Summary
이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.
Abstract
남성에서 meiotic 진행 높은 규제 셀룰러 이벤트 수의 공동된 작업을 필요로 하는 프로세스입니다. 감수 분열 중 발생 하는 오류는 불 임, 임신 손실 또는 유전자 결함이 발생할 수 있습니다. 사춘기와 성인 기 통해 계속의 개시에 개시, spermatocytes의 연속 반동기 파도 spermatogenesis 받아야 하 고 궁극적으로 단일 정자를 형성 한다. 마우스 spermatocytes meiotic 개시 진행의 첫 번째 파도 (10 dpp) 산 10 일 후에 나타납니다 하 고 35 dpp에서 성숙한 정자로 seminiferous tubules의 루멘으로 해제 됩니다. 따라서, 그것은 관심의 매우 풍부한 인구를 얻기 위하여이 발달 시간 창 내에서 마우스를 이용 하입니다. 희귀 세포 단계의 분석 이전 마우스는 tubules 내 세포 인구의 다양성을 증가 하는 연속 spermatogenic 파도의 기여 금 때문에 더 어렵습니다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogonia, spermatocytes, 및 spermatids를 포함 하 여 쥐의 seminiferous tubules 내 세포의 cytological 평가 위한 쉽게 구현 된 기술입니다. 관 스쿼시 기술 격리 된 남성 생식 세포의 무결성을 유지 하 고 세포 구조를 다른 기술로 쉽게 시각화 하지의 시험 있습니다. 설명 하기 위해이 관 스쿼시 기술의 가능한 애플 리 케이 션, 스핀 들 어셈블리 spermatocytes 내가 전환 분열에 의향을 통해 진행 (g 2/미 전환) 모니터링 했다. 또한, centrosome 중복, meiotic 섹스 염색체 비활성화 (MSCI), 및 염색체 꽃다발 형성이 관 스쿼시 메서드를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 cytological 구조의 사례로 평가 됐다. 이 기술은 spermatogenesis 동안 돌연변이 또는 외 인 섭 동에 의해 발생 하는 특정 결함을 정확 하 게 사용할 수 있습니다 따라서, 우리의 분자 spermatogenesis 이해에 기여.
Introduction
감수 분열은 DNA 복제의 단일 라운드 세포 분열의 2 연속 라운드 뒤 복잡 한 세포 이벤트입니다. 여러 감수 분열-특정 이벤트는 정확한 염색체 분리 되도록 감수 분열의 초기 단계에서 조정 해야 합니다. 이러한 이벤트 등 동종 재결합, 자매의 공동 방향의 완료 첫번째 meiotic 사단 그리고 homologs 사이 chiasmata 해결 하려면 cohesin 복합물의 stepwise 손실 동안 kinetochores. 이러한 프로세스의 정확한 규정은 비 옥도 유지 하 고 유전 발달 장애 및 자연 유산1발생할 수 있습니다 염색체 missegregation 이벤트를 방지 하기 위해 필요 합니다.
감수 분열의 주요 이벤트는 남성과 여성 모두에서 자리를 차지할 하는 동안 중요 한 시간적 및 기계적 차이 spermatogenesis 및 oogenesis2사이 존재 한다. 예를 들어 여성 감수 분열, 의향 배아 개발 하는 동안 발생 하 고 dictyate 단계에서 사춘기까지 체포 중 반면, spermatogenesis 사춘기와 체포 하지 않고 성인 생활 내내 파도에 진행 개시. 남성과 여성의 감수 분열의 차이 특히 spermatocytes에 oocytes 이러한 프로세스 평가 쪽으로 음식을 장만 하는 방법을 개발 하는 필요를 강조 한다. 현재, chromatin 스프레드3,,45의 사용에 의존 meiotic 진행을 주로 평가 합니다. Chromatin 스프레드 meiotic 염색체를 공부 하는 데 유용 동안, 그들은 세포 구조 스핀 들 microtubules, centrosomes, 핵 봉투, telomere 첨부 파일 등의 평가 방지 하는 세포 무결성을 유지 하 실패. 라이브 이미징 및 장기 자란 기술을 크게 고급 여성 감수 분열;에 대 한 우리의 이해 그러나 전체 그대로 셀 시각화를 유사한 방법, 자주 spermatogenesis6,7의 연구에 대 한 구현 됩니다. 남성 감수 분열을 통해 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 우리 빠르게 마우스 spermatocytes8,9개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해 설립 된 관 스쿼시 기술을 적응 시켰다. 여기 설명 하는 방법을 spermatogenesis의 다른 단계 동안 여러 세포 구조의 연구를 활성화 하는 세포의 무결성을 유지 합니다.
이 관 스쿼시 기술은 면역 형광 현미경을 통해 세포 구조의 평가 대 한 허용 하는 전체 셀 접근 이다. Haematoxylin 오신 파라핀 포함 testes, 및 cryosections의 immunofluorescent 라벨의 얼룩 등 남성 쥐에서 meiotic 진행을 시각화 하기 위해 일반적인 조직학 접근 허용 meiotic 진행에 대 한 광범위 한 개요. 그러나, 이러한 기술을 감수 분열10,11에 걸쳐 발생 하는 이벤트의 자세한 분석을 위해 필요한 범위 내에 단일 셀을 해결 하기 위해 실패 합니다. 대체 기술을 meiotic 프로세스를 시각화 하는 격리 하 고 수정 핵 자료3,,45spermatocyte 중요 한 chemiosmotic 중단에 의존 합니다. 이러한 화학 치료 기본 spermatocytes 다른 세포 유형의 관찰을 방해. Namekawa에 의해 최근에 설명된 방법 격리 spermatocytes의 핵 건축을 보존 하기 위해 연구 커뮤니티 활성화 하지만 cytospin 및 일부 실험실4쉽게 사용할 수 없을 수 있는 액세서리를 사용 해야 합니다. 대조적으로, 관 스쿼시 기술에는 대부분 세포 생물학 실험실에서 일반적으로 표준 장비를 필요 합니다.
여기 설명 하는 관 스쿼시 방법은 시각화 sertoli 세포, 등 spermatogonia, 기본 및 보조 spermatocytes spermatids seminiferous 관 내의 다양 한 셀 형식에 사용할 수 있습니다. 여 청소년 쥐에서 spermatogenesis 근처 동기 첫 번째 물결에이 기술을 결합해, 그들은 감수 분열12진행 spermatogenic 세포의 풍부한 인구를 가능 하다. 이 프로세스는 spermatogenesis 초기 의향 이벤트 등을 통해 프로세스의 상세한 분석, g 2/미와 분열 anaphase 전환 및 spermiogenesis를 허용합니다. 또한, 관 스쿼시 준비 시각화 염색체 (예: interchromatid 도메인 (Icd) 및 kinetochores)와 centrosomes (centrioles 및 pericentriolar 재료/행렬)의 cytological 기능을 사용할 수 있습니다. 스쿼시 메서드 chromatin 확산과 단백질 추출 등 다른 실험 방법 동시에 손쉽게 수행할 수 있습니다. 또한,이 기술은 성공적으로 수정 되었습니다 직접 시각화13슬라이드에 생활 spermatogenic 셀을 입금.
여기 설명 하는 방법을 야생-타입 C57BL/6J 마우스에서 g 2/미 전환 분석 전체 셀 seminiferous 관 스쿼시 기술을 포함 한다. 첫 번째 meiotic 부문 입력 기본 spermatocytes의 cytological 기능 관찰 meiotic 스핀 들에 면역 형광 검사 현미경 검사 법으로 시각화 했다. 이 다재 다능 한 기술은 다른 meiotic 단계와 다른 세포 유형 시각화를 쉽게 수정할 수 있습니다. 기술은 의무가 DNA와 RNA 물고기 접근 등 대체 시각화 전략 이기도합니다.
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Protocol
마우스를 사용 하 여 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었다. 실험 청소년 (20-26 일 산 후, dpp)에서 수행한 C57BL/6J 마우스, spermatogenesis 반동기 첫 번째 물결의 활용. 그러나,이 기술은 또한 수행할 수 있습니다 성인 쥐를 사용 하 여.
1. 해 부 및 마우스 seminiferous tubules의 절연
- 수정/세포 솔루션 및 항 체 희석 버퍼 (ADB) 표 1 및 표 2에 설명 된 준비.
- 버퍼링 하는 인산 염 (1 x PBS, pH 7.4), x 1의 3 mL와 함께 한 35 mm 페 트리 접시와 마우스 당 수정/세포 솔루션의 2 mL와 함께 또 다른 35 m m 접시를 준비 합니다.
- 자 궁 경관 탈 구 또는 CO2 질을 통해 마우스를 희생 하 고 70% 에탄올과 복 부 복 부를 스프레이. 살 균가 위, V 자형 오프닝 만들기를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. Testes, 집게를 사용 하 여 epididymal 지방 패드를 제거 그리고 tunica albuginea방해 하지 마십시오. 1 x PBS를 포함 하는 35 mm 페 트리 접시에 testes를 놓습니다.
참고: 관심14의 풍부한 세포 인구를 관찰 하기 위해 spermatogenesis의 첫 번째 파도 이용 한다. Spermatogenesis의 특정 단계 다른 마우스 연령대 (표 3)에 농축 된다. - 날카로운 흘린된 집게와 조직 puncturing 의해 tunica albuginea 고환 제거 하 고 느슨한 seminiferous tubules를 수집. 새로운 35 mm 페 트리 접시 수정/세포 솔루션의 2 개 mL를 포함 하는 tubules를 전송 합니다.
- 실 온에서 5 분에 대 한 수정/세포 솔루션에서 tubules를 품 어.
2입니다. seminiferous tubules의 준비
- 액체 차단 펜으로 슬라이드의 가장자리를 표시 하 여 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드를 준비 합니다.
- 유리 슬라이드 중심에 수정/세포 솔루션의 100 µ L를 적용 됩니다.
- 소독 집게를 사용 하 여와 위를 부드럽게 떨어져 seminiferous tubules 애타게. 오래 개별 관 절단 길이 약 20 m m를 세그먼트화합니다.
참고: centrosomes와 같은 장기간된 통 노출에 민감한 구조를 시각화, 1 x PBS에는 tubules를 먼저 분리 후 직접 말하다 tubules의 표면에 폴 리 리 신 슬라이드 수정 세포 솔루션의 100 µ L에 코팅. - 수정/세포 솔루션을 포함 하는 준비 된 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 개의 20 밀리미터 긴 seminiferous 관 세그먼트를 전송 합니다.
- 1.5에서 3.0 m m 세그먼트로 살 균가 위 말하다 seminiferous tubules를 사용 하 여.
- 사용 하 여 살 균 겸 정렬할 관 세그먼트를 유리 슬라이드에 없습니다 조직을 중복, tubules는 균등 하 게 배포.
참고: 유리 슬라이드에 관 세그먼트의 최적의 번호 20와 40 사이입니다.
3. 부 수 seminiferous tubules의
- 분산된 seminiferous 관 세그먼트는 벤치탑에 포함 된 유리 슬라이드를 전송 합니다. 스쿼시 단계 조직 손실을 방지 하려면 실험실 지우기를 사용 하 여 과잉 액체를 제거 합니다.
- 유리 슬라이드 위에 coverslip (22 x 60-1.5 m m)를 적용 하 고 10-20 초에 대 한 손바닥의 발뒤꿈치와 압력을 적용. 그것은 seminiferous tubules에서 spermatocytes를 분산 하도록 충분 한 힘을 적용 해야 합니다.
참고: 해 부 현미경 사용 하 여 모든 관 세그먼트 중단은 퇴치 단계를 최적화 하는 tubules를 관찰 합니다. - 슬라이드 집게를 사용 하 여, 즉시 플래시 동결 액체 N2 의 작은 dewar의 유리 슬라이드 15 초, 또는 액체 거품 중단 될 때까지. Immunolabeling는 즉시, 직선 모서리 면도날으로 coverslip 제거, 좋은 팁 집게 또는 21-게이지 바늘.
참고: 최적의 결과 immunolabel에 대 한 즉시 슬라이드 (4 단계 참조). 그러나,이 시점에서 슬라이드 수 유지-80 ° C에서 최대 2 주 동안. 단백질 및 세포 구조물의 수명을 최대화 하기 위해 즉시 드라이 아이스 또는-80 ° C 냉장고에 슬라이드를 저장 하 고 슬라이드에는 coverslip 유지. Immunolabeling 슬라이드를 저장 하는 경우 단계 3.3에에서 설명 된 대로 15 초 동안 액체 N2 에서 슬라이드를 immersing 하 여는 coverslip을 제거 합니다.
4입니다. 마운트 seminiferous tubules의 Immunolabeling
- 공영 방송, 그리고 세 번 1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분 동안 세척 x 1에 슬라이드를 담가.
참고: 결코 허용 슬라이드 immunolabeling 동안 완전히 건조. - 1-2 h 습도 챔버에 차단 유리 슬라이드에 항 체 희석 버퍼의 1 mL를 적용 합니다.
- 항 체 희석 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 항 체 희석 버퍼 습도 챔버에에서 희석의 100 µ L를 적용.
참고: 최상의 결과 얻으려면 기본 항 체 4 ° c.에 하룻밤을 품 어 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예: 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다. 유효성을 검사 하 고 기본 항 체15최적화. - 1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분에 대 한 세 번 슬라이드를 씻어.
참고: 을 강화 하기 위해 세척 Coplin 단지 작은 자석 저 어 막대를 사용 하 여 선동 낮은 속도로 자기 저 어 접시에 장소 또는 낮은 속도로 탁상 믹서에 Coplin jar를 배치. - 실내 온도에 습도 챔버에 1 ~ 1.5 h에 대 한 항 체 희석 버퍼에 희석 이차 항 체의 100 µ L를 적용 합니다. 사진 fluorophore 활용 된 항 체의 표백 피하기 위해 어두운 상자에서 슬라이드를 품 어.
참고: 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예: 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다. - 1 x PBS를 포함 하는 50 mL Coplin jar에 5 분에 대 한 두 번 슬라이드를 씻어.
- 장착 매체 포함 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5 µ g/mL)에서 슬라이드를 탑재 하 고 coverslips (22 x 60-1.5 m m)를 적용 합니다.
- 슬라이드를 보존 하는 coverslips 이동에서 방지 투명 매니큐어와 슬라이드 coverslips 인감.
5. 분석 및 이미징 관 스쿼시 준비
- Epifluorescence 현미경을 사용 하 여 정확한 z 축 이동 하 고 이미지 캡처에 대 한 고해상도 카메라 자동 무대. 또는 사용 하는 레이저 confocal 현미경.
참고: 이 단계에 대 한 모든 사용 가능한 하드웨어와 소프트웨어를 사용 합니다. 예를 들어 그림 1 과 그림 2 에 표시 된 이미지를 자이 스 셀 관찰자 Z1 오카-플래시 4.0 CMOS 카메라에 연결 하 고 Zeiss 선 2012 블루 에디션 이미지 소프트웨어와 함께 분석을 사용 하 여 점령 했다. - 스쿼시 준비의 품질을 결정 하는 20 X 목표를 사용 하 여 슬라이드를 평가 합니다. 좋은 품질 슬라이드는 균등 하 게 배포 되는 핵의 단층.
참고: 슬라이드의 일부 섹션은 다른 사람 들 보다 더 있을 수 있습니다, 그리고 어디 슬라이드의 최고의 지역 높은 확대를 사용 하 여 추가 분석을 위해 찾을 수 있습니다의 좌표를 참고 것이 좋습니다. - 높은 확대 목표 (예: 63 X 또는 X 100), 핵의 일관 된 단층 되는 슬라이드의 캡처 영역을 사용 하 여. 영역 선택 위쪽을 설정 하 고 Z-스택 모든 초점에 빛을 캡처 되도록 낮은.
참고: Z-스택 위와 더 낮은 한계 사이 촬영의 최적의 수 이미지 수집 소프트웨어에 의해 일반적으로 지정 하 고 각 목표에 대 한 다른. - 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 컴파일하려면 깊이 확장된 초점 이미지. 소프트웨어 스택에서 각 Z-, 초점에 빛을 결합 하 고 관 스쿼시 준비의 최적의 이미징에 대 한 필수적입니다.
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Representative Results
여기, 우리가 분열 하는 의향을 겪고 일시적인 세포 인구를 시각화 하 관 스쿼시 메서드 사용 난 (G2/MI) 청소년 야생-타입 마우스 spermatogenesis (24의 첫번째 파를 겪고에서 testes를 수확 하 여 농축 된 전환 민 진 당)입니다. 그림 1 관 스쿼시 메서드를 사용 하 여 구상 될 수 있다 다양 한 셀 단계의 대표 이미지를 묘사. 분열의 농축 내가 spermatocytes 알파-tubulin (그림 1A)에 대하여 항 체를 사용 하 여 시각화 했다. 초반과 후반 감수 분열에 대 한 마커를 활용 하는 우리 나 무대 meiotic 진행. 관 스쿼시 준비 했다 synaptonemal 복잡 한 단백질, SYCP3의 의향 I. Leptotene/zygotene 단계를 시각화 하는 항 체를 immunolabeled 하 고 pachytene/diplotene spermatocytes 그림 1B에서 표시 됩니다. 알파-tubulin에 대하여 항 체를 사용 하 여 첫 번째 meiotic 사단을 겪고 spermatocytes를 명확 하 게 확인 될 수 있다 (그림 1A 및 1 C). 공부 하 고 늦게 meiotic 이벤트, 관 과즙 했다 immunolabeled 세포 주기 니 오로라 B (AURKB), localizes 내부 centromere에 분열 하는 동안,이 대 한 항 체를 사용 하 여 다음에 스핀 들 midzone와 분열 밭 고 랑 중 relocalizes anaphase 고 cytokinesis, 각각 (그림 1C). 염색체의 cytological 기능 첫 번째 meiotic 부분 동안 시각화 했다. 관찰 하기 위해 Icd, 관은 했다 immunolabeled cohesin, REC8의 감수 분열 관련 알파-kleisin 소 단위에 대 한 항 체를 사용 하 여 준비 스쿼시 (그림 1D). 염색체 역학 anaphase 동안 알파-tubulin immunolabelling 및 DNA 얼룩, DAPI 사용 하 여 평가 됐다. 성공적으로 첫 번째 meiotic 부문 완료 spermatocyte anaphase 다리를 포함 하는 spermatocyte는 그림 1 층에 나와 하는 동안 그림 1E에 표시 됩니다. 관 스쿼시 기술, meiotic 스핀 들 길이 사용 하 여, 염색체 정렬 및 분리 측정 고 돌연변이 및 제어 마우스 사이 비교.
유틸리티 추가 세포 주기 전환 및 subcellular 구조 연관 의향의 시각화를 위한이 방법의 난 그림 2에서 설명 된다. 의향의 leptotene substage 동안 난 상 동 염색체 쌍의 개시는 동적 변화 telomere 첨부 파일 핵 봉투 (NE)16, 의 단 하나 극에 직면 하는 염색체 클러스터의 형성을 유도 하는 것에 의해 중재 17 , 18 , 19 , 20. 염색체 "꽃다발" 가능성과 간 체 상호 작용 (그림 2A)의 주파수를 증가 생각으로 알려진이 나 란. 개시 및 완료의 상 동 염색체 사이 synapsis 발생 zygotene (그림 2B) 와 pachytene substages (그림 2C), 각각,의 진보적인 분산에 해당 된 염색체 꽃다발입니다. 동시에 우리 SYCP3 하 centromeres, 항 체와 immunolabeled 관 스쿼시 준비 청소년 쥐에서 synapsis 염색체 꽃다발 역학을 평가 하기 위해 dna DAPI를 사용 하 여 스테인드. 마우스 염색체 telocentric, 따라서 centromere immunolabeling telomere NE 첨부 파일에서 변화를 탐지 하는 데 사용 되었다.
Meiotic 섹스 염색체 비활성화 (MSCI)는 전형적인 남성 감수 분열에 의하여 비 동종 X와 Y 염색체 염색체 전반 인 산화의 히스톤 변형 H2AFX (yH2AX; pSer139)를 진행 하 여 검사점 활성화 우회21 ,,2223. X-Y 염색체 쌍 transcriptionally 침묵 하 고 핵 밀도 "섹스 몸." 라는 하위 도메인으로 들 에게만 MSCI 겪고 spermatocytes 확인 될 수 있다 쉽게 pachytene 및 diplotene substages 중 immunolabeling 관 스쿼시 준비 항 체와 yH2AX에 의해 (Ser139). 그림 2D 묘사 yH2AX에 대 한 항 체와 pachytene substage immunolabelled에서 spermatocyte (Ser139)는 centromeres DAPI DNA를 시각화와 스테인드.
Centrosome 중복 반 보수 및 의향 DNA의 완료 되 면 남성 감수 분열의 결과 각 딸 세포 세포 분열24,25 다음 두 centrioles (하나의 centrosome) 상속 되도록 복구 중에 발생 . Centrosomes 유연 링커로 연결 된 두 개의 직교 배열된 centrioles 구성 하 고 pericentriolar 소재/매트릭스 (PCM)26로 알려진 단백질의 비정 질 매트릭스에 의해 포위 된다. 중복 pachytene substage, 후 새로 중심소체 쌍 서로에서 분리 하 고 받아야 centrosome 성숙 및 바이 폴라 스핀 들의 형성을 촉진 하기 위하여 diplotene 단계 반대 기둥에 마이그레이션 형성. 새로 형성된 된 중심소체 쌍의 분리를 진행 하는 초기 diplotene spermatocyte immunolabeling pericentrin (PCNT), 표시 하는 PCM 및 Centrin-3 (CETN3)의 단백질 구성 요소에 대 한 항 체와 관 스쿼시 준비에 의해 가시화 했다 centrioles (그림 2E). 준비 SYCP3에 대하여 항 체를 사용 하 여 결정 했다 그리고 DAPI DNA 얼룩에 사용 되었다.
그림 1 : 관 스쿼시 준비를 사용 하 여 meiotic g 2/미 전환의 대표적인 분석. 관 스쿼시 준비 C57BL/6J 쥐 세 24 dpp의 seminiferous 관 세그먼트에서 수행 했다. (A) 알파-tubulin (빨간색), centromeres (녹색)에 대 한 항 체를 개발 spermatocytes immunolabeled의 대표 분야 및 DNA DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, 파란색) 얼룩. (B) 야생-타입 관 과즙 DAPI 알파-tubulin (레드)에 대 한 항 체와 immunolabeled 뿐만 아니라 (파란색)와 사우스 캐롤라이나, SYCP3 (녹색)의 측면 요소 얼룩이 있었다. (C) 야생-타입 관 과즙 DAPI 알파-tubulin (레드)에 대 한 항 체와 immunolabeled 뿐만 아니라 (파란색)와 세포 주기 니 AURKB (녹색 얼룩이 했다). Icd와 anaphase 다리 같은 염색체의 cytological 기능 관 스쿼시 준비를 사용 하 여 구상 될 수 있다. (D) 관찰 하기 위해 Icd, prometaphase spermatocytes 했다 centromeres meiotic 특정 cohesin 구성 요소, REC8 (녹색) 뿐만 아니라 (빨간색)에 대 한 항 체와 immunolabeled DAPI (파란색)와 스테인드. (E, F) 염색체 형태 (녹색), 알파-tubulin (빨간색), centromeres에 대하여 항 체를 사용 하 여 anaphase 동안 가시화 했다 그리고는 DAPI 얼룩 (파란색). Spermatocytes 개발의 전체 보완 관 스쿼시 기술 (L/Z, leptotene/zygotene 단계 spermatocytes;를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. P/D, pachytene/diplotene 단계 spermatocytes; 오후, prometaphase spermatocytes; M, 분열 spermatocytes; A, anaphase spermatocytes)입니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 추가 형태학 변화 및 구조 관 스쿼시 준비를 사용 하 여 남성의 meiotic 의향 진행과 관련 된 예. 관 스쿼시 준비 seminiferous 관 C57BL/6J 쥐의 세그먼트 세 12 18 dpp와 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, 파란색) DNA 라벨로 얼룩진 했다 수행 했다. (A-C) 체 synapsis 형성과 의향 진행 동안 염색체 "꽃다발"의 진보적인 분산을 결합 이다. Leptotene (A), zygotene (B), pachytene (C) 단계 spermatocytes 했다 SYCP3 (빨간색)에 대 한 항 체와 immunolabeled 그리고 centromeres (녹색). (D-E) 관 스쿼시 준비 독특한 cytological 변경 내용을 검색 하는 데 사용 수 및 난 meiotic 섹스 염색체 비활성화 (MSCI) 등 centrosome 중복 진행 남성 의향 동안 구조. (D) Pachytene 단계 spermatocytes 겪고 MSCI yH2AX 항 체를 사용 하 여 검색 된 레이블을 섹스 바디 (녹색 화살표), (Ser139) 그리고 centromeres 빨간색으로 표시 됩니다. (E) 단계 spermatocytes (빨간색), SYCP3 및 centrosomes (화살촉)에 대하여 항 체를 사용 하 여 발견 했다 Diplotene Centrin-3 (녹색) 및 Pericentrin (마젠타)에 대 한 항 체는 centrioles와는 pericentriolar를 사용 하 여 발견 되었습니다. 재료/매트릭스, 각각. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 항목 | 금액 | 최종 농도 |
| 1 x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 Μ | 0.8% (v/v) |
| PBS에서 10 %TritonX-100 | 100 Μ | 0.1% (v/v) |
표 1: 수정 프로그램/세포 솔루션. 설명: NaOH [50mm]와 9에 pH를 조정 합니다. 알루미늄 호 일 빛에서 보호 하 고 4 ° c.에 저장 솔루션의 컨테이너 포장 경우 1 주일 이상 오래 된 수정/세포 솔루션을 사용 하지 마십시오. 단단한 PFA는 또한 솔루션을 만들기 위해 사용할 수 있습니다. fumehood의 사용은 PFA 노출을 피하기 위해 권장 됩니다.
| 항목 | 금액 | 최종 농도 |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1.5 g | 3% (w/v) |
| 말 혈 청 | 5 mL | 10% (v/v) |
| PBS에서 10 %TritonX-100 | 250 Μ | 0.05% (v/v) |
표 2: 항 체 희석 버퍼 (ADB) 제조 법. 설명: 저장소 4 ° C에서 ADB 또는-20 ° C 더 큰 수량을 만드는 경우에서 동결 주식. ADB는 오염 될 수 있습니다, 그리고 좋은 무 균 기술을 사용 하 고 각 사용 하기 전에 오염에 대 한 솔루션을 평가할 다는 것을 확인. 오염을 최소화 하기 위해 ADB의 더 작은 aliquots를 준비 합니다.
| 셀 유형 | 세포질 과정 | 마우스 시대 (dpp) |
| Leptotene | DNA DSB 형성 | 10-12 |
| 어셈블리의 축 요소 | ||
| Zygotene | 동종 DSB 수리 및 synapsis의 개시 | 12-16 |
| Pachytene | 상 염색체 DSB 수리 완료 | 16-20 |
| 크로스 오버 재결합 이벤트의 성숙 | ||
| Homologs 사이 완전 한 synapsis | ||
| Meiotic 섹스 염색체 비활성화 (MSCI) | ||
| 중심소체 중복/Centrosome 성숙 | ||
| Diplotene 및 Diakinesis | 사우스 캐롤라이나 Desynapsis | 18-22 |
| Centrosome 분리 | ||
| 분열 중 기 나 | 스핀 들 검사점 | 22-26 |
| 라운드 Spermatid | Protamine 교체 | > 24 |
| Acrosome 형성 |
표 3: spermatogenesis 청소년 생쥐에서 근처 동기 첫 번째 물결. 설명: spermatogenesis의 특정 단계 청소년 마우스 개발의 다른 단계에서 농축 됩니다.
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Discussion
마우스는 셀룰러 이벤트 spermatogenesis 동안 meiotic 진행을 제어 하는 공부에 대 한 유용한 모델 유기 체 입증. 또한, 그것 때문에 많은 이벤트와 같은 종료 meiotic 의향에서 내가 spermatogenesis의 연구 들만 하는 도구를 개발 하는 데 필요한, 성적으로 동종이 형. 이 프로토콜 seminiferous 관 스쿼시 방법을 시각화 및 서로 다른 단계의 마우스 spermatogenesis의 연구에 설명합니다. 이 방법은 세포 무결성을 보존 하며 그로 인하여 핵 및 세포질 구조의 상세한 분석 이 연구에서 묘사 하는 대표적인 결과 기본 spermatocytes meiotic 진행 진행 평가에서이 프로토콜의 유틸리티를 보여 줍니다. 또한,이 프로토콜 spermatogenesis, 확산 및 spermatogonia의 차별화와 spermiogenesis,2728의 단계를 포함 하 여 동안 다른 세포질 과정을 공부 하도 사용할 수 있습니다. 설명 하는 메서드는 앞에서 설명한 관 스쿼시 기법8,9에서 적응. 그러나,이 프로토콜은 모든 시 약 및 단일 세포 형광 현미경 검사 법을 통해 머릿속에 tubules를 얻기에서 필요한 단계 첫 번째 상세한 가이드. 또한, 우리는 중심소체와 기법으로 구상 될 수 있다 telomere 꽃다발을 포함 하 여 추가적인 세포 기능에 이미지를 제시 했습니다.
중요 관 스쿼시 준비를 최적화 하기 위한 몇 가지 기술 요소가 있습니다. 첫째, 한 유리 coverslip에 힘의 적절 한 금액을 적용 해야 합니다. 충분 한 힘을 적용 하는 실패는 대부분 셀 seminiferous tubules에서 남아 있기 몇 부착 세포, 슬라이드를 생산할 예정 이다. 둘째, 한 시간의 적절 한 길이 대 한 수정/세포 솔루션에서 고환 자료 품 어 해야 합니다. 일반적으로, 고정 5 분으로 제한 해야 하지만 5와 15 분 사이 범위는 허용. 연장된 기간 동안 고정 된 tubules를 조작 하 고 가난한 결과 얻을 어려울 것 이다. 그러나 그것은,, PFA의 농도 감소 시켜 보육 시간을 연장입니다. 예를 들어 0.5 %%PFA 낮추는 수정/세포 솔루션에 증가 보육 시간에 수 있습니다. 그러나 우리가 제시 하는 방법에 permeabilization 및 고정 단계 발생 동시에, 서로 후, 각각이 단계를 수행할 수 있습니다. Permeabilization 및 고정 단계 분리 세포질 배경 신호의 수준을 줄이기 위해 도울 수 있다. 고정 및/또는 permeabilization 전략의 변화 또한 특정 subcellular 구조 또는 항 체의 평가 대 한 조건을 최적화 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 예를 들어 centrosomal의 시각화 및 스핀 들 단백질 PFA29,,3031대신 메탄올을 사용 하 여 강화 될 수 있다. 또한, 그것은 특히에 spermatogenesis (약 10 월 26 일 민 진 당)의 첫 번째 파도 통해 진행 하 고 견고 하 게 시각화 간헐적인 meiotic 세포 이벤트12청소년 마우스를 사용 하 여 도움이. 또는, seminiferous 관32내 빛 흡수 패턴을 관찰 하 여 단계-특정 meiotic 세포 성인 쥐에서 분리 가능 하다. 그러나 성인 생쥐 spermatogenesis의 비동기 주기를 감안할 때,, 드문 meiotic 이벤트 자세히 분석 전하실 수 있습니다. 이 제한 bisdichloroacetyldiamine, 승리 18,446는 블록 비타민 A 대사 마우스 주입에 의해 극복 될 수 있다 고 spermatogonial 차별화33중단. 승리 18,466, spermatogenesis의 재개와 치료 다음과 발생 합니다 동시, 성숙한 동물34에서 풍부한 생식 세포 인구의 다량을 양보. 이 동기화 전략 관 스쿼시 기술 이전 spermatogenesis 성인35,36, 에서 발생 하는 그의 첫 번째 반동기 파 간의 차이 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 37. 또한, 아버지의 노화와 이수성 사이의 상관 관계 수 또한 평가 관 스쿼시 방법으로 승리 18,466 동기화 및 평가 하 고 염색체 분리를 사용 하 여.
요약, spermatogenesis의 다른 단계에서 세포를 관찰 함께 면역 형광 검사 현미경 검사 법이이 방법을 사용할 수 있습니다. 더 광범위 하 게 적용 된이 기술은 spermatogonia, spermatocytes 및 spermatids의 부분 모집단을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다 그리고 spermatogenesis 동안 다양 한 프로세스를 연구 지 어질 수 있다. 이 방법은 다양 한 세포 및 생화학 연구38,,3940을 라이브 셀 이미징 spermatocytes의 수정에 대 한 사용 되었습니다. 관 스쿼시 기술은 마우스와 쥐 seminiferous tubules, 그것 적용 해야 함을 쉽게 인간의40를 포함 한 다른 포유류 시스템에 제안에 대 한 사용 되었습니다. 이 기술은 불 임 및 정자 이수성을 셀룰러 섭 정의 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 NIGMS (R01GM11755) P.W.J.에 의해 및 훈련 그랜트 친목에서 미국 국립 암 연구소 (NIH) (CA009110) S.R.W. 하 재 혁에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
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