Summary
本报告概述了一个简单的方法, 成功诱导实验性自身免疫神经炎 (一) 使用髓磷脂蛋白零 (P0)180-199肽结合弗氏的完整佐剂和百日咳毒素。我们提出了一个复杂的范例, 能够准确地评估在这一过程中出现的功能性赤字和神经病的程度。
Abstract
实验性自身免疫神经炎 (欢迎) 是自身免疫性外周脱髓鞘疾病的实验模型。通过免疫小鼠的神经源性多肽诱导炎症, 使其对周围神经系统的成分有直接的攻击作用。最近的进展使得在相对耐药的 C57BL/6 小鼠线使用髓鞘蛋白零 (P0)106-125或 P0 的180-199多肽在佐剂和注射百日咳毒素的结合。在 C57BL/6 菌株中诱导药物的能力允许使用在这个老鼠背景上存在的众多的基因工具, 从而允许对疾病的发病机制和对新疗法的机械作用的审讯的复杂研究与转基因方法相结合。在本研究中, 我们展示了一个简单的方法, 成功地诱导使用 P0180-199肽的 C57BL/6 小鼠。我们还概述了在这个模型中出现的功能缺陷评估的一个协议, 同时还有一系列的病理特征。因此, 该模型是研究人外周脱髓鞘神经病的一个强有力的实验模型, 并确定了旨在促进髓鞘修复和预防自身免疫性神经损伤的潜在疗法的疗效。炎.
Introduction
外周神经病可以是遗传的起源或后天, 与后天神经病有代谢, 缺血性, 炎症, 或毒性沉淀。这些疾病也可以被归类为轴突或鞘的来源。最常见的后天性脱髓鞘外周神经病是急性炎症性脱髓鞘神经病 (AIDP, 也称为格林-巴利综合征, GBS) 和慢性炎症性脱髓鞘神经病 (CIDP)1,2,3,4;两者都是 pathogenetically 的特点是对髓鞘的自身免疫反应, 导致鞘周围神经。在这些疾病中, 活化的 T 细胞穿过血神经屏障, 在三七皂苷内产生免疫反应。激活的巨噬细胞, 然后导致鞘要么直接通过吞噬的攻击或间接通过分泌炎症介质, 导致临床残疾, 如麻痹和感觉障碍5。虽然鞘轴突保留 remyelinated 跟随鞘的能力, 髓通常是延迟或不完整的, 导致裸轴突的易感性到不可逆转的损害, 这是永久临床的主要原因残疾.目前, 最有效的治疗方法是免疫调节, 但尽管他们的疗效, 在许多情况下, 恢复往往是缓慢的和〜25% 患者将体验到剩余的功能赤字, 大大降低他们的生活质量6, 7。
是一种广泛使用的脱髓鞘周围神经病的动物模型, 它提供了有价值的洞察机制和评估新的治疗药物的方法4。该模型可诱导不同种类的家兔、大鼠、小鼠和豚鼠, 并由神经源性抗原免疫诱发。然而, 最终成功的细胞诱导依赖于适当的免疫反应的疾病发生。鉴于免疫功能的种类 (和间/应变) 的变化, 多种抗原和佐剂的组合已被开发成功地诱导了。在小鼠遗传工具方面, C57BL/6 是最广泛使用的;然而, 传统的 P2 蛋白肽 57-81 (P257-81), 导致在易感 SJL 小鼠菌株的疾病8是不能非法发病导致功能性赤字的 C57BL/6 菌株。幸运的是, 使用 P0106-125或 P0180-199多肽的敏化范例, 连同注射百日咳毒素的佐剂一起提供, 可以克服这一障碍, 使复杂的遗传工具能够用于小鼠模型。
本文介绍了一种简单的 C57BL/6 小鼠的诱导方法。此外, 还提供了一个综合详细的方法来评估与疾病相关的功能和病理的缺陷。P0180-199多肽9首选于 P057-81备选10。与 P057-81备选10相比, P0180-199模型已被描述为产生较不严重的临床症状, 因此可能会承受引入潜在有害的遗传摄动, 从外科手术中恢复 (如渗透泵植入), 并经得起跑步机的步态功能测试4。然而, 在 P0 的57-81诱导变异中研究这种疾病时, 可以很容易地使用在这里描述的跑步机步态功能测试和组织学协议。
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Protocol
此处描述的所有程序均由弗洛里神经科学和精神健康研究所 (墨尔本脑中心) 动物伦理委员会批准, 并遵循澳大利亚的《使用动物科学守则》目的.
1. 可诱导性
注意: 在6-8 周的雄性 C57BL/6 小鼠中可以成功的诱导。归纳协议总共需要9天。0天指的是第一次免疫的那天。对于这个协议, 注射进行了麻醉和 #160;(见下面的步骤 1.1.2).
- 在天-1:
- 准备百日咳毒素 (参见 材料表 ) 解决方案的1.6 和 #181; 使用无菌0.1 米小鼠-等渗磷酸盐缓冲盐水 (MT PBS)。
- 麻醉与异氟醚:
- 在麻醉室中放置鼠标 (C57BL/6、雄性、6-8 周), 并将氧气流量调整到1升/分.
- 打开异氟醚蒸发器, 调整它为麻醉 2.5%, 并监测呼吸和等待2分钟, 或直到初级反射 (角膜和后肢) 不再响应和 #160;
- 从麻醉腔中取出鼠标, 并管理250和 #181; 上述百日咳毒素溶液通过腹腔 (ip) 注射使用0.5 毫升注射器与 30 1/2 G 针.
- 准备注射接种免疫:
- 准备 解决方案 使用2毫克/毫升的 P0 180-199 多肽解决方案 (带和 #62; 98% 纯度, 在0.9% 盐水中, 序列 s-s--r-g--r-Q-T-对-钒--l--s--M--d--s-秒--s.
- 准备 解决方案 B 使用20毫克/mL 解决方案 结核分枝杆菌 (见 材料表 ) 在弗氏和 #39; 完全佐剂 (包括: 15% mannide monoolate + 85% 的石蜡油和0.5 毫克/毫升干燥杀死和干的 M 分枝杆菌酸 ).
- 将最终接种用于注射, 将解决方案 a 和 B 的相等体积部分组合在一个磁珠搅拌器中, 并在室温下以最高速度混合1分钟.
注: 解决方案 a 和 B 可以保存为库存, 并存储在4和 #176; C 为最多一个月, 但组合的最终接种必须在鼠标注射当天新鲜准备.
在0天的
- 中, 管理50和 #181; 接种 (步骤1.1.4 中概述) 的 L, 通过皮下注射使用23克针的皮下注射进入小鼠.
注: 注射可以放在肩胛骨之间, 也可放在后肢和尾部之间. - 在1天, 使百日咳毒素溶液的1.2 和 #181; g/毫升 (在 MT PBS) 和管理250和 #181; L 通过 ip 注射使用0.5 毫升注射器与 30 1/2 g 针的一只老鼠.
- 在3天, 重复上面的步骤 1.3.
注: 库存解决方案 a 和 B 可以组成, 并存储在4和 #730; C 为最多一个月。然而, 最终注射接种, 生产的结合股票解决方案 a 和 B, 必须在当天进行注射. - 在8天, 管理50和 #181; 接种 (步骤1.1.4 中概述) 的 L, 通过皮下注射 (参见上面的步骤 1.2), 在与步骤 1.2 (每种动物) 相同的注射地点, 在同一注入的小鼠上.
2. 临床评分
- 每天从0开始执行临床评分.
- 根据已发布的条件为每个鼠标提供0、1、2、3或4的分数 4 。请参见 表 1 以了解临床评分.
注意: 为了保持一致性, 应该努力在同一时间每天同时对小鼠进行评分.
3。电机功能评估
注意: 对相同队列的动物进行临床评分, 同时评估其运动性能。电机功能评估装置必须连接到装有步态功能成像系统的计算机 (参见 材料表 )。此外, 还建议所有被评估的小鼠都应该习惯于在诱导前进行的跑步任务。为此, 练习运行 (每只鼠标2测试运行) 在疾病诱导前三天执行 (天-3).
- 打开马达功能评估设备并在指示灯按钮上切换.
- 将鼠标牢牢地放在它的脚上, 然后将其放到一个装满红色墨水的容器中, 并保持其尾部的墨水.
注意: 此步骤对于 C57BL/6 应变是必需的, 但如果使用白大褂颜色的鼠标应变, 则可以跳过. - 将鼠标放到步行车厢中, 并将跑步机速度设置为15厘米/秒.
- 打开跑步机并单击 #34; 记录和 #34; 按钮以使用步态功能成像系统捕获鼠标的运行动作 (请参阅 材料表 ).
- 使用计时器并测量每个运行三十六年代的时间。三十六年代以后, 停止记录和停止跑步机.
注意: 无法成功完成三十六年代时间间隔的运行任务的鼠标被认为失败. - 将视频文件保存在指定的文件夹中.
- 对每个要评估的鼠标重复上述步骤。每3天测试一次相同的运行任务的小鼠.
- 使用软件为步态功能参数分析编辑过的视频文件 (请参阅 材料表 ).
注: 有关如何分析不同的马达参数的详细信息, 请参阅制造商和 #39 的说明, 然后再进行分析。通过免疫组化或电子显微镜获得轴突和髓鞘损伤的组织学证据, 动物组织可以根据研究的具体目的, 在任何阶段后运动功能评估中进行.
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Representative Results
P0180-199多肽诱导的 C57BL/6 小鼠, 导致一个单相疾病的临床评分开始从6天后第一次免疫 (dpi), 和最大评分严重性观察从 25 dpi, 然后从 40 dpi 的一些临床评分改善持续时间 (图 1)4,9。在步态功能方面, 早在 6 dpi 时, 小鼠就开始在一个简单的跑步任务上失败, 35 dpi 小鼠几乎没有能力完成一个简单的跑步机运行任务, 即使在 55 dpi4 (图 1) 也不能提高跑步能力。随着时间的推移, 被诱导的小鼠逐渐减少了执行任务的能力。在80% 的小鼠中观察到跑步任务失败, 但除此之外, 在跑步机跑步时, 后肢的步态扩大是一个关键的功能缺陷, 在疾病持续时间内是无法解决的4。
在 P0180-199中有几个关键的病理特征: 髓鞘损伤;轴突应力;增加了节点宽度和对 paranodal 结构的破坏。从坐骨神经神经薄切片的检查显示鞘 (图 2B, 箭头) 的区域与年龄匹配的健康控制 (图 2A) 的坐骨神经比较。重要的是, 这是可能获得的图像从薄坐骨神经切片拍摄的高功率与光学显微镜4的 G 比值。然而, 需要高功率透射电镜 (TEM) 图像, 以确定特定的病理特征, 如 dysmyelinaton, 对髓鞘的损伤, 和轴突应力的迹象, 如线粒体肿胀 (紊乱和失真的嵴和部分或全部 cristolysis) (图 2C-2D)。与轴突应力的超微结构证据 (图 2C-2D) 一致, P0180-199诱导的模型也显示急性轴突损伤, 表现为β-淀粉样前体的显著升高蛋白 (APP) 在坐骨神经中的表达 (图 3A)。这不是在年龄匹配的健康控制组织 (图 3A) 中观察到的。病理的变化在节点和 paranodes 已被很好地记录在 GBS;特别是, 一个变量11,12。在我们的小鼠模型中, 我们发现节点的扩大和对 paranode 的破坏是 P0180-199诱导的病理的附加的特性 (图 3B)。
图 1: 分度归纳范式的示意图表示、临床评分评估和在执行过程中的运行容量.(A) 在 C57BL/6 小鼠中, 从6-8 周龄开始, 在疾病病程期间 (B) 预期临床评分和 (C) 运行时间的示意图 (参见参考资料4)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 小鼠显示髓鞘丢失、髓鞘损伤和轴突应力的迹象.(a) 一个明亮的现场图像 (低于100X 放大率) 取自薄部分坐骨神经从年龄匹配的健康控制。(B) 在55天后第一次免疫接种 (dpi) 后, 从薄的小鼠坐骨神经中取出一个明亮的场图像 (在100X 放大率下)。缺髓鞘被稀薄的髓轴突 (箭头) 围拢的区域表明髓;这是没有观察到的组织中获得的年龄匹配的健康控制 (见 A)。(C) 一种具有代表性的电子显微镜图像 (在5,000X 放大率下) 取自 B 组的 fromsciatic 神经, 显示髓鞘病理 (开放箭头) 和轴突应力 (结合方表示 55 dpi 的线粒体肿胀)。(D) 高功率 TEM 图像 (C 中的边界盒), 显示了肿胀的线粒体表示轴突应力 (箭头头), 但这不符合年龄匹配的健康控制 (未显示数据)。缩放条形图 = 10 µm (a、B) 和 500 nm (C、D)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 轴突应力和结节病理是 P0180-199诱导的一个特征.(A) 单平面共焦图像 (低于40X 放大倍数) 通过坐骨神经在 55 dpi。从小鼠的组织显示显着提升应用程序表达 co-localized 与β III 蛋白 (神经元标记) 表明轴突压力的迹象。(B) 高功率 Z 投射 (100X 放大倍率) 的 paranodes 染色与抗体抗 Caspr 在坐骨神经节。在小鼠的节点中, 相邻 paranodes 之间的距离增加, 表示节点加宽。此外, 在小鼠身上可以观察到对 paranode 结构的破坏, 但不符合年龄匹配的健康控制。缩放条形图 = 10 µm (a) 和5µm (B)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 得分 | 标准 | 评估标准的注释和评论 |
| 0 | 普通鼠标 | |
| 1 | 不活泼或肥皂泡 | 这是根据正常处理评估, 小鼠通常首先显示减少活动的迹象, 从5天后免疫接种 |
| 2 | 尾麻痹或 | 尾麻痹是由尾冲程测试 (轻拂尾巴) 来评估的。 |
| 轻度肢体麻痹 | 轻度肢体麻痹指小鼠在平坦的地面上行走时将腹部拖到地上 | |
| 3 | 尾麻痹 + 轻度肢麻痹或 | 轻度共济失调被评定为在正常行走中的任何困难 |
| 尾麻痹 + 轻度共济失调或 | ||
| 轻度肢体麻痹 + 轻度共济失调 | ||
| 4 | 严重共济失调 | 严重的共济失调是由不典型的向后行走, 结合四肢麻痹, 轻度肢体麻痹, 或尾部麻痹 |
表 1: 临床评分范例。
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Discussion
本报告概述了一个简单的方法, 诱导使用 P0180-199多肽在 C57BL/6 小鼠, 使量化的关键病理和功能缺陷的小鼠的免疫诱导。不同的是, 这里所描述的归纳协议是使用麻醉, 而执行免疫注射。使用异氟醚麻醉, 大大提高了能力, 以确保总体积的接种被注入皮下在理想的位置, 最小的错误和压力的动物。
小鼠将开始显示疾病的临床症状从 6 dpi4使用这种方法的诱导。然而, 根据临床评分来衡量的疾病发作, 以前据报告为 10 dpi9,10。虽然临床评分确定的这种疾病发病的差异可能部分是由于不同的临床评分标准, 它更可能解释的是使用不同的佐剂在接种的免疫诱导。此协议使用弗氏的完整佐剂, 其中包含m 酸, 并辅以m 结核。其他研究使用弗氏的佐剂仅补充与m 结核在注射的接种包含 P0180-199肽9,10为免疫。
在本协议中, 推荐采用静脉注射 (静脉注射) 尾静脉注射百日咳毒素。已经表明, 百日咳分娩方式并没有显著改变疾病的发生或进展4, 但通过 ip 途径提供的选择, 而不是静脉注射尾静脉, 是由风险减轻和试图减少操作错误的可能性。与同等体积的注射相比, 尾静脉静脉注射在技术上更具挑战性。以前已经表明, 使用百日咳毒素作为佐剂是必要的, 以诱导在使用 P0180-199肽9。有趣的是, 先前的研究表明, 将这种方法中所概述的百日咳剂量减半, 就足以通过在跑步机运行4时的临床评分、神经病和步态加宽来测量非法药物。然而, 减少接种诱导期间使用的百日咳毒素的剂量会显著影响跑步能力, 而在跑步任务中, 当用本方法所描述的百日咳剂量的一半诱导时, 小鼠的表现会显著改善。4。
在这 P0180-199多肽诱导的模型中观察到的马达缺陷伴随着强大的病理证据。以前, 已经证明, 量化的髓鞘损伤的程度是足够敏感的, 以检测疾病的严重性变化导致的剂量的百日咳毒素在诱导。在这里, 其他的标志, 如轴向应力和中断的节点/paranodal 结构被确定, 导致一套定量的病理标记 P0180-199诱导的。这使得在评估疾病过程或新的治疗药物的功效时更谨慎地检查神经病。兴奋, 这些病理评估可能与功能读数相关, 以提供更深的洞察力, 更好地理解神经病和功能缺陷之间的关系, 这是这个模型的一个特点。除了在本研究中使用的病理分析和步态功能测试之外, 还提出了其他功能性评估, 如神经传导速度测量, 以充分捕捉治疗干预的功能结果这个模型。
鞘是一种功能强大且常用的实验模型, 用于检查周围神经和马尾神经, 是最常研究的外周髓。它的主要优势是, 它导致了一个可重复和可量化的运动缺陷, 从而允许从临床角度分析神经保护和髓鞘修复。此外, 髓鞘损伤是急性和重现性, 从而允许详细分析髓鞘和轴突损伤从病理学角度。
虽然模型代表一个令人兴奋的实验手段, 研究脱髓鞘周围神经病变, 有潜在的限制和技术挑战。了解人脱髓鞘周围神经病变的异质性是非常重要的, 涉及免疫系统与三七总苷的复杂相互作用。目前的挑战是, 没有一个动物模型可以忠实地模仿所有的方面。此外, 有大量的间和 inter-strain 变异关于疾病的严重性和进展的模型。例如, 我们发现在 C67/B6 小鼠体内所诱导的总毒性比 Lewis 大鼠 (未公布的数据) 所诱导的更严重。在同样的压力下, 也存在性别差异。我们未公布的数据表明, 在雄性 C57/B6 小鼠中诱导的模型比雌性小鼠更具可再生性, 然而, 导致性别差异的确切原因尚不清楚。
最后, 我们报告了一项协议, 允许在雄性 C57/B6 小鼠中对模型进行健壮快速的诱导。结合临床评分和运动功能评估与病理研究提供了一个战略工具, 从临床和病理角度研究脱髓鞘周围神经病变。重要的是, 它促进未来的研究的机制, 靶向周围神经髓鞘修复使用转基因老鼠的方法。
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Disclosures
作者对这项工作没有利益冲突。
Acknowledgments
DGG 是一个澳洲彼得多尔蒂和多发性硬化研究澳大利亚 (微软亚洲研究院) 早期职业研究员。JLF 得到微软亚洲研究院博士后奖学金的支持。这项工作得到澳大利亚国家卫生和医学研究理事会 (澳洲) 项目赠款 #APP1058647 JX。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
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