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Developmental Biology

माउस मॉडल का उपयोग शुक्राणुजनन के कोशिकाविज्ञान विश्लेषण के लिए एक सेमिनीफेरस Tubule स्क्वैश तकनीक

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56453
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health
* These authors contributed equally

Summary

इस tubule स्क्वैश तकनीक का लक्ष्य सेलुलर अखंडता के संरक्षण करते हुए माउस spermatocytes के विकास की कोशिकाविज्ञान सुविधाओं का तेजी से आकलन करना है । इस विधि शुक्राणुजनन के सभी चरणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, और आसानी से माउस अर्धसूत्रीविभाजन के अध्ययन के लिए अंय जैव रासायनिक और आणविक जैविक दृष्टिकोण के साथ कार्यांवित किया जा सकता है ।

Abstract

पुरुषों में Meiotic प्रगति एक प्रक्रिया है कि अत्यधिक विनियमित सेलुलर घटनाओं की एक संख्या के ठोस कार्रवाई की आवश्यकता है । अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होने वाली त्रुटियों बांझपन, गर्भावस्था के नुकसान या आनुवंशिक दोषों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यौवन की शुरुआत में शुरू और वयस्कता भर में जारी, सतत अर्द्ध spermatocytes की तुल्यकालिक तरंगों शुक्राणुजनन से गुजरना और अंततः अगुणित शुक्राणु फार्म । माउस की पहली लहर spermatocytes दौर से गुजर meiotic दीक्षा दिन में प्रकट 10 के बाद प्रसवोत्तर (10 डीपीपी) और ३५ नलिकाओं में परिपक्व शुक्राणु के रूप में सेमिनीफेरस डीपीपी के लुमेन में जारी कर रहे हैं । इसलिए, यह इस विकास के समय के भीतर चूहों का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है-खिड़की के लिए ब्याज की अत्यधिक समृद्ध आबादी को प्राप्त करने के लिए । दुर्लभ कोशिका चरणों का विश्लेषण परवर्ती spermatogenic तरंगों के योगदान के कारण पुराने चूहों में अधिक कठिन है, जो नलिकाओं के भीतर सेलुलर आबादी की विविधता को बढ़ाते हैं । यहां वर्णित विधि चूहों के सेमिनीफेरस नलिकाओं के भीतर पाई जाने वाली कोशिकाओं के कोशिकाविज्ञान मूल्यांकन के लिए एक आसानी से कार्यान्वित तकनीक है, जिसमें spermatogonia, spermatocytes, और spermatids शामिल हैं. tubule स्क्वैश तकनीक अलग नर रोगाणु कोशिकाओं की अखंडता का कहना है और सेलुलर संरचनाओं कि आसानी से अंय तकनीकों के साथ visualized नहीं कर रहे है की परीक्षा की अनुमति देता है । इस tubule स्क्वैश तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए, धुरी विधानसभा spermatocytes में निगरानी के लिए चरण के माध्यम से प्रगति कर रहा था metaphase मैं संक्रमण (G2/ इसके अलावा, centrosome दोहराव, meiotic सेक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (एमएससीआई), और गुणसूत्र गुलदस्ता गठन कोशिकाविज्ञान संरचनाओं कि इस tubule स्क्वैश विधि का उपयोग कर मनाया जा सकता है के उदाहरण के रूप में मूल्यांकन किया गया । इस तकनीक शुक्राणुजनन कि उत्परिवर्तन या exogenous गड़बड़ी की वजह से कर रहे है के दौरान विशिष्ट दोषों तुच्छ इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस प्रकार, शुक्राणुजनन के हमारे आणविक समझ में योगदान देता है ।

Introduction

अर्धसूत्रीविभाजन एक जटिल सेलुलर घटना है जिसमें डीएनए प्रतिकृति के एक दौर सेल विभाजन के दो क्रमिक दौर के बाद है । सटीक गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के लिए अर्धसूत्रीविभाजन के प्रारंभिक चरणों के दौरान कई अर्धसूत्रीविभाजन-विशिष्ट घटनाओं समंवित किया जाना चाहिए । इन घटनाओं में शामिल है मुताबिक़ पुनर्संयोजन के पूरा होने, सह पहली meiotic विभाजन के दौरान बहन kinetochores के उंमुखीकरण, और cohesin परिसरों के stepwise नुकसान chiasmata के बीच homologs को हल करने के लिए । इन प्रक्रियाओं की सटीक विनियमन प्रजनन क्षमता बनाए रखने और गुणसूत्र अलगाव की घटनाओं है कि आनुवंशिक विकासात्मक विकारों और सहज गर्भपात1के लिए नेतृत्व कर सकते है को रोकने के लिए आवश्यक है ।

जबकि अर्धसूत्रीविभाजन की प्रमुख घटनाओं दोनों पुरुषों और महिलाओं में जगह ले, महत्वपूर्ण लौकिक और यंत्रवत मतभेद शुक्राणुजनन और oogenesis2के बीच मौजूद हैं । उदाहरण के लिए, महिला अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, मैं भ्रूण विकास और dictyate चरण में गिरफ्तारियों यौवन तक के दौरान होता है । इसके विपरीत, शुक्राणुजनन यौवन पर शुरू और गिरफ्तारी के बिना वयस्क जीवन भर में लहरों में प्रगति । पुरुष और महिला अर्धसूत्रीविभाजन के बीच मतभेदों को spermatocytes और अंडाणुओं दोनों में इन प्रक्रियाओं का आकलन करने की दिशा में विशेष रूप से पूरा कर रहे है कि तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता पर जोर देती है । वर्तमान में, meiotic प्रगति का आकलन मोटे तौर पर क्रोमेटिन के उपयोग पर निर्भर करता है3,4,5फैलता है । जबकि क्रोमेटिन फैलता meiotic गुणसूत्रों के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं, वे सेलुलर अखंडता को बनाए रखने में विफल, धुरी microtubules, centrosomes, परमाणु लिफाफा, और telomere संलग्नक जैसे सेलुलर संरचनाओं के मूल्यांकन को रोकने. लाइव इमेजिंग और दीर्घकालिक संवर्धन तकनीक ने महिला अर्धसूत्रीविभाजन की हमारी समझ को बहुत उन्नत किया है; इसी तरह पूरे बरकरार सेल कल्पना करने के लिए दृष्टिकोण, तथापि, कम बार शुक्राणुजनन6,7के अध्ययन के लिए लागू किया जाता है । आदेश में पुरुष अर्धसूत्रीविभाजन भर में गतिशील घटनाओं कल्पना करने के लिए, हम tubule स्क्वैश तकनीक की स्थापना के लिए तेजी से विकसित माउस spermatocytes8,9के कोशिकाविज्ञान सुविधाओं का आकलन अनुकूलित किया है । विधि यहां वर्णित कोशिका की अखंडता को बनाए रखता है, शुक्राणुजनन के विभिंन चरणों के दौरान कई सेलुलर संरचनाओं के अध्ययन को सक्षम करने से ।

यह tubule स्क्वैश तकनीक एक पूरी सेल दृष्टिकोण है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के जरिए सेलुलर संरचनाओं के आकलन के लिए अनुमति देता है । आम ऊतकीय जैसे पुरुष चूहों में meiotic प्रगति कल्पना करने के लिए दृष्टिकोण haematoxylin और आयल एंबेडेड परीक्षण के धुंधला eosin, और immunofluorescent के cryosections लेबलिंग meiotic प्रगति का एक व्यापक सिंहावलोकन के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, इन तकनीकों अर्धसूत्रीविभाजन10,11भर में होने वाली घटनाओं का विस्तृत विश्लेषण के लिए आवश्यक सीमा तक एकल कक्षों को हल करने में विफल । वैकल्पिक तकनीक meiotic प्रक्रियाओं कल्पना करने के लिए spermatocyte को अलग और ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण chemiosmotic व्यवधान पर निर्भर परमाणु सामग्री3,4,5। इन रासायनिक उपचार प्राथमिक spermatocytes के अलावा अंय प्रकार के कक्ष के प्रेक्षण में बाधा । Namekawa द्वारा हाल ही में वर्णित विधि अनुसंधान समुदाय अलग spermatocytes के परमाणु वास्तुकला को बनाए रखने के लिए सक्षम है, लेकिन एक cytospin और सामान है कि कुछ प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है के उपयोग की आवश्यकता है4। इसके विपरीत, tubule स्क्वैश तकनीक केवल उपकरण है कि आम तौर पर सबसे सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में मानक है की आवश्यकता है ।

tubule स्क्वैश विधि यहां वर्णित विविध कोशिका सेमिनीफेरस tubule के भीतर पाया प्रकार, sertoli कोशिकाओं, spermatogonia, प्राथमिक और माध्यमिक spermatocytes, और spermatids सहित कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पास के साथ इस तकनीक युग्मन द्वारा किशोर चूहों में शुक्राणुजनन के तुल्यकालिक पहली लहर, यह spermatogenic कोशिकाओं के समृद्ध आबादी को प्राप्त करने के रूप में वे अर्धसूत्रीविभाजन12के माध्यम से प्रगति संभव है । इस प्रक्रिया में प्रक्रियाओं के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है शुक्राणुजनन, जैसे जल्दी चरण ईवेंट्स, G2/MI और metaphase anaphase संक्रमण के लिए, और spermiogenesis । इसके अलावा, tubule स्क्वैश तैयारी गुणसूत्रों (जैसे interchromatid डोमेन (आईसीडीएस) और kinetochores) की कोशिकाविज्ञान सुविधाओं की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और centrosomes (centrioles और pericentriolar सामग्री/ स्क्वैश विधि आसानी से ऐसे क्रोमेटिन फैलता है और प्रोटीन निष्कर्षण के रूप में अंय प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, के साथ समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, प्रत्यक्ष दृश्य13के लिए स्लाइड् स पर spermatogenic कक्षों को जमा करने के लिए इस तकनीक को सफलतापूर्वक संशोधित किया गया है ।

विधि यहां वर्णित एक पूरे सेल सेमिनीफेरस tubule स्क्वैश तकनीक शामिल करने के लिए जंगली-प्रकार C57BL/6J चूहों में G2/ प्राथमिक spermatocytes के पहले meiotic विभाजन में प्रवेश के कोशिकाविज्ञान सुविधाओं इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ meiotic धुरी का पालन करने के लिए visualized थे । इस बहुमुखी तकनीक को आसानी से अंय meiotic चरणों और विभिंन प्रकार के सेल कल्पना संशोधित किया जा सकता है । तकनीक भी ऐसे डीएनए और आरएनए मछली दृष्टिकोण के रूप में वैकल्पिक दृश्य रणनीतियों, के लिए उत्तरदायी है ।

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Protocol

चूहों के उपयोग को संस्थागत पशु देखभाल और जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय की उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी थी । प्रयोगों (20-26 दिनों के बाद प्रसवोत्तर, डीपीपी) C57BL/6J चूहों पर प्रदर्शन किया, अर्द्ध शुक्राणुजनन के तुल्यकालिक पहली लहर का लाभ ले रहे थे । हालांकि, इस तकनीक भी वयस्क चूहों का उपयोग किया जा सकता है ।

1. माउस का विच्छेदन और अलगाव सेमिनीफेरस नलिकाओं

  1. fix/lysis समाधान और तालिका 1 और तालिका 2में वर्णित एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर (एडीबी) तैयार करें ।
  2. 1x फॉस्फेट के 3 मिलीलीटर (1x पंजाब, पीएच ७.४), और एक और ३५-mm डिश के साथ १ ३५-mm पेट्री डिश तैयार करने के लिए माउस प्रति ठीक/lysis समाधान के 2 मिलीलीटर ।
  3. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन या सह2 asphyxiation के माध्यम से माउस बलिदान और ७०% इथेनॉल के साथ ventral पेट स्प्रे । खुले abdominopelvic गुहा बाँझ कैंची का उपयोग कर, एक वी के आकार का उद्घाटन कर रही है । फिर संदंश का उपयोग कर epididymal वसा पैड पर खींच कर tests निकालें, और tunica albugineaपरेशान करने से बचें । एक ३५-mm पेट्री डिश में टेस्ट प्लेस 1x पंजाबियों युक्त ।
    नोट: शुक्राणुजनन की पहली लहर का उपयोग करने के लिए ब्याज की एक समृद्ध सेल जनसंख्या का पालन करने के लिए14। शुक्राणुजनन के विशिष्ट चरणों अलग माउस उम्र (तालिका 3) में समृद्ध कर रहे हैं ।
  4. तेज इत्तला संदंश के साथ ऊतक puncturing द्वारा वृषण tunica albuginea निकालें और ढीला सेमिनीफेरस नलिकाओं इकट्ठा । नलिकाओं एक नई ३५-mm पेट्री डिश के लिए फिक्स/lysis समाधान के 2 मिलीलीटर से युक्त स्थानांतरण ।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए फिक्स/lysis समाधान में नलिकाओं की मशीन ।

2. सेमिनीफेरस नलिकाओं की तैयारी

  1. एक तरल अवरोधक कलम के साथ स्लाइड के किनारों को रेखांकित करके एक पाली-एल-lysine लेपित ग्लास स्लाइड तैयार करें ।
  2. लागू करें १०० µ की l तय/lysis समाधान कांच स्लाइड के केंद्र के लिए ।
  3. बाँझ संदंश और कैंची धीरे सेमिनीफेरस नलिकाओं के अलावा चिढ़ाने का उपयोग करना. लंबे समय से व्यक्तिगत tubule खंडों में लगभग 20 मिमी लंबाई में कटौती ।
    नोट: संरचनाओं कि लंबे समय तक निर्धारण जोखिम के प्रति संवेदनशील है कल्पना करने के लिए, जैसे centrosomes, 1x पंजाब में पहले नलिकाओं अलग है, तो सीधे पाली-lysine स्लाइड की सतह पर नलिकाओं में लेपित १०० µ l ठीक-lysis समाधान की ।
  4. ५ २० मिमी लंबी सेमिनीफेरस tubule खंडों को तैयार पाली-एल-lysine लेपित ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें जिसमें फ़िक्स/lysis समाधान शामिल है ।
  5. १.५ ३.० mm खंडों में बाँझ कैंची कीमा सेमिनीफेरस नलिकाओं का उपयोग करना ।
  6. उपयोग बाँझ संदंश ग्लास स्लाइड पर tubule खंडों की व्यवस्था है कि कोई ऊतक ओवरलैप, और नलिकाओं समान रूप से वितरित कर रहे हैं.
    नोट: एक ग्लास स्लाइड पर tubule खंडों की इष्टतम संख्या 20 और ४० के बीच है ।

3. सेमिनीफेरस नलिकाओं की स्क्वैशिंग

  1. एक benchtop पर फैलाया सेमिनीफेरस tubule क्षेत्रों युक्त ग्लास स्लाइड हस्तांतरण. स्क्वैश कदम के दौरान ऊतक खोने से बचने के लिए एक प्रयोगशाला पोंछ का उपयोग कर अतिरिक्त तरल निकालें ।
  2. ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर एक coverslip (22 x ६०-१.५ mm) लागू करें और 10-20 सेकंड के लिए हथेली की एड़ी के साथ दबाव लागू होते हैं । सेमिनीफेरस नलिकाओं से spermatocytes फैलाने के लिए पर्याप्त बल लागू करना जरूरी है ।
    नोट: सभी tubule खंडों बाधित कर रहे हैं ताकि स्क्वैश कदम का अनुकूलन करने के क्रम में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नलिकाओं का निरीक्षण करें.
  3. स्लाइड संदंश का प्रयोग, तुरंत फ़्लैश तरल एन2 के एक छोटे देवर में 15 सेकंड के लिए ग्लास स्लाइड फ्रीज, या जब तक तरल बुलबुला करने के लिए रहता है । यदि immunolabeling तुरंत, एक सीधी धार उस्तरा ब्लेड, ठीक टिप संदंश या 21 गेज सुई के साथ coverslip निकालें ।
    नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, तुरंत स्लाइड immunolabel (चरण 4 देखें) । हालांकि, इस बिंदु स्लाइड पर-८० ° c को दो सप्ताह के लिए संरक्षित किया जा सकता है । प्रोटीन और सेलुलर संरचनाओं के जीवनकाल को अधिकतम करने के लिए, तुरंत सूखी बर्फ पर स्लाइड की दुकान या एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर करने के लिए स्थानांतरण, और स्लाइड पर coverslip रहते हैं । immunolabeling स्लाइड संग्रहीत करते हैं, coverslip चरण ३.३ में वर्णित के रूप में 15 सेकंड के लिए, लिक्विड N2 में स्लाइड विसर्जित करके निकालें ।

4. घुड़सवार सेमिनीफेरस नलिकाओं की Immunolabeling

  1. 1x पंजाबियों में स्लाइड विसर्जित कर दिया, और एक ५० मिलीलीटर Coplin जार में 5 मिनट के लिए तीन बार धो 1x पंजाबियों युक्त ।
    नोट: immunolabeling के दौरान स्लाइड को पूरी तरह से सूखने की अनुमति कभी न दें ।
  2. एक humidified चैंबर में 1-2 ज के लिए ब्लॉक करने के लिए कांच स्लाइड पर एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर के 1 मिलीलीटर लागू करें ।
  3. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर निकालें और एक humidified कक्ष में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के १०० µ एल लागू होते हैं ।
    नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी गर्मी । एक coverslip या parafilm के साथ स्लाइड को कवर करके एंटीबॉडी (उदा ५० µ l) के छोटे खंडों का उपयोग करें । मांय और प्राथमिक एंटीबॉडी15का अनुकूलन ।
  4. एक ५० मिलीलीटर Coplin जार में 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला स्लाइड 1x पंजाब युक्त ।
    नोट: कम गति पर एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर एक छोटे से चुंबकीय हलचल बार और जगह का उपयोग करके बहाकर, आंदोलन Coplin जार बढ़ाने के लिए, या कम गति पर एक तालिका के ऊपर मिक्सर पर Coplin जार जगह है ।
  5. एक humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर 1 के लिए १.५ एच के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के १०० µ एल लागू करें । fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी की फोटो ब्लीचिंग से बचने के लिए एक डार्क बॉक्स में स्लाइड्स की मशीन करें ।
    नोट: एक coverslip या parafilm के साथ स्लाइड को कवर करके एंटीबॉडी (उदा ५० µ l) के छोटे खंडों का उपयोग करें ।
  6. एक ५० मिलीलीटर Coplin में 5 मिनट के लिए दो बार कुल्ला स्लाइड 1x पंजाब युक्त जार ।
  7. माउंट 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, १.५ µ g/एमएल) और लागू coverslips (22 x ६०-१.५ mm) युक्त मध्यम में स्लाइड ।
  8. स्लाइड्स को संरक्षित करने और coverslips को बढ़ने से रोकने के लिए coverslips को स् पष् ट नेल पॉलिश से स्लाइड पर सील करें ।

5. विश्लेषण और इमेजिंग tubule स्क्वैश की तैयारी

  1. स्वचालित चरण है कि सटीक जेड अक्ष आंदोलन और छवि पर कब्जा करने के लिए एक उच्च संकल्प कैमरा सक्षम बनाता है के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । वैकल्पिक रूप से, एक लेजर फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ।
    नोट: इस चरण के लिए किसी भी उपलब्ध हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, चित्रा 1 और चित्रा 2 में प्रदर्शित छवियां एक जीस सेल पर्यवेक्षक Z1 एक ORCA फ्लैश ४.० CMOS कैमरा से जुड़े और जीस ज़ेन २०१२ ब्लू संस्करण छवि सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया ।
  2. स्क्वैश तैयारी की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए एक 20X उद्देश्य का उपयोग कर स्लाइड का आकलन करें । अच्छी गुणवत्ता स्लाइड नाभिक की एक monolayer है कि समान रूप से वितरित कर रहे हैं ।
    नोट: स्लाइड के कुछ अनुभाग अंय लोगों की तुलना में बेहतर हो सकते हैं, यह उन निर्देशांकों को नोट करने के लिए उपयोगी है जहां स्लाइड का सबसे अच्छा क्षेत्र अधिक आवर्धन का उपयोग करके अधिक विश्लेषण के लिए पाया जा सकता है ।
  3. उच्च आवर्धन उद्देश्य (उदा. 63X या 100X) का उपयोग करके, उस स्लाइड के क्षेत्रों को कैप्चर करें, जिसमें नाभिक का एकरूप monolayer है । एक बार एक क्षेत्र चयनित है, यह सुनिश्चित करने के लिए ऊपरी और निचले Z-स्टैक सेट करें कि सभी फोकस लाइट कैप्चर किया गया है ।
    नोट: ऊपरी और निचली सीमा के बीच कैप्चर किए गए Z-स्टैक की श्रेष्ठतम संख्या सामांयत: छवि प्राप्ति सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्दिष्ट की जाती है और प्रत्येक उद्देश्य के लिए भिंन होती है ।
  4. विस्तृत गहराई फ़ोकस छवि संकलित करने के लिए छवि संसाधन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । सॉफ्टवेयर में एक जेड से फोकस प्रकाश को जोड़ती है ढेर, और tubule स्क्वैश तैयारियों के इष्टतम इमेजिंग के लिए आवश्यक है ।

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Representative Results

यहां, हम tubule स्क्वैश विधि का इस्तेमाल किया है क्षणभंगुर कोशिका को metaphase मैं (G2/MI) संक्रमण है, जो किशोर जंगली प्रकार से फसल परीक्षण से समृद्ध थे के दौर से गुजर आबादी कल्पना शुक्राणुजनन की पहली लहर के दौर से गुजर (24 डीपीपी) । चित्रा 1 tubule स्क्वैश विधि का उपयोग कर visualized किया जा सकता है कि विभिन्न सेल चरणों के प्रतिनिधि छवियों को दर्शाया गया है. metaphase मैं spermatocytes के समृद्ध आबादी अल्फा के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर visualized थे-tubulin (चित्र 1a) । हम जल्दी और देर अर्धसूत्रीविभाजन मैं मंच meiotic प्रगति के लिए मार्करों का उपयोग किया । Tubule स्क्वैश तैयारियों synaptonemal जटिल प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ immunolabeled थे, SYCP3, दौर मैं Leptotene/zygotene और pachytene/diplotene spermatocytes के चरणों की कल्पना करने के लिए चित्र 1bमें दिखाए जाते हैं । Spermatocytes पहले meiotic विभाजन स्पष्ट रूप से अल्फा के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर पहचाना जा सकता है-tubulin (आंकड़ा 1a और 1C)। देर meiotic घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, tubule स्क्वैश कोशिका चक्र कळेनासे अरोड़ा बी (AURKB) है, जो centromere के दौरान भीतरी metaphase के लिए स्थानीयकरण के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर immunolabeled थे, तो धुरी midzone और दरार कुंड करने के दौरान reinformations anaphase और cytokinesis, क्रमशः (चित्रा 1C). गुणसूत्रों की कोशिकाविज्ञान सुविधाओं के पहले meiotic विभाजन के दौरान visualized थे । आईसीडीएस का निरीक्षण करने के लिए, tubule स्क्वैश की तैयारी अर्धसूत्रीविभाजन-विशिष्ट अल्फा kleisin cohesin, REC8 (चित्रा 1 डी) के उपइकाई के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर immunolabeled थे । anaphase के दौरान गुणसूत्र गतिशीलता अल्फा-tubulin immunolabelling और डीएनए दाग, DAPI का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । पहली meiotic डिवीजन को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए spermatocyte को चित्रा 1Eमें दिखाया गया है, जबकि anaphase ब्रिज से युक्त एक spermatocyte को फिगर 1Fमें दिखाया गया है । tubule स्क्वैश तकनीक, meiotic धुरी लंबाई, गुणसूत्र संरेखण और अलगाव का उपयोग मापा जा सकता है और उत्परिवर्ती और नियंत्रण चूहों के बीच की तुलना में ।

अतिरिक्त सेल-चक्र संक्रमणों और उपसेलुलर संरचनाओं के दृश्य के लिए इस पद्धति की उपयोगिता मैं चित्रा 2में प्रदर्शन किया है । मैं, मुताबिक़ गुणसूत्र बाँधना के leptotene उपचरण के दौरान telomere संलग्नक में गतिशील परिवर्तन द्वारा मध्यस्थता के लिए परमाणु लिफाफा के एक पोल का सामना करना गुणसूत्र समूहों के गठन प्रेरित (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. इस अनुरूप, गुणसूत्र "गुलदस्ता" के रूप में जाना अंतर-homolog बातचीत की संभावना और आवृत्ति को बढ़ाने के लिए सोचा है (चित्रा 2a)। मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच synapsis की दीक्षा और पूर्णता के दौरान होता है zygotene (चित्रा 2 बी) और pachytene उपस्तरों (चित्रा 2c), क्रमशः, के प्रगतिशील फैलाव के साथ संगत गुणसूत्र गुलदस्ता । एक साथ किशोर चूहों में synapsis और गुणसूत्र गुलदस्ता गतिशीलता का आकलन करने के लिए, हम SYCP3 और centromeres के लिए एंटीबॉडी के साथ tubule स्क्वैश तैयारी immunolabeled, और DAPI का उपयोग डीएनए के लिए दाग. माउस गुणसूत्रों telocentric हैं, इसलिए centromere immunolabeling telomere NE संलग्नक में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

Meiotic सेक्स गुणसूत्र निष्क्रियण (एमएससीआई) पुरुष अर्धसूत्रीविभाजन, जिससे गैर मुताबिक़ एक्स और वाई गुणसूत्रों फास्फारिलीकरण वैरिएंट citrullinated (H2AFX; yH2AX) के गुणसूत्र चौड़ा pSer139 के दौर से गुजर द्वारा चौकी सक्रियण दरकिनार करने के लिए एक अनूठी बानगी है21 ,22,23. एक्स-वाई गुणसूत्र जोड़ी transcriptionally खामोश है और एक घने परमाणु उपडोमेन में compartmentalized "सेक्स शरीर कहा जाता है." Spermatocytes जाणे एमएससीआई आसानी से immunolabeling (tubule) के लिए एंटीबॉडी के साथ yH2AX Ser139 स्क्वैश तैयारी द्वारा pachytene और diplotene उपस्तर के दौरान पहचाना जा सकता है । चित्रा 2 डी yH2AX (Ser139), centromeres और DAPI के साथ दाग के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ pachytene उपस्तर immunolabelled में एक spermatocyte को दर्शाया गया है डीएनए कल्पना ।

Centrosome दोहराव अर्द्ध रूढ़िवादी है और डीएनए की मरंमत के पूरा होने पर पुरुष अर्धसूत्रीविभाजन के दौर मैं के दौरान होता है यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक बेटी सेल वारिस दो centrioles (एक Centrosome) सेल प्रभाग24,25 के बाद . Centrosomes दो orthogonally से मिलकर एक लचीला लिंकर से जुड़े centrioles की व्यवस्था और pericentriolar सामग्री के रूप में जाना जाता है प्रोटीन की एक अमली मैट्रिक्स से घिरा हुआ है/मैट्रिक्स (PCM)26। pachytene उपस्तर में दोहराव के बाद, नव गठित centriole जोड़े एक दूसरे से छुड़ाने और diplotene चरण के दौरान विपरीत डंडे के लिए centrosome परिपक्वता और प्रवास से गुजरना द्विध्रुवी धुरी के गठन की सुविधा के लिए । एक प्रारंभिक diplotene spermatocyte नए गठन centriole जोड़े के निषेधाज्ञा के दौर से गुजर tubule (pericentrin), पीसीएम और PCNT के एक प्रोटीन घटक के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeling Centrin स्क्वैश तैयारी द्वारा visualized था-3 (CETN3) के लिए चिह्नित centrioles (चित्रा 2E). मचान SYCP3 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर निर्धारित किया गया था, और DAPI डीएनए दाग के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

Figure 1
चित्र 1 : meiotic G2 के प्रतिनिधि विश्लेषण/MI tubule स्क्वैश की तैयारी का उपयोग कर संक्रमण. Tubule स्क्वैश की तैयारी C57BL/6J चूहों के 24 डीपीपी आयु वर्ग के सेमिनीफेरस Tubule खंडों पर प्रदर्शन किया गया । (क) अल्फा के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ spermatocytes immunolabeled के विकास के प्रतिनिधि क्षेत्र-tubulin (लाल), centromeres (हरा) और डीएनए दाग DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, नीला). (ख) जंगली-प्रकार tubule स्क्वैश DAPI (नीला) के साथ ही दाग थे और साथ ही अल्फा के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled-tubulin (लाल), और अनुसूचित जाति के पार्श्व तत्व, SYCP3 (हरा). (ग) जंगली-प्रकार tubule स्क्वैश DAPI (नीला) के साथ ही दाग थे और साथ ही अल्फा के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled-tubulin (लाल), और कोशिका चक्र कळेनासे AURKB (हरा). आईसीडीएस और anaphase पुलों जैसे गुणसूत्रों की कोशिकाविज्ञान सुविधाओं tubule स्क्वैश तैयारियों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । (घ) आईसीडीएस का निरीक्षण करने के लिए, prometaphase spermatocytes centromeres के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled थे (लाल) और साथ ही एक meiotic विशिष्ट cohesin घटक, REC8 (हरा) और DAPI (नीला) के साथ दाग. (E, F) गुणसूत्र आकृति विज्ञान अल्फा के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग anaphase के दौरान visualized था-tubulin (लाल), centromeres (हरा), और DAPI दाग (नीला). spermatocytes के विकास का एक पूर्ण पूरक tubule स्क्वैश तकनीक (एल/जेड, leptotene/zygotene स्टेज spermatocytes का उपयोग कर पहचाना जा सकता है; P/D, pachytene/diplotene स्टेज spermatocytes; बजे, prometaphase spermatocytes; मी, metaphase spermatocytes; ए, anaphase spermatocytes) । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : अतिरिक्त रूपात्मक परिवर्तन और tubule स्क्वैश की तैयारी का उपयोग पुरुषों में meiotic दौर प्रगति के साथ जुड़े संरचनाओं के उदाहरण । Tubule स्क्वैश तैयारियों C57BL के सेमिनीफेरस Tubule खंडों पर प्रदर्शन किया गया/6J 12-18 डीपीपी आयु वर्ग के चूहों और DAPI के साथ दाग थे (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, नीला) डीएनए लेबल के लिए । (A-C) Homolog synapsis गठन और गुणसूत्र के प्रगतिशील प्रसार के लिए युग्मित है "गुलदस्ता" चरण प्रगति के दौरान । Leptotene (क), zygotene (ख), और pachytene (ग) स्टेज spermatocytes immunolabeled (लाल) और SYCP3 (हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ centromeres थे. (डी-ई) Tubule स्क्वैश तैयारी meiotic सेक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (एमएससीआई) और centrosome दोहराव सहित पुरुष दौर मैं प्रगति के दौरान अद्वितीय कोशिकाविज्ञान परिवर्तन और संरचनाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (घ) Pachytene स्टेज spermatocytes जाणे एमएससीआई yH2AX (Ser139) के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर सेक्स-शरीर (green, ऐरोहेड) लेबल का पता लगाया गया, और centromeres लाल रंग में दिखाया गया है । (E) Diplotene चरण spermatocytes SYCP3 (लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर की पहचान की गई थी, और centrosomes (ऐरोहेड) Centrin के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया गया-3 (ग्रीन) और Pericentrin (रानी) centrioles और pericentriolar लेबल करने के लिए सामग्री/मैट्रिक्स, क्रमशः । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

आइटम राशि अंतिम एकाग्रता
1x पंजाब 10 मिलीलीटर 1x
16% पीएफए ५०० μL ०.८% (वि. वि./
पंजाब में 10% TritonX-१०० १०० μL ०.१% (वि. वि./

तालिका 1: Fix/lysis समाधान । विवरण: NaOH [50mM] के साथ 9 को पीएच समायोजित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और दुकान से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पंनी में समाधान के कंटेनर लपेटें । ठीक/lysis समाधान का उपयोग न करें यदि एक सप्ताह से अधिक पुराना है । समाधान करने के लिए ठोस पीएफए भी किया जा सकता है । एक fumehood का उपयोग करने के लिए पीएफए जोखिम से बचने की सिफारिश की है ।

आइटम राशि अंतिम एकाग्रता
1x पंजाब ५० एमएल 1x
bsa १.५ छ 3% (w/
हार्स सीरम 5 मिलीलीटर 10% (v/
पंजाब में 10% TritonX-१०० २५० μL ०.०५% (वि. वि./

तालिका 2: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर (एडीबी) नुस्खा । विवरण: 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एडीबी या बड़ी मात्रा में कर-20 ° c पर स्टॉक फ्रीज । एडीबी दूषित हो सकता है, सुनिश्चित करें कि अच्छा रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग किया जाता है और प्रत्येक उपयोग करने से पहले संदूषण के लिए समाधान का आकलन कर सकते हैं । संदूषण को कम करने के लिए एडीबी के छोटे aliquots तैयार करें ।

कक्ष प्रकार सेलुलर प्रक्रिया माउस उंर (डीपीपी)
Leptotene डीएनए DSB गठन 10-12
अक्षीय तत्वों की विधानसभा
Zygotene मुताबिक़ DSB मरंमत और synapsis की दीक्षा 12-16
Pachytene ऑटोसोमल DSB की मरम्मत का कार्य पूरा 16-20
अंतरराष्ट्रीय पुनर्संयोजन की घटनाओं की परिपक्वता
homologs के बीच पूरा synapsis
Meiotic सेक्स गुणसूत्र निष्क्रियण (एमएससीआई)
Centriole दोहराव/Centrosome परिपक्वता
Diplotene और Diakinesis अजा Desynapsis 18-22
Centrosome पृथक्करण
Metaphase I धुरी चौकी 22-26
गोल Spermatid Protamine प्रतिस्थापन > 24
Acrosome गठन

तालिका 3: पास-शुक्राणुजनन के किशोर चूहों में तुल्यकालिक पहली लहर । विवरण: शुक्राणुजनन के विशिष्ट चरणों किशोर माउस विकास के विभिंन चरणों में समृद्ध कर रहे हैं ।

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Discussion

चूहों सेलुलर घटनाओं है कि शुक्राणुजनन के दौरान meiotic प्रगति शासन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव साबित किया है । इसके अलावा, यह शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए पूरा उपकरण विकसित करने के लिए आवश्यक है क्योंकि कई घटनाओं, जैसे meiotic दौर से बाहर निकलने के रूप में मैं, यौन dimorphic हैं । इस प्रोटोकॉल दृश्य और माउस शुक्राणुजनन के विभिंन चरणों के अध्ययन के लिए एक सेमिनीफेरस tubule स्क्वैश विधि का वर्णन । इस विधि सेलुलर अखंडता को बरकरार रखता है और इस तरह परमाणु और cytoplasmic संरचनाओं के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है । इस अध्ययन में दर्शाया गया प्रतिनिधि परिणाम प्राथमिक spermatocytes जाणे meiotic प्रगति के आकलन में इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित करता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी शुक्राणुजनन के दौरान अंय सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रसार और spermatogonia और spermiogenesis27,28के चरणों के अंतर सहित । वर्णित तरीकों के भीतर पहले से अनुकूलित कर रहे है tubule स्क्वैश तकनीक8,9वर्णित है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल पहले विस्तृत गाइड है, सभी एजेंट और आवश्यक कदम को कवर, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एकल कोशिकाओं visualizing के लिए नलिकाओं प्राप्त करने से । इसके अलावा, हम centriole और telomere गुलदस्ता है, जो तकनीक के साथ visualized किया जा सकता है सहित अतिरिक्त सेलुलर सुविधाओं, पर छवियों को प्रस्तुत किया है ।

वहां कुछ तकनीकी तत्व है कि tubule स्क्वैश की तैयारी के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, एक कांच coverslip को बल की उचित मात्रा में लागू होगा । पर्याप्त बल लागू करने में विफलता कुछ अनुयाई कोशिकाओं के साथ स्लाइड का उत्पादन होगा, के रूप में अधिकांश कोशिकाओं सेमिनीफेरस नलिकाओं के भीतर रहना होगा । दूसरे, एक तय समय की उचित लंबाई के लिए/lysis समाधान में वृषण सामग्री मशीन चाहिए । आम तौर पर, निर्धारण 5 मिनट के लिए सीमित किया जाना चाहिए, लेकिन 5 और 15 मिनट के बीच एक सीमा स्वीकार्य है । नलिकाओं है कि एक लंबी अवधि के लिए तय किया गया है हेरफेर करने के लिए मुश्किल हो जाएगा और गरीब परिणाम उपज । यह संभव है, तथापि, पीएफए की एकाग्रता को कम करने से गर्मी समय का विस्तार करने के लिए । उदाहरण के लिए ०.५% पीएफए प्रतिशत को कम करने के लिए फिक्स/lysis समाधान में वृद्धि हुई गर्मी के समय के लिए अनुमति होगी । विधि में हम प्रस्तुत किया है, permeabilization और निर्धारण कदम एक साथ हो, लेकिन इन कदमों को क्रमशः एक के बाद एक किया जा सकता है । permeabilization और निर्धारण कदम को अलग करने से cytoplasmic बैकग्राउंड सिग्नल के स्तर को कम करने में मदद मिल सकती है । निर्धारण और/या permeabilization रणनीतियों का रूपांतर भी एक विशिष्ट उपसेलुलर संरचना या एंटीबॉडी के आकलन के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, centrosomal और धुरी प्रोटीन के दृश्य पीएफए के बजाय मेथनॉल का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है29,30,31। इसके अतिरिक्त, यह किशोर चूहों कि शुक्राणुजनन की पहली लहर के माध्यम से प्रगति कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए फायदेमंद है (लगभग 10-26 डीपीपी) क्रम में विशेष रूप से और मजबूती से निराला meiotic सेलुलरघटनाओं12 कल्पना. वैकल्पिक रूप से, यह सेमिनीफेरस tubule३२के भीतर प्रकाश अवशोषण पैटर्न देख कर वयस्क चूहों से मंच विशिष्ट meiotic कोशिकाओं को अलग करने के लिए संभव है । वयस्क चूहों में शुक्राणुजनन के अतुल्यकालिक चक्र को देखते हुए, तथापि, विस्तार में दुर्लभ meiotic घटनाओं का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस सीमा bisdichloroacetyldiamine के साथ चूहों इंजेक्शन से दूर किया जा सकता है, विन १८,४४६, जो विटामिन ए चयापचय और रुक जाती है spermatogonial विभेदन३३ब्लॉक. १८,४६६ जीत के साथ उपचार के बाद, शुक्राणुजनन की बहाली तुल्यकालिक हो जाएगा, एक परिपक्व जानवर३४से समृद्ध रोगाणु कोशिका आबादी की बड़ी मात्रा में उपज । इस तुल्यकालन रणनीति पहले अर्द्ध के बीच मतभेद की जांच करने के लिए tubule स्क्वैश तकनीक से पहले इस्तेमाल किया जा सकता है उन है कि वयस्क में होने के लिए शुक्राणुजनन की तुल्यकालिक तरंगों३५,३६, ३७. इसके अलावा, पैतृक उंर बढ़ने और aneuploidy के बीच संबंध भी जीत १८,४६६ तुल्यकालन और tubule स्क्वैश विधि के साथ गुणसूत्र अलगाव का आकलन का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।

संक्षेप में, इस विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अधिक मोटे तौर पर लागू, इस तकनीक को भी spermatogonia, spermatocytes और spermatids की उप आबादी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और शुक्राणुजनन के दौरान प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए सिलवाया जा सकता है । इस दृष्टिकोण spermatocytes के लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, और सेलुलर और जैव रासायनिक अध्ययन३८,३९,४०की एक किस्म का संचालन करने के लिए संशोधित । tubule स्क्वैश तकनीक माउस और चूहे सेमिनीफेरस नलिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया है, सुझाव है कि यह आसानी से मानव४०सहित अंय स्तनधारी प्रणालियों, के लिए लागू किया जाना चाहिए । यह तकनीक सेलुलर perturbations को परिभाषित करने में मदद कर सकती है जो बांझपन और शुक्राणु aneuploidy को जन्म देती है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIGMS (R01GM11755) द्वारा P.W.J. को और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NIH) (CA009110) से S.R.W. और J.H. को एक प्रशिक्षण अनुदान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था
 

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Electron Microscopy Sciences (EMS) 15710
10x PBS Quality Biological 119-069-161
Triton X-100 Sigma T8787
BSA Sigma A1470
Horse Serum Sigma H-1270
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated CellTreat P886-229638
Poly-L-lysine coated glass slides Sigma P0425-72EA
Liquid Blocker Pen Electron Microscopy Sciences (EMS) 71310
Humid Box Evergreen 240-9020-Z10
Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides Fisher 08-813E
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
Microscope Cover Slides (22mmx60mm) Fisher 12-544-G
Clear Nail Polish Amazon N/A
Microsopes
Name Company Catalog Number Comments
SteREO Discovery.V8 Zeiss 495015-0001-000 
Observer Z1 Zeiss 4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 blue edition image software Zeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS camera Hamamatsu
Primary Antibodies
Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti-SYCP3 Santa Cruz sc-74569 1 in 50
Rabbit anti-SYCP3 Fisher (Novus) NB300-231 1 in 1000
Goat anti-SCP3 Santa Cruz sc-20845 1 in 50
Human anti-Centromere Protein Antibodies Incorporated 15-235 1 in 100
Mouse anti-alpha tubulin Sigma T9026 1 in 1000
Mouse anti-AIM1 BD Biosciences 611082 1 in 200
Mouse anti-γH2AX Thermo Fisher MA1-2022 1 in 500
Mouse anti-CENT3 Abnova H00001070-M01 1 in 200
Rabbit anti-pericentrin Abcam ab4448 1 in 200
Rabbit anti-REC8 Courtesy of  Dr. Karen Schindler N/A 1 in 1000

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References

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Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model. J. Vis. Exp. (132), e56453, doi:10.3791/56453 (2018).

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