Summary
נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.
Abstract
אף אורגניזם מורכב מופיעות סטטי, הרקמות שלהם נמצאים תחת מחזור רציף. כמו תאים גיל, למות, והם יוחלפו על ידי תאים חדשים, תאים להעביר בתוך רקמות באופן הדוק מתוזמר. במהלך התפתחות גידולים, את האיזון מופר, ולהשאיר תאים סרטניים האפיתל ממוצא לפלוש את microenvironment המקומי, כדי לנסוע לאתרים מרוחקים, ובסופו של דבר להקים גידולים גרורות באתרים מרוחקים. וזמינותו נקודה היא assay פשוטה, מימדי ההעברה ללא הגבלה, כדי להעריך את התנועה נטו של גיליונות תא לתוך אזור ללא תא, וכדי לנתח את הפרמטרים של נדידת תאים באמצעות הדמיה בצילום מואץ. . הנה, וזמינותו נקודה הוכח שימוש של האדם פולשני, ריאות המושבה ויוצרים השד סרטן תאים בטור, MCF10CA1a, כדי לנתח בתגובה הנדידה התאים גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), אשר ידוע כדי להגדיל את פוטנציאל ממאיר של תאים סרטניים בשד, כדי לשנות את פנוטיפ הנדידה של תאים.
Introduction
העברת מבחני נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את הפוטנציאל פולשני ולא גרורתי של גידול תאים במבחנה. הנפוץ ביותר הפצע או גירוד assay משמש כדי להעריך את ההעברה של אפיתל גיליונות2,31,אזור תא מסומנת. כדי לבצע את הבדיקה מאפס, התאים הם מצופים לתוך טפט, "שריטה" או מאזור תא נוצר עם טיפ פיפטה. וזמינותו גירוד קל להגדיר עם תרביות רקמה זמין נפוץ אספקה, ניתן לבצע גם צלחות רב טוב, ומאפשרת עיבוד של דגימות מרובים. עם זאת, כפי השריטה נעשית, התאים יוסרו פיזית טפט, לעיתים קרובות עוברים מוות של תאים. יתר על כן, מטריצה חוץ-תאית מחובר לצלחת פגום לעיתים קרובות במהלך התהליך של גירוד. בדומה לכך, השימוש של סיליקון מוסיף (כגון Ibidi צ'יימברס4) או של סטנסילים5,6,7 יכול להוביל להפרעה מכנית של התאים הסרת חלקי של מטריקס חלבון ציפוי צלחות. חיסרון נוסף של מבחני פיקוח על סגירתו של פצעים או שריטות הוא קורס שלהם לזמן מוגבל, רק יכול להיות מנותח נדידת תאים עד השריטה סגורה.
ביצוע וזמינותו נקודה, התאים הם מצופה כמושבה מעגלית על גבי צלחת עם או בלי ציפוי8. הרציונל שאסטרטגיה זו ציפוי הוא לקבל תא סדינים עם קצוות מוגדרים, שניתן להעביר או לפלוש לתוך האזורים הסמוכים נטול תאים מבלי להפריע את התרבות על ידי הסרה של תאים או מוסיף. המטרה הכוללת של וזמינותו נקודה היא לבחון את ההעברה של גיליונות תא כפי שנמדד על-ידי קצה העקירה או מושבת קוטר, כמו גם כדי לבצע הדמיה בצילום מואץ כדי לנתח את פנוטיפ הנדידה של תאים בעתיים רזולוציה גבוהה יותר.
נדידת תאים יכולים להיות מושפעים מגוון של רמזים microenvironmental כמו נוגדנים, ציטוקינים גורמי גדילה כגון EGF. EGF הוא פקטור גדילה זה מפעיל את השפעותיו ביולוגי באמצעות קשירה לקולטן שלו, EGF קולטן9, ומגביר את התנהגות פולשנית ולא גרורתי של גידול תאים4,9,10. כאן, וזמינותו נקודה משמש ללמוד EGF מגורה נדידת תאים במושבה האנושי פולשני, ריאות ויוצרים השד סרטן תא קו (MCF10CA1a)8,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ציפוי של מנות (יום 1)
הערה: הקפד לא להשאיר טביעות אצבעות או לכלוך בתחתית הצלחת בעת טיפול זה.
- הפשרת העכבר קולגן הרביעי על קרח, לדלל את זה עם 50 מ"מ HCl (pH 1.3) להכין 3 מ"ל של פתרון הרביעי 10 µg/mL קולגן.
הערה: קולגן לזרז ב 37 º C. לכן חשוב לשמור את הפתרון קולגן בטמפרטורה נמוכה בעת מפשיר ובעבודה עם זה. להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה על-ידי הכנת aliquots בגודל מתאים ואחסונם ב-80 מעלות צלזיוס. - להוסיף 250 פתרון קולגן הרביעי µL כל טוב של לוחות זכוכית 12-ובכן, למקם אותם לתוך קופסת פלסטיק בגודל מתאים, סגירה הדוקה. מניחים מגבת נייר רטובה מעל ומסביב הלוחות מייצרים תא לח ולסגור את תיבת. דגירה הלוחות ללילה בטמפרטורת החדר.
הערה: כפי רק את אזור הגידול צריך להיות מצופה, זה מספיק לכסות רק על הרכב כיסוי, אשר מצורף בתחתית הלוח, עם פתרון קולגן (ראה איור 1A, B עבור סכימטי של צלחת). - למחרת בבוקר לשטוף צלחות עם יונים H2O פעמיים כדי להסיר קולגן שאינו נספג ומאגר. לכוון את המים עד לקצה הלוח לא עד הקצה שהוקמה על ידי בתחתית צלחת של coverslip (אם מים זה pipetted לתוך האיזור שזה ישחה). מילה נהדרת הלוחות בשכונה זרימה שכבתית. השתמש צלחות מיד או לאחסן ב 4 ° C עד 5 ימים.
הערה: שורות תאים שונים עשויים לדרוש שונים ציפוי, כגון fibronectin או קולגן אני.
2. ציפוי וזמינותו נקודה (יום 2)
-
הכנת התליה תא
- כדי להכין תא ההשעיה, להשתמש בתאים כך כבר גדלו בקערה תרביות רקמה 60 מ מ בינוני DMEM/F12 בתוספת 5% סרום סוס כדי 80% הנהרות
- לשטוף את התאים בתמיסת פוספט באגירה של סידן, מגנזיום-ללא Dulbecco (DPBS) פעם אחת, להוסיף µL 500 טריפסין-EDTA (בטמפרטורת החדר), דגירה התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור 37 ° C, 5% CO2, אווירה humidified.
- להשעות את התאים מנותקת במדיום תרבות 4.5 מ ל להפסיק פעילות טריפסין, נחשב 20 µL aliquot של התליה תא ב hemocytometer.
- גלולה התאים הנותרים צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב g x 200 למשך 3 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים תרבות בינוני 3 x 106 תאים/מ ל....
הערה: עבור אחרים ציפוי דיאלקטריים ו/או שורות תאים, צפיפות תא אופטימלי יש ליצור בסדרה דילול. 3 x 106 תאים למ"ל מומלצת כנקודת התחלה.
-
תאי ציפוי
- המקום טיפת 10 µL תא ההשעיה במרכזו של כל תלוש הכיסוי של הקולגן הרביעי מצופה צלחת זכוכית 12-ובכן התחתון בלי לגעת או לשרוט את הציפוי (איור 1א', ב'). דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, האווירה humidified, כדי לאפשר את התאים לצרף. צ'ק במיקרוסקופ הפוך התאים מחוברים.
הערה: ניתן בצורה הטובה ביותר לראות בקצה הירידה, איפה היווצרות טפט יכול להיות שנצפו (איור 1C). במידת הצורך, דגירה את הצלחת עד ה 3 להיות בטוח כי הלחות בחממה הוא מספיק גבוה כפי הטיפות יכול להתייבש במהירות. אם נצפית ירידה של אמצעי האחסון טיפה במהלך שלב זה, להוסיף החללים בין הבארות כדי להגדיל את הלחות PBS. - יש לשטוף בעדינות הבארות עם 1 מ"ל של תרבות בינוני פעמיים כדי להסיר תאים שאינם מצורפים. להוסיף 1 מ"ל תרבות בינוני כל טוב. צ'ק במיקרוסקופ הפוך כי לא התאים צפים נשארים, אחרת לשטוף שוב את הבארות. דגירה תאים בין לילה-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, האווירה humidified, כדי לקבל גיליונות תא מוגדרים היטב.
הערה: תאים צף סביר כדי לצרף מחדש הצלחת ואת להקים מושבות תאים לא רצויים.
- המקום טיפת 10 µL תא ההשעיה במרכזו של כל תלוש הכיסוי של הקולגן הרביעי מצופה צלחת זכוכית 12-ובכן התחתון בלי לגעת או לשרוט את הציפוי (איור 1א', ב'). דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, האווירה humidified, כדי לאפשר את התאים לצרף. צ'ק במיקרוסקופ הפוך התאים מחוברים.
3. גירוי תאים (יום 3)
- בדוק כל הבארות באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שתא מושבות גדלו כראוי. במידת הצורך, מארק בארות ומבניות, אל תשתמש בהם.
- תווית מכל קידוח של צלחת הולם עבור כל תנאי חקר. הפעל כל תנאי כפול או משולש.
- לשנות את המדיום לרעוב התאים DMEM/F12 המכיל סרום הסוס 0.1% (רעב בינוני) h 3 לפני התאים הם גירוי.
- לגרות את התאים על ידי תוספת של EGF (ריכוז סופי 5 ng/mL) או עוד מגשרים הרצוי ומערבבים בעדינות את המדיום באמצעות micropipettor 1 מ"ל או על-ידי מתערבל לצלחת.
- דגירה שלוחית 1-4 ימים לבחון את קצה הזחה וירידה קצה מתאר כמתואר בסעיף 4.1 או לבצע הדמיה בצילום מואץ כמתואר בסעיף 4.2.
4. ויזואליזציה של מושבות תאים, נדידת תאים
-
Hematoxylin-אאוזין (הוא) צביעת למדידת צמיחה המושבה (היום 4-7)
- לתקן תאים ב- 70% אתנול (1 מ"ל/טוב) ~ 2 דקות.
- כתם גרעינים עם hematoxylin (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.
- תאים תשטוף עם מים מהברז (1 מ"ל/טוב) עד הגרעינים הם כחול, 5-10 דקות.
- הציטופלסמה הכתם עם אאוזין (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.
- לשטוף עם מים יונים (1 מ"ל/טוב).
הערה: Hematoxylin ופתרונות אאוזין יכול להיות ונשתמש בהם מספר פעמים עד ההכתמה הופך להיות חלש. - מילה נהדרת צלחת.
- הפוך את הצלחת ולמדוד את הקוטר נקודה עם סרגל. לחלופין, לצלם תמונות של הצלחת עם מצלמה, ולנתח נקודה בקוטר של ImageJ.
-
זמן לשגות מיקרוסקופ (3 ביום)
- . הפעילי את המיקרוסקופ חממה ולהתאים את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס. למלא מעשיר dH2O. התאם CO2 ל 5%. ודא כי תא חממה הוא humidified כי השלב ממונע יכול לנוע בחופשיות. לסגור את תא חממה ולאפשר המיקרוסקופ להסתגל 37 מעלות צלזיוס.
הערה: המיקרוסקופ (ראה טבלה של החומרים) להשתמש כאן צריך להיות מחומם עד 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות לפני התאים הם צילמו כדי למנוע היסחפות של המוקד. - למקם את הצלחת על השלב של המיקרוסקופ חממה והגדר את הרשימה הבמה. תמונת שני קצוות מנוגדים, המרכז של כל נקודה תא (איור 1א').
- קח תמונות כל 3 דקות, עבור h 15-24 באמצעות המטרה X 10. להוריד את הנתונים ולהמשיך עם ניתוח תמונות בתוכנית של בחירה, למשל, ImageJ או Matlab.
- . הפעילי את המיקרוסקופ חממה ולהתאים את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס. למלא מעשיר dH2O. התאם CO2 ל 5%. ודא כי תא חממה הוא humidified כי השלב ממונע יכול לנוע בחופשיות. לסגור את תא חממה ולאפשר המיקרוסקופ להסתגל 37 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
וזמינותו נקודה המובאת כאן (איור 1) בוצעה באמצעות פולשני, ריאות המושבה ויוצרים תאים סרטניים בשד (MCF10CA1a) כמערכת מודל. וזמינותו נקודה התשואות תא מאוד לשחזור נקודות אפילו בידו של מתחילים נוחה וקלה לביצוע assay (איור 1D). וזמינותו נקודה בשילוב עם הוא מכתים, או הדמיה בצילום מואץ ומאפשר velocimetry תמונת החלקיקים הבאים (PIV) המחקר של פרמטרים שונים של העברה כולל עקירה של קצוות אפיתל, מהירות תא תא כיוון כמו תאים בקצוות של גיליון אפיתל נודדים אל אזור נטול תאים. בתחילה, שלב הדמיה ניגודיות של נקודות תא חשף כי פולשני, המושבה ויוצרים השד סרטן ריאות תאים (MCF10CA1a) לשמור על הפנוטיפ mesenchymal לאחר גירוי עם EGF. עם זאת, תאים בודדים עוזב את הגיליון הם נצפו בתדירות גבוהה יותר בנקודות גירוי-EGF תא (איור 2, חצים). התגובה של תאים MCF10CA1a EGF היה עוד יותר לאומדן הוא מכתים של תרבויות זה היו מגורה עם EGF במשך 4 ימים. אכן, EGF-גירוי כתוצאה קוטר מושבת מוגברת (איור 3). תצפיות אלה מציינים את ההעברה של EGF מגורה תאים עשוי להשתנות.
לכן, וזמינותו נקודה היה מנוצל הבאה כדי לבצע ניתוח מפורט יותר של פנוטיפ ההעברה דינמי של גיליונות תא MCF10CA1a. תאים בקצוות גיליון היו עם תמונה עבור h 9 בעקבות גירוי של תאים עם EGF (Video 1 ו- 2 וידאו), תמונות ואז נותחו על ידי PIV Matlab4,13,14. PIV חשף כי EGF מגביר מהירות תא (איור 4א) כדי מיקרומטר/min 0.63 מ 0.45 מיקרומטר/min בתאים שליטה. במקביל, EGF גדל כיוון של תאים, זה מסומן על ידי הפחתה של ההשתנות של תאים כיוון (זוויתי להתפשט) מ- 0.95 בתרבויות הבקרה כדי 0.79 בתרבויות EGF-גירוי (איור 4B). EGF גדל העקירה רדיאלי של הקצה האפיתל מעל 9 שעות משדה מיקרומטר 257 356 מיקרומטר (איור 4), כמו גם נצפתה על ידי הוא מכתים לאחר 4 ימים (איור 3). לפיכך, השימוש וזמינותו נקודה בשילוב עם מבחני עוקבות אחר מראה כי EGF הפיצולים ההעברה בקצוות של גיליונות תאים MCF10CA1a כך כיוון ומהירות תא הוגדלה, וכתוצאה מכך מיילים המושבה מוגברת.
איור 1: הדמיה וזמינותו נקודה. (A, B) התאים הם מצופה כמושבה מעגלית במרכז הזכוכית התחתונה צלחת בארות. לצורך ניתוח ההעברה, תמונות נלקחים שני קצוות מנוגדים, כמו גם ממרכז המושבה (A). תמונת שדה אפל (C) של תאים נקודה במהלך ציפוי (משמאל), ובשנת הגדלה גבוהה יותר (שלב חדות) מציג את הקצה של הטיפה לבין הקצה של הנקודה תא לאחר התאים מחובר לצלחת (במרכז). תאים המצורפים הם שטוחים, מצולע, בעוד שאינם מצורפים תאים עגולים (מימין). (ד) הקוטר של נקודות הוא מאוד לשחזור. הנקודות היו עם תמונה מיד לאחר ציפוי לפני התאים היו מגורה וקבעה הקוטר באמצעות ImageJ. גודל נקודה מאוד לשחזור בתוך אחד ניסוי גם בין משתמשים שונים, אימון מועט נדרש לרכוש מיומנות ב ציפוי הנקודות תא (E = יותר מ-10 שנים של ניסיון בתחום התרבות רקמות, אני = פחות מ- 4 שבועות של ניסיון ב- c רקמות ulture). n = 12 נקודות לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: EGF שמחליש את פנוטיפ מורפולוגי של תאים MCF10CA1a. MCF10CA1a התאים היו ברעב עבור 3 h ב- DMEM/F12 בתוספת 0.1% הסוס סרום לפני שהם היו מגורה עם EGF (5 ng/mL). בקצה של גירוי-EGF מושבות תאים בודדים נוטים להגר הגיליון (חיצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : EGF מגביר צמיחה נטו של המושבות תא. MCF10CA1a התאים היו ברעב עבור h 3 בינוני DMEM/F12 בתוספת 0.1% הסוס סרום לפני שהם היו מגורה עם EGF (5 ng/mL). 4 ימים לאחר מכן, היו תאים אתנול קבוע, מוכתם Hematoxylin & אאוזין. EGF-גירוי נקודות יש קוטר גבוהה יותר לאחר 4 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : EGF שמחליש את פנוטיפ הנדידה של תאים MCF10CA1a. MCF10CA1a התאים היו ברעב עבור h 3 בינוני DMEM/F12 בתוספת 0.1% הסוס סרום לפני שהם היו מגורה עם EGF (5 ng/mL). התאים היו עם תמונה כל 3 דקות עבור ניתוח velocimetry תמונות של חלקיק ה 9-עוקבים בוצעה ב Matlab13. מהירות ערכים מייצגים את המהירות הממוצעת לאורך זמן עבור כל שדה. התפשטות וקטורים מהירות זוויתית מחושב כמו:
איפה 
, נע בין 0 (כיוון גבוה) ל- 
(נמוך כיוון). ירידה כפולה זוויתי נחשב עלייה בכיוון. הזחה רדיאלי חושבה על-ידי חיסור רדיוס המושבה ב t = 0 h מ רדיוס המושבה ב t = 9 ה EGF-גירוי של MCF10CA1a תא הנקודות, גרמו מהירות מוגברת תא (A; החלונית העליונה), ירד התפשטות זוויתי או גדל כיוון (B; התיכון לוח), ו- radius המושבה מוגברת (C; החלונית התחתונה). נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM של n = 3 ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1: הדמיה בצילום מואץ של תאים MCF10CA1a unstimulated. התמונות צולמו כל 3 דקות עבור ה 9 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 2: מגורה זמן לשגות הדמיה של תאים MCF10CA1a עם EGF (5 ng/mL). התמונות צולמו כל 3 דקות עבור ה 9 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך הגידול התקדמות התאים נודדים מן הרקמה ממוצא לפלוש הרקמה שמסביב, גרורות באתרים מרוחקים15. נדידה של תאים מן מושבה התא יכול להיות שנצפו ב- dot וזמינותו. . הנה, וזמינותו נקודה מודגם על ידי ניתוח של פנוטיפ הנדידה של תאי סרטן השד אנושי בתגובה EGF.
כדי להשיג תוצאות מדויקות ו לטבלה הניתנת לשכפול מספר שלבים בקביעת בנקודה מבחני הם קריטיים. ראשית, הציפוי של הצלחת קובע אם, כמה תאים חזקים יכולים לדבוק הצלחת ואם להעביר תאים. להקפיד כי הציפוי של הצלחת עם קולגן IV או אחרים מטריצה חוץ-תאית היא הומוגנית כדי למזער את השתנות ניסיוני. יתר על כן, והקפדה כי תאי חקר לצרף ולהעביר על הצלחת מצופה, ניסויים מרובים עם מטריצות שונות בריכוזים מספר יכול להיות נחוץ למטב את התנאים ציפוי עבור קו תא שבחרת. שנית, ציפוי מדויק של התאים חיונית הפארמצבטית. טביעת רגל של הטיפה תא קובע את גודל הנקודה תא, כמו גם את צורתו. באופן אידיאלי, הירידה ממוקמת ללא קצה פיפטה לגעת במשטח. צורת הטיפה ואז נקבע בעיקר על ידי מתח הפנים של פני השטח צלחת, וכתוצאה מכך טביעת עגול מקוטר לשחזור. כתוצאה מכך, ניתן לשנות את קוטר הנקודה תא על-ידי שינוי הנפח של התא הבולם מצופה.
כך, הם מספר נקודות שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע וזמינותו נקודה. ראשית, צפיפות תא התליה תא צריך להיות מותאם הציפוי וכן את סוג התא המשמש. באופן כללי, אם הירידה מתפשט רחב יותר, גבוה יותר צפיפות התאים יש צורך צלחת תאים לתוך confluent monolayers. יתר על כן, יותר תאים צריך להיות מצופה להשיג של טפט confluent אם תאים קטנים, אינם מתפשטים כמו לעומת תאים גדולים, מתפשטת. שנית, וזמינותו נקודה ניתן לאמץ פורמטים שונים צלחת, בשביל זה, גודל נקודה ניתן להתאים וולס קטן יותר על-ידי הפחתת הנפח של הנקודה מצופה ו אם רצונך בכך, הנקודות גדול יותר יכול להיות מצופה באמצעות אמצעי אחסון טיפה יותר גבוה. שלישית, באיזה תא קווים לא יצרף לצלחת בתוך 30 דקות, ובמקרה בפעם ציפוי ניתן להרחיב עד 3 שעות. באופן דומה, הציפוי של הצלחת חייב להיות מתאים עבור תאים להעביר על, להקפיד לא לגרד את הציפוי בעת ציפוי התאים. אם תאים לא לצרף או להעביר על המטריקס שבחרת, ניתן לסייר סוגים אחרים של ציפוי, כגון קולגן 1 או fibronectin, או ריכוזים של מטריקס חלבונים, פעמים דגירה דגירה הטמפרטורות במהלך הציפוי של צלחות השתנה. מטריצה חוץ-תאית מתאימה עבור שורות תאים מסוימים שעשויים להימצא בספרות.
וזמינותו נקודה יש מספר מגבלות. . זה וזמינותו העברה דו מימדי, ולכן זה יכול להיחשב גם חיסרון לעומת מבחני תלת מימדי, אשר, עם זאת, יותר קשה לבצע יותר מבחני דו מימדי. אחת הבעיות המרכזיות היא אולי כי התפשטות תאים יכולים להשפיע על התוצאות, במיוחד אם שורות תאים מתרבים מהר משמשים נדידת תאים שקובעת במשך פרקי זמן ארוכים יותר כפי שנעשה כאן לניתוח של הקוטר המושבה לאחר 4 ימים. באופן דומה, במבחני מאפס הסגר על פצע שריטה מושפע על-ידי התפשטות תאים בתוך הגיליון תא; במבחני לשכת בוידן, במיוחד אם סרום או עוד מגשרים זה לגרום תא proliferations משמשים chemoattractant, התפשטות תאים מוגבר בתא התחתון יכול להטות את תוצאות. תא בודד מעקב ניתן להתבונן באופן ספציפי את התנועה של תאים שאינם מתרבים. יתר על כן, התפשטות תאים יכול להיות מופחת על ידי הרעבה סרום (i) כפי שנעשה כאן ו/או (ii) עיכוב של מיטוזה על ידי תוספת של מיטומיצין או אחר התפשטות מעכבי4,16. כדי לצמצם את התפשטות תאים, עם זאת, חייבים להקפיד לא נזק לתאים במידה שאינה הם כבר לא יכולים להעביר. מעניין, מצאנו את העברה ללא הגבלה דומה assay כי התפשטות תאים הוא לא מתואם עם קצה עקירה, למרות מעורב בשמירה על תקינות גיליון אפיתל במהלך ההעברה4,5, 17. פעולה זו פותחת שאלה מעניינת: הוא התפשטות תאים מרכיב הכרחי של הגירה של גיליון התא? הוא צפוי כי ההעברה של התא סדינים עם הדבקויות התא-התא חזק לתוך הסביבה שלילית יושפעו אם התפשטות חסומה לחלוטין, כמו הסדין בסופו של דבר לא יוכלו עוד להרחיב ולתמוך נדידה של תאים. בשלב זה, התאים צריכים העברה או איטי או להפסיק, או הסדין כדאי לשבש. לעומת זאת, ההעברה של סדינים עם הדבקויות תא תא נמוך עשוי להיות מושפעים פחות יחסית כמו תאים באפשרותך להשאיר הגיליון כדי להעביר באופן עצמאי, כגון פיזור בשולי הגיליון אפיתל. לפיכך, נדידת תאים והתפשטות תאים תלויות זו בזו, כל ניסיון של חסימת התפשטות תאים ללמוד גיליון ההעברה צריך להישקל בזהירות. לפיכך, מבחני ניתוח גיליון ההעברה מבוצעים בעיקר תחת רעב סרום אשר מפחית אבל לא לבטל את נדידת תאים.
מבחני הגירה אחרות ללמוד גיליון ההעברה על משטחים מימדי כוללות השריטה או הפצע assay ועוד, לאחרונה, מבחני ההעברה ללא הגבלה באמצעות סיליקון או PDMS צ'יימברס, סטנסילים המאפשרים ציפוי של תאים באזורים מוגדרים, הגירה ללא הגבלה של תאים לתוך האזור ללא תא לאחר הסרת ה קאמרית או סטנסיל1,3,4,5,6,7,16. אלה מבחני האחרון ואת וזמינותו נקודה מציעים הפארמצבטית גבוהה בידו של משתמשים מנוסים, כמו גם לתקלה כפי ציפוי תא קובע את הצורה והגודל של המושבה. לעומת זאת, גירוד של טפט הסלולר במבחני מאפס דורש תרגול, אפילו בידי מומחים חלקי הגיליון יכולים שיסדרו אותו בטעות אם שורות תאים שיוצרים monolayers חזק משמשים. בעיה זו חל שיפור כאשר תאי סיליקון או סטנסילים משמשים עבור ציפוי התאים, למרות הבחנו ופצעו מוטעים של גיליונות תא לאחר הסרת Ibidi צ'יימברס. וזמינותו נקודה מונע את הבעיה כמו תאי ציפוי לתוך המושבה, מותר לגדל בחופשיות. מאותן סיבות, וזמינותו dot מאפשר גם התאים להעביר על הציפוי שהודעה, אשר בקלות מופרעת על ידי גירוד או הסרה של הסטנסיל/הקאמרית במבחני הגירה אחרות. יתרה מזאת, כפי תאים לא נפגעו על ידי גירוד או הסרה של צ'יימברס/סטנסילים, תא מוות, שחרור המשויך של ציטוקינים הקשורים עם ההסרה של התאים/סטנסילים שאין לה השפעה על ההעברה ב- dot וזמינותו. לבסוף, תאים בדרך כלל מצופה יתר מבחני מאפס, מבחני באמצעות תאי או סטנסילים. לפיכך, לאחר ניקוי תאים על-ידי לשרוט אותם או הסרת המחסומים הפיזיים המעכבים נדידת תאים, טפט תא ירפה תא יידחפו, מתפשט לתוך האזור ללא תא ללא פעיל נודדות. לעומת זאת, ב- dot וזמינותו, גליונות תא יכול להקים עצמם בין לילה לפני ההעברה נצפית, נדידת תאים מאשר הרפיה של הגיליון התא יכול להיות שנצפו.
וזמינותו נקודה, אשר ניתן בקלות לבצע ללא שום ציוד מיוחד, משאיל את עצמו למגוון של מבחני עוקבות, כולל צביעת תאים כדי להעריך את המושבה ברוטו ומורפולוגיה פיזור תא8, immunostaining8, בצילום מואץ הדמיה, וניתוח הנתונים הבאים באמצעות ImageJ, Matlab או אחרים תוכנת ניתוח תמונה13. פרמטרים נוספים כגון מתאם של וקטורים השכן או מסלולים ההפרדה שלהם יכול להיות מוערך יותר בדיוק לתאר את קוהרנטיות של תנועת התא בתוך גליונות13. הדמיה בצילום מואץ יכול גם להיות משולב עם immunostaining ו ImageJ נתמך סלולרי מעקב כדי לקבל תובנות חדשות נדידת תאים. לדוגמה, נקודות יכול להיות immunostained חלבונים cytoskeletal לאחר זמן לשגות הדמיה, התאים ניתן אז לעקוב באמצעות ImageJ לנתח כיצד משפיע על ביטוי של חלבונים אלה של פנוטיפ הנדידה של תאים. שימוש עתידי נוסף הוא מעקב תא בודד של תאים המבטאים חלבונים גרעיניים פלורסנט. חשוב, וזמינותו נקודה ניתן לבצע גם צלחות רב טוב, הוא כזה מתאים תפוקה בינונית-גבוהה הדמיה, שהופך אותו כלי נגיש בקלות ובמחיר סביר מאוד למסך את ההשפעה של תרופות או shRNAs על גיליון ההעברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אין לחשוף.
Acknowledgments
המחבר מבקש להודות Bhagawat סבראמאניאן, צ'נג יי (ג'ייסון), פול Randazzo, קרול האב לקרוא ולהעיר על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לסרטן, מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
