Summary
O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.
Abstract
Meiótica progressão nos machos é um processo que exige a acção concertada de uma série de eventos celulares altamente regulamentados. Erros que ocorrem durante a meiose podem levar à infertilidade, perda de gravidez ou defeitos genéticos. Começando no início da puberdade e ao longo da vida adulta, contínuas ondas semisíncronas de espermatócitos submetido a espermatogênese e, finalmente, formam espermatozoides haploides. A primeira onda de espermatócitos de rato em fase meiótica iniciação aparecem no 10º dia pós-parto (dpp 10) e são liberados no lúmen dos túbulos seminíferos como esperma madura no dpp 35. Portanto, é vantajoso utilizar ratos dentro desta janela de tempo do desenvolvimento, a fim de obter populações altamente enriquecidas de interesse. Análise dos estágios de célula rara é mais difícil em ratos mais velhos devido à contribuição das sucessivas ondas espermatogênico, que aumentam a diversidade das populações celulares dentro dos túbulos. O método descrito aqui é uma técnica facilmente implementada para a avaliação citológica das células encontradas nos túbulos seminíferos dos ratos, incluindo espermatogónias espermatócitos e espermátides. A técnica de abóbora túbulo mantém a integridade das células germinativas masculinas isoladas e permite a análise das estruturas celulares que não são facilmente visualizados com outras técnicas. Para demonstrar as possíveis aplicações desta técnica de abóbora do túbulo, montagem do eixo foi monitorada em espermatócitos progredir através da prófase para metáfase que eu transição (transição G2/MI). Além disso, duplicação centrossoma, inativação do cromossomo meiótico de sexo (MSCI) e formação de cromossomo buquê foram avaliados como exemplos das estruturas citológicas que podem ser observadas usando esse método de abóbora do túbulo. Esta técnica pode ser usada para identificar defeitos específicos durante a espermatogênese causadas por mutação ou perturbação exógena, e assim, contribui para a nossa compreensão molecular da espermatogênese.
Introduction
Meiose é um evento complexo celular em que uma única rodada de replicação do DNA é seguida por duas rondas sucessivas de divisão celular. Vários eventos de meiose específicos devem ser coordenados durante os estágios iniciais da meiose para garantir a segregação do cromossomo precisos. Estes eventos incluem a conclusão de recombinação homóloga, co a orientação da irmã cinetócoros durante a primeira divisão meiótica e a perda gradual de cohesin complexos para resolver chiasmata entre homologs. Regulamento preciso destes processos é necessário para manter a fertilidade e evitam que podem levar a disfunções no desenvolvimento genéticas e aborto espontâneo1cromossoma missegregation eventos.
Enquanto os principais eventos da meiose ocorrem em machos e fêmeas, existem diferenças significativas de temporais e mecanicistas entre espermatogênese e a ovogênese2. Por exemplo, durante a meiose feminina, prófase I ocorre durante o desenvolvimento embrionário e prende no estágio de Dictióteno até a puberdade. Em contraste, a espermatogênese começa na puberdade e progride em ondas por toda a vida adulta, sem prisão. As diferenças entre masculino e feminino meiose enfatiza a necessidade de desenvolver métodos que são servidos especificamente para avaliar estes processos em espermatócitos e oócitos. Atualmente, avaliar progressão meiótica em grande parte se baseia na utilização de cromatina se espalha3,4,5. Enquanto cromatina spreads são úteis para o estudo de cromossomos meióticos, eles falham preservar a integridade celular, impedindo a avaliação de estruturas celulares como os microtúbulos do fuso, centrossomas, o envelope nuclear e anexos dos telômeros. Ao vivo de imagens e técnicas de cultivo a longo prazo avançaram muito nossa compreensão da meiose feminina; abordagens semelhantes para visualizar toda a célula intacta, no entanto, são menos frequentemente implementadas para o estudo da espermatogênese6,7. A fim de Visualizar eventos dinâmicos durante a meiose masculina, adaptaram-se técnicas de abóbora túbulo estabelecido para avaliar rapidamente as características citológicas de desenvolver rato espermatócitos8,9. O método descrito aqui mantém a integridade da célula, permitindo o estudo de várias estruturas celulares durante diferentes estágios da espermatogênese.
Esta técnica de abóbora do túbulo é uma abordagem de célula inteira, o que permite a avaliação de estruturas celulares através de microscopia de imunofluorescência. Abordagens histológicas comuns Visualizar meiótica progressão em ratos masculinos como hematoxilina e eosina mancha de parafina incorporado testículos e rotulação de imunofluorescência de cryosections permitem uma visão ampla da progressão meiótica. No entanto, essas técnicas não conseguem resolver células únicas na medida do necessário para uma análise detalhada dos eventos ocorridos durante a meiose10,11. Técnicas alternativas para visualizar processos meióticos dependem quimiosmótica significativa perturbação para a maturação para isolar e corrigir materiais nucleares3,4,5. Estes tratamentos químicos dificultam a observação dos tipos de célula diferentes espermatócitos primários. Um método recentemente descrito por Namekawa permitiu que a comunidade de pesquisa preservar a arquitetura nuclear de espermatócitos isolados, mas requer o uso de um cytospin e acessórios que podem não estar prontamente disponíveis para alguns laboratórios4. Em contraste, a técnica de abóbora túbulo requer apenas o equipamento que é geralmente padrão na maioria dos laboratórios de biologia celular.
O método de abóbora túbulo descrito aqui pode ser usado para visualizar os tipos de célula diversos encontrados dentro do túbulo seminífero, incluindo células de sertoli, espermatogónias, espermatócitos primários e secundários, espermátides e. Por esta técnica de engate com a primeira onda perto-síncrono de espermatogênese em camundongos juvenis, é possível obter populações enriquecidas de células espermatogênico medida que progridem através de de meiose12. Este processo permite a análise detalhada dos processos em toda a espermatogênese, como primeiros eventos da prófase, metáfase, a anáfase transições e acridina e G2/MI. Além disso, preparações de abóbora túbulo podem ser usadas para visualizar características citológicas dos cromossomas (por exemplo, domínios interchromatid (ICDs) e cinetócoros) e centrossomas (centríolos e pericentriolar material/matrizes). O método de abóbora pode ser prontamente executado em paralelo com outras abordagens experimentais, tais como cromatina spreads e extração de proteínas. Além disso, esta técnica foi modificada com sucesso para depositar as células espermatogênico em lâminas para visualização directa13.
O método descrito aqui envolve uma técnica de abóbora de tubo seminífero células inteiras para analisar a transição G2/MI em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem. As características citológicas de espermatócitos primários, entrando a primeira divisão meiótica foram visualizadas com microscopia de imunofluorescência para observar o fuso meiótico. Esta técnica versátil pode ser facilmente modificada para visualizar outros estágios meióticos e diferentes tipos de células. A técnica também é passível de estratégias de visualização alternativos, tais como o DNA e RNA peixe abordagens.
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Protocol
O uso de ratos foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e usar o Comitê da Universidade Johns Hopkins. Experimentos foram realizados no juvenil (20-26 dias pós-parto, dpp) camundongos C57BL/6J, aproveitando-se da primeira onda semisíncrona de espermatogênese. No entanto, esta técnica também pode ser realizada usando ratos adultos.
1. dissecção e o isolamento dos túbulos seminíferos do mouse
- Prepare o reparo/solução e anticorpo diluição do lysis (ADB) descrito na tabela 1 e tabela 2.
- Prepare um prato de Petri 35mm com 3 mL de 1x tampão fosfato solução salina (1X PBS, pH 7,4) e um outro prato de 35 mm com 2 mL da solução de correção/lise por rato.
- Sacrificar o mouse através de deslocamento cervical ou CO2 asfixia e pulverizar o abdômen ventral com etanol a 70%. Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Então remova os testículos puxando a epidídimo almofada gorda usando fórceps e evitar perturbar a túnica albugínea. Coloque os testículos em um prato de Petri 35mm contendo 1X PBS.
Nota: Utilize a primeira onda de espermatogênese para observar uma população celular enriquecido de interesse14. Estágios específicos da espermatogênese são enriquecidos em idades diferentes do rato (tabela 3). - Remova o testicular túnica albugínea , perfurando o tecido com pinças com pontas afiadas e coletar túbulos seminíferos soltos. Transferi os túbulos para um novo 35mm placa de Petri contendo 2 mL de solução de Lise/fix.
- Incube os túbulos na solução fix/lise durante 5 min à temperatura ambiente.
2. preparação dos túbulos seminíferos
- Prepare um slide de vidro revestido de poli-L-lisina, delineando as bordas da lâmina com uma caneta de bloqueador de líquido.
- Aplicam-se 100 µ l de solução de Lise/fix para o centro da lâmina de vidro.
- Usando Pinças esterilizadas e tesoura suavemente arreliar distante dos túbulos seminíferos. Corte de tempo individual túbulo segmentos aproximadamente 20 mm de comprimento.
Nota: Para visualizar estruturas que são sensíveis à exposição prolongada de fixador, tais como as centrossomas, primeiro, separar os túbulos na PBS 1x e, em seguida, picar diretamente os túbulos na superfície dos slides de poli-lisina revestido em 100 µ l de solução de Lise-fix. - Transferência de cinco segmentos de tubo seminífero longo de 20mm para o slide de vidro revestido de poli-L-lysine preparados contendo solução fix/Lise.
- Usando a tesoura estéril carne moída tubules seminiferous em segmentos de 1,5 a 3,0 mm.
- Usando Pinças esterilizadas organizar os segmentos do túbulo sobre a lâmina de vidro para que o tecido não se sobrepõe, e os túbulos são distribuídos uniformemente.
Nota: O número ideal de segmentos do túbulo sobre uma lâmina de vidro é entre 20 e 40 anos.
3. esmagamento dos túbulos seminíferos
- Transferi a lâmina de vidro que contém segmentos de tubo seminífero dispersos em uma bancada. Remova o excesso de líquido utilizando um laboratório para evitar a perda de tecido durante a etapa de abóbora.
- Uma lamela (22 x 60-1,5 mm) na parte superior da lâmina de vidro e aplicar pressão com o calcanhar da palma por 10 a 20 segundos. É importante aplicar força suficiente para dispersar espermatócitos de túbulos seminíferos.
Nota: Observe os túbulos usando um microscópio de dissecação, a fim de otimizar a etapa de caça aos bugs, para que todos os segmentos do túbulo são rompidos. - Usando o slide fórceps, imediatamente flash congelar a lâmina de vidro em um pequeno dewar de líquido N2 por 15 segundos, ou até o líquido deixa de bolha. Se immunolabeling imediatamente, remova a lamela com uma lâmina de barbear borda reta, ótimo dica fórceps ou agulha de 21.
Nota: Para obter melhores resultados, immunolabel os slides imediatamente (ver passo 4). No entanto, neste ponto slides podem ser preservados a-80 ° C por até duas semanas. Para maximizar a vida útil de proteínas e estruturas celulares, imediatamente armazena os slides em gelo seco ou transferência para um freezer-80 ° C e mantém a lamela no slide. Quando immunolabeling armazenados slides, remova a lamela imergindo os slides no líquido N2 por 15 segundos, conforme descrito na etapa 3.3.
4. Immunolabeling de túbulos seminíferos montados
- Mergulhe o slide em 1X PBS e lavar três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.
Nota: Nunca permita que os slides completamente seco durante immunolabeling. - Aplica 1 mL de tampão de diluição de anticorpo a lâmina de vidro para bloquear por 1-2 h em uma câmara umidificada.
- Retire o tampão de diluição de anticorpo e aplicar 100 µ l de anticorpo primário, diluído em tampão de diluição de anticorpo em uma câmara umidificada.
Nota: Para melhores resultados, incubar os anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm. Validar e otimizar os anticorpos primários15. - Enxague slides três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.
Nota: Para aprimorar a lavagens, agitar frascos de Coplin usando uma barra de agitação magnética pequena e coloque em um prato de agitação magnética em baixa velocidade ou coloque a jarra de Coplin em um misturador de mesa a baixa velocidade. - Aplicam-se 100 µ l de anticorpo secundário diluído em tampão de diluição de anticorpo para 1 a 1,5 h em uma câmara humidificada à temperatura ambiente. Incube os slides em uma caixa escura para evitar foto branqueamento de anticorpos fluoróforo conjugado.
Nota: Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm. - Enxague slides duas vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.
- Montar as lâminas no meio de montagem contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µ g/mL) e aplique as lamelas (22 x 60-1,5 mm).
- Sele as lamelas para os slides com esmaltes claros para preservar os slides e evitar as lamelas de mover-se.
5. análise e preparações de abóbora túbulo de imagem
- Use um microscópio de epifluorescência com palco automatizado que permite o movimento preciso do eixo z e uma câmera de alta resolução para captura de imagem. Como alternativa, use um microscópio confocal a laser.
Nota: Use qualquer software e hardware disponíveis para esta etapa. Por exemplo, imagens exibidas na Figura 1 e Figura 2 foram capturadas usando uma célula de Zeiss observador Z1 ligado a uma câmera CMOS de ORCA-Flash 4.0 e analisados com o software de imagem de edição de Zeiss ZEN 2012 azul. - Avalie os slides usando um objectivo X 20 para determinar a qualidade da preparação da polpa. Slides de boa qualidade tem uma monocamada de núcleos que são uniformemente distribuídos.
Nota: Algumas seções do slide podem ser melhores do que outros, é útil observar as coordenadas de onde as melhores regiões do slide podem ser encontradas para posterior análise utilizando a maior ampliação. - Usando a maior ampliação objectivo (por exemplo, 63 X ou 100 X), regiões de captura do slide que têm um monolayer consistente dos núcleos. Uma vez que uma região está selecionada, definir a parte superior e menor Z-pilhas para garantir que toda a luz em foco é capturada.
Nota: O número ideal de Z-pilhas capturado entre o limite superior e inferior é geralmente designado pelo software de aquisição de imagem e é diferente para cada objetivo. - Use a software de processamento de imagem para compilar uma imagem de foco estendido de profundidade. O software combina a luz em foco de cada pilha-Z e é essencial para a imagem ideal de preparações de abóbora do túbulo.
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Representative Results
Aqui, nós usamos o método de abóbora do túbulo para visualizar populações de células transitória em fase da prófase para metáfase eu (G2/MI) transição, que foram enriquecidos por colheita testículos de juvenis selvagem-tipo ratos submetidos à primeira onda de espermatogênese (24 DPP). A Figura 1 retrata imagens representativas das diversas fases de célula que podem ser visualizadas usando o método de abóbora do túbulo. Enriquecido com populações da metafase eu espermatócitos foram visualizados usando anticorpos contra alfa-tubulina (figura 1A). Utilizamos marcadores para início e final da meiose I meiótica progressão de palco. Túbulo abóbora preparativos foram immunolabeled com um anticorpo à proteína do complexo synaptonemáticos, SYCP3, para visualizar as fases da prófase i leptóteno/zygote e paquíteno/diplóteno espermatócitos são mostrados na figura 1B. Espermatócitos, passando pela primeira divisão meiótica podem ser claramente identificados usando anticorpos contra alfa-tubulina (figura 1A e 1C). Para estudar eventos tardios meióticos, túbulo polpas foram immunolabeled usando anticorpos contra o ciclo celular quinase Aurora B (AURKB), que localiza-se ao Centrómero interno durante a metáfase, então relocalizes para o sulco midzone e clivagem do eixo durante anáfase e citocinese, respectivamente (Figura 1). Características citológicas de cromossomos foram visualizadas durante a primeira divisão meiótica. Para observar ICDs, túbulo squash preparações foram immunolabeled usando anticorpos contra o subunit específico meiose alfa-kleisin de cohesin, REC8 (Figura 1). Dinâmica de cromossomos durante a anáfase foram avaliada usando encontrava alfa-tubulina e a mancha de DNA, DAPI. Uma maturação concluir com sucesso a primeira divisão meiótica é mostrada na Figura 1E, enquanto uma maturação contendo uma ponte anáfase é mostrada na Figura 1F. Usando a técnica de abóbora do túbulo, comprimento do fuso meiótico, segregação e alinhamento de cromossomas podem ser medidos e comparados entre ratos mutantes e controle.
A utilidade desse método para visualização das transições de ciclo celular adicional e estruturas subcelulares associadas a prófase é demonstrado na Figura 2. Durante o leptóteno subestágio da prófase I, iniciação de emparelhamento de cromossomos homólogos é mediada por mudanças dinâmicas em anexos de telômero para induzir a formação de clusters de cromossomo enfrentando um único polo do envelope nuclear (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. esta conformação, conhecida como o "bouquet" cromossomo é pensado para aumentar a probabilidade e a frequência de interações inter homólogo (Figura 2A). Início e conclusão da sinapse entre cromossomos homólogos ocorre durante o zygote (Figura 2B) e substages paquíteno (Figura 2), respectivamente, correspondendo com dispersão progressiva da buquê de cromossomo. Para avaliar a dinâmica de buquê de sinapse e cromossomo em ratos juvenis, nós immunolabeled preparações de abóbora túbulo com anticorpos anti-SYCP3 e os centrómeros, simultaneamente e manchado por DNA usando DAPI. Cromossomos de mouse são telocêntricos, portanto Centrómero immunolabeling foi usado para detectar alterações em anexos NE telômero.
Inativação do cromossomo meiótico de sexo (MSCI) é uma característica única de meiose masculina, pelo qual o X não-homólogos e cromossomos Y burlar a ativação do posto de controlo através de todo o cromossomo fosforilação da variante do histone H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. O par de cromossomo X-Y é transcriptionally silenciado e compartimentalizado em um subdomínio nuclear denso, chamado o corpo de"sexo". Espermatócitos, passando por MSCI podem ser facilmente identificados durante os paquíteno e diplóteno substages por immunolabeling túbulo abóbora preparações com anticorpos yH2AX (Ser139). Figura 2D retrata uma maturação no paquíteno subestágio immunolabelled com anticorpos contra yH2AX (Ser139), os centrómeros e corados com DAPI para visualizar o DNA.
Duplicação do centrossoma é semi conservador e ocorre durante a prófase que i da meiose masculina após a conclusão do DNA reparo para garantir que cada célula filha resultante herda dois centríolos (um centrossoma) seguindo a divisão celular24,25 . Centrossomas consistem em dois centríolos dispostos ortogonalmente conectados por um vinculador flexível e são cercadas por uma matriz amorfa de proteínas conhecidas como o pericentriolar material/matriz (PCM)26. Após a duplicação no subestágio paquíteno, recém-formado centriole pares soltar um do outro e sofrem maturação centrossoma e migração para polos opostos durante o estágio de diplóteno para facilitar a formação de fusos bipolares. Uma maturação precoce de diplóteno submetidos à disjunção de centríolos recém-formado foi visualizada por preparações de abóbora immunolabeling túbulo com anticorpos contra pericentrin (PCNT), um componente da proteína do PCM e Centrin-3 (CETN3) para marcar centríolos (Figura 2E). Estadiamento foi determinado utilizando anticorpos contra SYCP3, e DAPI foi usado para manchar o DNA.
Figura 1 : Análise representativa da transição G2/MI meiótica usando preparações de abóbora túbulo. Preparações de abóbora túbulo realizaram-se em segmentos de tubo seminífero C57BL/6J ratos com idade 24 DPP. (A) representante de campo de desenvolvimento immunolabeled de espermatócitos com anticorpos contra alfa-tubulina centrômeros (vermelhos), (verdes) e o DNA mancham DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, azul). (B) as polpas de túbulo do selvagem-tipo foram coradas com DAPI (azul), bem como immunolabeled com anticorpos contra alfa-tubulina (vermelho) e o elemento lateral do SC, SYCP3 (verde). (C) as polpas de túbulo do selvagem-tipo estavam manchadas com DAPI (azul), bem como immunolabeled com anticorpos contra alfa-tubulina (vermelho) e o ciclo celular quinase verde AURKB (). Características citológicas de cromossomos como ICDs e anáfase pontes podem ser visualizadas usando preparações de abóbora do túbulo. (D) para observar ICDs, espermatócitos prometafase foram immunolabeled com anticorpos contra centrômeros (vermelhos) bem como um componente de meiose cohesin específico, REC8 (verde) e corados com DAPI (azul). (E, F) Morfologia do cromossomo foi visualizada durante a anáfase usando anticorpos contra alfa-tubulina centrômeros (vermelhos), (verdes), e o DAPI mancha (azul). Um conjunto completo de desenvolvimento de espermatócitos pode ser identificado usando a técnica de abóbora do túbulo (L/Z, espermatócitos de palco leptóteno/zygote; P/D, paquíteno/diplóteno espermatócitos de estágio; P.M., prometafase espermatócitos; M, espermatócitos metáfase; A, espermatócitos anáfase). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Exemplos de alterações morfológicas adicionais e estruturas associadas com a progressão da prófase meiótica em machos usando preparações de abóbora túbulo. Preparações de abóbora túbulo foram realizadas no túbulo seminífero segmentos de camundongos C57BL/6J com idades entre 12-18 dpp e estavam manchados com DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, azul) para rotular o DNA. (A-C) Sinapse do homólogo é acoplado à formação e dispersão progressiva do cromossomo "bouquet" durante a progressão da prófase. Leptóteno (A), zygote (B)e espermatócitos de palco paquíteno (C) foram immunolabeled com anticorpos contra SYCP3 (vermelho) e os centrómeros (verde). (D-E) Preparações de abóbora túbulo pode ser usado para detectar alterações citológicas exclusivas e estruturas durante a prófase masculino eu progressão incluindo inativação meiótica dos cromossomos sexuais (MSCI) e duplicação centrossoma. (D) espermatócitos de estágio de paquíteno passando por MSCI foram detectados utilizando anticorpos yH2AX (Ser139) para rotular o sexo-corpo (seta verde), e centrómeros são mostrados em vermelho. (E) diplóteno espermatócitos de palco foram identificados utilizando anticorpos SYCP3 (vermelho) e centrossomas (ponta de seta) foram detectados usando anticorpos contra Centrin-3 (verde) e Pericentrin (magenta) para rotular os centríolos e o pericentriolar material/matriz, respectivamente. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Item de | Quantidade | Concentração final |
| 1X PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 ΜL | 0,8% (v/v) |
| 10% TritonX-100 em PBS | 100 ΜL | 0,1% (v/v) |
Tabela 1: solução de correção/Lise. Descrição: Ajuste o pH a 9 com NaOH [50 milímetros]. Embrulhe o recipiente da solução em folha de alumínio para proteger da luz e armazenar a 4 ° C. Não use a solução de Lise/fix, se mais de uma semana de idade. PFA sólido também pode ser usado para fazer a solução. Recomenda-se o uso de um fumehood para evitar a exposição PFA.
| Item de | Quantidade | Concentração final |
| 1X PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (p/v) |
| Soro de cavalo | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% TritonX-100 em PBS | 250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabela 2: receita do anticorpo diluição amortecedor (ADB). Descrição: Loja ADB a 4 ° C ou estoques de congelar a-20 ° C, se tornando maiores quantidades. ADB pode tornar-se contaminada, certifique-se de boas técnicas de assepsia são utilizadas e avaliar a solução para a contaminação antes de cada utilização. Prepare alíquotas menores do ADB para minimizar a contaminação.
| Tipo de célula | Processo celular | Idade do rato (dpp) |
| Leptóteno | Formação de DNA ORL | 10 - 12 |
| Montagem de elementos axiais | ||
| Zygote | Iniciação de homólogos DSB reparação e synapsis | 12 - 16 |
| Paquíteno | Conclusão da reparação de ORL autossômica | 16 - 20 |
| Maturação dos eventos de recombinação de cruzamento | ||
| Synapsis completa entre homologs | ||
| Inativação do cromossomo meiótico de sexo (MSCI) | ||
| Maturação de duplicação/centrossoma centríolo | ||
| Diplóteno e diacinese | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Separação do centrossoma | ||
| Metáfase eu | Spindle Checkpoint | 22 - 26 |
| Nucleologênese redonda | Substituição de protamina | > 24 |
| Formação do acrossoma |
Tabela 3: perto-síncrono primeira onda de espermatogênese em ratos juvenis. Descrição: As fases específicas de espermatogênese são enriquecidas em diferentes estágios de desenvolvimento juvenil do mouse.
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Discussion
Os ratos têm provado para ser um organismo modelo útil para estudar os eventos celulares que regulam a progressão meiótica durante a espermatogénese. Além disso, é necessário desenvolver ferramentas servidas para o estudo da espermatogênese porque muitos eventos, como sair da prófase meiótica, são sexualmente dimórfico. Este protocolo descreve um método de abóbora tubo seminífero para visualização e estudo de diferentes estágios da espermatogênese de rato. Este método preserva a integridade celular e desse modo permite análises detalhadas das estruturas nucleares e citoplasmáticas. Os resultados representativos retratados neste estudo demonstram a utilidade do presente protocolo em avaliar espermatócitos primários, passando por progressão meiótica. Além disso, esse protocolo também pode ser usado para estudar outros processos celulares durante a espermatogênese, incluindo proliferação e diferenciação das espermatogónias e estágios de acridina27,28. Encontram-se os métodos descritos são adaptado do túbulo descrito anteriormente abóbora técnicas8,9. No entanto, este protocolo é o primeiro guia detalhado, cobrindo todos os reagentes e as etapas necessárias, de obtenção dos túbulos para visualização de células únicas através de microscopia de fluorescência. Além disso, apresentamos imagens adicionais recursos de celulares, incluindo o centríolo e o buquê do telômero, que pode ser visualizado com a técnica.
Existem alguns elementos técnicos que são a chave para otimizar os preparativos de abóbora do túbulo. Em primeiro lugar, um deve aplicar a quantidade adequada de força para a lamela de vidro. Falha ao aplicar força suficiente irá produzir slides com poucas células aderentes, como a maioria das células permanecerá dentro dos túbulos seminíferos. Em segundo lugar, um deve Incubar o material de testículo na solução fix/Lise para o período adequado de tempo. Geralmente, a fixação deve ser limitada a 5 min, mas um intervalo entre 5 e 15 min é aceitável. Túbulos que foram corrigidos por um período prolongado, será difícil de manipular e produzir resultados pobres. No entanto, é possível, para prolongar o tempo de incubação, reduzindo a concentração de PFA. Por exemplo, abaixar os PFA % para 0,5% permitiria incubações aumento na solução fix/Lise. No método que apresentámos, as etapas de fixação e permeabilização ocorrem simultaneamente, no entanto estas etapas podem ser executadas uma após a outra, respectivamente. Separar as etapas de fixação e permeabilização pode ajudar a reduzir os níveis de sinal de fundo citoplasmática. Variação das estratégias de fixação e/ou permeabilização também pode ser testada para otimizar as condições de avaliação de uma estrutura subcelular específica ou anticorpo. Por exemplo, visualização de centrosomal e proteínas do eixo podem ser reforçadas com o uso de metanol em vez de PFA29,30,31. Além disso, é útil usar ratos juvenis que estão progredindo através da primeira onda de espermatogênese (aproximadamente 10-26 dpp) para especificamente e robustamente Visualizar eventos celulares meióticas infrequente12. Alternativamente, é possível isolar o estágio específico células meióticas de ratos adultos, observando o padrão de absorção da luz dentro do tubo seminífero32. Tendo em conta o ciclo assíncrono da espermatogênese em ratos adultos, no entanto, analisar raros eventos meióticos em detalhes pode ser um desafio. Esta limitação pode ser superada através da injeção de ratos com bisdichloroacetyldiamine, ganhar 18.446, metabolismo de vitamina A que blocos e interrompe a diferenciação das espermatogónias33. Após o tratamento com ganhar 18.466, retomada de espermatogênese ocorrerá sincronicamente, produzindo grandes quantidades de populações enriquecido de células germinativas de um animal maduro34. Esta estratégia de sincronização pode ser usada antes da técnica de abóbora do túbulo para investigar as diferenças entre as primeiras ondas semisíncronas de espermatogênese para aqueles que ocorrem em adultos35,36, 37. Além disso, a correlação entre envelhecimento paterno e aneuploidia também podia ser avaliada usando WIN 18.466 sincronização e avaliar segregação do cromossomo com o método de abóbora do túbulo.
Em resumo, este método pode ser usado em conjunto com microscopia de imunofluorescência para observar células em diferentes estágios da espermatogênese. Aplicada de forma mais ampla, esta técnica também pode ser usada para avaliar as subpopulações de espermatogónias, espermatócitos e espermátides e pode ser adaptada para estudar uma grande variedade de processos durante a espermatogênese. Esta abordagem tem sido utilizada para célula viva imagem de espermatócitos e modificado para conduzir uma variedade de estudos celulares e bioquímicos38,39,40. A técnica de abóbora túbulo tem sido usada para camundongo e rato de túbulos seminíferos, sugerindo que deve ser facilmente aplicado a outros sistemas de mamíferos, incluindo humanos40. Esta técnica pode ajudar a definir as perturbações celulares que dão origem a infertilidade e aneuploidia de esperma.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J. e uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para S.R.W. e J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
