worden beïnvloed door een verscheidenheid van microenvironmental signalen zoals chemokines, cytokines en groeifactoren zoals EGF. EFG is een groeifactor dat oefent haar biologische effecten via binding aan de receptor, EGF receptor9, en verhoogt de invasieve en metastatische gedrag van de tumor cellen4,9,10. Hier, de stip-test wordt gebruikt om te studeren EGF gestimuleerd cel migratie in een menselijke invasieve, Long kolonievormende borst kanker cel lijn (MCF10CA1a)8,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. coating van gerechten (dag 1)
Opmerking: Zorg ervoor dat u niet laat vingerafdrukken of vuil op de bodem van de plaat bij het verwerken van het.
- Muis collageen IV op ijs ontdooien en Verdun het met 50 mM HCl (pH 1.3) ter voorbereiding van 3 mL van een 10 µg/mL collageen IV oplossing.
Opmerking: Collageen neerslaat bij 37 ° C. Het is daarom belangrijk om de collageen-oplossing bij een lage temperatuur tijdens het ontdooien en het werken met het. Herhaalde bevriezen-ontdooien cycli door de voorbereiding van gepaste afmetingen aliquots voorkomen en op te slaan bij-80 ° C. - 250 µL collageen IV oplossing toevoegen aan elk putje van 12-well glazen bodem platen en plaats hen in een gepaste afmetingen, strakke-sluiting plastic doos. Plaats van natte papieren handdoek over en rondom de platen voor de vervaardiging van een vochtige kamer en sluit het. Incubeer de platen 's nachts bij kamertemperatuur.
Opmerking: Als u alleen het groeigebied moet worden bekleed, volstaat alleen betrekking hebben op de cover slip, die is aan de onderkant van de plaat, met collageen oplossing gehecht (Zie Figuur 1A, B voor een schematische voorstelling van de plaat). - Volgende ochtend, spoel platen met gedeïoniseerd H2O tweemaal te verwijderen niet-geabsorbeerd collageen en buffer. Direct het water tot aan de rand van de plaat goed, niet op de rand gevormd door de onderkant van de plaat en het dekglaasje aan (als water is afgepipetteerde in dit gebied die het zal splash). Het drogen van de platen in de laminaire flow kap. Platen onmiddellijk gebruik of bewaren bij 4 ° C voor maximaal 5 dagen.
Opmerking: Verschillende cellijnen kunnen vereisen verschillende coating, zoals fibronectine of collageen ik.
2. plating de Dot Assay (dag 2)
-
Voorbereiding van de celsuspensie
- Cellen die zijn geteeld in een schotel van 60 mm weefselkweek in DMEM/F12 medium aangevuld met 5% paard serum tot 80% samenkomst om te bereiden celsuspensie, gebruiken
- Spoel de cellen met de calcium - en magnesium-free Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) eens, voeg 500 µL trypsine-EDTA (kamertemperatuur) en Incubeer de cellen gedurende 3-5 min. in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer.
- Opschorten van de vrijstaande cellen in 4.5 mL gestolde voedingsbodem om te stoppen trypsine-activiteit en een 20 tellen µL aliquoot gedeelte van de celsuspensie in een hemocytometer.
- De resterende cellen in een conische tube van 15 mL pellet door centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in een kweekvloeistof tot 3 x 106 cellen/mL.
Opmerking: Om andere coating substraten en/of cellijnen, de optimale celdichtheid moet worden ingesteld in een verdunningsreeks. 3 x 106 cellen/mL wordt aanbevolen als uitgangspunt.
-
Beplating cellen
- Plaats een druppel 10 µL celsuspensie in het midden van elke slip van de cover van de collageen IV gecoat glas 12-well bodemplaat zonder aanraken of krabben van de coating (Figuur 1A, B). Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C, bevochtigde sfeer, om de cellen te koppelen. Controleer in een omgekeerde Microscoop of de cellen zijn aangesloten.
Opmerking: Dit kan worden best gezien aan de rand van de daling, waar vorming van een enkelgelaagde kan worden waargenomen (Figuur 1C). Indien nodig, incubeer tot de plaat 3 h. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de broedstoof hoog genoeg is, zoals de druppels snel kunnen uitdrogen. Als een vermindering van het volume daling tijdens deze stap wordt waargenomen, PBS aan de ruimten tussen de putten te verhogen van de vochtigheid toevoegen. - Zachtjes was de putjes met 1 mL gestolde voedingsbodem tweemaal te verwijderen van de niet-ingeschrevenen cellen. Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem toe aan elk putje. Controleer in een omgekeerde Microscoop of geen zwevende cellen blijven, anders was de putjes goed weer. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer, verkrijgen van welomschreven cel bladen.
Opmerking: De zwevende cellen zijn waarschijnlijk opnieuw koppelen aan de plaat en ongewenste cel kolonies vormen.
- Plaats een druppel 10 µL celsuspensie in het midden van elke slip van de cover van de collageen IV gecoat glas 12-well bodemplaat zonder aanraken of krabben van de coating (Figuur 1A, B). Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C, bevochtigde sfeer, om de cellen te koppelen. Controleer in een omgekeerde Microscoop of de cellen zijn aangesloten.
3. stimuleren van de cellen (dag 3)
- Controleer alle putjes met behulp van een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen dat cel kolonies zijn behoorlijk gegroeid. Indien nodig, mark ongeschikt wells en kan ze niet gebruiken.
- Label elk putje van de plaat op de juiste wijze voor elke voorwaarde onderzocht. Elke voorwaarde in dubbele of drievoud uitgevoerd.
- Wijzigen van het medium om te verhongeren de cellen in de DMEM/F12 met 0,1% paard serum (hongerende medium) 3 h voordat cellen worden gestimuleerd.
- Stimuleren van de cellen door toevoeging van EFG (5 ng/mL eindconcentratie) of andere gewenste bemiddelaars/mediators en meng voorzichtig het medium gebruik van een micropipettor van 1 mL of door zwenken van de plaat.
- Incubeer de plaat voor 1-4 dagen te observeren van verplaatsing van de rand en rand contour zoals beschreven in punt 4.1 of time-lapse imaging uit te voeren zoals beschreven in paragraaf 4.2.
4. visualisatie van kolonies van de cel en de cel migratie
-
De Haematoxyline-eosine (HE) kleuring voor het meten van de groei van de kolonie (dag 4-7)
- Fix cellen in 70% ethanol (1 mL/putje) voor ~ 2 min.
- Vlek kernen met haematoxyline (1 mL/putje), ~ 2 min.
- Wassen cellen met leidingwater (1 mL/putje) tot kernen zijn blauw, 5-10 min.
- Vlek cytoplasma met eosine (1 mL/putje), ~ 2 min.
- Spoel af met gedeïoniseerd water (1 mL/putje).
Opmerking: De haematoxyline en eosine oplossingen kunnen worden verzameld en gebruikt meerdere malen totdat de kleuring wordt vaag. - Luchtdroog plaat.
- Draai de plaat en de dot-diameter meten met een liniaal. Als alternatief, neem foto's van de plaat met een camera, en analyseren van de diameter van de dot in ImageJ.
-
Time-lapse microscopie (dag 3)
- De incubator Microscoop inschakelen en aanpassen van de temperatuur tot 37 ° C. Vul de luchtbevochtiger met dH2O. verkleinen/vergroten de CO2 tot 5%. Zorg ervoor dat de zaal incubator is bevochtigde en dat de gemotoriseerde fase zich vrij kan bewegen. Sluit de incubator kamer en laat de Microscoop te passen tot 37 ° C.
Opmerking: De Microscoop (Zie de tabel van materialen) gebruikt hier moet worden verwarmd tot 37 ° C gedurende ten minste 3 uur, voordat de cellen zijn beeld om te voorkomen dat het drijven van de focus. - Plaats de plaat in het werkgebied van de incubator Microscoop en instellen van de fase-lijst. Afbeelding twee tegengestelde randen en het centrum van elke cel stip(Figuur 1).
- Neem beelden elke 3 minuten, voor 15-24 h met gebruikmaking van de 10 X doelstelling. Downloaden van de gegevens en ga verder met beeldanalyse in een programma van keuze, bijvoorbeeldImageJ of Matlab.
- De incubator Microscoop inschakelen en aanpassen van de temperatuur tot 37 ° C. Vul de luchtbevochtiger met dH2O. verkleinen/vergroten de CO2 tot 5%. Zorg ervoor dat de zaal incubator is bevochtigde en dat de gemotoriseerde fase zich vrij kan bewegen. Sluit de incubator kamer en laat de Microscoop te passen tot 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bepaling van de dot (Figuur 1) hier gepresenteerd werd uitgevoerd met behulp van invasieve, Long kolonievormende borstkankercellen (MCF10CA1a) als een modelsysteem. De stip-assay levert zeer reproduceerbaar cel stippen zelfs in de hand van beginners, waardoor het een handig en eenvoudig worden gerealiseerd assay (Figuur 1D). De stip-bepaling in combinatie met hij kleuring, of time-lapse imaging en latere particle image velocimetry (PIV) maakt de studie van de verschillende parameters van de migratie met inbegrip van verplaatsing van epitheliale randen, de snelheid van de cel en cel directionaliteit als cellen aan de randen migreren van een epitheliale sheet in een cel-vrije zone. Aanvankelijk, bleek fase contrast beeldvorming van cel puntjes dat invasieve, Long kolonie vormende borstkankercellen (MCF10CA1a) een mesenchymale fenotype na stimulatie met EGF handhaven. Afzonderlijke cellen verlaten van het blad zijn echter vaker waargenomen in cel EGF-gestimuleerd stippen (Figuur 2, pijlen). De reactie van MCF10CA1a cellen met EFG was verder beoordeeld door hij kleuring van culturen die werden gestimuleerd met EGF voor 4 dagen. Inderdaad, EGF-stimulatie resulteerde in een grotere kolonie diameter (Figuur 3). Deze opmerkingen aangeven dat migratie van EFG gestimuleerd cellen kunnen worden gewijzigd.
Daarom werd de dot-assay vervolgens gebruikt voor het uitvoeren van een meer gedetailleerde analyse van het fenotype van de dynamische migratie van MCF10CA1a cel bladen. Cellen aan de randen van het blad waren beeld voor 9 h na stimulatie van cellen met EGF (Video 1 en Video 2) en beelden werden vervolgens geanalyseerd door PIV in Matlab4,13,14. PIV geopenbaard dat EGF snelheid van de cel (Figuur 4A) aan 0.63 µm/min van 0,45 µm/min in cellen verhoogt. EGF verhoogd directionaliteit van cellen op hetzelfde moment, en dit wordt aangegeven door een vermindering van de variabiliteit van cel directionaliteit (hoekige verspreiding) van 0.95 in de controleculturen aan 0.79 in EGF-gestimuleerd culturen (Figuur 4B). EGF verhoogd de radiale verplaatsing van de epitheliale rand meer dan 9u van 257 µm tot 356 µm (Figuur 4), zoals ook werd waargenomen door hij kleuring na 4 dagen (Figuur 3). Dus, het gebruik van de bepaling van de dot in combinatie met verschillende daaropvolgende testen blijkt dat EGF migratie aan de randen van de MCF10CA1a cellen bladen verandert zodanig dat de snelheid van de cel en de directionaliteit zijn toegenomen, resulterend in een verhoogde kolonie straal.
Figuur 1: De stip assay imaging. (A, B) Cellen zijn vergulde als een circulaire kolonie in het centrum van glazen bodem plaat wells. Voor de analyse van de migratie, zijn images geschoten op twee tegengestelde randen als het centrum van de kolonie (A). (C) donker veld afbeelding van cel dot tijdens beplating (links), en in hogere vergroting (fase contrast) voor het weergeven van de rand van de daling en de rand van de cel stip na cellen gekoppeld aan de plaat (midden). Gekoppelde cellen zijn plat en veelhoekige, terwijl niet-ingeschrevenen cellen ronde zijn (rechts). (D) De diameter van de stippen is zeer reproduceerbaar. Stippen werden onmiddellijk na de beplating en beeld voordat cellen werden gestimuleerd en de diameter bepaald met behulp van ImageJ. De puntgrootte is zeer reproduceerbaar binnen één experiment ook tussen verschillende gebruikers en weinig opleiding moet verwerven vaardigheid in de cel puntjes plating (E = meer dan 10 jaar ervaring in de weefselkweek, ik = minder dan 4 weken ervaring in weefsel c ultuur). n = 12 punten per groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: EGF moduleert de morfologische fenotype van cellen MCF10CA1a. MCF10CA1a cellen waren uitgehongerd voor 3U in DMEM/F12 aangevuld met 0,1% paard serum voordat ze gestimuleerd met EGF werden (5 ng/mL). Aan de rand van kolonies EGF-gestimuleerd afzonderlijke cellen de neiging om te migreren uit het blad (pijlen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : EGF verhoogt de netto groei van cel kolonies. MCF10CA1a cellen waren uitgehongerd voor 3U in DMEM/F12 medium aangevuld met 0,1% paard serum voordat ze gestimuleerd met EGF werden (5 ng/mL). 4 dagen later waren cellen ethanol vast en gekleurd met haematoxyline en eosine. EGF-gestimuleerd stippen hebben een hogere diameter na 4 dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : EGF moduleert de trekkende fenotype van cellen van de MCF10CA1a. MCF10CA1a cellen waren uitgehongerd voor 3U in DMEM/F12 medium aangevuld met 0,1% paard serum voordat ze gestimuleerd met EGF werden (5 ng/mL). Cellen werden elke 3 minuten beeld voor 9 h. opeenvolgende particle image velocimetry analyse werd uitgevoerd in Matlab13. Snelheid waarden vertegenwoordigen de gemiddelde snelheid na verloop van tijd voor elk veld. Hoekige verspreiding van vectoren van de snelheid was als volgt berekend:
waar 
, en varieert van 0 (hoge directionaliteit) en 
(lage directionaliteit). Een afname van de hoekige verspreiding wordt beschouwd als een verhoging in directionaliteit. Radiale verplaatsing werd berekend door aftrekken van de straal van de kolonie op t = 0 h van de straal van de kolonie op t = 9 h. EGF-stimulatie van de MCF10CA1a cel stippen resulteerde in toegenomen cel snelheid (A; bovenste deelvenster), daalde van hoekige verspreiding of verhoogd directionaliteit (B; midden deelvenster), en verhoogde kolonie radius (C; onderste paneel). Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1: Time-lapse beeldvorming van ongestimuleerde MCF10CA1a cellen. Beelden werden genomen om 3 min voor 9 h. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: Time-lapse imaging van MCF10CA1a cellen gestimuleerd met EGF (5 ng/mL). Beelden werden genomen om 3 min voor 9 h. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de progressie van de tumorcellen migreren uit de buurt van het weefsel van oorsprong metastaseren naar verre locaties15te vallen van het omringende weefsel. Migratie van cellen uit de buurt van de kolonie van een cel kan worden waargenomen in de dot-bepaling. Hier, wordt de stip bepaling geïllustreerd door het analyseren van de trekkende fenotype van menselijke borstkankercellen in reactie op EGF.
Nauwkeurige en repliceerbaar om resultaten te verkrijgen verschillende stappen in de opzet van de stip zijn testen kritisch. Eerst, de coating van de plaat kan bepalen als en hoe sterk cellen aan de plaat voldoen kunnen en cellen migreren. Worden moet gezorgd dat de coating van de plaat met collageen IV of andere extracellulaire matrix homogeen is te minimaliseren van experimentele variabiliteit. Bovendien moet er worden gezorgd dat de cellen onderzocht hechten aan migreren op de beklede plaat en meerdere experimenten met verschillende matrices in verschillende concentraties nodig wellicht voor het optimaliseren van de voorwaarden van de coating voor een gekozen cellijn. Ten tweede, de nauwkeurige plating van de cellen is cruciaal voor de reproduceerbaarheid. De voetafdruk van de daling van de cel bepaalt de grootte van de cel-stip, alsmede de vorm. De daling is idealiter geplaatst zonder het uiteinde van de pipet aanraken van het oppervlak. De vorm van de daling wordt vervolgens meestal bepaald door de oppervlaktespanning van het oppervlak van de plaat, wat resulteert in een circulaire voetafdruk reproduceerbare diameter. Bijgevolg kan de diameter van de stip van de cel worden gewijzigd door het veranderen van het volume van de celsuspensie verguld.
Zo zijn verschillende punten kunnen worden bij het uitvoeren van de bepaling van de dot. In de eerste plaats moet de celdichtheid van de celsuspensie worden aangepast aan de coating en het celtype wordt gebruikt. In het algemeen, als de daling van de bredere verspreidt, zijn hogere dichtheden van de cel nodig om plaat cellen in confluente monolayers. Bovendien moeten meer cellen te verkrijgen van een confluente enkelgelaagde als cellen klein zijn en niet verspreiden zoveel als in vergelijking met grote, verspreiden cellen worden verguld. In de tweede plaats de dot-bepaling aangenomen kan worden naar verschillende plaat formaten, hiervoor de puntgrootte kan aangepast worden aan kleinere putten door vermindering van het volume van de dot verguld en indien gewenst, grotere punten kunnen worden verguld met behulp van hogere volumes van de daling. Ten derde, een cel lijnen niet aan de plaat binnen 30 min, in welk geval de plating-tijd hechten zal kan worden verlengd tot 3 h. Ook de coating van de plaat moeten geschikt zijn voor cellen om te migreren op en moet oppassen niet te krabben van de coating, wanneer de cellen plating. Als cellen niet toevoegen of op de gekozen matrix migreren, andere types van coating, bijvoorbeeld collageen 1 of fibronectin, kunnen worden onderzocht of concentraties van matrix eiwitten, incubatie tijden en incubatie temperaturen tijdens de coating van platen veranderd. Geschikte extracellulaire matrix voor specifieke cellijnen kan worden gevonden in de literatuur.
De stip-bepaling heeft enkele beperkingen. Het is een twee-dimensionale migratie assay en dus dit kan worden beschouwd als een nadeel ten opzichte van driedimensionale testen, die echter zijn meer moeilijk uit te voeren dan tweedimensionale testen. Een groot probleem is misschien dat celproliferatie resultaten, beïnvloeden kan, met name als snel delende cellijnen worden gebruikt en cel migratie wordt beoordeeld over langere perioden, zoals hier werd gedaan voor de analyse van de diameter van de kolonie na 4 dagen. Ook wordt de sluiting van een kras gewikkeld in kras tests beïnvloed door celproliferatie binnen de cellaag; en in Boyden kamer tests, met name als serum of andere bemiddelaars die cel proliferations induceren worden gebruikt als een chemoattractant, verhoogde celproliferatie in de onderste zaal kan laten uitvallen resultaten. Eencellige bijhouden kan worden gebruikt om specifiek verkeer van niet-prolifererende cellen te observeren. Bovendien kan celproliferatie worden verminderd door (i) serum honger zoals hier gedaan en/of (ii) de remming van de mitose door toevoeging van mitomycine of andere proliferatie remmers4,16. Verklein de celproliferatie en echter moet zorg men zich niet schade de cellen in een mate dat ze niet langer kunnen migreren. Interessant, vonden we een soortgelijk onbeperkte migratie assay dat celproliferatie is niet gecorreleerd met rand ontheemd, hoewel het is betrokken bij het behoud van de integriteit van de epitheliale blad tijdens migratie4,5, 17. Hiermee opent u een interessante vraag: Is celproliferatie een noodzakelijk onderdeel van de migratie van een cellaag? Er wordt verwacht dat de migratie van cel bladen met sterke cel verklevingen in het omringende milieu will be negatively impacted als proliferatie is volledig geblokkeerd als het blad uiteindelijk niet langer in staat zijn zal uit te breiden en ondersteuning van de migratie van de cellen. Op dit punt, de cellen moeten ofwel traag of stop migratie of het blad moet verstoren. Omgekeerd, de migratie van bladen met lage cel verklevingen mogelijk minder beïnvloed als cellen kunnen het blad om te migreren onafhankelijk, zoals verstrooiing aan de rand van het epitheliale blad te verlaten. Dus, de migratie van de cel en de celproliferatie onderling, en elke poging van het blokkeren van celproliferatie te bestuderen blad migratie moet zorgvuldig worden overwogen. Dus worden testen analyseren blad migratie meestal uitgevoerd onder serum honger die vermindert, maar doet niet afschaffen cel migratie.
Andere migratie testen om te studeren blad migratie op twee-dimensionale oppervlakken omvatten de kras of wond assay en, meer onlangs, onbeperkte migratie testen met behulp van silicium of PDMS chambers en stencils waarmee beplating van cellen in bepaalde gebieden en onbeperkte migratie van de cellen in de cel-vrije zone na verwijdering van de kamer of stencil1,3,4,5,6,7,16. Deze laatste testen en de dot-assay bieden hoge reproduceerbaarheid in de hand van zowel ervaren als onervaren gebruikers de cel plating bepaalt de vorm en grootte van de kolonie. In tegenstelling, krassen van de cellulaire enkelgelaagde in kras testen vereist praktijk, en zelfs in de handen van deskundigen delen van het blad kan worden opgelicht ten onrechte als cellijnen die strakke monolayers vormen worden gebruikt. Dit probleem is verbeterd wanneer siliconen chambers of stencils worden gebruikt voor de plating de cellen, hoewel we waargenomen foutieve verwonden van cel vellen na verwijdering van Ibidi kamers. De stip-assay vermijdt dit probleem, zoals de cellen zijn vergulde in een kolonie en toegestaan om te groeien vrij. Om dezelfde redenen staat de stip bepaling ook de cellen om te migreren op de ongewijzigde coating, die gemakkelijk door krassen of verwijdering van de kamer/stencil in andere migratie testen is verstoord. Bovendien, zoals cellen zijn niet gewond door krassen of verwijdering van kamers/stencils, cel dood en de bijbehorende release van cytokines die is gekoppeld aan de verwijdering van kamers/stencils heeft geen invloed op de migratie in de dot-bepaling. Tot slot, cellen zijn vaak overdreven vergulde in kras testen en testen met behulp van kamers of stencils. Dus, na het ontruimen van cellen door te krassen hen af of de fysieke belemmeringen die cel migratie belemmeren, de cel enkelgelaagde ontspannen zal en cel worden geduwd, verspreidt zich in de cel-vrije zone zonder actief te migreren. Daarentegen in de stip assay, kunnen cel bladen zich vestigen 's nachts voordat migratie wordt waargenomen, en cel migratie in plaats van ontspanning van de cellaag kan worden waargenomen.
De stip-assay, die kan gemakkelijk worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur, leent zich voor een bereik van opeenvolgende tests, met inbegrip van kleuring van cellen te beoordelen bruto kolonie morfologie en cel verstrooiing8, immunokleuring8, time-lapse beeldvorming, en latere data-analyse met behulp van ImageJ, Matlab, of andere afbeelding analyse software13. Aanvullende parameters beschrijven zoals correlatie van naburige vectoren of hun scheiding trajecten kunnen worden beoordeeld om meer precies de samenhang van het mobiele verkeer binnen bladen13. Time-lapse imaging kan ook worden gecombineerd met immunokleuring en ImageJ ondersteund cel bijhouden om te krijgen verder inzicht in cel migratie. Bijvoorbeeld, kunnen stippen immunostained voor cytoskeletal eiwitten na time-lapse beeldvorming, en cellen kunnen vervolgens worden bijgehouden met behulp van ImageJ om te analyseren hoe de expressie van deze proteïnen beïnvloedt de trekkende fenotype van cellen. Een ander toekomstig gebruik is één cel bijhouden van cellen die uitdrukking geven aan nucleaire fluorescente proteïnen. Nog belangrijker is, de stip bepaling kan worden uitgevoerd in multi goed platen en is deze geschikt voor medium tot hoge doorvoer imaging, waardoor het een gemakkelijk toegankelijk en zeer betaalbaar instrument om het scherm van het effect van drugs- of shRNAs op blad migratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteur wil Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo, en Carole Parent bedanken voor het lezen en commentaar op het manuscript. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
