Summary
Målet med denne tubule squash teknikken er å raskt vurdere fargemaskin funksjoner for å utvikle musen spermatocytes samtidig som du beholder mobilnettet integritet. Denne metoden muliggjør studiet av alle faser av spermatogenesis, og kan enkelt implementeres sammen med andre biokjemiske og molekylære biologiske metoder for studier av musen meiose.
Abstract
Meiotic progresjon hos menn er en prosess som krever felles handlingen av en rekke sterkt regulerte mobilnettet hendelser. Feil som oppstod under meiose kan føre til sterilitet, graviditet eller genetiske defekter. Begynner ved utbruddet av puberteten og fortsetter gjennom voksen alder, kontinuerlig halvsynkron bølger av spermatocytes gjennomgå spermatogenesis og til slutt danne haploid sperm. Den første bølgen av musen spermatocytes gjennomgår meiotic innvielsen vises på dag 10 post-partum (10 dpp) og slippes lumen av seminiferous tubules som modne sædceller på 35 dpp. Derfor er det en fordel å bruke mus i denne utviklingsmessige-vinduet for å få høyanriket bestander av interesse. Analyse av sjeldne celle stadier er vanskeligere i eldre mus på grunn av bidrag av påfølgende spermatogenic bølger, som øke mangfoldet av mobilnettet befolkningen i på tubuli. Metoden beskrevet her er en lett implementert teknikk for fargemaskin vurdering av cellene innen de seminiferous tubules mus, inkludert spermatogonia, spermatocytes og spermatids. Tubule squash teknikken opprettholder integriteten til isolerte mannlige bakterie celler og tillater undersøkelse av cellulære strukturer som ikke er lett å visualisere med andre teknikker. For å demonstrere de mulige anvendelser av denne tubule squash teknikken, ble spindelen montering kartlagt i spermatocytes komme videre gjennom prophase til metaphase jeg overgang (G2/MI overgang). I tillegg ble centrosome duplisering, meiotic sex-kromosom inaktivering (MSCI) og kromosom bukett formasjon vurdert som eksempler på fargemaskin strukturer som kan observeres med denne tubule squash metoden. Denne teknikken kan brukes til å finne bestemte feil under spermatogenesis forårsaket av mutasjoner eller eksogene forstyrrelsene, og dermed bidrar til våre molekylære forståelse av spermatogenesis.
Introduction
Meiose er en kompleks mobilnettet hendelse som én enkelt runde med utryddelse er fulgt av to påfølgende rundene av cellen divisjon. Flere meiose-spesifikke hendelser koordineres under den innledende stadiet av meiose å sikre nøyaktige kromosom raseskille. Disse hendelsene inkluderer ferdigstillelse av homologe rekombinasjon, co retningen på søster kinetochores under den første meiotic divisjonen, og gradvis tap av cohesin komplekser løse chiasmata mellom homologs. Presis regulering av disse prosessene er å opprettholde fruktbarhet og hindre kromosom missegregation hendelser som kan føre til genetisk utviklingsforstyrrelser og spontan abort1.
Mens de viktigste hendelsene i meiose finne sted i både hanner og hunner, forskjeller betydelig timelige og mekanistisk mellom spermatogenesis og oogenesis2. For eksempel under kvinnelige meiose, prophase jeg oppstår under embryonale utviklingen og arrestasjoner på dictyate scenen før puberteten. Derimot starter spermatogenesis på puberteten og utvikler seg i bølger over hele voksenlivet uten arrestasjon. Forskjellene mellom mannlige og kvinnelige meiose understreker behovet for å utvikle metoder som er spesielt rettet mot vurdere disse prosessene i både spermatocytes og oocytes. Foreløpig avhengig vurdering meiotic progresjon i stor grad av bruk av chromatin sprer3,4,5. Mens chromatin oppslag er nyttig for å studere meiotic kromosomer, mislykkes de å bevare mobilnettet integritet, hindrer evaluering av cellulære strukturer som spindel piskehale som henger, centrosomes, kjernefysiske konvolutten og telomere vedlegg. Live bildebehandling og langsiktig dyrking teknikker har sterkt avansert vår forståelse av kvinnelige meiose; lignende tilnærminger til å visualisere hele intakt cellen, men implementeres sjeldnere for studier av spermatogenesis6,7. For å visualisere dynamisk arrangementer gjennom hele mannlige meiose, har vi tilpasset etablerte tubule squash teknikker for å raskt vurdere fargemaskin funksjonene for å utvikle musen spermatocytes8,9. Metoden beskrevet her opprettholder integriteten til cellen, muliggjør studiet av flere cellulære strukturer under ulike stadier av spermatogenesis.
Denne tubule squash teknikken er en hele cellen tilnærming, som tillater for vurdering av cellulære strukturer via immunofluorescence mikroskopi. Felles histologiske tilnærminger til å visualisere meiotic progresjon i mannlige mus som haematoxylin og eosin flekker av parafin innebygd testiklene, og immunofluorescent merking av cryosections gir en bred oversikt over meiotic progresjon. Men disse teknikkene ikke løse enkeltceller grad for detaljert analyse av hendelser oppstår gjennom meiose10,11. Alternative teknikker for å visualisere meiotic prosesser er avhengige av betydelig chemiosmotic avbrudd i spermatocyte å isolere og løse kjernefysisk materiale3,4,5. Disse kjemiske behandlinger hindre observasjon av celletyper enn primære spermatocytes. En nylig beskrevet metoden av Namekawa har aktivert forskningen fellesskapet å bevare kjernefysiske arkitektur isolert spermatocytes, men krever bruk av en cytospin og tilbehør som ikke kan være lett tilgjengelig for noen laboratorier4. Tubule squash teknikken krever derimot bare utstyr som er vanligvis standard i de fleste celle biologi laboratorier.
Tubule squash metoden beskrevet her kan brukes å visualisere de ulike celletyper innen den seminiferous tubule, inkludert sertoli celler, spermatogonia, primære og sekundære spermatocytes og spermatids. Ved å koble denne teknikken med nær-synkron første bølgen av spermatogenesis i juvenile mus, er det mulig å få beriket bestander av spermatogenic celler som de fremskritt gjennom meiose12. Denne prosessen tillater den detaljerte analysen av prosessene i spermatogenesis, for eksempel tidlig prophase hendelser, G2/MI og metaphase anaphase overganger, og spermiogenesis. Videre kan tubule squash preparater brukes å visualisere fargemaskin funksjoner av kromosomer (interchromatid domener (ICDs) og kinetochores) og centrosomes (centrioles og pericentriolar materiale/matriser). Metoden squash kan lett utføres parallelt med andre eksperimentelle tilnærminger, som chromatin oppslag og protein utvinning. Dessuten, er denne teknikken ble endret for å sette inn levende spermatogenic celler på lysbilder for direkte visualisering13.
Metoden beskrevet her innebærer en hele cellen seminiferous tubule squash teknikk for å analysere G2/MI overgangen i vill-type C57BL/6J mus. Fargemaskin funksjonene i primære spermatocytes inn første meiotic divisjon ble visualisert med immunofluorescence mikroskopi å observere meiotic spindelen. Denne allsidige teknikken kan enkelt endres for å se andre meiotic stadier og forskjellige celletyper. Teknikken er også mottakelig for alternative visualisering strategier, som DNA og RNA fisk tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av mus ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruke komiteen av Johns Hopkins University. Eksperimenter ble utført på juvenil (20-26 dager post-partum, dpp) C57BL/6J mus, utnytter den halvsynkron første bølgen av spermatogenesis. Men kan denne teknikken også utføres med voksen mus.
1. disseksjon og isolasjon av musen seminiferous tubules
- Forberede fastsette/løsning og antistoff fortynning lyseringsbuffer (ADB) i tabell 1 og tabell 2.
- Forberede en 35 mm Petriskål med 3 mL 1 x fosfat bufret saltvann (1 x PBS, pH 7.4), og en annen 35 mm fat med 2 mL fastsette/lysis per musen.
- Ofre musen via cervical forvridning eller CO2 kvelning og spray ventrale magen med 70% etanol. Åpne abdominopelvic hulrom bruker sterilt saks, gjør en V-formet åpning. Deretter fjerne testiklene ved å trekke på epididymal fett puten ved hjelp av pinsett og unngå å forstyrre tunika albuginea. Sett prøvene i en 35 mm Petriskål som inneholder 1 x PBS.
Merk: Benytte den første bølgen av spermatogenesis for å observere en beriket celle befolkning på rundt14. Bestemt stadier av spermatogenesis er beriket på annen mus aldre (tabell 3). - Fjerne den testicular tunika albuginea ved punktering vevet med skarpe tippet tang og samle de løs seminiferous tubules. Overføre på tubuli til en ny 35 mm Petriskål inneholder 2 mL fastsette/lysis løsning.
- Inkuber tubules i fastsette/lysis løsningen for 5 min ved romtemperatur.
2. forberedelse av seminiferous tubules
- Forberede en poly-L-lysine tonet glass lysbilde ved å disponere kantene av lysbildet med en flytende blokkering.
- Bruke 100 µL fastsette/lysis løsning på midten av av objektglass.
- Ved hjelp av sterile pinsett og saks forsiktig erte hverandre seminiferous tubules. Kutte ut lenge individuelle tubule segmenter ca 20 mm i lengde.
Merk: Visualisere strukturer som er følsomme for langvarig etappe, den stabiliserende eksponering, som centrosomes, skille på tubuli først i 1 x PBS, og deretter direkte hakke på tubuli på overflaten av poly-lysine lysbildene belagt i 100 µL av fastsette-lysis løsning. - Overføre fem 20 mm lange seminiferous tubule segmenter til forberedt poly-L-lysine tonet glass lysbilde som inneholder fastsette/lysis løsning.
- Bruke sterilt saks hakke seminiferous tubules i 1.5 til 3.0 mm segmenter.
- Bruke sterilt tang ordne tubule segmentene på glass lysbildet slik at ingen vev overlapper, og på tubuli fordeles jevnt.
Merk: Det optimale antallet tubule segmenter på et glass lysbilde er mellom 20 og 40.
3. squashing av seminiferous tubules
- Overføre glass lysbilde som inneholder spredt seminiferous tubule segmenter til en Borstemmaskin. Fjern overflødig væske med et laboratorium tørke for å unngå å miste vev i squash-trinn.
- Bruke en dekkglassvæske (22 x 60-1,5 mm) på toppen av objektglass og bruke press med hælen av hånden i 10-20 sekunder. Det er viktig å bruke nok makt å spre spermatocytes fra seminiferous tubules.
Merk: Observere på tubuli bruker disseksjon mikroskop for å optimalisere sammenklemmingen trinnet slik at alle tubule segmenter er avbrutt. - Bruker lysbildet tang, umiddelbart flash fryse av objektglass i en liten dewar væske N2 i 15 sekunder, eller til væsken opphører å boble. Hvis immunolabeling fjerner umiddelbart, dekkglassvæske med rette kant razor blad, fine tips tang eller 21-gauge nål.
Merk: For optimale resultater, immunolabel lysbildene umiddelbart (se trinn 4). Men kan på dette punktet lysbilder bevares ved-80 ° C i opptil to uker. For å maksimere levetiden til proteiner og cellular strukturer, umiddelbart Lagre lysbilder tørris eller overføring til-80 ° C fryser, og holde dekkglassvæske på lysbildet. Når immunolabeling lagret lysbilder, Fjern dekkglassvæske ved immersing lysbildene i flytende N2 i 15 sekunder, som beskrevet i trinn 3.3.
4. Immunolabeling av montert seminiferous tubules
- Fordype lysbildet i 1 x PBS og vask tre ganger for 5 min med en 50 mL Coplin glasset som inneholder 1 x PBS.
Merk: La aldri lysbildene for å helt tørre under immunolabeling. - Bruke 1 mL av antistoff fortynning buffer på objektglass blokkere for 1-2 h i en fuktet kammer.
- Fjern antistoff fortynning bufferen og bruke 100 µL primære antistoff fortynnet i antistoff fortynning buffer i en fuktet kammer.
Merk: De beste resultatene ruge primære antistoffer overnatting på 4 ° C. Bruk mindre mengder antistoff (f.eks 50 µL) ved å dekke lysbildet med en dekkglassvæske eller parafilm. Valider og optimalisere primære antistoffer15. - Skyll lysbilder tre ganger i 5 minutter i en 50 mL Coplin glasset som inneholder 1 x PBS.
Merk: Forbedre vasker, agitere Coplin glass ved hjelp av en liten magnetic røre bar og plassere på en tallerken magnetic røre ved lav hastighet, eller Coplin glasset på en tabletop mikser ved lav hastighet. - Bruke 100 µL sekundære antistoff fortynnet i antistoff fortynning buffer for 1 til 1,5 timer i en fuktet kammer ved romtemperatur. Inkuber lysbildene i en mørk for å unngå Foto bleking av fluorophore konjugerte antistoffer.
Merk: Bruk mindre mengder antistoff (f.eks 50 µL) ved å dekke lysbildet med en dekkglassvæske eller parafilm. - Skyll lysbilder to ganger i 5 minutter i en 50-mL Coplin glasset som inneholder 1 x PBS.
- Montere lysbildene i montering medium som inneholder 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) og bruke coverslips (22 x 60-1,5 mm).
- Forsegle coverslips på lysbildene med klart neglelakk å bevare lysbildene og hindre at coverslips bevegelse.
5. analyse og tenkelig tubule squash forberedelser
- Bruk en epifluorescence mikroskop med automatisert scenen som gir presis z bevegelse og en høyoppløselig kameraet for avbildningsopptak. Alternativt bruke laser AC confocal mikroskop.
Merk: Bruke alle tilgjengelige maskinvare og programvare for dette trinnet. For eksempel ble bilder som vises i figur 1 og figur 2 tatt med en Zeiss celle observatør Z1 knyttet til en ORCA-Flash 4.0 CMOS-kamera og analysert med Zeiss ZEN 2012 blå edition bilde-programvare. - Vurdere lysbildene ved hjelp av en 20 X målsetting for å fastslå kvaliteten på squash utarbeidelse. God kvalitet lysbilder har en monolayer av kjerner som fordeles jevnt.
Merk: Noen deler av lysbildet kan være bedre enn andre, det er nyttig å merke koordinatene til der de beste regionene i lysbildet finnes for videre analyse ved hjelp av høyere forstørrelse. - Bruke høyere forstørrelse mål (f.eks 63 X eller 100 X) fange områder av lysbildet som har en konsekvent monolayer av kjerner. Når et område er valgt, angir øvre og lavere Z-stabler for å sikre at alt i fokus lys er fanget.
Merk: Det optimale antallet Z-stabler fanget mellom øvre og nedre grensen angis vanligvis av bilde oppkjøpet og er forskjellig for hver målsetting. - Bruk bildebehandlingen kompilere et utvidet dybde fokus bilde. Programmet kombinerer i fokus lyset fra hver Z stabel, og er viktig for optimal imaging tubule squash forberedelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her, har vi brukt tubule squash metoden for å visualisere forbigående celle populasjoner gjennomgår prophase å metaphase jeg (G2/MI) overgang som ble beriket av høsting testiklene fra juvenile vill-type mus under den første bølgen av spermatogenesis (24 DPP). Figur 1 viser representant bilder av de ulike celle stadiene som kan visualiseres ved hjelp av metoden tubule squash. Beriket av metaphase jeg spermatocytes var visualisert ved hjelp av antistoffer mot alpha-tubulin (figur 1A). Vi utnyttet markører for tidlige og sene meiose jeg til scenen meiotic progresjon. Tubule squash forberedelsene immunolabeled med et antistoff synaptonemal kompleks protein, SYCP3, visualisere stadier av prophase I. Leptotene/zygotene og pachytene/diplotene spermatocytes er vist i figur 1B. Spermatocytes gjennomgår den første meiotic divisjonen kan være tydelig identifisert ved hjelp av antistoffer mot alpha-tubulin (figur 1A og 1 C). For å studere sent meiotic hendelser, var tubule saft immunolabeled ved hjelp av antistoffer mot celle syklus kinase Aurora B (AURKB), som regionaliserer til den indre centromere under metaphase, deretter relocalizes til spindelen midzone og cleavage fure under anaphase og cytokinesis, henholdsvis (figur 1 c). Fargemaskin funksjoner av kromosomer var visualisert under den første meiotic divisjonen. For å observere ICDs, tubule squash forberedelsene ble immunolabeled ved hjelp av antistoffer mot meiose-spesifikke alpha-kleisin delenhet i cohesin, REC8 (figur 1 d). Kromosom dynamics under anaphase ble vurdert alpha-tubulin immunolabelling og DNA flekken, DAPI. En spermatocyte å fullføre den første meiotic divisjonen er vist i figur 1E, mens en spermatocyte som inneholder en anaphase bro er vist i figur 1F. Bruke tubule squash teknikk, meiotic spindel lengde, kan kromosom justering og segregering måles og forhold mellom mutant og kontroll mus.
Nytten av denne metoden for visualisering av ekstra cellen syklus overganger og subcellular konstruksjoner knyttet prophase jeg er vist i figur 2. Under leptotene substage av prophase er I initiering av homologe kromosomer sammenkobling formidlet av dynamiske endringer i telomere vedlegg å indusere dannelsen av kromosom klynger mot en enkelt stang kjernefysiske konvolutten (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. dette konformasjon, kjent som kromosomet "bukett" antas å øke sannsynligheten og hyppigheten av Inter homolog vekselsvirkningene (figur 2A). Initiering og gjennomføring av Adept mellom homologe kromosomer oppstår under zygotene (figur 2B) og pachytene substages (figur 2C), henholdsvis tilsvarende med progressiv spredning av den Kromosom bukett. Å vurdere samtidig Adept og kromosom bukett dynamikken i juvenile mus, vi immunolabeled tubule squash preparater med antistoffer mot SYCP3 og centromeres, og farget for DNA ved hjelp av DAPI. Mus-kromosomene er telocentric, derfor centromere immunolabeling ble brukt til å registrere endringer i telomere NE vedlegg.
Meiotic sex-kromosom inaktivering (MSCI) er et kjennetegn som er unike for mannlige meiose, der ikke-homologe X og Y kromosomer omgå checkpoint aktivisering ved gjennomgår kromosom hele fosforylering histone variant H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. X-og Y-kromosom paret er transcriptionally forstummet og compartmentalized inn et tett kjernefysiske underdomene kalt "sex kroppen." Spermatocytes gjennomgår MSCI kan lett kjennemerke under pachytene og diplotene substages av immunolabeling tubule squash preparater med antistoffer til yH2AX (Ser139). Figur 2D viser en spermatocyte på pachytene substage immunolabelled med antistoffer mot yH2AX (Ser139), centromeres og farget med DAPI å visualisere DNA.
Centrosome duplisering er semi-konservativt og oppstår under prophase I av mannlige meiose ved ferdigstillelse av DNA reparasjon for å sikre at hver resulterende datter celle arver to centrioles (en centrosome) etter celledeling24,25 . Centrosomes består av to ortogonalt arrangert centrioles forbundet med en fleksibel linker og er omgitt av en amorf matrise av proteiner kalles pericentriolar materiale/matrise (PCM)26. Etter duplisering i pachytene-substage, dannet nylig centriole par løsner fra hverandre og gjennomgå centrosome modning og migrasjon til motsatt poler under diplotene stadium å lette dannelsen av bipolar spindler. En tidlig diplotene spermatocyte gjennomgår disjunksjon nyopprettede centriole par var visualisert ved immunolabeling tubule squash preparater med antistoffer mot pericentrin (PCNT), en proteinkomponenter PCM og Centrin-3 (CETN3) merke centrioles (figur 2E). Oppsetningen var bestemmes ved hjelp av antistoffer mot SYCP3, og DAPI ble brukt stain DNA.
Figur 1 : Representant analyse av meiotic G2/MI overgangen ved hjelp tubule squash forberedelser. Tubule squash forberedelsene ble utført på seminiferous tubule segmenter av C57BL/6J mus alderen 24 dpp. (A) representant feltet utvikle spermatocytes immunolabeled med antistoffer mot alpha-tubulin (rød), centromeres (grønn) og DNA flekken DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blå). (B) vill-type tubule saft var farget med DAPI (blå) og immunolabeled med antistoffer mot alpha-tubulin (rød), og den laterale elementet i SC, SYCP3 (grønn). (C) vill-type tubule saft var farget med DAPI (blå) og immunolabeled med antistoffer mot alpha-tubulin (rød) og celle syklus kinase AURKB (grønn). Fargemaskin funksjoner av kromosomer som ICDs og anaphase broer kan visualiseres ved hjelp av tubule squash forberedelser. (D) for å observere ICDs, prometaphase spermatocytes var immunolabeled med antistoffer mot centromeres (rød) og en meiotic bestemte cohesin komponent, REC8 (grønn) og farget med DAPI (blå). (E, F) Kromosom morfologi var visualisert under anaphase bruker antistoffer mot alpha-tubulin (rød), centromeres (grønn), og DAPI beis (blå). Komplette utvikle spermatocytes kan identifiseres ved hjelp av tubule squash teknikk (L/Z, leptotene/zygotene fase spermatocytes; P/D, pachytene/diplotene fase spermatocytes; PM, prometaphase spermatocytes; M, metaphase spermatocytes; A, anaphase spermatocytes). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempler på morfologiske endringer og strukturer som er tilknyttet meiotic prophase progresjon i menn med tubule squash forberedelser. Tubule squash forberedelsene ble utført på seminiferous tubule segmenter av C57BL/6J mus i alderen 12-18 dpp og var farget med DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blå) merke DNA. (A-C) Homolog Adept er koplet til dannelse og progressiv spredning av kromosom "bukett" under prophase progresjon. Leptotene (A), zygotene (B)og pachytene (C) scenen spermatocytes var immunolabeled med antistoffer mot SYCP3 (rød) og centromeres (grønn). (D-E) Tubule squash preparater kan brukes til å oppdage unike fargemaskin endringer og strukturer i mannlige prophase jeg progresjon inkludert meiotic sex-kromosom deaktivering (MSCI) og centrosome duplisering. (D) Pachytene scenen spermatocytes gjennomgår MSCI ble oppdaget ved hjelp av antistoffer mot yH2AX (Ser139) merke sex-kroppen (grønn, pilspiss), og centromeres vises i rødt. (E) Diplotene scenen spermatocytes ble identifisert med antistoffer mot SYCP3 (rød) og centrosomes (pilspiss) ble oppdaget ved hjelp av antistoffer mot Centrin-3 (grønn) og Pericentrin (rosa) merke centrioles og pericentriolar materiale/matrise, henholdsvis. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Element | Beløp | Siste konsentrasjon |
| 1 x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 ΜL | 0,8% (v/v) |
| 10% TritonX-100 i PBS | 100 ΜL | 0,1% (v/v) |
Tabell 1: fastsette/lysis løsning. Beskrivelse: Justere pH 9 med NaOH [50mM]. Vikle av løsning i aluminiumsfolie beskytte fra lys og lagre på 4 ° C. Bruk ikke fastsette/lysis løsningen hvis mer enn en uke gamle. Solid PFA kan også brukes til å gjøre løsningen. Bruk av en fumehood anbefales å unngå PFA eksponering.
| Element | Beløp | Siste konsentrasjon |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (w/v) |
| Hest Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% TritonX-100 i PBS | 250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabell 2: antistoff fortynning buffer (ADB) oppskrift. Beskrivelse: Store ADB på 4 ° C eller fryse aksjer på 20 ° C hvis gjør større mengder. ADB kan bli forurenset, gode aseptiske teknikker brukes og vurdere løsningen for forurensning før bruk. Forberede mindre dele ADB å redusere forurensning.
| Celle type | Mobilnettet prosessen | Musen alder (dpp) |
| Leptotene | DNA DSB formasjon | 10 - 12 |
| Montering av aksial elementer | ||
| Zygotene | Initiering av homologe DSB reparasjon og Adept | 12 - 16 |
| Pachytene | Autosomal DSB reparasjon er fullført | 16 - 20 |
| Modning av crossover rekombinasjon hendelser | ||
| Komplett Adept mellom homologs | ||
| Meiotic Sex-kromosom inaktivering (MSCI) | ||
| Centriole kopiering/Centrosome modning | ||
| Diplotene og Diakinesis | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Centrosome separasjon | ||
| Metaphase jeg | Spindel Checkpoint | 22 - 26 |
| Runde Spermatid | Protamine erstatning | > 24 |
| Acrosome formasjon |
Tabell 3: nær synkron første bølgen av spermatogenesis i juvenile mus. Beskrivelse: Bestemt stadier av spermatogenesis er beriket på ulike stadier av juvenile musen utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus har vist seg for å være en nyttig modell organisme for å studere mobilnettet hendelsene som styrer meiotic progresjon i spermatogenesis. Videre, det er nødvendig å utvikle verktøy rettet til studiet av spermatogenesis fordi mange arrangementer, som ut fra meiotic prophase jeg, er dekket av hvit. Denne protokollen beskriver seminiferous tubule squash metode for visualisering og studie av ulike stadier av musen spermatogenesis. Denne metoden beholder mobilnettet integritet, og gir dermed detaljerte analyser av kjernefysisk og cytoplasmatiske strukturer. Representant resultatene avbildet i denne studien viser nytten av denne protokollen vurdere primære spermatocytes gjennomgår meiotic progresjon. Dessuten, denne protokollen kan også brukes til å studere andre cellulære prosesser under spermatogenesis, inkludert spredning og differensiering av spermatogonia og av spermiogenesis27,28. Metodene beskrevet ligger er tilpasset fra tidligere beskrevet tubule squash teknikker8,9. Men er denne protokollen den første detaljert guiden som dekker alle reagenser og trinnene som er nødvendig, å få på tubuli å visualisere enkeltceller via fluorescens mikroskopi. Videre har vi presentert bilder på flere cellulære funksjoner, inkludert centriole og telomere buketten, som kan visualiseres med teknikken.
Det er noen tekniske elementer som er sentrale for å optimalisere tubule squash forberedelser. Først må man søke riktig mengde kraft glass dekkglassvæske. Unnlatelse av å bruke tilstrekkelig styrke vil produsere lysbilder med noen tilhenger celler, som de fleste cellene skal fortsette seminiferous tubules. Dernest må en ruge testikkel materiale i fastsette/lysis løsningen for et passende tidsrom. Vanligvis fiksering bør begrenses til 5 min, men mellom 5 og 15 min er akseptabelt. Tubuli som er løst i en lengre periode vil være vanskelig å manipulere og gir dårlige resultater. Det er imidlertid mulig å forlenge inkubasjon tiden ved å redusere konsentrasjonen av PFA. For eksempel senke prosent PFA 0,5% ville tillate økt inkubasjon ganger i fastsette/lysis løsningen. I metoden vi har presentert, utføres permeabilization og fiksering trinnene samtidig, men fremgangsmåten kan utføres etter hverandre, henholdsvis. Skille permeabilization og fiksering trinnene kan bidra til å redusere konsentrasjonene av cytoplasmatiske bakgrunn signal. Variant av fiksering og/eller permeabilization strategier kan også testes for å optimalisere vilkårene for vurdering av en bestemt subcellular struktur eller antistoff. For eksempel visualisering av centrosomal og spindel proteiner kan styrkes med metanol i stedet for PFA29,30,31. I tillegg er det gunstig å bruke juvenile musene som utvikler seg gjennom den første bølgen av spermatogenesis (ca 10-26 dpp) for å spesifikt og robust visualisere sjeldne meiotic mobilnettet hendelser12. Alternativt er det mulig å isolere scenen-spesifikke meiotic celler fra voksen mus ved å observere lys absorpsjon mønsteret i seminiferous tubule32. Gitt den asynkrone syklusen av spermatogenesis i voksen mus, men kan analysere sjeldne meiotic hendelser i detalj være utfordrende. Denne begrensningen kan overvinnes ved å injisere mus med bisdichloroacetyldiamine, vinne 18,446, som blokkerer vitamin A metabolisme og stopper spermatogonial differensiering33. Etter behandling med vinne 18,466, gjenopptakelse av spermatogenesis skjer synkront, gir store mengder beriket bakterie celle populasjoner fra en eldre dyr34. Denne synkroniseringen strategien kan brukes før tubule squash teknikken til å undersøke forskjellene mellom første halvsynkron bølger spermatogenesis til de som oppstår i voksen35,36, 37. videre sammenheng mellom faderlige aldring og aneuploidy kan også bli vurdert ved hjelp vinne 18,466 synkronisering og vurdere kromosom segregering med metoden tubule squash.
I sammendraget, kan denne metoden brukes sammen med immunofluorescence mikroskopi for å observere celler i ulike stadier av spermatogenesis. Brukt videre, denne teknikken kan også brukes til å vurdere undergrupper av spermatogonia, spermatocytes og spermatids, og kan skreddersys for å studere en rekke prosesser under spermatogenesis. Denne tilnærmingen er brukt for levende celle imaging av spermatocytes, og endres til et mangfold av mobilnettet og biokjemiske studier38,39,40. Tubule squash teknikken er brukt for musen og rotten seminiferous tubules, antyder at det bør lett brukes på andre pattedyr systemer, inkludert menneskelige40. Denne teknikken kan bidra til å definere de cellulære forstyrrelser som gir opphav til infertilitet og sperm aneuploidy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIGMS (R01GM11755) til P.W.J. og en trening grant fellowship fra National Cancer Institute (NIH) (CA009110) S.R.W. og J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
