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Cancer Research

Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56451

Summary

Migración celular es esencial para el desarrollo, mantenimiento de tejidos y reparación y tumorigenesis y está regulada por factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas. Este protocolo describe el ensayo de punto, un análisis de la migración de dos dimensiones, sin restricciones para evaluar el fenotipo migratorio de hojas adjunta, cohesivo de la célula en respuesta a señales microambiental.

Abstract

Aunque organismos complejos aparecen estáticos, sus tejidos están bajo una rotación continua. Como las células de edad, mueren y son reemplazados por nuevas células, las células se mueven dentro de los tejidos de una manera bien orquestada. Durante el desarrollo del tumor, este equilibrio es perturbado, y salir de las células del tumor del epitelio de origen, para invadir el microambiente local, viajar a sitios distantes y en última instancia formar tumores metastásicos en sitios distantes. El punto es un análisis simple, de dos dimensiones de la migración sin restricciones, para evaluar el movimiento neto de las hojas de la célula en una zona libre de células y para analizar parámetros de migración de la célula usando proyección de imagen de Time-lapse. Aquí, el análisis de punto se demuestra con un humano invasor, línea de células de cáncer de mama, MCF10CA1a, formadoras de pulmón para analizar migratorias ante las células factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se sabe para aumentar el potencial maligno de las células de cáncer de mama y para alterar el fenotipo migratorio de las células.

Introduction

Ensayos de migración son ampliamente utilizados para evaluar el potencial invasivo y metastásico de las células de tumor en vitro. Por lo general, la herida o rasguño de análisis se utilizan para evaluar la migración de hojas epiteliales en un celular autorizado zona1,2,3. Para realizar el ensayo de rayado, las células se platean en una monocapa y se crea un "cero" o zona libre de células con una punta de pipeta. El ensayo de rayado es fácil de configurar con suministros de cultivo de tejidos comúnmente disponibles y puede ser realizado en placas de varios pocillos, permitiendo para el procesamiento de muestras múltiples. Sin embargo, mientras se hace la raya, las células se quitan físicamente de la monocapa y someterse a menudo a la muerte celular. Además, matriz extracelular, conectada a la placa a menudo se daña durante el proceso de raspado. Asimismo, el uso de silicona rellenos (tales como Ibidi cámaras4) o de plantillas de5,6,7 puede conducir a la interrupción mecánica de las células y la eliminación parcial de las proteínas de la matriz utilizada para el recubrimiento de la placas. Otra desventaja de ensayos de control de cierre de las heridas o rasguños es su curso de tiempo limitado, como la migración de la célula sólo puede ser analizada hasta que se cierre el cero.

Al realizar el ensayo de punto, las células se platean como Colonia circular en una placa cubierta o sin recubrimiento8. La razón fundamental de esta estrategia de la galjanoplastia es obtener hojas de células con bordes definidos, que pueden migrar o invadir en los alrededores libres de células sin molestar a la cultura por la eliminación de las células o partes movibles. El objetivo general de la prueba de dot es observar la migración de hojas de celular medida por el desplazamiento del borde o diámetro de Colonia, así como para realizar Time-lapse de imágenes para analizar el fenotipo migratorio de las células en mayor resolución espacio-temporal.

Migración de la célula puede verse afectada por una variedad de señales microambiental como quimiocinas, citoquinas y factores de crecimiento como el EGF. EGF es un factor de crecimiento que ejerce sus efectos biológicos por Unión a su receptor, del receptor de EGF9y aumenta el comportamiento invasivo y metastásico de tumor las células4,9,10. Aquí, el ensayo del punto se utiliza para el estudio de EGF estimula la migración de la célula en un humano invasor, pulmón formadoras mama cáncer célula línea (MCF10CA1a)8,11,12.

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Protocol

1. capa de platos (día 1)

Nota: Asegúrese de no dejar huellas dactilares o suciedad en la parte inferior de la placa al manejarla.

  1. Descongelar el colágeno de ratón IV en el hielo y diluir con 50 mM HCl (pH 1.3) para preparar 3 mL de solución 10 μg/mL colágeno IV.
    Nota: Colágeno precipitará a 37 ° C. Por lo tanto es importante mantener la solución de colágeno a baja temperatura descongelamiento y trabajando con él. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida mediante la preparación de alícuotas de tamaños adecuado y almacenamiento a-80 ° C.
  2. Añadir solución de colágeno IV de 250 μl a cada pocillo de las placas de fondo de cristal 12-bien y colocarlos en una caja de plástico de tamaño adecuado, cierre firmemente. Coloque toalla de papel húmeda sobre y alrededor de las placas para la fabricación de una cámara húmeda y cerrar el cuadro. Incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente.
    Nota: Como sólo el área de crecimiento necesita ser cubierto, es suficiente para cubrir solamente la hoja de cubierta, que se une a la parte inferior de la placa, con la solución de colágeno (ver figura 1A, B para un esquema de la placa).
  3. A la mañana siguiente, enjuagar las placas con desionizada de H2O dos veces para quitar el tampón y colágeno no absorbido. Dirigir el agua hasta el borde de la placa de la pozo, no hasta el borde formado por la placa inferior y el cubreobjetos (si agua se pipetea en esta área que salpicará). Deje secar al aire los platos en la campana de flujo laminar. Utilizar las placas inmediatamente o guardar a 4 ° C durante 5 días.
    Nota: Diferentes líneas celulares pueden requerir diferentes capa, como la fibronectina o colágeno I.

2. galjanoplastia el ensayo de punto (día 2)

  1. Preparación de la suspensión de células
    1. Para preparar la suspensión celular, utilizar las células que se han cultivado en una placa de cultivo de tejido de 60 milímetros en medio DMEM/F12 suplementado con suero de caballo de 5% a 80% de confluencia
    2. Lavar las células con solución salina amortiguada de fosfatos de calcio y magnesio libres Dulbecco (DPBS) una vez, Añadir 500 μl de tripsina-EDTA (temperatura ambiente) e Incube las células 3-5 minutos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado.
    3. Suspender las células separadas 4,5 mL medio de cultivo para parar la actividad de tripsina y contar 20 alícuota μl de la suspensión de células en un hemocitómetro.
    4. Sedimenten las células restantes en un tubo cónico de 15 mL por centrifugación a 200 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo a 3 x 106 células/mL.
      Nota: Para otros sustratos de capa o líneas celulares, la densidad celular óptima debe establecerse en una serie de diluciones. 3 x 106 células/mL se recomienda como punto de partida.
  2. Las células de la galjanoplastia
    1. Lugar un descenso de 10 μl de la suspensión celular en el centro de cada tapa del colágeno IV 12-bien vidrio inferior Placa revestida sin tocar ni rayar el recubrimiento (figura 1A, B). Incube la placa durante 30 min a 37 ° C, atmósfera humidificada, para permitir que las células a conectar. Ver en un microscopio invertido que se unen las células.
      Nota: Esto puede ser ve mejor en el borde de la gota, donde puede observarse la formación de una monocapa (figura 1C). Si es necesario, Incube la placa hasta 3 h. Asegúrese de que la humedad en la incubadora es lo suficientemente alta como las gotas pueden secar rápidamente. Si se observa una reducción del volumen de gota durante este paso, añadir PBS a los espacios entre los pozos para aumentar la humedad.
    2. Lave suavemente los pocillos con 1 mL de medio de cultivo dos veces para eliminar las células no inscritos. Añadir 1 mL medio de cultivo a cada pocillo. Ver en un microscopio invertido que ningunas células flotantes mantienen, de lo contrario lavar los pozos otra vez. Incube las células durante la noche a 37 ° C, 5% CO2, atmósfera humidificada, para obtener hojas de celda bien definida.
      Nota: Celdas de flotación están probable que vuelva a acoplar a la placa y formar colonias de células no deseadas.

3. estimulando a las células (día 3)

  1. Compruebe todos los pozos utilizando un microscopio inverso para ese celular colonias han crecido adecuadamente. Si es necesario, marcar pozos inadecuados y no los utilice.
  2. Etiqueta de cada pocillo de la placa adecuada para cada condición de investigado. Ejecute cada condición en duplicado o triplicado.
  3. Cambiar el medio para matar de hambre las células en DMEM/F12 que contiene 0.1% de suero equino (medio muerto de hambre) 3 h antes de que las células son estimuladas.
  4. Estimular las células por adición de EGF (concentración final de 5 ng/mL) o por otros mediadores deseadas y mezcle suavemente el medio utilizando una micropipeta de 1 mL o agitando la placa.
  5. Incube la placa durante 1-4 días observar el desplazamiento de borde y contorno de borde tal como se describe en la sección 4.1 o realizar proyección de imagen de Time-lapse como se describe en la sección 4.2.

4. visualización de colonias de células y la migración celular

  1. Hematoxilina-eosina (HE) tinción para medir el crecimiento de la Colonia (día 4-7)
    1. Fijar las células en etanol al 70% (1 mL/pocillo) durante 2 minutos.
    2. Tinción con hematoxilina (1 mL/pocillo), min ~ 2 núcleos.
    3. Células de lavado con agua del grifo (1 mL/pocillo) hasta los núcleos son de color azules, 5-10 minutos.
    4. Citoplasma de tinción con eosina (1 mL/pocillo), ~ 2 min.
    5. Enjuague con agua desionizada (1 mL/pocillo).
      Nota: Soluciones de hematoxilina y eosina pueden ser recogidas y utilizadas varias veces hasta que la coloración se convierte en débil.
    6. Placa de secado al aire.
    7. Dé vuelta la placa y medir el diámetro del punto con una regla. Alternativamente, tomar fotos de la placa con una cámara y analizar el punto de diámetro en ImageJ.
  2. Time-lapse microscopia (día 3)
    1. Encienda el microscopio de la incubadora y ajustar la temperatura a 37 ° C. Llene el humidificador con dH2O. ajustar el CO2 al 5%. Asegúrese de que la cámara de la incubadora es humidificada y que la etapa motorizada puede moverse libremente. Cierre la cámara incubadora y permita que el microscopio a 37 ° C.
      Nota: El microscopio (véase la tabla de materiales) utilizado aquí se debe calentar a 37 ° C durante al menos 3 horas antes de que las células son imágenes para evitar la deriva de la atención.
    2. Coloque la placa en la etapa del microscopio incubadora y configurar la lista de la etapa. Imagen dos bordes opuestos y el centro de cada punto de la célula (figura 1A).
    3. Tomar imágenes cada 3 minutos, para 15-24 h con el objetivo de X 10. Descargar los datos y proceder a su análisis de la imagen en un programa de elección, por ejemplo, ImageJ o Matlab.

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Representative Results

El ensayo de punto presentado (figura 1) se realizó con invasor, Colonia de pulmón formando las células de cáncer de mama (MCF10CA1a) como modelo. El ensayo de punto cede puntos celular altamente reproducibles en manos de principiantes, lo que es un conveniente y fácil de ejecutar el ensayo (figura 1D). El ensayo de punto combinado con la coloración, o proyección de imagen de Time-lapse y partícula posterior imagen velocimetry (PIV) permite el estudio de diversos parámetros de migración como el desplazamiento de los bordes epiteliales, células velocidad y direccionalidad celular como las células de los bordes de una hoja epitelial migra hacia una zona libre de células. Inicialmente, la proyección de imagen de contraste fase de puntos celulares reveló que invasiva, pulmón Colonia formando células cancerosas del pecho (MCF10CA1a) mantengan un fenotipo mesenquimal Tras estimulación con EGF. Sin embargo, las células dejando la hoja se observan con mayor frecuencia en puntos EGF estimulan la célula (figura 2, flechas). La respuesta de las células MCF10CA1a a EGF se evaluó más por de las culturas que fueron estimuladas con EGF durante 4 días. De hecho, EGF-estímulo dio lugar a un diámetro mayor de la Colonia (figura 3). Estas observaciones indican que la migración de EGF estimuladas células podrían modificarse.

Por lo tanto, el ensayo del punto siguiente fue utilizado para realizar un análisis más detallado del fenotipo migración dinámica de hojas de MCF10CA1a de la célula. Las células de los bordes de la hoja se reflejada para 9 h después de la estimulación de las células con EGF (Video 1 y Video 2) e imágenes luego fueron analizadas por PIV en Matlab4,13,14. PIV reveló que EGF aumenta la velocidad de la célula (figura 4A) 0,63 μm/min de 0.45 μm/min en las células del control. Al mismo tiempo, EGF aumenta la direccionalidad de las células, y esto es indicado por una reducción de la variabilidad de la direccionalidad de la célula (extensión angular) de 0.95 en cultivos control a 0,79 en culturas estimulado por EGF (figura 4B). EGF aumenta el desplazamiento radial del borde epitelial más 9 h de 257 μm μm 356 (figura 4), como también fue observado por él la coloración después de 4 días (figura 3). Así, el uso de la prueba de dot en combinación con diferentes ensayos posteriores muestra que EGF altera migración en los bordes de las hojas de MCF10CA1a las células que aumentan la velocidad de la célula y la direccionalidad, resultando en un radio mayor de la Colonia.

Figure 1
Figura 1: El ensayo de punto de la imagen. (A, B) Las células se platean como Colonia circular en el centro de pozos de la placa de cristal inferior. Para el análisis de la migración, se toman imágenes en dos bordes opuestos, así como el centro de la Colonia (A). (C) imagen de campo oscuro de punto celular durante galjanoplastia (izquierda) y en la mayor ampliación (contraste de fase) muestra el borde de la gota y el borde del punto de la célula después de células conectadas a la placa (centro). Adjunto las células son planas y poligonales, mientras que las células no adheridas son redondas (derecha). (D) El diámetro de puntos es altamente reproducible. Puntos fueron reflejados inmediatamente después de la galjanoplastia y antes de que las células fueron estimuladas y diámetro determina con ImageJ. El tamaño de punto es altamente reproducible dentro de un experimento, así como entre diferentes usuarios y poca formación es necesaria para ganar la pericia en los puntos de la célula de la galjanoplastia (E = más de 10 años de experiencia en cultivo de tejidos, I = menos de 4 semanas de experiencia en tejido c cultura). n = 12 puntos por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: EGF modula el fenotipo morfológico de las células de MCF10CA1a. MCF10CA1a células estaban hambrientos de 3 h en DMEM/F12 suplementado con 0,1% de suero equino antes de que fueran estimulados con EGF (5 ng/mL). En el borde de las colonias EGF estimula las células tienden a migrar fuera de la hoja (flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : EGF aumenta el crecimiento neto de colonias celular. MCF10CA1a células estaban hambrientos de 3 h en DMEM/F12 suplementado con 0,1% de suero equino antes de que fueran estimulados con EGF (5 ng/mL). 4 días más tarde, las células eran etanol fijados y teñidos con hematoxilina y eosina. Estimulado por EGF puntos tienen un diámetro más alto después de 4 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : EGF modula el fenotipo migratorio de las células MCF10CA1a. MCF10CA1a células estaban hambrientos de 3 h en DMEM/F12 suplementado con 0,1% de suero equino antes de que fueran estimulados con EGF (5 ng/mL). Las células fueron imagen cada 3 minutos para 9 h. posteriores partícula imagen velocimetry análisis fue realizado en Matlab13. Valores de velocidad representan la velocidad media en el tiempo para cada campo. Angular propagación de vectores de velocidad se calcula como:
Equation 1donde Equation 2 y va de 0 (alta dirección) a Equation 3 (bajo la direccionalidad). Una disminución en la extensión angular se considera un aumento en direccionalidad. Desplazamiento radial se calculó restando el radio Colonia en t = 0 h de radio Colonia en t = 9 h. EGF-estimulación de MCF10CA1a célula puntos dio lugar a la velocidad creciente de la célula (A; panel superior), disminuyeron la dispersión angular o mayor direccionalidad (B; media panel) y radio Colonia mayor (C, panel inferior). Los datos representan la media ± SEM de n = 3 experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Movie 1
Video 1: Proyección de imagen de Time-lapse de sin estimular células de MCF10CA1a. Imágenes fueron tomadas cada 3 minutos para 9 h. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Movie 2
Video 2: Time-lapse de imágenes de células MCF10CA1a estimulados con EGF (5 ng/mL). Imágenes fueron tomadas cada 3 minutos para 9 h. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

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Discussion

En las células de la progresión del tumor migran fuera del tejido de origen, para invadir el tejido circundante y metastatizar a sitios distantes15. Migración de células de una colonia de células se observan en el análisis del punto. Aquí, el análisis de punto se ilustra mediante el análisis del fenotipo migratorio de las células de cáncer de mama humano en respuesta al EGF.

Para obtener resultados precisos y reproducibles en varios pasos en la configuración del punto ensayos son críticos. En primer lugar, la capa de la placa determina si y cómo las células fuertes pueden adherirse a la placa y las células migran. Debe tenerse cuidado que el recubrimiento de la placa con otra matriz extracelular colágeno IV es homogéneo para minimizar la variabilidad experimental. Además, debe garantizarse que las células investigadas fijen a migran en la placa de cubierta y múltiples experimentos con diferentes matrices en varias concentraciones podrían ser necesarios optimizar las condiciones de recubrimiento de una línea celular elegido. En segundo lugar, la galjanoplastia precisa de las células es crucial para la reproducibilidad. La huella de la caída de la célula determina el tamaño de punto celular así como su forma. Idealmente, la gota se coloca sin la punta de la pipeta tocando la superficie. La forma de la gota se determina principalmente por la tensión superficial de la superficie de la placa, dando como resultado una huella circular de diámetro reproducible. En consecuencia, el diámetro del punto de la célula puede modificarse cambiando el volumen de suspensión celular plateado.

Así, varios puntos deben ser tener en cuenta al realizar el análisis de punto. En primer lugar, la densidad celular de la suspensión de células debe ajustarse a la capa, así como el tipo de célula utilizada. En general, si la gota se extiende más, mayores densidades celulares son necesarios para las células de la placa en monocapas confluentes. Además, las células más necesitan platear para obtener una monocapa confluente si las células son pequeñas y no dispersan tanto como en comparación con células grandes, que se separa. En segundo lugar, el ensayo de punto puede adoptarse a placa diferentes formatos y para esto, el tamaño de punto puede adaptarse a pozos más pequeños reduciendo el volumen del punto plateado, y si lo desea, más puntos pueden ser mediante el uso de mayores volúmenes de gota. En tercer lugar, algunas células de líneas no atará a la placa dentro de 30 minutos, en cuyo caso el tiempo de la galjanoplastia pueden ampliarse hasta 3 h. Del mismo modo, el recubrimiento de la placa debe ser adecuado para que las células migran en y debe tener cuidado de no rayar el recubrimiento cuando las células de la galjanoplastia. Si las células no conecte o migrar en la matriz de solicitadas, pueden explorarse otros tipos de revestimiento, por ejemplo 1 de colágeno o fibronectina, o cambiaron las concentraciones de proteínas de la matriz, tiempos de incubación y temperaturas de incubación durante el revestimiento de las placas. Matriz extracelular adecuado para líneas celulares específicas podría encontrarse en la literatura.

El análisis de punto tiene algunas limitaciones. Es un análisis de dos dimensiones de la migración y por lo tanto esto puede considerarse como una desventaja en comparación con los análisis tridimensionales, que son, sin embargo, más difícil de realizar que el análisis de dos dimensiones. Un problema importante tal vez es que la proliferación celular puede influir en los resultados, especialmente si se utilizan líneas celulares de proliferación rápida y migración de la célula se evalúa sobre períodos más largos, como se hizo aquí para el análisis del diámetro de la Colonia después de 4 días. Del mismo modo, en los ensayos de rayado el cierre de un rasguño de la herida se ve afectado por proliferación celular dentro de la hoja de la célula; y en los ensayos de la cámara de Boyden, particularmente si se usan suero u otros mediadores que inducen proliferaciones de célula como quimioatractiva, proliferación celular aumentada en la cámara inferior puede sesgar resultados. Célula de seguimiento puede utilizarse para observar específicamente movimiento de las células no proliferantes. Además, la proliferación celular puede reducirse por hambre (i) del suero como hecho aquí o (ii) la inhibición de la mitosis además de mitomicina u otros inhibidores de proliferación4,16. Para reducir la proliferación celular, sin embargo, debe tenerse cuidado para no dañar las células de manera que ya no puede migrar. Curiosamente, encontramos en una migración sin restricciones similar del análisis que la proliferación celular no está correlacionada con la dislocación de borde, aunque está implicada en mantener la integridad de la lámina epitelial durante la migración4,5, 17. ¿Esto abre una interesante pregunta: es la proliferación de célula un componente necesario de la migración de una capa celular? Se espera que migración de hojas de la célula con adhesiones célula-célula fuerte en el entorno se verán negativamente afectada si proliferación se bloquea totalmente, como la hoja eventualmente ya no serán capaces de ampliar y apoyar la migración de las células. En este punto, las células deben migración lenta o parada, o la hoja debe interrumpir. Por el contrario, la migración de hojas con adherencias bajo célula podría ser menos impactada como células pueden dejar la hoja de migrar independientemente, como la dispersión en el borde de la lámina epitelial. Así, la migración celular y la proliferación celular son interdependientes, y cualquier intento de bloquear la proliferación de células para estudiar la migración de la hoja debe ser cuidadosamente considerado. Así, ensayos análisis de migración de la hoja en su mayoría se realizan bajo hambre de suero que reduce pero no abolir la migración celular.

Otros ensayos de migración para estudiar la migración de la hoja en las superficies de dos dimensiones incluyen el rasguño o herida ensayo y, más recientemente, ensayos de migración sin restricciones usando silicio o cámaras PDMS y plantillas que permiten la galjanoplastia de las células en áreas definidas y migración sin restricciones de las células en la zona libre de células después del retiro de la cámara o stencil1,3,4,5,6,7,16. Estos últimos ensayos y el ensayo punto ofrecen alta reproducibilidad en la mano de usuarios expertos como inexpertos como el recubrimiento de la célula determina la forma y el tamaño de la Colonia. En cambio, rasguño de la monocapa celular en ensayos de rayado requiere práctica y aún en manos de parte de expertos de la hoja puede ser estafado erróneamente si se utilizan líneas celulares que forman monocapas apretadas. Este problema se mejora cuando cámaras de silicona o plantillas se utilizan para el revestimiento de las células, aunque observamos errónea heridas a las hojas de la célula después del retiro de cámaras Ibidi. El ensayo de punto evita este problema ya que las células son plateadas en una colonia y permitió que creciera libremente. Por las mismas razones, el análisis de punto también permite que las células migran a la capa inalterable, que es fácilmente perturbada por rascado o el retiro de la cámara/de la plantilla en otros ensayos de migración. Además, como las células no se lesionan por rascado o eliminación de plantillas de cámaras, muerte celular y la liberación asociada de citoquinas asociadas con el retiro de plantillas de cámaras no tiene impacto sobre la migración en el análisis del punto. Por último, las células son a menudo demasiado plateadas en cero ensayos y ensayos utilizando cámaras o plantillas. Así, después de limpiar células rasguño apagado o eliminando las barreras físicas que impiden la migración de la célula, la monocapa celular se relajará y células se empujan, extendiendo en la zona libre de células sin migración activamente. En cambio, en el ensayo de punto, las hojas de la célula pueden establecerse durante la noche antes de la migración se observa y se observa la migración de la célula en lugar de relajación de la capa celular.

El análisis del punto, que puede realizarse fácilmente sin necesidad de equipos especializado, se presta a una gama de ensayos posteriores, incluyendo la tinción de células para evaluar la morfología de las colonias bruto y celular dispersión8, immunostaining8, Time-lapse la proyección de imagen y análisis de datos subsiguiente mediante ImageJ, Matlab u otras de software de análisis de imagen13. Parámetros adicionales tales como correlación de vectores vecinos o sus trayectorias de separación pueden ser evaluadas más exacto describen la coherencia del movimiento celular en hojas13. Proyección de imagen de Time-lapse puede combinarse también con inmunotinción y ImageJ apoyo seguimiento celular para conocer más de la migración de la célula. Por ejemplo, puntos pueden ser immunostained para proteínas citoesqueléticas después de la proyección de imagen de Time-lapse, y entonces se pueden rastrear las células usando ImageJ para analizar cómo la expresión de estas proteínas influye el fenotipo migratorio de las células. Otro uso futuro es el seguimiento de la célula de las células que expresan proteínas fluorescentes nucleares. Lo importante es el ensayo de punto puede ser realizado en placas de varios pocillos y es tan conveniente para el medio a alto rendimiento imagen, convirtiéndolo en una herramienta accesible y muy asequible para el efecto de drogas o shRNAs en migración de la hoja de la pantalla.

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Disclosures

El autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

El autor desea agradecer Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo y Carole Parent para leer y comentar el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF10CA1a cells Karmanos Research Institute N/A cells used for assay
mouse collagen IV BD Biosciences 354233 used to coat plates
trypsin / EDTA Thermo Fisher 25300054 used to remove cells from tissue culture plates
DPBS  Mediatech 21-031-CV used to wash cells
DMEM / F12 Thermo Fisher 11320082 used as culture medium
horse serum Thermo Fisher 26050088 used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate MatTek P12G-1.5-14-F used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant) Peprotech AF-100-15 used to stimulate cells
fatty acid free BSA Sigma A8806-1G used to make buffer for EGF
hematoxylin Sigma HHS32 used to stain colonies
eosin Electron Microscopy Sciences 26051-10 used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator Sanyo model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage Zeiss model Axio Observer.Z1 used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera BioVision C11440-42U-KIT used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph BioVision MMACQMIC software used for time lapse imaging
inverted microscope Olympus model IX70 used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box Lock&Lock N/A used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas
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Stuelten, C. H. Using the Dot AssayMore

Stuelten, C. H. Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets. J. Vis. Exp. (130), e56451, doi:10.3791/56451 (2017).

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