Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Семенных канальцах Сквош техника для цитологического анализа с помощью мыши модель сперматогенеза

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56453
* These authors contributed equally

Summary

Цель этой техники Сквош трубочку является быстро оценить цитологические особенности развивающихся сперматоцитах мыши при сохранении целостности клеточных. Этот метод позволяет для изучения всех этапов сперматогенеза и могут быть легко реализованы вместе с другими биохимических и молекулярных биологических подходов для изучения мыши мейоз.

Abstract

Meiotic прогрессии в мужчины является процессом, который требует согласованных действий ряда жестко регулируемых сотовой событий. Ошибки, возникающие во время мейоза может привести к бесплодию, потери беременности или генетические дефекты. Начиная с наступлением полового созревания и продолжается в зрелом возрасте, непрерывной полусинхронные волны сперматоцитах пройти сперматогенеза и в конечном счете формируют гаплоидным спермы. Первая волна мыши сперматоцитах переживает meiotic инициации появляются на 10 день после родов (10 ДПП) и выпускаются в просвете семенных канальцев как зрелые сперматозоиды в 35 dpp. Таким образом это выгодно использовать мышь в этой области развития промежуток времени с целью получения высокообогащенного населения интерес. Анализ этапов редких клетки является более сложным в старых мышей за счет вклада последовательных генерациями волн, которые увеличивают разнообразие клеточных популяций в трубочки. Метод, описанный здесь легко реализована методика для цитологического оценки клетки, находящиеся в пределах семенных канальцев мышей, в том числе сперматогонии, сперматоцитах и сперматид. Трубочка Сквош техника обеспечивает целостность изолированные мужские половые клетки и позволяет изучение клеточных структур, которые не визуализируются легко с другими методами. Чтобы продемонстрировать возможности применения этой техники Сквош трубочку, шпинделя Ассамблея контролировали в сперматоцитах прогрессирует через профаза до метафазы, которую я переход (G2/ми переход). Кроме того Центросома дублирования, инактивирование meiotic секс хромосомы (МСКИ) и хромосомы букет формирования были оценены как примеры цитологического структур, которые можно наблюдать с помощью этого метода Сквош трубочку. Этот метод можно использовать для определить конкретные дефекты в ходе сперматогенеза, которые вызваны мутации или внешних возмущений, и таким образом, вносит вклад в наше понимание молекулярных сперматогенеза.

Introduction

Мейоз представляет собой комплекс сотовой событие, в котором один раунд репликации ДНК следуют два последовательных раундов клеточного деления. Несколько конкретных мейоз события должны быть скоординированы на начальных этапах мейоз для обеспечения точной хромосома сегрегации. Эти мероприятия включают в себя завершение гомологичных рекомбинации, Сопредседатель ориентации сестры kinetochores во время первого дивизиона meiotic и поэтапного потери когезинов комплексов для устранения chiasmata между гомолог. Точное регулирование этих процессов является необходимым для поддержания плодородия и предотвращения хромосоме missegregation события, которые могут привести к генетическими отклонениями и самопроизвольный выкидыш1.

Хотя основные события мейоз происходят у самцов и самок, значительные временные и механистические различия существуют между сперматогенеза и женских2. Например во время женского мейоз, профазе I происходит во время эмбрионального развития и аресты на dictyate этапе до полового созревания. В отличие от сперматогенез начинается в период полового созревания и прогрессирует в волны по всей взрослой жизни без ареста. Различия между мужской и женской мейоз подчеркивает необходимость разработки методов, которые специально рассчитаны на оценку этих процессов в сперматоцитах и яйцеклеток. В настоящее время оценки meiotic прогрессии во многом основывается на использовании хроматина распространяется3,4,5. Хотя хроматина спреды являются полезными для изучения meiotic хромосом, они сумеют сохранить целостность клеточных, предотвращая оценки клеточных структур, таких как шпинделя микротрубочек, большое, ядерная оболочка и теломер вложения. Живут изображений и долгосрочные культивирования методов значительно продвинулись нашего понимания женской мейоз; аналогичные подходы к визуализировать всю ячейку нетронутыми, однако, менее часто реализуются для исследования сперматогенеза6,7. Для того, чтобы визуализировать динамических событий всей мужской мейоз, мы адаптировали установленных трубочку Сквош методы быстро оценить цитологические особенности разработки мыши сперматоцитах8,9. Метод, описанный здесь поддерживает целостность клетки, позволяя изучение нескольких клеточных структур на различных этапах сперматогенеза.

Эта трубочка Сквош техника является клеточных подход, который позволяет для оценки клеточных структур через иммунофлуоресценции. Общие подходы гистологические визуализировать meiotic прогрессии у мышей-самцов, такие как гематоксилин и эозином парафина встроенных яичек, и immunofluorescent маркировки cryosections позволяют широкий обзор meiotic прогрессии. Однако эти методы не удается урегулировать отдельные ячейки в необходимом для детального анализа событий, происходящих на протяжении мейоз10,11. Альтернативные методы для визуализации meiotic процессов полагаться на значительные Хемиосмотическая нарушения Сперматоцит изолировать и исправить ядерных материалов3,4,5. Эти присадки препятствуют наблюдения клеток типов, отличных от основного сперматоцитах. Недавно описан метод Namekawa позволило исследовательского сообщества для сохранения ядерной Архитектура изолированных сперматоцитах, но требует использования cytospin и аксессуары, которые не могут быть легко доступны для некоторых лабораторий4. В противоположность этому техника Сквош трубочку только требует оборудования, обычно стандартный в большинстве лаборатории биологии клетки.

Трубочка Сквош метод, описанный здесь может использоваться для визуализации различных клеток типов, найденные в пределах семенных канальцах, включая клеток Сертоли, сперматогонии, первичных и вторичных сперматоцитах и сперматид. Путем соединения эту технику с рядом синхронная первой волной сперматогенеза у несовершеннолетних мышей, можно получить обогащенного популяции сперматогенных клеток, как они прогресс через мейоз12. Этот процесс позволяет подробный анализ процессов на протяжении сперматогенез, таких, как ранние события профаза, G2/ми и метафаза анафазе переходы, и spermiogenesis. Кроме того трубочка Сквош препаратов может использоваться для визуализации цитологические особенности хромосом (например, interchromatid домены (ВТС) и kinetochores) и большое (centrioles и pericentriolar материал/матрицы). Сквош метод может легко выполняться параллельно с другими экспериментальные подходы, такие как хроматина спреды и извлечения белков. Кроме того этот метод успешно изменен депозита живых сперматогенных клеток на слайдах для прямой визуализации13.

Метод, описанный здесь включает клеточных семенных канальцах Сквош способ анализа G2/ми переход в мышей C57BL/6J одичал типа. Цитологические особенности первичной сперматоцитах, введя в первый дивизион meiotic были визуализированы с иммунофлуоресценции соблюдать meiotic шпинделя. Этот универсальный метод могут быть легко изменены для визуализации другие meiotic этапов и различных типов клеток. Метод также поддаются стратегии альтернативных визуализации, такие как ДНК и РНК рыбы подходов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование мыши был одобрен институциональный уход животных и использовать Комитет из университета Джона Хопкинса. Были проведены эксперименты по делам несовершеннолетних (20-26 дней после родов, dpp) мышей C57BL/6J, воспользовавшись полусинхронные первой волны сперматогенеза. Однако этот метод можно также выполнить с помощью взрослых мышей.

1. Вскрытие и изоляции мыши семенных канальцев

  1. Подготовьте исправление/решения и антитела разрежения буфера lysis (ADB) описаны в таблице 1 и таблице 2.
  2. Подготовьте один из 35-мм Петри с 3 мл 1 x-фосфатный буфер (ПБС, рН 7,4) и еще 35-мм блюдо с 2 мл раствора исправить/лизиса на мышь.
  3. Пожертвовать мыши через шейки матки вывих или CO2 удушья и спрей вентральной живота с 70% этиловом спирте. Откройте abdominopelvic полости, используя стерильными ножницами, что делает V-образный открытия. Затем удалите семенников, потянув на эпидидимальных жировой ткани с помощью щипцов и не мешать белочной. Разместите яички в 35-мм Петри, содержащие ПБС.
    Примечание: Использование первой волны сперматогенез для того чтобы наблюдать обогащенных клеток населения интерес14. Конкретные этапы сперматогенеза обогащены мыши разных возрастов (Таблица 3).
  4. Удаление яичка белочной , проколов ткани с острым наконечником щипцы и собирать свободно семенных канальцев. Передать новый 35-мм Петри, содержащий 2 мл раствора исправить/лизис трубочки.
  5. Инкубируйте трубочки в решении исправление/лизис 5 мин при комнатной температуре.

2. Подготовка семенных канальцев

  1. Подготовьте слайд стекла с покрытием поли L-лизин, изложением края слайд с жидким блокатор ручкой.
  2. Обратиться в центр слайда стекла 100 мкл раствора исправить/лизис.
  3. С помощью стерильный пинцет и ножниц аккуратно задразнить врозь семенных канальцев. Вырезания долго отдельных трубочку сегменты около 20 мм в длину.
    Примечание: Визуализировать структур, которые являются чувствительными к фиксирующие длительного воздействия, такие как большое, сначала отделить трубочки в однократном ПБС, а затем непосредственно фарш трубочки на поверхности поли лизин слайды с покрытием в 100 мкл раствора исправить лизис.
  4. Передать подготовленные стекла с покрытием поли L-лизин слайд, содержащий исправления/лизис решение пять сегментов длиной семенных канальцах 20 мм.
  5. С помощью стерильными ножницами фарш семенных канальцев на сегменты 1,5 до 3,0 мм.
  6. С помощью стерильный пинцет организовать трубочку сегментов на слайде стекла, так что не ткани перекрывается, и трубочки распределяются равномерно.
    Примечание: Оптимальное количество сегментов трубочку на слайде стекла составляет от 20 до 40.

3. давя из семенных канальцев

  1. Передача стекла слайд, содержащий дисперсной семенных канальцах сегменты на benchtop. Удалите избыток жидкости с помощью Лаборатория очистки, чтобы избежать потери ткани во время шага Сквош.
  2. Применить coverslip (22 x 60-1,5 мм) на вершине стеклянное скольжение и применить давление с пятки ладони на 10-20 секунд. Важно применить достаточно силы для разгона сперматоцитах от семенных канальцев.
    Примечание: Наблюдать за трубочки с помощью микроскопа диссекции для того, чтобы оптимизировать интенсивное шаг так, что нарушены все сегменты трубочку.
  3. С помощью щипцов слайд, немедленно вспышки заморозить стеклянное скольжение в небольшой Дьюар жидкости N2 на 15 секунд, или до тех пор, пока жидкость перестает пузырь. Если immunolabeling немедленно, удалите coverslip с прямой край лезвия, хорошо подсказка щипцами или 21-иглы.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, immunolabel слайды немедленно (см. шаг 4). Однако на данный момент слайды могут быть сохранены на-80 ° C до двух недель. Чтобы максимизировать жизни белков и клеточных структур, немедленно хранить слайды на сухой лед или передачи в морозильной камере-80 ° C и держать coverslip на слайде. При immunolabeling хранении слайды, удалите coverslip, погружая слайды в жидком N2 на 15 секунд, как описано в пункте 3.3.

4. Immunolabeling навесные семенных канальцев

  1. Погрузите слайд в 1 x PBS и мыть три раза за 5 мин в 50-мл Coplin jar, содержащий ПБС.
    Примечание: Никогда не позволяйте слайды для полностью сухой во время immunolabeling.
  2. Примените 1 мл буфера для разведения антител на стекло слайд для блокирования на 1-2 ч в камере увлажненной.
  3. Удалить в буфер разбавления антитела и применить 100 мкл основное антитело, разводили буфером для разбавления проб антитела в камере увлажненные.
    Примечание: Для достижения наилучших результатов Инкубируйте первичных антител на ночь при 4 ° C. Используйте меньшие объемы антител (например 50 мкл), покрывая слайд с coverslip или парафина. Проверить и оптимизировать первичного антитела15.
  4. Промывайте слайды три раза за 5 мин в опарник Coplin 50 мл, содержащие ПБС.
    Примечание: Для повышения моет, агитировать Coplin баночки с помощью малых магнитных перемешать бар и место на магнитные перемешать пластины на низкой скорости или место опарник Coplin на Настольный миксер на низкой скорости.
  5. Примените 100 мкл вторичные антитела, разводили буфером для разбавления проб антитела для 1-1,5 ч в камере увлажненной при комнатной температуре. Инкубируйте слайды в темной коробке, чтобы избежать фото отбеливание Флюорофор конъюгированных антител.
    Примечание: Используйте меньшие объемы антител (например 50 мкл), покрывая слайд с coverslip или парафина.
  6. Промойте слайды в два раза за 5 мин в 50-мл Coplin jar, содержащий ПБС.
  7. Маунт слайды монтажа носитель, содержащий 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 мкг/мл) и применить coverslips (22 x 60-1,5 мм).
  8. Уплотнение coverslips слайды с четкой Лак для сохранения слайды и предотвратить перемещение coverslips.

5. анализ и изображений препаратов Сквош трубочка

  1. Используйте помощью эпифлуоресцентного микроскопа с автоматизированной стадии, который позволяет точное движение по оси z и с высоким разрешением камеры для захвата изображения. Кроме того использование лазерного конфокального микроскопа.
    Примечание: Используйте любые имеющиеся аппаратное и программное обеспечение для этого шага. Например изображения в Рисунок 1 и 2 были захвачены с помощью Zeiss клеток наблюдателя Z1 связана с ORCA-Flash 4.0 КМОП-камера и проанализированы с программным обеспечением образ издание Zeiss Дзэн 2012 синий.
  2. Оцените с помощью 20 X цель определить качество подготовки Сквош слайды. Хорошее качество слайды имеют монослоя ядер, которые равномерно распределены.
    Примечание: Некоторые разделы слайда может быть лучше, чем другие, это полезно отметить координаты где можно найти лучшие регионы слайд для дальнейшего анализа с использованием увеличение.
  3. Использование выше увеличение цели (например 63 X или 100 X), захват регионов слайда, которые последовательно монослоя ядер. После того, как выбран регион, установите верхний и Нижняя Z-стеки обеспечить, что все в фокусе свет улавливается.
    Примечание: Оптимальное количество Z-стеки, захватили между верхний и нижний предел обычно обозначается приобретения изображений программное обеспечение и различны для каждой цели.
  4. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для компиляции увеличенной глубины фокуса изображения. Программное обеспечение сочетает в себе свет в фокус от каждого Z-стека и имеет важное значение для оптимального изображения трубочку Сквош препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь, мы использовали метод Сквош трубочку для визуализации лицевой клеточных популяций, претерпевает профаза до метафазы I (G2/MI) переходного периода, которые были обогащенный уборки семенников из несовершеннолетних мышах одичал тип проходит первая волна сперматогенеза (24 DPP). Рисунок 1 изображает представитель изображений на различных этапах клеток, которые могут быть визуализированы с помощью метода Сквош трубочку. Обогащенный популяций метафаза я сперматоцитах были визуализируется с использованием антител против альфа тубулина (рис. 1A). Мы использовали маркеры для раннего и позднего мейоз I стадии meiotic прогрессии. Трубочка Сквош препараты были полученных с антитела белков синаптонемного комплекса, SYCP3, чтобы визуализировать этапы профаза I. Leptotene/zygotene и pachytene/diplotene сперматоцитах показаны на рисунке 1B. Сперматоцитах, проходящих в первый дивизион meiotic могут быть четко определены с использованием антител против альфа тубулина (рис. 1A и 1 C). Для изучения конце meiotic событий, трубочка тыквы были, полученных с использованием антител против клеточного цикла киназы Аврора B (AURKB), которая локализуется в внутренний центромер во время метафазы, затем relocalizes к midzone и расщепление борозду шпинделя во время анафазе и цитокинез, соответственно (рис. 1 c). Цитологические особенности хромосом были визуализируется во время первого meiotic дивизиона. Соблюдать ВТС, трубочка Сквош препараты были полученных с использованием антител против конкретных мейоз альфа kleisin Субблок когезинов, REC8 (рис. 1 d). Хромосома динамика в анафазе были оценены с использованием альфа тубулина immunolabelling и ДНК пятно, DAPI. Сперматоцит, успешно завершив первый дивизион meiotic показан на рисунке 1E, в то время как Сперматоцит, содержащий анафазе мост показан на рисунке 1F. Используя технику Сквош трубочку, meiotic шпинделя Длина, хромосома выравнивание и сегрегация может измеряется и сравнивается между мышей мутант и управления.

Полезность этого метода для визуализации дополнительного цикла клетки переходы и внутриклеточных структур, связанных с профаза я показана на рисунке 2. Во время leptotene substage профаза я, начало пары гомологичных хромосом при посредничестве динамических изменений в теломер вложения для стимулирования формирования кластеров хромосомы, стоящих перед однополюсный ядерная оболочка (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. Эта конформация, известный как хромосома «букет» считается, что повышает вероятность и частота взаимодействий между гомолога (рисунок 2A)и. Начало и завершение синапса между гомологичных хромосом происходит во время zygotene (рис. 2B) и pachytene подэтажи (рис. 2 c), соответственно, с прогрессивной разгон хромосома букет. Чтобы одновременно оценить динамику букет синапса и хромосомы несовершеннолетних мышей, мы полученных препаратов Сквош трубочка с антителами к SYCP3 и центромеры и витражи для ДНК с помощью DAPI. Хромосомы мыши Телецентрический, поэтому центромер immunolabeling был использован для обнаружения изменений в теломер СВ вложения.

Инактивирование meiotic секс хромосомы (MSCI) является отличительной уникальные для мужчин мейоз, whereby не гомологичных X и Y хромосомы обойти контрольно-пропускной пункт активации путем прохождения всей хромосомы фосфорилирование гистона вариант H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,,22-23. X-Y хромосома пары транскрипционно замолчать и разобщенным в плотной ядерной поддомена под названием «секс тело». Сперматоцитах, претерпевает MSCI можно легко определить во время pachytene и diplotene подэтажи подготовке Сквош трубочку immunolabeling с антителами к yH2AX (Ser139). 2D рисунок изображает Сперматоцит на pachytene substage immunolabelled с антителами против yH2AX (Ser139), центромеры и витражи с DAPI визуализировать ДНК.

Центросома дублирования полу консервативен и происходит во время профаза, которую я мужской мейоз по завершении ДНК ремонт обеспечить что каждый результирующая ячейка дочь наследует две centrioles (один центросом) после деления клеток24,25 . Большое состоят из двух ортогонально аранжированное centrioles соединены гибкими компоновщика и окружены аморфной матрице белков, известный как pericentriolar материал/матрица (PCM)26. После дублирования в pachytene substage новообразование Центриоль пар освободиться друг от друга и подвергаются Центросома созревания и миграции к противоположным полюсам на этапе diplotene для облегчения формирования биполярного шпинделей. Ранние diplotene Сперматоцит, претерпевает дизъюнкции новообразованной Центриоль пар был визуализирован immunolabeling трубочку Сквош препаратами с антителами против pericentrin (PCNT), белковый компонент PCM и Centrin-3 (CETN3) для обозначения centrioles (рис. 2е). Постановка был определен с использованием антител против SYCP3, и DAPI была использована для пятно ДНК.

Figure 1
Рисунок 1 : Представитель анализ meiotic G2/ми перехода с использованием препаратов Сквош трубочка. Трубочка Сквош препараты были исполнены на семенных канальцах сегменты возрасте мышей C57BL/6J 24 dpp. (A) представитель области развивающихся сперматоцитах полученных с антителами против альфа тубулина (красный), центромеры (зеленый) и ДНК пятно DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, синий). (B) одичал тип трубочку кабачки окрашивали DAPI (синий), а также полученных с антителами против альфа тубулина (красный) и боковой элемент SC, SYCP3 (зеленый). (C) одичал тип трубочку кабачки окрашивали DAPI (синий), а также полученных с антителами против альфа тубулина (красный) и зеленый клеточного цикла киназы AURKB (). Цитологические особенности хромосом как ВТС и остановку анафазы мосты могут быть визуализированы с помощью препаратов Сквош трубочку. (D) соблюдать ВТС, Прометафаза сперматоцитах были полученных с антителами против центромеры (красный), а также изучали конкретные когезинов компонент, REC8 (зеленый) и витражи с DAPI (синий). (E, F) Хромосома морфология был визуализирован в анафазе, с использованием антител против альфа тубулина (красный), центромеры (зеленый), и DAPI пятен (синий). Полный состав развивающихся сперматоцитах могут быть определены с помощью метода Сквош трубочку (L/Z, leptotene/zygotene сперматоцитах стадии; P/D, pachytene/diplotene сперматоцитах стадии; Вечера, Прометафаза сперматоцитах; M, метафаза сперматоцитах; A, сперматоцитах анафазе). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Примеры дополнительных морфологических изменений и структур, связанных с прогрессированием meiotic профаза самцов, с использованием препаратов Сквош трубочка. Трубочка Сквош препараты были исполнены на семенных канальцах сегментов мышей C57BL/6J в возрасте 12-18 dpp и окрашивали DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, синий) для обозначения ДНК. (A-C) Гомолога Синапсис соединен к формированию и прогрессивного разгон в профазе прогрессии хромосомы «букет». Leptotene (A), zygotene (B)и pachytene (C) этап сперматоцитах были полученных с антителами против SYCP3 (красный) и центромеры (зеленый). (D-E) Трубочка Сквош препараты могут быть использованы для выявления уникальных цитологических изменений и структуры во время мужской профаза прогрессии, включая инактивирование meiotic секс хромосомы (МСКИ) и Центросома дублирования. (D) Pachytene этап сперматоцитах проходит MSCI были обнаружены с помощью антител к yH2AX (Ser139) для обозначения пола тела (зеленый, стрелки), и центромеры показаны красным цветом. (E) Diplotene, сперматоцитах этапе были определены с использованием антител против SYCP3 (красный) и большое (стрелки) были обнаружены с использованием антител против Centrin-3 (зеленый) и Pericentrin (пурпурный) для обозначения centrioles и pericentriolar материал/матрица, соответственно. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Элемент Сумма Конечная концентрация
ПБС 10 мл 1 x
16% PFA 500 МКЛ 0,8% (v/v)
10% TritonX-100 в PBS 100 МКЛ 0,1% (v/v)

Таблица 1: решение Fix/лизис. Описание/контроль: Настройте рН до 9 с NaOH [50 мм]. Заверните контейнер решения в алюминиевой фольги для защиты от света и хранить при 4 ° C. Не использовать исправление/лизис решение, если более чем неделю назад. Твердых PFA может также использоваться для решения. Чтобы избежать PFA воздействия рекомендуется использовать fumehood.

Элемент Сумма Конечная концентрация
ПБС 50 мл 1 x
BSA 1.5 g 3% (w/v)
Лошадь сыворотки 5 мл 10% (v/v)
10% TritonX-100 в PBS 250 МКЛ 0,05% (v/v)

Таблица 2: рецепт буфера (АБР) разбавления антитела. Описание: Магазин АБР на 4 ° C или заморозить запасы в-20 ° C, если делать больших количествах. АБР могут быть загрязнены, убедитесь, что хороший асептических методов используются и оценить решение для загрязнения до каждого использования. Подготовьте небольшие аликвоты ADB для сведения к минимуму загрязнения.

Тип ячейки Сотовый процесс Возраст (dpp) мыши
Leptotene Формирование ДНК DSB 10 - 12
Ассамблея осевой элементов
Zygotene Начало гомологичных DSB ремонт и Синапсис 12 - 16
Pachytene Завершение ремонта аутосомно-DSB 16 - 20
Созревание кроссовер рекомбинации события
Полный синапса между гомолог
Инактивирование meiotic секс хромосомы (MSCI)
Центриоль дублирования/Центросома созревания
Diplotene и Diakinesis СК Desynapsis 18 - 22
Центросома разделение
Метафазы I Контрольно-пропускной пункт шпинделя 22 - 26
Круглая сперматид Протамин замена > 24
Формированию Акросома

Таблица 3: вблизи синхронная первая волна сперматогенеза у несовершеннолетних мышей. Описание/контроль: Конкретные этапы сперматогенеза обогащены на разных стадиях развития несовершеннолетних мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мышей оказались организм полезной моделью для изучения клеточных события, которые управляют meiotic прогрессии в ходе сперматогенеза. Кроме того это необходимо разработать инструменты, обслуживали исследования сперматогенеза, потому что многие события, такие как выход из meiotic профаза, сексуально диморфизм. Этот протокол описывает метод Сквош семенных канальцах для визуализации и изучения различных этапов мыши сперматогенеза. Этот метод сохраняет целостность клеточных и тем самым позволяет подробный анализ ядерных и цитоплазматических структур. Представитель результаты, изображенные в этом исследовании продемонстрировать полезность настоящего протокола оценки первичной сперматоцитах, претерпевает meiotic прогрессии. Кроме того этот протокол может также использоваться для изучения других клеточных процессов в ходе сперматогенеза, включая распространение и дифференциации сперматогонии и этапы spermiogenesis27,28. Описанные методы находятся в пределах адаптировано из ранее описанных трубочку Сквош методы8,9. Однако этот протокол является первым подробное руководство, охватывающих все реагенты и шаги, необходимые, от получения трубочки для визуализации единичных клеток через микроскопии флуоресцирования. Кроме того мы представили изображения на дополнительных клеточных функций, включая Центриоль и теломер букет, который могут быть визуализированы с техникой.

Существует несколько технических элементов, которые являются ключевыми для оптимизации подготовки Сквош трубочку. Во-первых одно необходимо применить надлежащее количество силы к coverslip стекла. Неспособность применять достаточной силой будет производить слайды с несколько адэрентных клеток, поскольку большинство клеток будет оставаться в пределах семенных канальцев. Во-вторых один должен инкубировать яички материал в решении исправление/лизиса для соответствующей длины времени. Как правило фиксации должно быть ограничено до 5 мин, но в диапазоне от 5 до 15 мин является приемлемым. Трубочки, которые были исправлены для длительного периода времени будет трудно управлять и дают плохие результаты. Вполне возможно, однако, продлить время инкубации путем уменьшения концентрации PFA. Например снижение процента PFA до 0,5% позволит увеличение инкубации раз в решении исправление/lysis. В методе, который мы представили permeabilization и фиксация действия происходят одновременно, однако эти шаги можно выполнять один за другим, соответственно. Разделение permeabilization и фиксация шаги могут помочь уменьшить уровни цитоплазматической фон сигнала. Вариация фиксации и/или permeabilization стратегии также могут быть тестированны для оптимизации условий для оценки конкретных субцеллюлярные структуры или антитела. Например, Визуализация centrosomal и белки шпинделя может быть повышена с помощью метанола вместо PFA29,30,31. Кроме того это выгодно использовать несовершеннолетних мышей, которые продвигаются через первой волны сперматогенеза (приблизительно 10-26 dpp) для того чтобы конкретно и энергично визуализировать редкие meiotic сотовой события12. В качестве альтернативы можно изолировать этап специфичные meiotic клетки от взрослых мышей, наблюдая за модель поглощения света в семенных канальцах32. Учитывая асинхронных цикла сперматогенеза у взрослых мышей, однако, анализ редких meiotic события в деталях может быть сложным. Это ограничение можно преодолеть путем инъекций мышей с bisdichloroacetyldiamine, 18,446, выиграть, какие блоки метаболизм витамина А и завешивает дифференцировки сперматогониальные33. После лечения с выиграть 18,466, возобновление сперматогенеза будет происходить синхронно, приносит большое количество обогащенного зародышевых клеток населения от Зрелые животные34. Эта стратегия синхронизации может использоваться до техника Сквош трубочка для исследовать различия между первой волны полусинхронные сперматогенеза тем, которые происходят в взрослых35,36, 37. Кроме того, корреляция между отцовской старения и Анеуплоидия может также оцениваться с помощью выиграть 18,466 синхронизации и оценки хромосома сегрегации с методом Сквош трубочку.

В целом этот метод может использоваться в сочетании с иммунофлуоресценции соблюдать клетки в разных стадиях сперматогенеза. Применяется в более широком смысле, этот метод может также использоваться для оценки подгрупп населения, сперматогонии, сперматоцитах и сперматид и могут быть приспособлены для изучения широкий спектр процессов в ходе сперматогенеза. Этот подход использовался для живых клеток изображений из сперматоцитах и изменения для проведения различных клеточных и биохимические исследования38,,3940. Трубочка Сквош методика использовалась для крыс и мышей семенных канальцев, предполагая, он легко применять к другим системам млекопитающих, включая человека40. Эта техника может помочь определить сотовой возмущений, которые приводят к бесплодию и спермы анеуплоидии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIGMS (R01GM11755) для P.W.J. и обучения Грант стипендий от Института национального рака (НИЗ) (CA009110) S.R.W. и. г.
 

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Electron Microscopy Sciences (EMS) 15710
10x PBS Quality Biological 119-069-161
Triton X-100 Sigma T8787
BSA Sigma A1470
Horse Serum Sigma H-1270
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated CellTreat P886-229638
Poly-L-lysine coated glass slides Sigma P0425-72EA
Liquid Blocker Pen Electron Microscopy Sciences (EMS) 71310
Humid Box Evergreen 240-9020-Z10
Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides Fisher 08-813E
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
Microscope Cover Slides (22mmx60mm) Fisher 12-544-G
Clear Nail Polish Amazon N/A
Microsopes
Name Company Catalog Number Comments
SteREO Discovery.V8 Zeiss 495015-0001-000 
Observer Z1 Zeiss 4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 blue edition image software Zeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS camera Hamamatsu
Primary Antibodies
Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti-SYCP3 Santa Cruz sc-74569 1 in 50
Rabbit anti-SYCP3 Fisher (Novus) NB300-231 1 in 1000
Goat anti-SCP3 Santa Cruz sc-20845 1 in 50
Human anti-Centromere Protein Antibodies Incorporated 15-235 1 in 100
Mouse anti-alpha tubulin Sigma T9026 1 in 1000
Mouse anti-AIM1 BD Biosciences 611082 1 in 200
Mouse anti-γH2AX Thermo Fisher MA1-2022 1 in 500
Mouse anti-CENT3 Abnova H00001070-M01 1 in 200
Rabbit anti-pericentrin Abcam ab4448 1 in 200
Rabbit anti-REC8 Courtesy of  Dr. Karen Schindler N/A 1 in 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  2. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  3. Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
  4. Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
  5. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
  6. Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
  7. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
  8. Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
  9. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  10. Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
  11. Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
  12. Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
  13. Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
  14. Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
  17. Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
  18. Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
  19. Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
  20. Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
  21. Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
  22. Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
  23. Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
  24. Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
  25. Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
  26. Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
  27. Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
  28. Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
  29. Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
  30. Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
  31. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  32. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  33. Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
  34. Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
  35. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
  36. Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
  37. Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
  38. Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
  39. Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
  40. Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).

Tags

Биология развития выпуск 132 мейоз синаптонемного комплекса клетки семенозачатка яички хромосома динамика сперматогенеза Кинетохор шпинделя Центросома профаза метафаза анафазе
Семенных канальцах Сквош техника для цитологического анализа с помощью мыши модель сперматогенеза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, More

Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model. J. Vis. Exp. (132), e56453, doi:10.3791/56453 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter