Summary
Hücre göç geliştirme, doku bakım ve onarım ve tumorigenesis için çok önemlidir ve büyüme faktörleri, kemokinler ve sitokinler tarafından düzenlenmiştir. Bu iletişim kuralı nokta yöntemi, ekli, uyumlu cep yaprak yanıt microenvironmental ipuçlarını göçmen fenotip değerlendirmek için bir iki boyutlu, serbest geçiş tahlil açıklar.
Abstract
Karmaşık organizmalara statik görünse de, onların dokular altında sürekli cirosu vardır. Yaş hücreleri ölür ve vardır yeni hücreleri tarafından yerine hücreleri doku içinde sıkıca orkestra bir şekilde hareket. Tümör gelişimi sırasında bu denge bozulmuştur ve tümör hücreleri epitel yerel microenvironment, uzak siteler için seyahat etmek ve sonuçta uzak sitelerdeki metastatik tümörler oluşturmak için istila kökenli bırakın. Nokta tahlil bir boş hücre alana hücre yaprak hareket net değerlendirmek ve parametreleri hızlandırılmış Imaging'i kullanma hücre göç çözümlemek için bir basit, iki boyutlu Kısıtlamasız geçiş tahlil olduğunu. Burada, nokta tahlil epidermal büyüme Malign meme kanseri hücrelerinin potansiyelini artırmak için bilinen faktörü (EGF), hücre göç yanıt çözümlenecek bir insan invaziv, meme kanseri hücre kültürünü, MCF10CA1a, şekillendirme akciğer koloni kullanarak gösterilmiştir ve hücre göç fenotip değiştirmek için.
Introduction
Geçiş deneyleri yaygın olarak tümör hücreleri vitroinvaziv ve metastatik potansiyeli değerlendirmek için kullanılır. En sık, yara veya karalama tahlil epitel sayfaları geçiş bir hücre seçili alan1,2,3içine değerlendirmek için kullanılır. Kazı-kazan tahlil gerçekleştirmek için hücre monolayer kaplama ve bir "scratch" veya boş hücre alan bir pipet ucu ile oluşturulur. Kazı-kazan tahlil yaygın olarak bulunan doku kültürü malzemeleri ile kurmak kolaydır ve çok iyi Kaplamalar, birden fazla örnekleri işleme için izin, gerçekleştirilebilir. Ancak, sıfırdan yapılmış gibi hücreleri monolayer fiziksel olarak kaldırılır ve sık sık hücre ölümü tabi. Ayrıca, hücre dışı matriks plakasına bağlı kez tırmalamak işlemi sırasında hasar görmüş. Benzer şekilde, silikon kullanımı ekler (Ibidi odaları4gibi) veya şablonlar5,6,7 hücrelerin mekanik bozulma ve kaplama için kullanılan matris proteinlerin kısmi kaldırma yol açabilir tabaklar. Yara ya da çizik kapatılması izleme deneyleri bir diğer dezavantajı kendi sınırlı bir süre ders gibidir çizik kapatılana kadar hücre göç sadece analiz edilebilir.
Nokta tahlil gerçekleştirmek için hücreleri üzerine kaplamalı veya kaplamasız levha8dairesel bir koloni olarak kaplama. Bu kaplama strateji için gerekçe göç veya boş hücre çevresinde kültür hücreleri veya ekler kaldırılmasını tarafından rahatsız etmeden istila tanımlı kenarları hücre yaprak elde etmektir. Nokta tahlil genel amacı geçiş kenar yer değiştirme veya daha yüksek spatio-zamansal çözünürlük hücrelerinin göçmen fenotip çözümlemek için hızlandırılmış görüntüleme için farklı koloni çapı, de tarafından ölçülen hücre yaprak gözlemlemektir.
Hücre göç microenvironmental yardımlar kemokinler, sitokinler ve büyüme faktörleri gibi EGF gibi çeşitli tarafından etkilenebilir. EGF üzerinden bağlayıcı için onun reseptör, EGF reseptör9, biyolojik etkileri giderek artan ve invaziv ve metastatik tümör hücreleri4,9,10davranışını artan bir büyüme faktörüdür. Burada, nokta tahlil incelemek için kullanılır EGF uyarılmış bir insan invaziv, akciğer kolonisi meme kanseri hücre satırı (MCF10CA1a)8,11,12oluşturan hücre göç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kaplama yemekleri (1 gün)
Not: parmak izi ya da kir Kalenin dibinde bu işlerken bırakmamaya dikkat edin.
- Fare kollajen IV buz çözme ve 3 mL 10 µg/mL kollajen IV çözeltisi hazırlamak için 50 mM HCl (pH 1.3) ile sulandırmak.
Not: Kollajen 37 ° C'de çökelti Bu nedenle kollajen çözüm ise çözülme ve bu modülle çalışmanın bir düşük sıcaklıkta tutmak önemlidir. Uygun büyüklükteki aliquots hazırlayarak tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek ve onları-80 ° C'de depolama - 12-şey cam alt plakanın her şey için 250 µL kollajen IV çözüm ekleyin ve uygun ölçekli, kapanış sıkı bir plastik kutuya koyun. Islak kağıt havlu üzerinde ve çevresinde plakaları nemli bir odası imalatı ve kutusunu kapatmak yerleştirin. Gecede, oda sıcaklığında plakaları kuluçkaya.
Not: olarak sadece büyüme alanı kaplı olması gerekiyor, bu yalnızca alt plaka kollajen çözüm ile bağlı olduğu kapak notu karşılamak için yeterli olur ( şekil 1A, B bir şematik plaka için bakınız). - Ertesi sabah, iki kez absorbe olmayan kollajen ve tampon kaldırmak için deiyonize H2O ile plakalar durulayın. Su iyi değil (su sıçrama bu alana pipetted ise) plaka alt ve coverslip tarafından kurulmuş kenarına plaka kenarına doğrudan. Tabakalar laminar akış başlıklı kuruması. Tabak hemen kullanın veya 4 ° C'de 5 güne kadar saklayın.
Not: Farklı kaplama, fibronektin veya kollajen gibi ben farklı hücre hatları gerektirebilir.
2. nokta tahlil (2 gün) kaplama
-
Hücre süspansiyon hazırlama
- Hücre süspansiyon hazırlamak için 60 mm doku kültürü çanak ile % 5 at serum % 80 izdiham için takıma DMEM/F12 orta artış var hücreleri kullanın.
- Kalsiyum ve magnezyum ücretsiz Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) içeren hücreleri bir kez durulama, 500 µL tripsin-EDTA (oda sıcaklığında) ekleyin ve 3-5 dk 37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfere bir kuluçka için hücreleri kuluçkaya.
- 4.5 mL kültür tripsin etkinliğini durdurur ve bir 20 Say için orta müstakil hücrelerde askıya µL aliquot bir hemasitometre hücre süspansiyon.
- Tarafından Santrifüjü 200 x g 3 dk de 15 mL konik tüp içinde kalan hücreleri cips, süpernatant Aspire edin ve kültür orta 3 x 106 hücre/mL olarak hücrelerde resuspend.
Not: diğer kaplama Substratları ve/veya hücre satırları için optimum hücre yoğunluğu seyreltme serideki oluşturulmalıdır. 3 x 106 hücre/mL başlangıç noktası olarak önerilir.
-
Kaplama hücreleri
- Yer hücre süspansiyon kollajen IV her kapak kayma ortasındaki bir 10 µL damla 12-şey cam alt plaka dokunmadan veya kaplama (şekil 1A, B) tırmalamak kaplı. 30 dk 37 ° c, oksijen atmosfere hücreleri eklemek izin vermek için plaka kuluçkaya. Bir ters mikroskobu hücreleri bağlı olduğu kontrol edin.
Not: Bu en iyi damla, kenarında nerede bir monolayer oluşumu (şekil 1C) gözlenen görülebilir. Gerekirse, plaka kadar kuluçkaya 3 h. damla hızlı bir şekilde kuru olabilir gibi nem kuluçka kadar yüksek olduğunu emin olun. Damla birimin bir azalma bu adımı sırasında gözlenen, PBS nem oranı artırmak için kuyu arasında boşluk ekleyin. - Yavaşça wells kültür iki kez ekli olmayan hücreleri kaldırmak için orta 1 mL ile yıkayın. 1 mL kültür orta her şey için ekleyin. Bir ters mikroskobu kontrol kayan hiçbir hücre kalır, aksi takdirde kuyuları tekrar yıka. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer iyi tanımlanmış hücre yaprak elde etmek için hücreleri kuluçkaya.
Not: Yüzen hücreleri yeniden plakasına eklemek ve istenmeyen hücre kolonileri kurmaya muhtemeldir.
- Yer hücre süspansiyon kollajen IV her kapak kayma ortasındaki bir 10 µL damla 12-şey cam alt plaka dokunmadan veya kaplama (şekil 1A, B) tırmalamak kaplı. 30 dk 37 ° c, oksijen atmosfere hücreleri eklemek izin vermek için plaka kuluçkaya. Bir ters mikroskobu hücreleri bağlı olduğu kontrol edin.
3. uyarıcı hücreleri (3. gün)
- Bütün wells kolonileri düzgün büyüdü o hücreye sağlamak için ters bir mikroskop kullanarak kontrol edin. Gerekirse, uygun olmayan wells işaretlemek ve bunları kullanmayın.
- Her şey uygun bir şekilde araştırıldı her koşul için plaka etiketleyin. Her koşul yinelenen veya nüsha çalıştırın.
- DMEM/F12 %0,1 at serum (Aç orta) içeren hücrelerde açlıktan için orta değiştirmek 3 h önce hücreleri uyarılır.
- Hücreleri EGF (5 ng/mL nihai toplama) eklenmesi veya istenilen başka arabulucu tarafından teşvik ve karışımı yavaşça 1 mL micropipettor kullanarak orta veya plaka dönen tarafından.
- Plaka kenar deplasman ve kenar kontur 4.1 bölümünde açıklandığı gibi gözlemlemek 1-4 gün kuluçkaya veya 4.2 bölümünde açıklandığı gibi hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirmek.
4. hücre kolonileri ve hücre göç görselleştirme
-
Hematoksilen-koloni büyüme (4-7 gün) ölçmek için boyama Eozin (o)
- % 70 etanol (1 mL/de) ~ 2 min için hücrelerde düzeltmek.
- Çekirdeklerin Hematoksilen (1 mL/de), ~ 2 dk ile leke.
- Musluk suyu (1 mL/de) çekirdeği kadar yıkama hücrelerle mavi, 5-10 dak.
- Sitoplazma Eozin (1 mL/de), ~ 2 dk ile leke.
- Deiyonize su (1 mL/de) ile durulayın.
Not: Hematoksilen Eozin çözümler toplanan ve boyama zayıf hale gelinceye kadar birden çok kez kullanılan. - Plaka kuruması.
- Plaka çevirmek ve bir cetvel ile nokta çapı ölçmek. Alternatif olarak, Resimler plaka kamera ile fotoğraf çekip ImageJ nokta çapı analiz.
-
Hızlandırılmış mikroskobu (3. gün)
- Kuluçka makinesi mikroskobunun geçin ve 37 ° c sıcaklık ayarlama Nemlendirici dH2O. küçültme/büyütme CO%2 5 ile doldurun. Kuluçka odası nemlendirilmelidir ve motorlu sahne özgürce hareket edebilirsiniz olun. Kuluçka odası kapatın ve 37 ° C'ye ayarlamak mikroskop izin
Not: Mikroskop (malzemeleri tablo görmek) kullanılan hücreleri odak sürüklenen önlemek için yansıma önce burada 37 ° c en az 3 h için ısıtmalı olabilir. - Plaka kuluçka mikroskop sahnesinde yerini ve sahne liste oluşturma. Görüntü iki karşıt kenarları ve her hücre nokta (şekil 1A) merkezi.
- Görüntüler her 3 dk, 15-24 h 10 X amacı istimal için tutar. Veri indirme ve görüntü analizi tercih, bir programda devam örneğin, ImageJ veya Matlab.
- Kuluçka makinesi mikroskobunun geçin ve 37 ° c sıcaklık ayarlama Nemlendirici dH2O. küçültme/büyütme CO%2 5 ile doldurun. Kuluçka odası nemlendirilmelidir ve motorlu sahne özgürce hareket edebilirsiniz olun. Kuluçka odası kapatın ve 37 ° C'ye ayarlamak mikroskop izin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan (şekil 1) nokta tahlil invaziv, kullanarak gerçekleştirilen bir modeli sistem olarak meme kanseri hücreleri (MCF10CA1a) oluşturan akciğer koloni. Yeni başlayanlar, yapım o a uygun elinde bile son derece tekrarlanabilir hücre nokta nokta tahlil verimleri ve tahlil (şekil 1D) yürütmek kolay. O boyama veya hızlandırılmış görüntüleme nokta tahlil Birleşik ve sonraki partikül imaj velosimetri (PIV) deplasman epitel kenarları, hücre hızı ve hücre yön hücreler kenarlı olarak dahil olmak üzere çeşitli geçiş parametreleri çalışma sağlar epitel bir levha bir boş hücre alanına geçirin. Başlangıçta, faz kontrast görüntüleme hücre nokta invaziv, akciğer koloni oluşturan meme kanseri hücreleri (MCF10CA1a) Mezenkimal fenotip stimülasyon ile EGF sonra korumak olduğunu ortaya koydu. Ancak, tek hücreleri sayfa bırakarak EGF uyarılmış hücre noktalar (Şekil 2, oklar) daha sık gözlenir. MCF10CA1a hücreleri cevaben EGF daha da o tarafından değerlendirildi EGF ile 4 gün için teşvik kültürlerin boyama. Nitekim, EGF-stimülasyon bir artan koloni çapı (şekil 3) sonuçlandı. Bu gözlemler o geçiş gösterir EGF teşvik hücreleri değişmiş olabilir.
Bu nedenle, nokta tahlil sonraki dinamik geçiş fenotip MCF10CA1a hücre yaprak daha ayrıntılı bir analizini gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Hücreleri yaprak kenarlarında 9 h EGF (Video 1 ve Video 2) içeren hücrelerin uyarılması takip için görüntüsü ve görüntüleri daha sonra Matlab4,13,14' te PIV tarafından analiz edildi. PIV EGF hücre hızı (şekil 4A) 0,63 µm/dak için kontrol hücreleri 0,45 µm/dk dan çıkar ortaya. Aynı zamanda yön hücre EGF artmış ve bu bir azalma 0,79 EGF uyarılmış kültürlerde (şekil 4B) için hücre yön (açısal yaymak) üzerinden kontrol kültürde 0,95 değişkenliği tarafından belirtilir. EGF epitel kenar 356 µm (şekil 4), 257 µm üzerinde 9 h Radyal deplasman da o dört gün sonra (şekil 3) Boyama tarafından gözlendi olarak arttı. Böylece, öyle ki hücre hız ve yön arttı, EGF MCF10CA1a hücreleri yaprak kenarlarında geçiş bir artan koloni RADIUS kaynaklanan değiştirir ki farklı sonraki deneyleri ile birlikte nokta tahlil kullanımını göstermektedir.
Şekil 1: Nokta tahlil Imaging. (A, B) Hücrelerin ortasındaki cam alt plaka Wells döngüsel bir koloni olarak kaplama. Geçiş analizi için görüntüleri ortasına koloni(a)yanı sıra iki karşıt kenarları alınır. (C) karanlık alan görüntü hücre nokta (solda) kaplama sırasında ve daha yüksek büyütme (Faz kontrast) kenarına açılan ve hücre nokta kenarına sonra plaka (Merkezi) bağlı hücreleri gösteren. Ekli hücreleri düz ve poligonal, ekli olmayan hücreleri (sağda) yuvarlak iken. (D) Nokta çapını son derece tekrarlanabilir. Noktalar kaplama hemen sonra ve önce hücreleri teşvik ve çapı ImageJ kullanarak kararlı görüntüsü. Nokta boyutu farklı kullanıcılar arasında bir deney içinde de son derece tekrarlanabilir ve küçük eğitim hücre noktalar kaplama yeterlik kazanmak için gerekli (E = 10 yıldan fazla deneyimi doku kültürü, ben doku c deneyimi az 4 hafta = ulture). n grup başına 12 nokta =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: EGF modüle MCF10CA1a hücre morfolojik fenotip. MCF10CA1a hücrelerin 3 h DMEM/F12 EGF ile uyarılan önce %0,1 at serum ile takviye için aç (5 ng/mL). EGF uyarılmış kolonileri kenarında tek hücreleri (oklar) sayfası dışında geçirmek eğilimindedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : EGF artırır hücre kolonileri net büyüme. MCF10CA1a hücrelerin EGF ile uyarılan önce %0,1 at serum ile desteklenmiş DMEM/F12 orta 3 h için aç (5 ng/mL). 4 gün sonra sabit ve Hematoksilen ve Eozin ile lekeli etanol hücreleri vardı. EGF uyarılmış nokta 4 gün sonra daha yüksek bir çapa sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : EGF MCF10CA1a hücre göç fenotip modüle. MCF10CA1a hücrelerin EGF ile uyarılan önce %0,1 at serum ile desteklenmiş DMEM/F12 orta 3 h için aç (5 ng/mL). 9 h. sonraki partikül imaj velosimetri analiz Matlab13' te gerçekleştirilen için hücreleri her 3 dakikada görüntüsü. Hız değerleri ortalama hızı her alan için zamanla temsil eder. Açısal hız vektörel çizimler yayılmasını olarak hesaplanmıştır:
nerede 
ve aralıkları (yüksek yön) 0 
(düşük yön). Açısal yayılmış bir düşüş bir artış içinde yön olarak kabul edilir. Radyal deplasman koloni RADIUS t çıkarılarak hesaplanan t koloni RADIUS üzerinden 0 h = 9 h. EGF-stimülasyon hücre noktalar artan hücre hızı (A; doğru üst kapı) sonuçlandı, açısal yayılmış azalmıştır veya artmış yön (B; orta MCF10CA1a = paneli) ve artan koloni RADIUS (C; alt paneli). Verileri temsil eden ortalama ± SEM n = 3 deneyler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1: Unstimulated MCF10CA1a hücre zaman hata görüntüleme. Görüntüler her 3 dakikada 9 h. için lütfen bu videoyu izlemek için buraya tıklayın alınmıştır. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2: Hızlandırılmış MCF10CA1a hücrelerinin Imaging EGF ile uyarılmış (5 ng/mL). Görüntüler her 3 dakikada 9 h. için lütfen bu videoyu izlemek için buraya tıklayın alınmıştır. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uzak doku çevreleyen doku istila ve uzak siteleri15' e metastaz kökenli tümör ilerleme hücreleri sırasında geçirilir. Geçiş hücre hücre koloni uzak nokta assay olarak görülebilir. Burada, nokta tahlil insan meme kanseri hücrelerinin yanıt EGF olarak göçmen fenotip analiz ederek gösterilmektedir.
Nokta up birkaç adımda doğru ve yinelenebilir sonuçları elde etmek için deneyleri kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kaplama plaka olmadığını ve güçlü hücreleri plakasına uygun nasıl ve hücreleri geçirirseniz belirler. Kollajen IV veya diğer hücre dışı matriks ile plaka kaplama deneysel değişkenlik en aza indirmek için homojen özen gösterilmelidir. Ayrıca, bu soruşturma hücreleri ekleyin ve kaplamalı plaka üzerinde göç ve çeşitli konsantrasyonlarda farklı matrisler ile birden fazla deneyler kaplama koşullar için seçilen hücre kültürünü en iyi duruma getirmek gerekli olabilir sağlanması gerekir. İkinci olarak, hücrelerin doğru kaplama tekrarlanabilirlik için çok önemlidir. Hücre açılan ayak izi şeklini yanı sıra cep nokta boyutunu belirler. İdeal olarak, açılan yüzeylere pipet ucu yerleştirilir. Damla şeklinde çoğunlukla yüzey gerilimi tekrarlanabilir çapı dairesel bir ayak izi kaynaklanan plaka yüzeyi tarafından belirlenir. Sonuç olarak, hücre nokta çapı kaplama hücre süspansiyon hacmi değiştirerek değiştirilebilir.
Böylece, nokta tahlil yaparken olması göz önüne almanız gereken birkaç nokta vardır. İlk olarak, hücre süspansiyon hücre yoğunluğu kaplama yanı sıra kullanılan hücre tipi ayarlanması gerekiyor. Genel olarak, damla daha geniş yayılırsa, daha yüksek hücre yoğunluğu Konfluent monolayers plaka hücrelere ihtiyaç vardır. Ayrıca, daha fazla hücre hücreleri küçük ve büyük, Yayilim hücrelere kıyasla ne kadar yaymamak Konfluent monolayer elde etmek için kaplama gerekiyor. İkinci olarak, nokta tahlil farklı plaka biçimlerine kabul edilebilir ve bunun için nokta boyutu kaplama nokta hacmi azaltarak daha küçük kuyu için adapte edilebilir ve istenirse, daha büyük nokta, daha yüksek damla birimi kullanarak kaplama. Üçüncü olarak, bazı hücre hatları plaka 30 dk içinde bu durumda kaplama zaman bağlanacağı değil en fazla 3 saat genişletilebilir. Benzer şekilde, kaplama plaka hücreler geçiş etkin için uygun olmalı ve kaplama hücreleri kaplama zaman değil çizmemeye özen gösterilmelidir. Hücreleri değil iliştirin veya seçilen matrisin üzerinde göç, kaplama, örneğin kollajen 1 veya fibronektin, diğer tür düzenlemelidir veya matris proteinler, kuluçka süreleri ve kuluçka sıcaklıklar konsantrasyonları plakaların kaplama sırasında değişti. Belirli hücre hatları için uygun hücre dışı matriks literatürde bulunabilir.
Nokta tahlil bazı sınırlamalar vardır. Bu iki boyutlu geçiş tahlil ve bir dezavantaj vardır, ancak, üç boyutlu deneyleri için daha fazla karşılaştırıldığında böylece bu kabul edilebilir iki boyutlu deneyleri yapmak zor. Büyük bir sorun belki de hücre çoğalması sonucu, özellikle hızlı Proliferasyona hücre satırları kullanılır ve hücre geçiş burada koloni çapı analiz için 4 gün sonra olduğu gibi uzun süreler boyunca değerlendirildi etkileyebilir var. Benzer şekilde, kazı-kazan deneyleri yara yara kapatma hücre çoğalması hücre sayfası içinde etkilenir; ve özellikle serum veya hücre proliferations neden diğer arabulucu bir chemoattractant kullanılırsa Boyden odası deneyleri, artan hücre çoğalması alt Kamara içinde sonuçları çarpık. Tek hücre izleme özellikle hareketi olmayan Proliferasyona hücre gözlemlemek için kullanılabilir. Ayrıca, hücre çoğalması burada bitmiş gibi (i) serum açlık ve/veya (II) mitoz inhibisyonu yoluyla mitomycin veya diğer nükleer silahların yayılmasına karşı inhibitörleri4,16eklenmesi tarafından azaltılabilir. Hücre çoğalması azaltmak için ancak, zarar için artık geçirebilirsiniz bir ölçüde hücrelere özen göstermelidir. İlginçtir ki, biz benzer bir Kısıtlamasız geçişinde bulundu geçiş4,5sırasında, epitel sayfası bütünlüğünü korumada söz konusu olsa da hücre çoğalması kenar öteleme ile ilişkili değil tahlil 17. Bu ilginç bir soru açar: hücre çoğalması geçiş bir hücre levha, gerekli bir bileşenidir. Bu sayfanın sonunda artık genişletin ve geçiş hücreleri desteklemek mümkün olacak gibi nükleer silahların yayılmasına karşı tamamen bloke edilirse güçlü hücre-hücre yapışıklıklar sayfalarıyla hücre göç içine çevreye olumsuz etkilenecektir bekleniyor. Bu noktada, yavaş veya stop geçiş hücreleri gerekir veya sayfayı bozacaktır. Bunun tersi olarak, düşük hücre-hücre yapışıklıklar sayfalarıyla geçiş hücreleri epitel sayfasının kenarında saçılma gibi bağımsız olarak, geçirilecek sayfası bırakabilirsiniz daha az etkilenen olabilir. Böylece, hücre göç ve Hücre proliferasyonu birbirine bağlı ve çalışma sayfası geçiş hücre çoğalması engelleme girişimleri dikkatle düşünülmesi gerekiyor. Böylece, sayfa geçişi analiz deneyleri çoğunlukla azaltır ancak hücre göç kaldırılması değil serum açlık altında gerçekleştirilir.
Sayfa geçiş iki boyutlu yüzeyler üzerinde çalışmaya diğer geçiş deneyleri çizik veya yara tahlil ve, daha fazla son zamanlarda, silikon veya PDMS Odalar ve kaplama hücre tanımlanmış alanlarda sağlayan şablonlar kullanarak serbest geçiş deneyleri içerir ve hücreleri odası ya da kalıp1,3,4,5,6,7,16çıkarıldıktan sonra serbest geçiş boş hücre alana. Nesnenin şeklini ve boyutunu koloninin hücre kaplama belirler gibi bu ikinci deneyleri ve nokta tahlil yanı sıra unexperienced deneyimli kullanıcıların elinde yüksek tekrarlanabilirlik sunuyoruz. Buna ek olarak, kazı-kazan deneyleri hücresel monolayer in tırmalamak pratik gerektirir ve sıkı monolayers formu hücre hatları kullandıysanız bile uzmanlar parçaları kağıdın elinde yanlışlıkla kandırıldım olmak. Her ne kadar biz hatalı hücre yaprak Ibidi chambers çıkarıldıktan sonra yaralama gözlenen silikon odaları veya şablonlar hücreleri, kaplama için kullanıldığında bu sorun artırıldı. Hücreleri bir koloni kaplama olarak serbestçe büyümeye izin nokta tahlil bu sorunu önler. Aynı nedenlerle, nokta tahlil Ayrıca hücrelere kolayca çizilmemesi veya odası/şablon içinde diğer geçiş deneyleri kaldırma tarafından rahatsız değiştirilmemiş kaplama geçiş sağlar. Ayrıca, hücreleri çizilmemesi veya odaları/şablonlar, kaldırılması tarafından yaralı değil ölüm hücre ve sitokinler odaları/şablonların kaldırılması ile ilişkili ilişkili sürümü nokta tahlil geçişinde üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Son olarak, sık sık sıfırdan deneyleri ve deneyleri odaları veya şablonlar kullanarak aşırı kaplama hücrelerdir. Böylece, hücreleri onları kapalı tırmalama veya hücre geçiş engel fiziksel engellerin kaldırılması takas, hücre monolayer sakin olur ve hücre itti sonra etkin olarak geçirmeden boş hücre alana yayılıyor. Buna ek olarak, nokta assay olarak, hücre sayfaları kendileri gecede önce göç görülmektedir ve gevşeme hücre sayfasının yerine hücre göç gözlenen kurabilirsiniz.
Kolayca herhangi bir özel ekipman yapılabilir, nokta tahlil ödünç vermek kendisi sonraki deneyleri, brüt koloni morfolojisi ve hücre saçılma8, immunostaining8, hızlandırılmış değerlendirmek için hücreleri boyama da dahil olmak üzere bir dizi için görüntü ve sonraki veri analizi ImageJ, Matlab veya diğer görüntü analiz yazılımı13. Korelasyon komşu vektörlerin veya onların ayrılık yörüngeleri daha kesin olarak tespit edilebilir gibi ek parametreler yaprak13içinde hücre hareket tutarlılık açıklar. Hızlandırılmış görüntüleme da immunostaining ile kombine edilebilir ve ImageJ hücre izleme hücre göç daha fazla anlayış kazanmak için desteklenir. Örneğin, nokta immunostained hücre iskeleti proteinleri için hızlandırılmış görüntüleme sonra olabilir ve hücreleri sonra nasıl etkilediği ifade bu proteinlerin hücre göç fenotip analiz etmek için ImageJ kullanılarak izlenebilir. Başka bir gelecek nükleer floresan proteinler hızlı hücreleri tek hücre izleme kullanılır. Önemlisi, nokta tahlil çok iyi levha gerçekleştirilebilir ve bu böyle uygun orta yüksek üretilen iş için Imaging, uyuşturucu veya shRNAs etkisi sayfası geçiş ekran için kolayca erişilebilir ve çok uygun bir araç yapma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.
Acknowledgments
Yazar Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo ve Carole üst okuma ve el yazması üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyor. Bu eser Ulusal Kanser Enstitüsü Intramural araştırma programı tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
