Summary
Målet med denna tubuli squash teknik är att snabbt bedöma cytologiska funktioner att utveckla mus spermatocyter samtidigt bevara cellulär integritet. Denna metod möjliggör studiet av alla stadier av spermatogenesen, och lätt kan genomföras parallellt med andra biokemiska och molekylära biologiska metoder för studier av mus meios.
Abstract
Meiotiska progression hos hanar är en process som kräver den samordnade åtgärden ett antal reglerade cellulära händelser. Fel som uppstår under meios kan leda till infertilitet, missfall eller genetiska defekter. Påbörjas i början av puberteten och fortsätter under hela vuxenlivet, kontinuerlig semi-synkron vågor av spermatocyter genomgå spermatogenes och slutligen bilda haploida spermier. Den första vågen av mus spermatocyter genomgår meiotiska initiering visas på dag 10 efter förlossningen (10 dpp) och släpps ut i lumen av sädeskanalerna som mogna spermier på 35 dpp. Därför är det fördelaktigt att utnyttja möss inom detta utvecklingsmässiga tidsfönster för att få höganrikat populationer av intresse. Analys av ovanlig cell stadier är svårare i äldre möss på grund av bidraget av spermatogenesisk omgångar, som ökar mångfalden av de cellulära populationerna inom tubuli. Den metod som beskrivs här är en enkelt genomförd teknik för Cytologisk bedömning av de celler som finns inom sädeskanalerna av möss, inklusive spermatogonier, spermatocyter och spermatids. Tubuli squash tekniken upprätthåller integriteten för isolerade manliga könsceller och tillåter granskning av cellulära strukturer som inte visualiseras enkelt med andra tekniker. För att visa de möjliga tillämpningarna av denna tubuli squash teknik, övervakades spindelenhet i spermatocyter fortskrider genom profas till metafas jag övergång (G2/MI övergång). Dessutom bedömdes centrosome duplicering, meiotiska könskromosom inaktivering (MSCI) och kromosom bukett bildandet som exempel på den cytologiska strukturer som kan observeras här tubuli squash metoden. Denna teknik kan användas för att peka ut specifika defekter under spermatogenes som orsakas av mutation eller EXOGEN störning, och således bidrar till vår molekylär förståelse av spermatogenes.
Introduction
Meios är en komplex cellulära händelse där en enda runda för DNA-replikation följs av två på varandra följande rundorna av celldelning. Flera meios-specifika händelser måste samordnas under de inledande skedena av meios att säkerställa korrekt kromosomsegregering. Dessa händelser inkluderar slutförandet av homolog rekombination, samtidig läggning av syster kinetochores under den första meiotiska divisionen, och stegvis förlusten av cohesin komplex att lösa chiasmata mellan homologs. Exakt reglering av dessa processer är nödvändigt att bibehålla fertiliteten och förhindra kromosom missegregation händelser som kan leda till genetisk utvecklingsstörningar och spontana missfall1.
Medan de viktiga händelserna i meiosen sker hos både män och kvinnor, finns betydande temporal och mekanistiska skillnader mellan spermatogenes och oogenes2. Till exempel under kvinnliga meios, profas jag uppstår under fosterutvecklingen och gripanden i dictyate skede fram till puberteten. Däremot börjar spermatogenes vid puberteten och fortskrider i vågor under hela vuxenlivet utan gripandet. Skillnaderna mellan manliga och kvinnliga meios betonar behovet av att utveckla metoder som tillgodoses specifikt mot bedömningen av dessa processer i både spermatocyter och oocyter. För närvarande beroende bedömer meiotiska progression till stor del av användning av kromatin sprider3,4,5. Medan kromatin sprider är användbar för att studera meiotiska kromosomer, misslyckas de med att bevara cellulär integritet, förhindra utvärdering av cellulära strukturer såsom spindeln mikrotubuli, centrosomes, kärn kuvert och telomer bilagor. Live imaging och långsiktig odling tekniker har mycket avancerade vår förståelse av kvinnliga meios; liknande metoder för att visualisera hela intakta cellen, genomförs dock mindre ofta för studiet av spermatogenesen6,7. För att visualisera dynamiska händelser under hela manliga meios, har vi anpassat etablerade tubuli squash tekniker för att snabbt bedöma de cytologiska funktionerna att utveckla mus spermatocyter8,9. Den metod som beskrivs här upprätthåller integriteten av cellen, möjliggör studier av flera cellulära strukturer under olika skeden av spermatogenes.
Denna tubuli squash teknik är ett hela cellen synsätt, vilket möjliggör bedömning av cellulära strukturer via immunofluorescens mikroskopi. Gemensamma histologiska metoder att visualisera meiotiska progression hos hanmöss som hematoxylin och eosin färgning av paraffin inbäddade testiklar och Immunofluorescerande märkning av kryosnitt möjliggör en bred översikt av meiotiska progression. Dessa tekniker fungerar emellertid inte att lösa enstaka celler i utsträckning som är nödvändig för detaljerad analys av de händelser som inträffar i hela meios10,11. Alternativa tekniker för att visualisera meiotiska processer är beroende av betydande kemiosmotisk störningar för spermatocyte att isolera och åtgärda kärnämnen3,4,5. Dessa kemiska behandlingar hindra observationen av celltyper än primära spermatocyter. En nyligen beskriven metod av Namekawa har gjort det möjligt för forskarsamhället att bevara isolerade spermatocyter nukleära arkitektur, men kräver användning av en cytospin och tillbehör som inte kan vara lätt tillgänglig för vissa laboratorier4. Tubuli squash tekniken kräver däremot endast utrustning som är allmänt standard i de flesta cellbiologi laboratorier.
Tubuli squash metoden som beskrivs här kan användas för att visualisera de olika celltyper som finns inom de seminifera tubuli, inklusive sertoli celler, spermatogonier, primära och sekundära spermatocyter och spermatids. Genom att koppla denna teknik med den nära-synkron första vågen av spermatogenes hos juvenila möss, är det möjligt att få berikade populationer av spermatocyt celler som de framsteg genom meios12. Denna process möjliggör detaljerad analys av processer i hela spermatogenes, såsom tidig profas händelser, G2/MI och metafas Anaphasen övergångar och spermiogenesis. Tubuli squash preparat kan dessutom användas för att visualisera cytologiska funktionerna i kromosomer (t.ex. interchromatid domäner (ICDs) och kinetochores) och centrosomes (centrioles och pericentriolar material/matriser). Metoden squash kan lätt utföras parallellt med andra experimentella metoder, såsom kromatin sprider och protein utvinning. Denna teknik har dessutom ändrats framgångsrikt för att deponera levande spermatocyt celler på bilder för direkt visualisering13.
Den metod som beskrivs här innebär en hel cell seminifera tubuli squash teknik för att analysera G2/MI övergången i vildtyp C57BL/6J möss. Cytologiska funktioner i primära spermatocyter in första meiotiska divisionen var visualiserat med immunofluorescens mikroskopi att iaktta meiotiska spindeln. Denna mångsidiga teknik kan enkelt modifieras för att visualisera andra meiotiska stadier och olika celltyper. Tekniken är också mottagliga för alternativa visualisering strategier, till exempel DNA och RNA fisk strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av möss godkändes av den institutionella djur vård och använda kommittén av Johns Hopkins University. Experimenten utfördes på unga (20-26 dagar efter födseln, dpp) C57BL/6J möss, dra nytta av den semi-synkron första vågen av spermatogenes. Denna teknik kan dock också utföras med vuxna möss.
1. dissektion och isolering av mus seminifera tubuli
- Förbereda den fix/lösning och antikropp utspädning lyseringsbuffert (ADB) beskrivs i tabell 1 och tabell 2.
- Förbered en 35 mm petriskål med 3 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (1 x PBS, pH 7,4) och en annan 35 mm maträtt med 2 mL per mus fixa/Lys.
- Offra musen via cervikal dislokation eller CO2 kvävning och spraya ventrala buken med 70% etanol. Öppna den abdominopelvic kaviteten med steril sax, att göra en V-formad öppning. Sedan bort testiklarna genom att dra den epididymal fett pad med pincett, och undvika att störa den tunica albuginea. Placera testiklarna i en 35 mm petriskål som innehåller 1 x PBS.
Obs: Utnyttja den första vågen av spermatogenesen för att observera en berikad cell befolkning intresse14. Specifika stadier av spermatogenesen är berikad på musen för olika åldrar (tabell 3). - Ta bort den testikel tunica albuginea genom att punktera vävnaden med vass spets pincett och samla lös sädeskanalerna. Överföra tubuli till en ny 35 mm petriskål innehållande 2 mL fix/Lys lösning.
- Inkubera i tubuli i fix/Lys lösningen för 5 min i rumstemperatur.
2. beredning av sädeskanalerna
- Förbered en poly-L-lysin belagt glas bild beskriver kanterna på bilden med en flytande blockerare penna.
- Tillsätt 100 µL av fix/Lys lösning till mitten av glasskiva.
- Med hjälp av steril pincett och sax retas försiktigt isär sädeskanalerna. Skära ut länge enskilda tubuli segment ca 20 mm i längd.
Obs: Att visualisera strukturer som är känsliga för långvarig fixativ exponering, såsom centrosomes, separera tubuli först i 1 x PBS och sedan direkt finhacka tubuli på ytan av poly-lysin bilder belagd i 100 µL av fix-Lys lösning. - Överföra fem 20 mm lång seminifera tubuli segment till beredda poly-L-lysin belagt glas bild innehållande fix/Lys lösning.
- Med steril sax färs sädeskanalerna i 1,5 till 3,0 mm segment.
- Med hjälp av steril pincett ordna tubuli segmenten i glas-bilden så att ingen vävnad överlappar, och tubuli fördelas jämnt.
Obs: Det optimala antalet tubuli segment på en glasskiva är mellan 20 och 40.
3. eliminera av sädeskanalerna
- Överföra den glasskiva som innehåller spridda seminifera tubuli segment på en bänkmonterade. Ta bort överflödig vätska med en laboratorium torka för att undvika att förlora vävnad under squash steg.
- Lägg på ett täckglas (22 x 60-1,5 mm) ovanpå glasskiva och tryck med hälen på handflatan för 10-20 sekunder. Det är viktigt att applicera tillräckligt kraft att sprida spermatocyter från sädeskanalerna.
Obs: Iaktta de tubuli med dissektion Mikroskop för att optimera det ihoptryckning steget så att alla tubuli segment störs. - Använda bild pincett, omedelbart flash frysa glas bilden i en liten dewar vätska N2 i 15 sekunder eller tills vätskan upphör att bubbla. Om immunolabeling tar omedelbart bort täckglaset med en rak kant rakblad, fina tip pincett eller 21-gauge nål.
Obs: För optimalt resultat, immunolabel bilderna omedelbart (se steg 4). Men kan på denna punkt diabilder bevaras vid-80 ° C i upp till två veckor. För att maximera livslängden på proteiner och cellulära strukturer, omedelbart lagra bilderna på torris eller överföring till-80 ° C frys och hålla täckglaset på bilden. När immunolabeling lagras bilder, ta bort täckglaset genom doppa glasen i flytande N2 i 15 sekunder, enligt beskrivningen i steg 3.3.
4. Immunolabeling av monterade seminifera tubuli
- Fördjupa bilden i 1 x PBS, och tvätta tre gånger för 5 min i en 50 mL Coplin burk som innehåller 1 x PBS.
Obs: Låt aldrig bilderna ska helt torr under immunolabeling. - Applicera 1 mL förtunningsbuffert antikropp in i glas bilden att blockera för 1-2 h i en fuktig kammare.
- Ta bort den antikropp förtunningsbuffert och tillsätt 100 µL av primär antikropp utspätt i antikropp förtunningsbuffert i en fuktig kammare.
Obs: För bästa resultat, inkubera primära antikroppar över natten vid 4 ° C. Använd mindre volymer av antikropp (t.ex. 50 µL) av täcker bilden med ett täckglas eller parafilm. Validera och optimera primära antikroppar15. - Skölj diabilder tre gånger för 5 min i en 50 mL Coplin burk som innehåller 1 x PBS.
Obs: Att förbättra tvättar, agitera Coplin burkar med hjälp av en liten magnetiska rör bar och placera på en tallrik med magnetiska rör på låg hastighet, eller placera Coplin burken på en bordsskiva mixer på låg hastighet. - Tillsätt 100 µL av sekundär antikropp utspätt i antikropp förtunningsbuffert för 1 till 1.5 h i en fuktig kammare vid rumstemperatur. Inkubera bilder i en mörk låda att undvika foto blekning av fluorophore konjugerade antikroppar.
Obs: Använd mindre volymer av antikropp (t.ex. 50 µL) av täcker bilden med ett täckglas eller parafilm. - Skölj bilderna två gånger för 5 min i en 50 mL Coplin burk som innehåller 1 x PBS.
- Montera bilder i monteringsmedium innehållande 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, 1,5 µg/mL) och applicera coverslips (22 x 60-1,5 mm).
- Tätning av coverslips till bilder med genomskinligt nagellack att bevara bilderna och förhindra att coverslips flyttar.
5. analys och imaging tubuli squash preparat
- Använd ett epifluorescensmikroskop med automatiserad scen som möjliggör exakta z-rörelser och en högupplöst kamera för att fånga bilden. Alternativt använda en laser confocal mikroskopet.
Obs: Använda alla tillgängliga maskinvara och programvara för detta steg. Exempelvis fångades bilder som visas i figur 1 och figur 2 med en Zeiss Cell observatör Z1 kopplad till en ORCA-Flash 4.0 CMOS kamera och analyseras med Zeiss ZEN 2012 blå edition bildbehandlingsprogram. - Bedöma de bilder som använder ett 20 X-objektiv för att bestämma kvaliteten på squash beredning. God kvalitet bilder har en enskiktslager av kärnor som är jämnt fördelade.
Obs: Vissa delar av bilden kan vara bättre än andra, det är värt att notera koordinaterna för där de bästa regionerna i bilden kan hittas för vidare analys med högre förstoring. - Använda högre förstoring mål (t.ex. 63 X eller 100 X), fånga områden i bilden som har en konsekvent enskiktslager av atomkärnor. När en region är vald, Ställ in övre och lägre Z-stackar för att säkerställa att alla i fokus Ljuset fångas.
Obs: Det optimala antalet Z-stackar fångas mellan den övre och undre gränsen betecknas generellt av programvaran bild förvärv och är olika för varje mål. - Använd den bildbehandlingsprogram för att sammanställa en utökad djup fokus bild. Programmet kombinerar i fokus ljuset från varje Z-stack och är avgörande för optimal avbildning av tubuli squash preparat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här har vi använt metoden tubuli squash för att visualisera övergående cellpopulationer som genomgår profas till metafas jag (G2/MI) transition, som var berikas av skörd testiklarna från juvenil vildtyp möss som genomgår den första vågen av spermatogenesen (24 DPP). Figur 1 illustrerar representativa bilder av de olika cell-faser som kan visualiseras med metoden tubuli squash. Berikad populationer av metafas jag spermatocyter var visualiserat med antikroppar mot alfa-tubulin (figur 1A). Utnyttjade vi markörer för tidiga och sena meios I till scenen meiotiska progression. Tubuli squash preparat var immunolabeled med en antikropp mot proteinet synaptonemal komplex, SYCP3, att visualisera stadier av profas I. Leptotene/zygotene och pachytene/diplotene spermatocyter visas i figur 1B. Spermatocyter genomgår första meiotiska divisionen kan identifieras med hjälp av antikroppar mot alfa-tubulin (figur 1A och 1 C). För att studera sent meiotiska händelser, var tubuli squash immunolabeled med hjälp av antikroppar mot de cellcykeln kinase Aurora B (AURKB), som lokaliserar till den inre Centromeren under metafas, sedan relocalizes till spindeln midzone och klyvning fåran under Anaphasen och cytokines, respektive (figur 1 c). Cytologiska funktioner av kromosomer var visualiserat under första meiotiska divisionen. För att observera ICDs, tubuli squash preparat var immunolabeled med antikroppar mot meios-specifika alpha-kleisin subuniten av cohesin, REC8 (figur 1 d). Kromosom dynamics under Anaphasen bedömdes med hjälp av alpha-tubulin immunolabelling och DNA fläcken, DAPI. En spermatocyte som framgångsrikt slutföra den första meiotiska divisionen visas i figur 1E, medan en spermatocyte som innehåller en Anaphasen bridge visas i figur 1F. Med hjälp av tubuli squash teknik, meiotiska spindeln längd, kan kromosom justering och segregation mätas och jämfört mellan mutant och kontroll möss.
Nytta av denna metod för visualisering av ytterligare cellcykeln-övergångar och subcellulära strukturer associerade med profas jag demonstreras i figur 2. Under leptotene undre fokalplanet av profas medieras I, inledandet av homologa kromosom ihopkoppling av dynamiska förändringar i telomeren bilagor att inducera bildandet av kromosom kluster inför en enda stolpe av kärn kuvert (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. denna konformation, känd som kromosomen ”bukett” tros öka sannolikheten för och frekvens mellan homolog interaktioner (figur 2A). Inledande och avslutning av synapsis mellan homologa kromosomer uppstår under zygotene (figur 2B) och pachytene substages (figur 2 c), respektive, motsvarande med progressiv spridning av den kromosom bukett. Att samtidigt bedöma synapsis och kromosom bukett dynamik i juvenil möss, vi immunolabeled tubuli squash preparat med antikroppar mot SYCP3 och centromerer, och färgas för DNA använder DAPI. Mus kromosomer är telocentric, därför centromer immunolabeling användes för att upptäcka förändringar i telomeren NE bilagor.
Meiotiska könskromosom inaktivering (MSCI) är ett kännetecken som är unika för manliga meios, whereby den icke-homologa X och Y kromosomer kringgå checkpoint aktivering av genomgår kromosom-wide fosforylering av Histon variant H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. X-Y kromosomparen är transcriptionally tystas och uppdelade i en tät nukleära underdomän som kallas ”sex kroppen”. Spermatocyter genomgår MSCI kan lätt identifieras under de pachytene och diplotene substages av immunolabeling tubuli squash preparat med antikroppar till yH2AX (Ser139). Figur 2D skildrar en spermatocyte på den pachytene undre fokalplanet immunolabelled med antikroppar mot yH2AX (Ser139), centromerer och fläckade DAPI att visualisera DNA.
Centrosome dubblering är delvis konservativ och inträffar under profas I av manliga meios efter slutförandet av DNA reparation för att säkerställa att varje resulterande dotter cell ärver två centrioles (en centrosome) efter celldelningen24,25 . Centrosomes består av två vinkelrätt ordnat centrioles ansluten av en flexibel länkare och omges av en amorf matris av proteiner som kallas den pericentriolar material/matrix (PCM)26. Efter dubbelarbete i pachytene undre fokalplanet, nybildade centriol par lossnar från varandra och genomgå centrosome mognad och migration till motsatta poler under diplotene scenen för att underlätta bildandet av bipolär spindlar. En tidig diplotene spermatocyte genomgår disjunktion nybildade centriol par var visualiserat med immunolabeling tubuli squash preparat med antikroppar mot pericentrin (PCNT), en protein komponent av PCM och Centrin-3 (CETN3) för att markera centrioles (figur 2E). Iscensättning bestämdes med hjälp av antikroppar mot SYCP3 och DAPI användes för att färga DNA.
Figur 1 : Representativ analys av meiotiska G2/MI övergången med hjälp av tubuli squash preparat. Tubuli squash preparat utfördes på seminifera tubuli segment av C57BL/6J möss i åldern 24 dpp. (A) representant området utveckla spermatocyter immunolabeled med antikroppar mot alfa-tubulin (röd), centromerer (grön) och DNA fläcken DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol, blå). (B) vildtyp tubuli squash var fläckade av DAPI (blå) samt immunolabeled med antikroppar mot alfa-tubulin (röd), och den laterala delen av SC, SYCP3 (grön). (C) vildtyp tubuli squash var fläckade DAPI (blå) samt immunolabeled med antikroppar mot alfa-tubulin (röd), och cellcykeln Kinas AURKB ()gröna). Cytologiska funktioner kromosomer som defibrillatorer och Anaphasen broar kan visualiseras med hjälp av tubuli squash preparat. (D) för att observera ICDs, metafasen spermatocyter var immunolabeled med antikroppar mot centromerer (röd) samt en meiotiska specifika cohesin komponent, REC8 (grön) och fläckade DAPI (blå). (E, F) Kromosom morfologi var visualiserat under Anaphasen med antikroppar mot alfa-tubulin (röd), centromerer (grön), och DAPI fläcken (blå). En full uppsättning utveckla spermatocyter kan identifieras med hjälp av tubuli squash teknik (L/Z, leptotene/zygotene skede spermatocyter; P/D, pachytene/diplotene skede spermatocyter; P.M., metafasen spermatocyter; M, metafas spermatocyter; A, Anaphasen spermatocyter). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Exempel på ytterligare morfologiska förändringar och strukturer associerade med meiotiska profas progression hos män som använder tubuli squash preparat. Tubuli squash preparat utfördes på seminifera tubuli segment av C57BL/6J möss i åldern 12-18 dpp och var fläckade av DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol, blå) att märka DNA. (A-C) Homolog synapsis är kopplat till bildning och progressiva spridning av kromosomen ”bukett” under profas progression. Leptotene (A), zygotene (B)och pachytene (C) scenen spermatocyter var immunolabeled med antikroppar mot SYCP3 (röd) och centromerer (grön). (D-E) Tubuli squash preparat kan användas för att upptäcka unika cytologiska förändringar och datastrukturer under manliga profas I progression inklusive meiotiska könskromosom inaktivering (MSCI) och centrosome dubbelarbete. (D) Pachytene skede spermatocyter genomgår MSCI upptäcktes med hjälp av antikroppar mot yH2AX (Ser139) för att märka kön-kroppen (grön pil) och centromerer visas i rött. (E) Diplotene skede spermatocyter identifierades med hjälp av antikroppar mot SYCP3 (röd) och centrosomes (pilspets) upptäcktes med hjälp av antikroppar mot Centrin-3 (grön) och Pericentrin (magenta) för att märka centrioles och pericentriolar material/matris, respektive. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Objekt | Belopp | Slutlig koncentration |
| 1 x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 ΜL | 0,8% (v/v) |
| 10% TritonX-100 i PBS | 100 ΜL | 0,1% (v/v) |
Tabell 1: Fix/Lys lösning. Beskrivning: Justera pH till 9 med NaOH [50mM]. Linda behållaren lösning i aluminiumfolie att skyddas från ljus och lagras vid 4 ° C. Använd inte fix/Lys lösningen om mer än en vecka gammal. Solid PFA kan också användas för att göra lösningen. En fumehood rekommenderas att undvika PFA exponering.
| Objekt | Belopp | Slutlig koncentration |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (w/v) |
| Häst Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% TritonX-100 i PBS | 250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabell 2: antikropp utspädning buffert (ADB) recept. Beskrivning: Butik ADB vid 4 ° C eller frysa bestånd vid-20 ° C om att göra större kvantiteter. ADB kan kontamineras, kontrollera bra aseptisk teknik används och bedöma lösningen för kontaminering före varje användning. Förbereda mindre portioner av ADB att minimera kontaminering.
| Celltyp | Cellulär Process | Mus ålder (dpp) |
| Leptotene | DNA DSB bildandet | 10 - 12 |
| Montering av axial element | ||
| Zygotene | Inledande av homologa DSB reparation och mås | 12 - 16 |
| Pachytene | Slutförandet av autosomal DSB reparation | 16 - 20 |
| Mognaden av crossover rekombination händelser | ||
| Komplett synapsis mellan homologs | ||
| Meiotiska könskromosom inaktivering (MSCI) | ||
| Centriol dubbelarbete/Centrosome mognad | ||
| Diplotene och Diakinesis | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Centrosome separation | ||
| Metafas jag | Spindeln Checkpoint | 22 - 26 |
| Runda Spermatid | Protamin ersättare | > 24 |
| Akrosomen bildandet |
Tabell 3: nära-synkron första våg av spermatogenes hos juvenila möss. Beskrivning: Specifika stadier av spermatogenesen är berikad i olika skeden av juvenil mus utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Möss har visat sig vara en användbar modellorganism för att studera de cellulära händelser som styr meiotiska progression under spermatogenes. Ytterligare, det är nödvändigt att utveckla verktyg catered till studiet av spermatogenesen eftersom många evenemang, såsom jag avsluta från meiotiska profas i, är könsdimorfism. Det här protokollet beskriver en seminifera tubuli squash metod för visualisering och studien av olika skeden av mus spermatogenes. Denna metod bevarar cellulär integritet och tillåter därmed detaljerade analyser av kärn- och cytoplasmiska strukturer. Representativa resultaten skildras i denna studie visar nyttan av detta protokoll bedömning av primära spermatocyter genomgår meiotiska progression. Detta protokoll kan dessutom också användas för att studera andra cellulära processer under spermatogenes, inklusive proliferation och differentiering av spermatogonier och stadier av spermiogenesis27,28. De metoder som beskrivs är inom är anpassade från tidigare beskrivna tubuli squash tekniker8,9. Detta protokoll är dock den första detaljerade guide, som omfattar alla reagenser och steg som krävs, från att erhålla tubuli att visualisera enstaka celler via fluorescensmikroskopi. Dessutom har vi presenterat bilder på ytterligare cellulära funktioner, inklusive centriol och telomer buketten, som kan visualiseras med tekniken.
Det finns några tekniska element som är viktiga för att optimera tubuli squash preparat. För det första måste en applicera rätt mängd kraft till täckglaset. Underlåtenhet att tillämpa tillräcklig kraft kommer att producera bilder med några vidhäftande celler, som de flesta celler förblir i sädeskanalerna. För det andra måste en Inkubera testiklarna materialet i fix/Lys lösningen för lämplig längd av tid. I allmänhet fixering bör begränsas till 5 min, men mellan 5 och 15 min är acceptabelt. Tubuli som har fastställts för en längre period kommer att bli svårt att manipulera och ger dåliga resultat. Det är dock möjligt, förlänga inkubationstiden genom att minska koncentrationen av PFA. Till exempel sänka procent PFA till 0,5% skulle möjliggöra ökad inkubationstider i fix/Lys lösningen. I metoden har vi presenterat, uppträder permeabilisering och fixering stegen samtidigt, men dessa åtgärder kan utföras efter varandra, respektive. Separera de permeabilisering och fixering steg kan hjälpa för att minska nivåerna av cytoplasmisk bakgrund signal. Variant av fixering och/eller permeabilisering strategier kan också testas för att optimera villkoren för bedömning av en viss subcellulär struktur eller antikropp. Till exempel visualisering av centrosomal och spindeln proteiner kan förbättras med hjälp av metanol istället för PFA29,30,31. Dessutom är det fördelaktigt att använda juvenil möss som framskrider genom den första vågen av spermatogenesen (cirka 10-26 dpp) för att specifikt och kraftfullt visualisera sällan meiotiska cellulära händelser12. Alternativt är det möjligt att isolera scenen-specifika meiotiska celler från vuxna möss genom att observera det ljusabsorption mönstret inom de seminifera tubuli32. Asynkron cykeln av spermatogenesen i vuxna möss får dock kan analysera sällsynta meiotiska händelser i detalj vara utmanande. Denna begränsning kan övervinnas genom att injicera möss med bisdichloroacetyldiamine, vinna 18,446, som blockerar vitamin A metabolism och stoppar spermatogoniala differentiering33. Efter behandling med vinna 18,466, återupptagande av spermatogenesen sker synkront, vilket ger stora mängder anrikat bakteriecellen populationer från en mogen djur34. Denna synkronisering strategi kan användas före tubuli squash tekniken för att undersöka skillnaderna mellan de första semi-synkron vågorna av spermatogenesen till de som uppstår i den vuxna35,36, 37. Dessutom korrelation mellan paternal åldrande och aneuploidi kunde också bedömas med vinna 18,466 synkronisering och bedöma kromosomsegregering med metoden tubuli squash.
Sammanfattningsvis kan denna metod användas tillsammans med immunofluorescens mikroskopi för att iaktta celler i olika stadier av spermatogenes. Tillämpas mer allmänt, denna teknik kan också användas för att bedöma delpopulationer av spermatogonier, spermatocyter och spermatids, och kan skräddarsys för att studera en mängd olika processer under spermatogenes. Detta tillvägagångssätt har använts för levande cell avbildning av spermatocyter och ändrades för att genomföra en mängd olika cellulära och biokemiska studier38,39,40. Tubuli squash tekniken har använts för mus och råtta seminifera tubuli, vilket tyder på att det lätt bör tillämpas på andra däggdjur system, inklusive människans40. Denna teknik kan hjälpa till att definiera de cellulära störningar som ger upphov till infertilitet och spermier aneuploidi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av NIGMS (R01GM11755) till P.W.J. och ett utbildning bevilja stipendium från National Cancer Institute (NIH) (CA009110) till S.R.W. och J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
