Summary
Migração celular é essencial para o desenvolvimento, manutenção de tecidos e reparação e tumorigênese e é regulada por citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Este protocolo descreve o ensaio de ponto, um ensaio de migração bidimensional, irrestrita para avaliar o fenótipo migratório de folhas de célula unida, coesa, em resposta a sinais microenvironmental.
Abstract
Apesar de organismos complexos aparecem estáticos, seus tecidos estão sob contínua um volume de negócios. Como células de idade morrem e são substituídas por novas células, as células mover dentro de tecidos de forma bem orquestrada. Durante o desenvolvimento do tumor, este equilíbrio é perturbado, e células tumorais deixar o epitélio de origem para invadir o local microambiente, para viajar para locais distantes e, finalmente, formar tumores metastáticos em locais distantes. O ensaio de ponto é um ensaio de migração irrestrita simples, bidimensional, para avaliar o movimento líquido de folhas de célula em uma área livre de célula e analisar parâmetros de migração celular utilizando imagens de lapso de tempo. Aqui, o ensaio de ponto é demonstrado usando um humano invasivo, formadoras de pulmão em linhagem de células de câncer de mama, MCF10CA1a, para analisar a resposta de migratória das células para fator de crescimento epidérmico (EGF), que é conhecida por aumentar o potencial maligno das células de câncer de mama e para alterar o fenótipo migratório das células.
Introduction
Ensaios de migração são amplamente utilizados para avaliar o potencial invasivo e metastático do tumor células em vitro. Mais comumente, a ferida ou ensaio zero é usado para avaliar a migração de folhas epiteliais em uma célula desmarcada área1,2,3. Para realizar o ensaio de zero, as células são banhadas em um monolayer e uma área livre de célula ou "zero" é criada com uma ponta da pipeta. O ensaio de zero é fácil de configurar com suprimentos de cultura de tecidos comumente disponíveis e pode ser executado em placas multi bem, permitindo processamento de amostras múltiplas. No entanto, como é feito o zero, células são fisicamente removidas a monocamada e muitas vezes passam por morte celular. Além disso, ligada à placa de matriz extracelular é muitas vezes danificada durante o processo de coçar. Da mesma forma, o uso de silício insere (tais como câmaras de Ibidi4) ou de estênceis5,6,7 pode levar a ruptura mecânica das células e a remoção parcial de proteínas da matriz usada para revestimento a placas. Outra desvantagem dos ensaios de acompanhamento de fechamento de ferimentos ou arranhões é seu curso de tempo limitado, como migração celular só pode ser analisada até que o zero é fechado.
Realizar o ensaio de ponto, as células são banhadas como uma colônia circular sobre uma placa revestidos ou não revestidos de8. A justificativa para esta estratégia de chapeamento é obter lençóis de células com bordas definidas, que podem migrar ou invadir em áreas circundantes sem célula sem perturbar a cultura pela remoção de células ou inserções. O objetivo geral do ensaio ponto é observar a migração das folhas de célula medida pelo deslocamento de borda ou diâmetro colônia, bem como para realizar a imagem de lapso de tempo para analisar o fenótipo migratório das células em maior resolução espaço-temporal.
Migração celular pode ser afetada por uma variedade de sugestões microenvironmental como fatores de crescimento como EGF, citocinas e quimiocinas. EGF é um fator de crescimento que exerce seus efeitos biológicos através da ligação ao seu receptor, o receptor de EGF9e aumenta o comportamento invasivo e metastático de células de tumor a4,9,10. Aqui, o ensaio de ponto é usado para estudar EGF estimulou a migração de células em uma colônia de pulmão humano invasoras, formando mama câncer célula linha (MCF10CA1a)8,11,12.
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Protocol
1. revestimento de pratos (dia 1)
Nota: Certifique-se para não deixar impressões digitais ou sujeira na parte inferior da placa, quando manuseá-lo.
- Descongelar o colágeno rato IV no gelo e dilui-lo com 50mm HCl (pH 1,3) para preparar 3 mL de solução 10 µ g/mL colagénio IV.
Nota: Colágeno irá precipitar a 37 ° C. Portanto, é importante manter a solução de colágeno em uma baixa temperatura ao descongelamento e trabalhar com ele. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento por preparar alíquotas de tamanhos adequado e armazená-los a-80 ° C. - Adicionar solução de colágeno IV 250 µ l de cada poço de placas de vidro 12-poço fundo e colocá-los em uma caixa plástica de tamanho adequado, apertado-fechamento. Coloque a toalha de papel molhada sobre e ao redor as placas para fabricar uma câmara húmida e fechar a caixa. Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente.
Nota: Como somente a área de crescimento precisa ser revestida, é suficiente para cobrir apenas o deslizamento da tampa, que é anexado à parte inferior da placa, com solução de colágeno (consulte a Figura 1A, B para um esquema da placa). - Na manhã seguinte, lave as placas com desionizada H2O duas vezes para remover o tampão e colágeno não-absorvido. Direcionar a água até a borda da placa bem, não à borda formada pela placa inferior e a lamela (se a água é pipetada para esta área que vai espirrar). Secar ao ar livre as placas do capuz de fluxo laminar. Usar placas imediatamente ou armazenar a 4 ° C por até 5 dias.
Nota: Linhas celulares diferentes podem exigir diferentes do revestimento, como fibronectina ou colágeno eu.
2. chapeamento do ponto do ensaio (dia 2)
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Preparar a suspensão de células
- Para preparar a suspensão de células, use as células que têm sido cultivadas em um prato de cultura de tecido-60mm em DMEM/F12 suplementado com 5% de soro de cavalo a confluência de 80%
- Enxagúe as células com solução salina tamponada fosfato de cálcio e magnésio livre Dulbecco (DPBS) uma vez, adicionar 500 µ l do trypsin-EDTA (temperatura ambiente) e incube as celulas por 3-5 min em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado.
- Suspender as células destacadas em 4,5 mL de meio de cultura para parar a atividade de tripsina e contar 20 alíquota µ l de suspensão de células em um hemocytometer.
- As células restantes em um tubo cônico de 15 mL de pelotas por centrifugação a 200 x g, durante 3 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura para 3 x 106 células/mL.
Nota: Para outros substratos de revestimento e/ou linhas de células, a densidade celular ideal deve ser estabelecida em uma série de diluição. 3 x 106 células/mL recomenda-se como ponto de partida.
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Células de chapeamento
- Lugar uma gota de 10 µ l de suspensão de células no centro de cada lamela do colagénio IV revestido a placa de vidro 12-poço fundo sem tocar ou coçar o revestimento (Figura 1A, B). Incube a placa por 30 min a 37 ° C, ambiente umidificado, para permitir que as células anexar. Verifique em um microscópio invertido as células estão presas.
Nota: Isto pode ser melhor visto na borda da gota, onde a formação de uma monocamada pode ser observada (Figura 1C). Se necessário, incubar a placa até 3 h. Certifique-se de que a umidade na incubadora é alta o suficiente, como as gotas podem secar rapidamente. Se for observada uma redução do volume gota durante esta etapa, adicione PBS para os espaços entre os poços para aumentar a umidade. - Delicadamente lave os poços com 1 mL de meio de cultura duas vezes para remover as células não-inscritos. Adicione 1 mL de meio de cultura para cada poço. Check-in um microscópio invertido que nenhuma célula flutuante permanecem, caso contrário, lavar os poços novamente. Incube as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado, para obter folhas de celular bem definida.
Nota: Células flutuante são prováveis para re-anexar à placa e formam colônias de células indesejáveis.
- Lugar uma gota de 10 µ l de suspensão de células no centro de cada lamela do colagénio IV revestido a placa de vidro 12-poço fundo sem tocar ou coçar o revestimento (Figura 1A, B). Incube a placa por 30 min a 37 ° C, ambiente umidificado, para permitir que as células anexar. Verifique em um microscópio invertido as células estão presas.
3. estimular células (dia 3)
- Verifique se todos os poços, usando um microscópio inverso para garantir essa célula colônias cresceram adequadamente. Se necessário, marque poços inadequados e não usá-los.
- Etiquete cada poço da placa apropriadamente para cada condição de investigado. Execute cada condição em duplicado ou triplicado.
- Mudar o meio para morrer de fome as células em DMEM/F12 contendo 0,1% de soro de cavalo (meio faminto) 3 h antes que as células são estimuladas.
- Estimular as células pela adição de EGF (concentração final de 5 ng/mL) ou outros mediadores desejados e misture suavemente o meio utilizando um micropepitador de 1 mL ou agitando a placa.
- Incubar a placa por 1-4 dias para observar o deslocamento de borda e contorno de borda conforme descrito na seção 4.1 ou executar a imagem latente de lapso de tempo, conforme descrito na seção 4.2.
4. visualização de colônias de células e migração celular
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Hematoxilina-eosina (HE) coloração para medir o crescimento da colônia (dia 4-7)
- Conserte as células em etanol a 70% (1 mL/poço) para ~ 2 min.
- Mancha de núcleos com hematoxilina (1 mL/poço), ~ 2 min.
- Células de lavagem com água da torneira (1 mL/poço) até núcleos são azuis, 5-10 min.
- Mancha de citoplasma com eosina (1 mL/poço), ~ 2 min.
- Enxague com água desionizada (1 mL/poço).
Nota: Soluções de hematoxilina e eosina podem ser coletadas e usadas várias vezes até que a mancha se torna fraco. - Secar a placa.
- Inverter a placa e medir o diâmetro do ponto com uma régua. Alternativamente, tirar fotos da placa com uma câmera e analisar o diâmetro do ponto no ImageJ.
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Microscopia de lapso de tempo (dia 3)
- Ligar o microscópio de incubadora e ajustar a temperatura de 37 ° C. Encha o umidificador com dH2O. ajustar o CO2 a 5%. Certifique-se que a câmara incubadora é úmida e que o palco motorizado pode mover-se livremente. Fechar a câmara incubadora e permitir que o microscópio ajustar a 37 ° C.
Nota: O microscópio (consulte a tabela de materiais) usado aqui deve ser aquecido a 37 ° C, durante pelo menos 3 h antes que as células são fotografadas para evitar deriva do foco. - Colocar a placa no palco do microscópio incubadora e configurar a lista de palco. Duas arestas opostas de imagem e o centro de cada ponto de célula (Figura 1A).
- Com imagens a cada 3 min, de 15-24 h, com o objetivo de X 10. Baixar os dados e prosseguir com a análise de imagem em um programa de escolha, por exemplo, ImageJ ou Matlab.
- Ligar o microscópio de incubadora e ajustar a temperatura de 37 ° C. Encha o umidificador com dH2O. ajustar o CO2 a 5%. Certifique-se que a câmara incubadora é úmida e que o palco motorizado pode mover-se livremente. Fechar a câmara incubadora e permitir que o microscópio ajustar a 37 ° C.
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Representative Results
O ensaio de ponto aqui apresentado (Figura 1) foi realizado utilizando invasiva, colônia de pulmão formando células de câncer de mama (MCF10CA1a) como um sistema modelo. O ensaio de ponto rende pontos de célula altamente reprodutível nem na mão de iniciantes, tornando-se um conveniente e fácil de executar o ensaio (Figura 1D). O ensaio de ponto combinado com ele mancha, ou lapso de tempo de imagem e subsequente Velocimetria por imagem (PIV) permite o estudo de diversos parâmetros de migração, incluindo a deslocação de bordas epiteliais, velocidade de célula e direcionalidade de células, como células nas bordas de uma folha de epitelial migre para uma área livre de célula. Inicialmente, imagens de contraste de fase de pontos de cela revelaram que invasiva, células de câncer de mama formando pulmão colônia (MCF10CA1a) mantenham um fenótipo mesenquimal após estimulação com EGF. No entanto, células únicas, deixando a folha são observadas mais frequentemente em pontos de célula EGF-estimulada (Figura 2, as setas). A resposta das células MCF10CA1a para EGF novo foi avaliada por mancha de culturas que foram estimuladas com EGF por 4 dias. Com efeito, EGF-estimulação resultou em um diâmetro de colônia aumentada (Figura 3). Estas observações indicam que a migração de EGF estimuladas células podem ser alteradas.
Portanto, o ensaio de ponto próximo foi utilizado para realizar uma análise mais detalhada do fenótipo migração dinâmica de MCF10CA1a folhas de célula. Células nas bordas da folha foram fotografadas por 9 h após estimulação de células com EGF (vídeo 1 e vídeo 2) e imagens foram então analisadas por PIV em Matlab4,13,14. PIV revelou que EGF aumenta velocidade de célula(Figura 4)a 0.63 µm/min de 0,45 µm/min em células de controle. Ao mesmo tempo, EGF aumentou a direcionalidade das células, e isso é indicado por uma redução da variabilidade de direcionalidade de célula (propagação angular) de 0,95 em culturas de controle para 0,79 em culturas de EGF-estimulada (Figura 4B). EGF aumentou o deslocamento radial da borda epitelial mais de 9h de 257 µm para 356 µm (Figura 4), como também foi observada por ele mancha depois de 4 dias (Figura 3). Assim, o uso do ensaio ponto em combinação com diferentes ensaios subsequentes mostra que EGF altera migração nas bordas de células de folhas de MCF10CA1a tal que aumentam a velocidade da célula e a direcionalidade, resultando em um raio maior colônia.
Figura 1: o ensaio de ponto de imagem. (, B) As células são banhadas como uma colônia de circular no centro de poços de placa de fundo de vidro. Para a análise de migração, as imagens são tiradas em duas extremidades opostas, bem como o centro da colônia (A). (C) imagem de campo escuro de ponto de célula durante o chapeamento (à esquerda) e em maior ampliação (contraste de fase), mostrando a borda da gota e a borda do ponto célula após células anexadas à placa (centro). Células anexadas são planas e poligonal, enquanto as células não-inscritos são redondas (à direita). (D) O diâmetro de pontos é altamente reprodutível. Pontos foram fotografados imediatamente após o chapeamento e antes que as células foram estimuladas e o diâmetro determinado usando o ImageJ. O tamanho do ponto é altamente reprodutível dentro de um experimento, bem como entre diferentes usuários e pouco treinamento é necessário para obter proficiência em chapeamento os pontos da célula (E = mais de 10 anos de experiência em cultura de tecidos, eu = menos de 4 semanas de experiência em tecido c ulture). n = 12 pontos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: EGF modula o fenótipo morfológico de células MCF10CA1a. MCF10CA1a células estavam sedentos de 3h em DMEM/F12 suplementadas com 0.1% de soro de cavalo antes de serem estimulados com EGF (5 ng/mL). Na borda das colônias EGF-estimulada células únicas tendem a migrar para fora da folha (setas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : EGF aumenta crescimento líquido das colônias celular. MCF10CA1a células estavam sedentos de 3h em DMEM/F12 suplementado com 0,1% de soro de cavalo antes de serem estimulados com EGF (5 ng/mL). 4 dias depois, as células foram etanol fixados e corados com hematoxilina e eosina. EGF-estimulados pontos tem um diâmetro maior depois de 4 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : EGF modula o fenótipo migratório das células MCF10CA1a. MCF10CA1a células estavam sedentos de 3h em DMEM/F12 suplementado com 0,1% de soro de cavalo antes de serem estimulados com EGF (5 ng/mL). As células foram fotografadas cada 3 min para 9 h. subsequentes partícula image velocimetry análise foi realizada em Matlab13. Valores de velocidade representam a velocidade média ao longo do tempo para cada campo. Angular propagação dos vetores de velocidade foi calculada como:
onde 
e varia de 0 (alta direção) para 
(baixa direcionalidade). Uma diminuição na propagação angular é considerada um aumento na direcionalidade. Deslocamento radial foi calculado subtraindo-se o raio de colônia em t = 0 h a partir do raio de colônia em t = 9 h. EGF-estimulação de MCF10CA1a célula pontos resultaram na velocidade de aumento da célula (A; painel superior), diminuição da propagação angular ou aumentaram direcionalidade (B; médio painel) e um raio maior colônia (C; painel inferior). Dados representam média ± SEM das n = 3 experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Imagem de lapso de tempo de unstimulated células de MCF10CA1a. Imagens foram tomadas todas as 3 min para 9 h. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2: Time-Lapse da imagem latente de MCF10CA1a células estimuladas com EGF (5 ng/mL). Imagens foram tomadas todas as 3 min para 9 h. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Durante as células de progressão do tumor migre longe do tecido de origem para invadir o tecido circundante e metástase para locais distantes15. Migração de células de uma colônia de células pode ser observada no ensaio de ponto. Aqui, o ensaio de ponto é ilustrado por analisar o fenótipo migratório de células de câncer de mama humano em resposta a EGF.
Para obter resultados precisos e replicáveis várias etapas na configuração do ponto os ensaios são críticos. Primeiro, o revestimento da placa determina se e como células fortes podem aderir à placa e se as células migram. Cuidado deve ser tomado que o revestimento da placa com colagénio IV ou outra matriz extracelular é homogêneo para minimizar a variabilidade experimental. Além disso, deve assegurar que as células investigadas anexar a migram na placa revestida e vários experimentos com diferentes matrizes, em várias concentrações podem ser necessários para otimizar as condições de revestimento de uma linha celular escolhido. Segundo, o chapeamento exato das células é crucial para a reprodutibilidade. A pegada da gota célula determina o tamanho do ponto da célula, bem como sua forma. Idealmente, a gota é colocada sem a ponta da pipeta tocando a superfície. A forma da gota é determinada principalmente pela tensão de superfície da superfície da placa, resultando em uma pegada circular de diâmetro podem ser reproduzido. Consequentemente, o diâmetro do ponto célula pode ser alterado, alterando o volume de suspensão celular chapeado.
Assim, vários pontos devem ser considerar ao realizar o ensaio de ponto. Em primeiro lugar, a densidade celular da suspensão celular precisa ser ajustada para o revestimento, bem como para o tipo de célula usada. Em geral, se a gota se espalha mais amplo, maiores densidades de célula são necessários para as células da placa em monocamadas confluentes. Além disso, mais células precisam ser chapeado para obter uma monocamada confluente, se as células são pequenas e não se espalhou tanto quanto em comparação com células grandes, espalha. Em segundo lugar, o ensaio de ponto pode ser adotado para a placa de diferentes formatos, por isso, o tamanho do ponto pode ser adaptado para poços menores, reduzindo o volume do ponto chapeado e se desejado, maiores pontos podem ser chapeados usando volumes mais elevados de gota. Em terceiro lugar, algumas linhas não é compatível com a placa dentro de 30 min, caso em que o tempo de chapeamento de célula pode ser estendida até 3 h. Da mesma forma, o revestimento da placa deve ser apropriado para células migrar na... e deve ter cuidado para não riscar o revestimento quando o chapeamento das células. Se as células não anexar ou migrar na matriz da escolhida, outros tipos de revestimento, por exemplo, colágeno 1 ou fibronectina, podem ser explorados, ou concentrações de proteínas da matriz, tempos de incubação e temperaturas de incubação durante o revestimento das placas alteradas. Matriz extracelular adequada para linhas de célula específica pode ser encontrada na literatura.
O ensaio de ponto tem algumas limitações. É um ensaio de migração bidimensional e, portanto, isso pode ser considerado como uma desvantagem em comparação com ensaios tridimensionais, que são, no entanto, mais difícil de realizar do que ensaios bidimensionais. Talvez, um grande problema é que a proliferação celular pode influenciar resultados, particularmente se são usadas linhas de células de proliferação rápida e migração celular é avaliada durante longos períodos de tempo, como foi feito aqui para a análise do diâmetro da colônia após 4 dias. Da mesma forma, em ensaios de zero o encerramento de um risco de ferimento é afetado pela proliferação de células dentro da camada de células; e em ensaios de câmara de Boyden, particularmente se o soro ou outros mediadores que induzem a proliferação celular são usados como um quimiotático, proliferação celular aumentada na câmara inferior pode distorcer os resultados. Única célula de rastreamento pode ser usada para observar especificamente o movimento de não-proliferação de células. Além disso, a proliferação celular pode ser reduzida por inanição (i) o soro como feito aqui e/ou (ii) inibição da mitose por adição de mitomicina ou outros inibidores de proliferação4,16. Para reduzir a proliferação celular, no entanto, deve ter cuidado para não danificar as células de forma que eles já não podem migrar. Curiosamente, encontramos em uma migração semelhante irrestrita do ensaio que a proliferação celular não está correlacionada com deslocamento de borda, embora está envolvido na manutenção da integridade epitelial folha durante a migração4,5, 17. Isso abre uma questão interessante: É a proliferação celular um componente necessário da migração de uma camada de células? Espera-se que a migração de folhas de célula com aderências célula-célula forte no ambiente circundante será negativamente afectada se proliferação está bloqueada totalmente, como a folha eventualmente já não será capaz de expandir e oferecer suporte a migração de células. Neste ponto, as células devem ou lenta ou parar a migração, ou a folha deve interromper. Por outro lado, a migração de folhas com aderências celular baixa pode ser menos impactada como células podem deixar a folha para migrar de forma independente, como espalhamento na borda da folha epitelial. Assim, a migração celular e a proliferação das células são interdependentes, e qualquer tentativa de bloquear a proliferação celular para estudar a migração folha precisa ser cuidadosamente considerado. Assim, analisando a migração folha de ensaios na maior parte são executados sob inanição de soro que reduz, mas não abolir a migração celular.
Outros ensaios de migração para estudar a migração de folha em superfícies bidimensionais incluem o arranhão ou ferida de ensaio e, mais recentemente, os ensaios de migração irrestrita usando silício ou câmaras PDMS e estênceis que permitem chapeamento de células em áreas definidas e irrestrita migração de células para a área de célula livre após a remoção do câmara ou estêncil1,3,4,5,6,7,16. Estes últimos ensaios e o ensaio de ponto oferecem alta reprodutibilidade na mão de usuários experientes, bem como inexperientes como o chapeamento de célula determina a forma e o tamanho da colônia. Em contraste, arranhões a monocamada celular em ensaios de risco requer prática e mesmo nas mãos de especialistas as partes da folha podem ser arrancado erroneamente se linhas de células que formam monocamadas apertadas são usadas. Esta questão é melhorada quando câmaras de silicone ou estênceis são usados para chapear as pilhas, embora observamos ferindo errônea de folhas de célula após a remoção das câmaras Ibidi. O ensaio de ponto evita esse problema como as células são banhadas em uma colônia e permitidas crescer livremente. Pelas mesmas razões, o ensaio de ponto também permite que as células migrar no revestimento inalterado, que é facilmente perturbado por coçar ou remoção da câmara/estêncil em outros ensaios de migração. Além disso, como as células não são feridas por coçar ou remoção de câmaras/stencils, morte de células e a associado liberação de citocinas associadas com a remoção de câmaras/stencils não tem impacto sobre migração no ensaio de ponto. Por último, as células são frequentemente excesso chapeadas em zero ensaios e ensaios utilizando câmaras ou estênceis. Assim, depois de limpar células arranhando-os ou removendo as barreiras físicas que impedem a migração celular, vai relaxar a monocamada de células e células são empurradas, espalhando em área livre celular sem ativamente migrando. Em contraste, no ensaio de ponto, folhas de célula podem estabelecer-se durante a noite antes de migração é observada, e migração celular, ao invés de relaxamento da camada de células pode ser observado.
O ensaio de ponto, que pode ser facilmente executado sem qualquer equipamento especializado, presta-se a uma série de ensaios subsequentes, incluindo coloração de células para avaliar a morfologia de colônia bruta e célula dispersão8, immunostaining8, lapso de tempo imagem e análise de dados subsequentes usando o ImageJ, Matlab ou outros de software de análise de imagem13. Parâmetros adicionais tais como correlação de vetores vizinhas ou suas trajetórias de separação podem ser avaliadas a mais precisamente descrevem a coerência do movimento de célula dentro de folhas13. Imagem de lapso de tempo também pode ser combinada com imunocoloração e ImageJ com suporte a rastreamento de pilha para obter mais informações sobre migração celular. Por exemplo, pontos podem ser immunostained para proteínas do citoesqueleto depois da imagem latente de lapso de tempo, e as células então podem ser controladas usando o ImageJ para analisar como a expressão destas proteínas influencia o fenótipo migratório das células. Outro uso futuro é única célula rastreamento de células que expressam proteínas fluorescentes nucleares. Importante, o ensaio de ponto pode ser executado em placas multi bem e é tão apropriado para médio a alto throughput de imagem, tornando-se uma ferramenta muito acessível e facilmente acessível para o efeito de drogas ou shRNAs na migração folha de tela.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
O autor deseja agradecer lucianoteixeira Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo e Carole Parent para ler e comentar sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
