Summary
Cellmigration är avgörande för utveckling, vävnad underhåll och reparation och uppkomst, och regleras av cytokiner, tillväxtfaktorer och chemokiner. Det här protokollet beskriver dot analysen, en tvådimensionell, obegränsad invandring analysen att bedöma flyttande fenotypen av bifogade, sammanhängande cell ark som svar på microenvironmental signaler.
Abstract
Komplexa organismer tyckas statisk, är deras vävnader under en kontinuerlig omsättning. Som cellerna ålder, flytta dö, och är ersatt av nya celler, celler inom vävnader i ett tätt iscensatt sätt. Denna balans störs under tumörutveckling, och tumörceller lämnar epitelet i ursprung att invadera den lokala mikromiljö, att resa till avlägsna platser, och att slutligen bilda metastaserande tumörer på avlägsna platser. Dot analysen är en enkel, tvådimensionell unconstrained migration analys, att bedöma den netto rörelsen cell ark i en cell-fritt område och analysera parametrar av cellmigration med time-lapse imaging. Här, dot analysen påvisas med en mänskliga invasiva, lung kolonibildande breast cancer cellinje, MCF10CA1a, för att analysera cellernas flyttande svar på epidermal tillväxtfaktor (EGF), som är känt för att öka malign potential av bröstcancer cancerceller och att ändra flyttande fenotypen av celler.
Introduction
Migration-analyser används ofta för att utvärdera den invasiva och metastatisk potentialen av tumör celler in vitro. Vanligast, används det såret eller scratch test för att bedöma migration av epitelial ark till en cell som rensat området1,2,3. För att utföra scratch analysen, celler är klädd i en enskiktslager och en ”repa” eller cell-fritt område skapas med en pipettspetsen. Scratch analysen är lätt att ställa upp med allmänt tillgängliga vävnadsodling leveranser och kan utföras i plattor med flera, vilket möjliggör bearbetning av flera prover. Dock som scratch görs, celler avlägsnas fysiskt från enskiktslager och genomgår ofta celldöd. Extracellulär matrix kopplad till plattan är dessutom ofta skadad under processen avlysningen. Likaså användningen av kisel infogas (t.ex. Ibidi kammare4) eller av stenciler5,6,7 kan leda till mekaniska avbrott i cellerna och partiellt avlägsnande av matrix proteiner används för beläggning av plattorna. En annan nackdel med analyser övervakning nedläggning av sår eller repor är sin begränsade tid kurs, som cellmigration kan endast analyseras tills scratch är stängd.
I utför dot analysen, är celler klädd som en cirkulär koloni på ett bestruket eller obestruket tallrik8. Grunden för denna plätering strategi är att få cell ark med definierade kanter, som kan migrera eller invadera in i omgivande cellfria områden utan att störa kulturen av borttagning av celler eller skär. Det övergripande målet för dot analysen är att observera migration av cell ark mätt som edge förskjutning eller kolonin diameter, samt att utföra time-lapse imaging att analysera flyttande fenotypen av celler i högre plats-temporal upplösning.
Cellmigration kan påverkas av en mängd microenvironmental ledtrådar som chemokiner, cytokiner och tillväxtfaktorer såsom EGF. EGF är en tillväxtfaktor som utövar sin biologiska effekt genom bindning till sin receptor, EGF-receptorn9, och ökar invasiva och metastaserande beteende av tumör celler4,9,10. Här dot analysen används att studera EGF stimuleras cellmigration i en mänsklig invasiva, lung kolonibildande breast cancer cell linje (MCF10CA1a)8,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beläggning av rätter (dag 1)
Obs: Se till att inte lämna fingeravtryck eller smuts på undersidan av plattan när du hanterar den.
- Tina mus kollagen IV på is, och späda ut det med 50 mM HCl (pH 1,3) för att förbereda 3 mL en 10 µg/mL kollagen IV lösning.
Obs: Kollagen kommer fällningen vid 37 ° C. Det är därför viktigt att hålla kollagen lösningen vid en låg temperatur medan upptining och arbeta med den. Undvik upprepad frysning-tining cykler genom att förbereda lagom stora portioner och lagra dem vid-80 ° C. - Lägga till 250 µL kollagen IV lösning till varje brunn av 12-väl glas bottenplåtar och placera dem i en lämplig storlek, tight-stängning plastlåda. Placera vått pappershandduk över och runt plattorna att tillverka en fuktig kammare och stänga rutan. Inkubera plattorna över natten i rumstemperatur.
Obs: Endast tillväxtområdet behov att vara belagd, är det tillräckligt att bara täcka den täckglas, som är knuten till botten av plattan, med kollagen lösning (se figur 1A, B för en schematisk av plattan). - Nästa morgon, skölj plattor med avjoniserat H2O två gånger för att ta bort icke-absorberade kollagen och buffert. Direkt vattnet till kanten av plattan väl, inte till kanten bildas av plattan botten och täckglaset (om vatten är pipetteras i detta område som det kommer splash). Lufttorka plattorna i LAF. Använda plattor omedelbart eller förvaras vid 4 ° C i upp till 5 dagar.
Observera: Olika cellinjer kan kräva olika beläggning, till exempel Fibronektin eller kollagen jag.
2. plätering Dot analysen (dag 2)
-
Förbereda cellsuspensionen
- För att förbereda cellsuspension, Använd celler som har odlats i en 60 mm vävnadsodling maträtt i DMEM/F12 medium kompletteras med 5% häst serum till 80% sammanflödet
- Skölj cellerna med kalcium - och magnesium-fri Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) en gång, tillsätt 500 µL trypsin-EDTA (rumstemperatur) och inkubera cellerna för 3-5 min i en inkubator på 37 ° C, 5% CO2, fuktad atmosfär.
- Avbryta fristående cellerna i 4,5 mL odlingsmedium att stoppa trypsin aktivitet och räkna en 20 µL alikvot av cellsuspensionen i en hemocytometer.
- Pellet återstående cellerna i en 15 mL koniska rör genom centrifugering vid 200 x g i 3 min, Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i odlingsmedium till 3 x 106 celler/mL.
Obs: För andra beläggning substrat eller cellinjer, optimal cell densiteten måste fastställas i en utspädning serie. 3 x 106 cell/mL rekommenderas som utgångspunkt.
-
Plätering celler
- Plats en droppe 10 µL cellsuspension i mitten av varje täckglas av kollagen IV belagd 12-väl glas bottenplattan utan att vidröra eller repa beläggningen (figur 1A, B). Inkubera plattan under 30 minuter vid 37 ° C, fuktad atmosfär, så att cellerna att bifoga. Kontrollera i ett inverterat Mikroskop att cellerna är anslutna.
Obs: Detta kan bäst ses vid kanten av droppa, där bildandet av en enskiktslager kan observeras (figur 1C). Om nödvändigt, inkubera plattan upp till 3 h. vara säker på att luftfuktigheten i inkubatorn är tillräckligt hög som dropparna kan torka ut snabbt. Om en minskning av volymen droppe under detta steg observeras, lägga till PBS i mellanrummen mellan brunnarna att öka luftfuktigheten. - Försiktigt Tvätta brunnarna med 1 mL odlingsmedium två gånger för att ta bort grupplösa celler. Tillsätt 1 mL odlingsmedium till varje brunn. Kontrollera i ett inverterat Mikroskop att inga flytande celler kvar, annars Tvätta brunnarna igen. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO2, fuktad atmosfär för att få väldefinierade cell ark.
Obs: Den flytande cellerna sannolikt att åter fästa till plattan och bildar oönskade cell kolonier.
- Plats en droppe 10 µL cellsuspension i mitten av varje täckglas av kollagen IV belagd 12-väl glas bottenplattan utan att vidröra eller repa beläggningen (figur 1A, B). Inkubera plattan under 30 minuter vid 37 ° C, fuktad atmosfär, så att cellerna att bifoga. Kontrollera i ett inverterat Mikroskop att cellerna är anslutna.
3. stimulera celler (dag 3)
- Kontrollera alla brunnar med ett inverterat Mikroskop för att se till att cell kolonier har vuxit ordentligt. Om det behövs, markera olämpliga brunnar och Använd dem inte.
- Märk varje brunn av plattan på lämpligt sätt för varje villkor som undersökt. Kör varje villkor i två eller tre exemplar.
- Ändra mediet för att svälta cellerna i DMEM/F12 som innehåller 0,1% häst serum (svältande medium) 3 h innan cellerna stimuleras.
- Stimulera cellerna genom tillägg av EGF (5 ng/mL koncentration) eller annan önskad medlare och blanda försiktigt mediet använder en 1 mL micropipettor eller genom omskakning plattan.
- Inkubera plattan för 1-4 dagar att följa kanten förskjutning och kanten kontur som beskrivs i avsnitt 4.1 eller utför time-lapse imaging som beskrivs i avsnitt 4.2.
4. visualisering av Cell kolonier och cellmigration
-
Hematoxylin-eosin (han) färgning för att mäta kolonin tillväxt (dag 4-7)
- Fixa celler i 70% etanol (1 mL per brunn) för ~ 2 min.
- Fläcken atomkärnor med hematoxylin (1 mL per brunn), ~ 2 min.
- Tvätta cellerna med kranvatten (1 mL per brunn) tills kärnorna är blå, 5-10 min.
- Färga cytoplasman med eosin (1 mL per brunn), ~ 2 min.
- Spola med avjoniserat vatten (1 mL per brunn).
Obs: Hematoxylin och eosin lösningar kan samlas in och användas flera gånger tills färgningen blir svag. - Lufttorka plattan.
- Vänd plattan och mät dot diameter med en linjal. Alternativt, ta bilder av plattan med en kamera och analysera dot diametern i ImageJ.
-
Time-lapse mikroskopi (dag 3)
- Slå på mikroskopet inkubator och justera temperaturen till 37 ° C. Fyll luftfuktare med dH2O. Justera CO2 till 5%. Se till att inkubator kammaren är tilluften och att motoriserade scenen kan röra sig fritt. Stäng inkubator kammaren och tillåta mikroskopet att anpassa sig till 37 ° C.
Obs: Mikroskopet (se tabell av material) används här bör värmas till 37 ° C under minst 3 h innan cellerna är avbildas för att undvika drifting i fokus. - Placera plattan på scenen av mikroskopet inkubator och ställa in listan scenen. Bild två motsatta kanter och centrum av varje cell dot (figur 1A).
- Ta bilder varje 3 min, för 15-24 h med målsättningen 10 X. Ladda ner data och fortsätta med bildanalys i ett program av val, t.ex., ImageJ eller Matlab.
- Slå på mikroskopet inkubator och justera temperaturen till 37 ° C. Fyll luftfuktare med dH2O. Justera CO2 till 5%. Se till att inkubator kammaren är tilluften och att motoriserade scenen kan röra sig fritt. Stäng inkubator kammaren och tillåta mikroskopet att anpassa sig till 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dot analysen presenteras här (figur 1) utfördes med hjälp av invasiv, lung kolonibildande bröstcancer cancerceller (MCF10CA1a) som modellsystem. Dot analysen ger mycket reproducerbara cell prickar även i räcka av nybörjare, vilket är ett bekvämt och enkelt att utföra analysen (figur 1D). Dot analysen tillsammans med han färgning, eller time-lapse imaging och efterföljande particle image velocimetry (PIV) tillåter studier av olika migration parametrar inklusive förskjutning av epitelial kanter, cell hastighet och cell riktverkan som celler i kanterna av en epitelial ark migrera in i en cell-fritt område. Inledningsvis, avslöjade fas kontrast avbildning av cell prickar att invasiva, lung kolonin bildar bröstcancer cancerceller (MCF10CA1a) upprätthåller en mesenkymala fenotyp efter stimulering med EGF. Dock observeras enstaka celler lämnar bladet oftare i EGF-stimulerad cell prickar (figur 2, pilar). Svaret av MCF10CA1a celler till EGF bedömdes ytterligare genom han färgning av kulturer som stimuleras med EGF i 4 dagar. Faktiskt, EGF-stimulering resulterade i en ökad kolonin diameter (figur 3). Dessa observationer tyder på att migrationen av EGF stimuleras cellerna kan ändras.
Dot analysen var därför nästa utnyttjas för att utföra en mer detaljerad analys av dynamiska migration fenotypen av MCF10CA1a cell ark. Cellerna i bladet kanterna var avbildas för 9 h stimulering av celler med EGF (Video 1 och Video 2) och bilder analyserades sedan av PIV i Matlab4,13,14. PIV avslöjade att EGF ökar cell hastighet (figur 4A) till 0.63 µm/min från 0,45 µm/min i kontroll celler. Samtidigt, EGF ökade riktningen på celler, och detta indikeras av en minskning av variabilityen av cell riktverkan (kantiga spridning) från 0,95 i kontroll kulturer till 0,79 i EGF-stimulerad kulturer (figur 4B). EGF ökat radiellt förskjutningen av epitelial kanten över 9 h från 257 µm till 356 µm (figur 4), som observerades också av han färgning efter 4 dagar (figur 3). Användningen av dot analysen i kombination med olika efterföljande analyser visar således att EGF förändrar migration vid kanterna av MCF10CA1a celler lakan så att cellen hastighet och riktningen är ökat, vilket resulterar i en ökad kolonin radie.
Figur 1: Imaging dot analysens. (A, B) Celler är klädd som en cirkulär koloni i mitten av glas botten plattan brunnar. För migration analys tas bilder på två motstående kanter samt mitten av kolonin (A). (C) mörka fältet bild av cell dot under plating (vänster) och i högre förstoring (faskontrast) visar kanten av drop och kanten av cellen punkten efter celler som bifogas plattan (center). Bifogade celler är platta och polygona, medan grupplösa celler är runda (till höger). (D) Diametern på prickar är mycket reproducerbara. Prickarna var avbildade omedelbart efter plätering och innan cellerna stimuleras och diametern fastställs med hjälp av ImageJ. Dot storlek är mycket reproducerbara inom ett experiment samt mellan olika användare och lite utbildning krävs för att få kunskaper i plätering cell prickar (E = mer än 10 års erfarenhet i vävnadskultur, jag = mindre än 4 veckor erfarenhet av vävnad c rådgivande). n = 12 punkter per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: EGF modulerar morfologiska fenotypen av MCF10CA1a celler. MCF10CA1a celler var svalt för 3 h i DMEM/F12 kompletteras med 0,1% häst serum innan de var stimuleras med EGF (5 ng/mL). Vid kanten av EGF-stimulerad kolonier tenderar enstaka celler att migrera ur bladet (pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : EGF ökar nettotillväxten av cell kolonier. MCF10CA1a celler var svalt för 3 h i DMEM/F12 medium kompletteras med 0,1% häst serum innan de var stimuleras med EGF (5 ng/mL). 4 dagar senare var cellerna etanol fixeras och färgas med Hematoxylin och Eosin. EGF-stimulerad prickar har en högre diameter efter 4 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : EGF modulerar flyttande fenotypen av MCF10CA1a celler. MCF10CA1a celler var svalt för 3 h i DMEM/F12 medium kompletteras med 0,1% häst serum innan de var stimuleras med EGF (5 ng/mL). Cellerna var avbildade var 3 minut för 9 h. efterföljande particle image velocimetry analys utfördes i Matlab13. Hastighetsvärden representerar den genomsnittliga hastigheten över tiden för varje fält. Kantiga spridningen av velocity vektorer beräknades som:
där 
, och sträcker sig från 0 (hög riktverkan) till 
(låg riktverkan). En minskning av kantiga spridningen anses en ökning i riktverkan. Radial förskjutning beräknades genom att subtrahera kolonin radien vid t = 0 h från kolonin radien vid t = 9 h. EGF-stimulering av MCF10CA1a cell prickar resulterade i ökad cell hastighet (A; övre panelen), minskade kantiga spridning eller ökad riktverkan (B; mitten panel), och ökad kolonin radie (C; nedre panelen). Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM n = 3 experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Time-lapse imaging ostimulerade MCF10CA1a celler. Bilder togs varje 3 min för 9 h. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Time-lapse avbildning av MCF10CA1a celler stimuleras med EGF (5 ng/mL). Bilder togs varje 3 min för 9 h. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migrera från vävnaden i ursprung att invadera den omgivande vävnaden och metastasera till avlägsna platser15under progression tumörceller. Migrering av celler från en cell koloni kan observeras i dot-analysen. Här illustreras dot analysen genom att analysera flyttande fenotypen av mänskliga bröstcancerceller svar på EGF.
För att erhålla exakta och reproducerbara resultat flera steg i utformningen av dot är analyserna kritisk. Först, beläggning av plattan avgör om och hur starka celler kan hålla sig till plattan och om celler migrerar. Försiktighet bör iakttas att beläggning av plattan med kollagen IV eller andra extracellulära matrix är homogen att minimera experimentella variabilitet. Dessutom måste det säkerställas att de celler som undersökt tillmäter migrera på bestruket plattan och flera experiment med olika matriser i flera koncentrationer kan vara nödvändigt att optimera beläggning villkoren för en vald cell fodrar. Andra är korrekt plätering av cellerna avgörande för reproducerbarhet. Fotavtryck av cell nedgången bestämmer storleken på cellen punkten samt dess form. Idealiskt, drop placeras utan pipettspetsen att vidröra ytan. Formen på nedrullningsbara bestäms sedan mestadels av ytspänningen i den platta ytan, vilket resulterar i ett cirkulär fotavtryck av reproducerbara diameter. Diametern på den cell pricken kan följaktligen ändras genom att ändra volymen av cellsuspensionen pläterade.
Således är flera punkter att överväga när du utför dot analysen. För det första måste cell densiteten av cellsuspensionen anpassas till beläggning samt till den celltyp som används. I allmänhet om drop sprider bredare, behövs högre cell densiteter för att platta celler in konfluenta enskiktslager. Dessutom behöver fler celler vara klädd för att erhålla en konfluenta enskiktslager om cellerna är små och inte sprids mycket som jämfört med stora, spridning celler. För det andra dot analysen kan antas till olika platta format, och för detta, dot storlek kan anpassas till mindre brunnar genom att minska volymen av dot pläterade, och om så önskas större prickar kan beläggas med högre droppe volymer. För det tredje kan någon cell linjer inte kommer fäster på plattan inom 30 min, i vilket fall plätering tiden förlängas upp till 3 h. Likaså, beläggning av plattan måste vara lämplig för celler att migrera på och försiktighet bör iakttas för att inte repa beläggningen när plätering cellerna. Om cellerna inte bifoga eller migrera på valda matrisen, andra typer av beläggning, till exempel kollagen 1 eller Fibronektin, kan utforskas eller koncentrationer av matrix proteiner, inkubationstider, och inkubering under beläggning av plattor ändrats. Lämpliga extracellulär matrix för specifika cellinjer kan hittas i litteraturen.
Dot analysen har några begränsningar. Det är en tvådimensionell migration analysen och således detta kan anses som en nackdel jämfört med tredimensionella analyser, som dock mer svårt att utföra än tvådimensionella analyser. Ett stort problem är kanske att cellproliferation kan påverka resultat, särskilt om snabbt prolifererande cellinjer används och cellmigration bedöms över längre tidsperioder som gjordes här för analysen av kolonin diameter efter 4 dagar. Likaså i scratch analyser påverkas stängningen av en repa sår av cellproliferation inom cellagret; och i Boyden kammare analyser, särskilt om serum eller andra mediatorer som inducerar cell proliferations används som ett korrektiv, ökad cellproliferation i botten kammare kan skeva resultat. Enstaka cell spårning kan användas att särskilt Observera rörlighet för icke-frodas celler. Dessutom kan cellproliferation minskas genom (i) serum svält som gjort här och/eller (ii) hämning av Mitos genom tillsats av mitomycin eller andra spridning-hämmare4,16. För att minska cellproliferation, men måste vara försiktig att inte skada cellerna i sådan utsträckning att de inte längre kan migrera. Intressant, Vi hittade i en liknande unconstrained migrering assay att cellproliferation inte korreleras med edge deplacement, även om det är involverade i att upprätthålla epitelial ark integritet under migration4,5, 17. Detta öppnar en intressant fråga: är cellproliferation en nödvändig del av migration av en cellagret? Det förväntas att migreringen av cell ark med stark cell-cell sammanväxningar i den omgivande miljön kommer att påverkas negativt om spridning blockeras helt, eftersom bladet så småningom kommer inte längre att kunna expandera och stödja migrering av celler. Vid denna punkt, cellerna bör antingen långsam eller sluta migration, eller bladet bör störa. Migreringen av ark med låg cell-cell sammanväxningar kan däremot vara mindre påverkade som cellerna kan lämna bladet för att migrera självständigt, såsom spridning vid kanten av arket epitelial. Således, cellmigration och cellproliferation är beroende av varandra, och varje försök att blockera cellproliferation att studera ark migration måste övervägas noggrant. Således, analyser analysera ark migrering utförs mestadels under serum svält vilket minskar men inte avskaffar cellmigration.
Andra migration analyser att studera ark migration på tvådimensionella ytor inkluderar scratch eller såret assay och, mer nyligen, oinskränkt migration analyser med silicon eller PDMS chambers och stenciler som tillåter plätering av celler i definierade områden och unconstrained migrering av celler i området cellfria efter borttagning av kammare eller stencil1,3,4,5,6,7,16. Dessa senare analyser och dot analysen erbjuder hög reproducerbarhet i räcka av såväl erfarna som oerfarna användare som cellen plätering bestämmer form och storlek av kolonin. Däremot skrapa av den cellulära enskiktslager i scratch analyser kräver övning, och även i händerna på experter delar av bladet kan bli lurade felaktigt om cellinjer som bildar tight enskiktslager används. Problemet är bättre när silikon chambers eller schabloner används för plätering cellerna, även om vi observerat Felaktiga såra cell ark efter avlägsnande av Ibidi kamrar. Dot analysen undviker problemet som cellerna är klädd i en koloni och tillåts växa fritt. Av samma skäl kan dot analysen också cellerna att migrera på oförändrat beläggning, som störs lätt av repor eller borttagning av kammaren/stencilen i andra migration analyser. Eftersom cellerna inte är skadas av repor eller borttagning av chambers/stenciler, celldöd och den associerade frisättningen av cytokiner som är associerad med avlägsnande av chambers/stenciler har ingen inverkan på migrationen i dot-analysen. Slutligen, celler är ofta alltför pläterad i scratch analyser och analyser med chambers eller stenciler. Således efter clearing celler genom skrapa dem eller ta bort de fysiska hindren för cellmigration, den cell enskiktslager kommer att koppla av och cell skjuts, sprider sig till området cellfria utan aktivt migrerar. Däremot i dot-analysen, kan cell ark etablera sig över natten innan migreringen observeras, och cellmigration i stället för avkoppling av cellagret kan observeras.
Dot analysen, som kan utföras enkelt utan någon specialiserad utrustning, lämpar sig för en rad efterföljande analyser, inklusive färgning av celler att bedöma brutto kolonin morfologi och cell spridning8, immunfärgning8, time-lapse Imaging, och efterföljande dataanalys ImageJ, Matlab eller andra bild analys programvara13. Ytterligare parametrar beskriva såsom korrelation av angränsande vektorer eller deras separation banor kan bedömas till mer exakt samstämmigheten i cellers rörelser inom ark13. Time-lapse imaging kan också kombineras med immunfärgning och ImageJ stöds cell tracking för att få ytterligare inblick i cellmigration. Till exempel prickar kan vara immunostained för cytoskeletal proteiner efter time-lapse imaging, och cellerna kan sedan spåras med hjälp av ImageJ för att analysera hur uttrycket av dessa proteiner påverkar flyttande fenotypen av celler. En annan framtida användning är enda cell spårning av celler som uttrycker nukleära fluorescerande proteiner. Ännu viktigare, dot analysen kan utföras i plattor med flera och är sådana passar medium till hög genomströmning imaging, gör det en lättillgänglig och mycket prisvärd verktyg att skärmen effekten av droger eller shRNAs på ark migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Författaren vill tacka Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo, och Carole Parent för att läsa och kommentera manuskriptet. Detta arbete stöds av intramurala forskningsprogrammet av National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
