Summary
Denna rapport beskriver en enkel metod för att framgångsrikt framkalla experimentella autoimmuna neurit (EAN) med hjälp av myelin protein noll (P0)180-199 peptid i kombination med Freunds kompletta adjuvans och kikhosta toxin. Vi presenterar en sofistikerad paradigm kan korrekt bedöma omfattningen av funktionella underskott och neuropatologi som förekommer i denna EAN.
Abstract
Experimental autoimmune neurit (EAN) är en väl uppskattad experimentell modell för autoimmuna perifera demyeliniserande sjukdomar. EAN-sjukdomen framkallas av immuniseringsämnet möss med neurogen peptider direkt en inflammatorisk attack mot komponenter i det perifera nervsystemet (PNS). Senaste framstegen har aktiverat induktion av EAN i relativt resistent C57BL/6 mus linjen med hjälp av myelin protein noll (P0)106-125 eller P0180-199 peptider levereras i adjuvant kombinerat med injektion av kikhosta toxin. Förmågan att inducera EAN i C57BL/6 stam möjliggör användningen av de talrika genetiska verktyg som finns på denna mus bakgrund, och därmed tillåter sofistikerade studien av sjukdomspatogenes och förhör i den mekanistiska åtgärden av romanen therapeutics i kombination med transgena metoder. I denna studie visar vi ett enkelt tillvägagångssätt för att framgångsrikt inducera EAN använder P0180-199 peptiden i C57BL/6 möss. Vi beskriver också ett protokoll för bedömning av funktionella underskott som uppstår i denna modell, åtföljs av en mängd neuropatologiska funktioner. Således, denna modell är en kraftfull experimentell modell att studera patogenesen av människans perifera demyeliniserande neuropatier, och att avgöra effekten av potentiella terapier som syftar till att främja myelin reparation och skydda mot nervskador i autoimmuna neurit.
Introduction
Perifera neuropatier kan vara genetiska ursprung eller förvärvade, med förvärvade neuropatier har antingen metabola, ischemisk, inflammatoriska eller giftiga precipitants. Dessa sjukdomar klassificeras också med fördel som antingen axonal eller demyelinative ursprung. Den vanligaste förvärvade demyeliniserande perifera neuropatier är akut inflammatorisk demyeliniserande polyneuropati (AIDP, även känd som Guillain-Barrés syndrom, GBS) och kronisk inflammatorisk demyeliniserande polyneuropati (CIDP)1, 2 , 3 , 4. båda kännetecknas pathogenetically av en autoimmun reaktion riktad mot den myelinskidan, orsakar demyelinisering av perifera nerver. I dessa sjukdomar, aktiverade T-celler korsa blod nerv barriären och generera en immunreaktion i PNS. Aktivering av makrofager i nerven sedan orsakar demyelinisering antingen direkt via fagocytos attack eller indirekt via utsöndrade inflammatoriska mediatorer, vilket resulterar i kliniska funktionshinder såsom förlamning och sensorisk dysfunktion5. Medan demyeliniserade axoner behåller förmågan att vara remyelinated efter demyelinisering, remyelination är ofta försenad eller ofullständig, vilket leder till känslighet av nakna axoner till irreversibla skador, vilket är den största orsaken till permanent kliniska funktionshinder. För närvarande är de mest effektiva behandlingarna är immunmodulerande, men trots sin effekt, i många fall återhämtning ofta långsam och ~ 25% patienter kommer att uppleva kvarstående funktionella underskott som avsevärt minska deras livskvalitet6, 7.
EAN är en allmänt använd djurmodell av demyeliniserande neuropati som har gett värdefulla insikter om patogenes och ett sätt att bedöma nya terapeutiska medel4. Denna modell kan induceras hos olika arter såsom kaniner, råttor, möss och marsvin, och framkallas av immunisering med neurogen antigener. Ytterst beror framgångsrika EAN induktion emellertid på ett lämplig immunsvar för sjukdom inträffar. Med tanke på de arter (och inter-djurarter/stam) variationerna i immunförsvaret, har flera kombinationer av antigener och adjuvans utvecklats för att framgångsrikt inducera EAN. När det gäller murina genetiska verktyg är den C57BL/6 den mest använda; den traditionella P2 protein peptiden 57-81 (P257-81) som resulterar i sjukdom i mottagliga SJL mus stam8 är dock inte att olaglig patogenes leder till funktionella underskott i C57BL/6 stam. Lyckligtvis, sensibilisering paradigm med P0106-125 eller P0180-199 peptider, levereras i adjuvant kombinerat med injektion av kikhosta toxin kan övervinna detta hinder, aktivera avancerade genetiska verktyg för att utnyttjas i de murina EAN modell.
Här presenteras en enkel metod för induktion av EAN i C57BL/6 möss. Dessutom finns en omfattande detaljerad strategi som ska utvärderas de funktionella och neuropatologiska underskotten som förknippas med sjukdomen. P0180–199 peptid9 valdes framför de P057-81 alternativa10. P0180–199 modellen har beskrivits för att producera mindre allvarliga kliniska tecken jämfört med P057-81 alternativa10, och är därför sannolikt att stå emot införandet av potentiellt skadliga genetiska störningar, återhämta sig från kirurgiska ingrepp (såsom osmotisk pump implantation), och är mottagliga för löpband gait funktion testning4. Dock kan de löpband gait funktionstester och histologiska protokoll som beskrivs här enkelt appliceras när man studerar sjukdomen i en P057-81 inducerad variant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla förfaranden beskrivs här godkändes av Florey Institutet för neurovetenskap och psykisk hälsa (Melbourne hjärnan centrum) djur etikkommittén och följ den australiska uppförandekod för användning av djur för vetenskapliga Ändamål.
1. EAN induktion
Obs: EAN framgångsrikt kan induceras hos manliga C57BL/6 möss i åldern 6-8 veckor. Induktion protokollet tar 9 dagar totalt. Dag 0 refererar till dagen för den första immunisering. För detta protokoll, injektioner utfördes under anestesi (se steg 1.1.2 nedan).
- På dag -1:
- förbereda kikhosta Toxin (se Tabell för material) lösning på 1,6 µg/mL med steril 0,1 M mus-isoton fosfatet buffrad koksaltlösning (MT-PBS).
- Anesthetization med isofluran:
- Placera musen (C57BL/6, hane, 6-8 veckor) i anesthetization kammaren och justera syreflödet till 1 L/min.
- Slå på den isofluran spridare, justera det till 2,5% för anesthetization, och övervaka andas och vänta 2 min, eller tills primära reflexer (hornhinnan och hind limb) är inte längre responsiv
- Ta bort musen från anesthetization kammaren och administrera 250 µL av ovanstående kikhosta Toxin lösning via en intraperitoneal (IP) injektion med en 0,5 mL spruta med en 30 1/2 G nål.
- Förbereda det injicerbara inokulatet för immunisering:
- Förbered lösning A med 2 mg/mL lösning av P0 180-199 peptid (med > 98% renhet, sekvens S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) i 0,9% koksaltlösning.
- Förbered Lösning B med 20 mg/mL lösning av Mycobacterium tuberculosis (se Tabell för material) i Freund ' s komplett adjuvant (FCA, bestående av: 15% mannide monoolate + 85% av paraffinolja och 0,5 mg/mL av desiccated dödade och torkade M Mycobacterium butyricum).
- Att göra det slutliga inokulatet för att injicera, kombinera lika volym delar av lösningar A och B i en pärla visp och blanda dem med en maximal hastighet för 1 min i rumstemperatur.
Obs: Lösningar A och B kan hållas som lager och lagras vid 4 ° C i högst en månad men det kombinerade slutliga inokulatet måste vara nyberedd mus injektionen dag.
- På dag 0, administrera 50 µL av inokulatet (förberedelse beskrivs i steg 1.1.4) in i musen via en subkutan injektion med en 23-G nål.
Obs: Injektionen kan placeras mellan skulderbladen, eller mellan bakbenen och svansen över kaudala dorsum. - På dag 1, göra kikhosta Toxin lösningen på 1,2 µg/mL (i MT-PBS) och administrera 250 µL till en mus via i.p.-injektion med en 0,5 mL spruta med en 30 1/2 G nål.
- På dag 3, upprepa steg 1.3 ovan.
Obs: Lager lösningar A och B kan göras upp och lagras vid 4 ° c i högst en månad. Men den slutliga injicerbara inokulum, produceras genom att kombinera stamlösningar A och B, måste göras samma dag som injektion. - På dag 8, administrera 50 µL av inokulatet (förberedelse beskrivs i steg 1.1.4) in i musen via en subkutan injektion (se steg 1.2 ovan), på samma injektionsställe som i steg 1.2 (för varje djur)
2. kliniska Scoring
- utföra kliniska scoring ut daglig start på dag 0.
- Ge varje mus en poäng på 0, 1, 2, 3 eller 4 enligt de offentliggjorda kriterier 4. Se tabell 1 för EAN kliniska scoring.
Obs: För konsekvens, ett försök bör göras poäng möss på samma gång dagligen av samma forskaren.
3. Motorisk funktion bedömning
Obs: motor prestanda bedöms parallellt med kliniska scoring för samma kohort av djur. Motorisk funktion bedömning apparaten måste alltid vara ansluten till en dator att har en gångart funktion imaging system (se Tabell för material) installerat. Det rekommenderas också att alla möss ska bedömas bör vara vana att aktiviteten körs före EAN induktion. Detta gör praktiken körningar (2 provkörningar per mus) utförs tre dagar före sjukdomen induktion (dag -3).
- Tur på motorisk funktion bedömning apparater och växla på LYS-knappen.
- Kragen musen ordentligt och bläck fötter genom att sänka det till en behållare fylld med rött bläck medan du håller stjärten.
Obs: Detta steg krävs för C57BL/6 stammen, men kan hoppas över om en mus stam med en vit päls färg används. - Placera musen i gångavstånd facket och ställa in löpbandet hastigheten på 15 cm/s.
- Slå på löpband och klicka på den " post " knappen för att fånga den rinnande rörelsen av musen med hjälp av gånganalys funktionen imaging system (se Tabell för material).
- Använder en timer och mäta varje kör för 36 s. Efter 36 s, stoppa inspelning och stoppa löpbandet.
Obs: Möss som inte kan slutföra aktiviteten körs för 36 s intervallet anses ha misslyckats. - Spara videofilen i den angivna mappen.
- Upprepa ovanstående steg för varje mus bedömas. Test möss med den samma aktiviteten som körs varje 3 dagar.
- Analysera de redigerade video filer med programvara för gångarten funktionsparametrar (se Tabell för material).
Obs: Informationen för att analysera olika motor parametrar variera bland programvara så hänvisas till tillverkaren ' s instruktion innan analys. Att få histologiskt axonal och myelin skada via antingen immunohistokemi eller elektronmikroskopi, djur vävnader kan tas vid något skede post motorik bedömningen beroende på de specifika målen forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P0180-199 peptid inducerad EAN i C57BL/6 möss leder till en monofasiska sjukdom med kliniska Poäng debut från 6 dagar efter första immunisering (dpi), och maximal poäng svårighetsgrad observeras från 25 dpi följt av några kliniska Poäng förbättring från 40 dpi varaktighet (figur 1)4,9. När det gäller gait funktion, möss börjar misslyckas på en enkel aktivitet som körs så tidigt som 6 dpi, och av 35 dpi möss har liten förmåga att slutföra ett enkelt löpband kör uppgiften och förbättras inte i kör förmåga även vid 55 dpi4 (figur 1). Möss inducerad med EAN successivt minskat i deras förmåga att utföra aktiviteten körs över tid. Kör uppgift misslyckande observeras i 80% av möss, men förutom detta, bakbenen gait breddning i löpband kör är en viktiga funktionella underskott som inte löser över varaktigheten av sjukdomen4.
Det finns flera viktiga neuropatologiska funktioner i P0180-199 inducerad EAN: skador på myelin slida; Axon stress; och ökad nod bredd och skador på paranodal strukturer. Undersökning av semi tunna snitt tas från höftnerver avslöjar områden av demyelinisering (figur 2B, pilar) jämfört med höftnerver från åldersmatchade friska kontroller (figur 2A). Viktigt, är det möjligt att få bilder tagna från semi tunna ischiasnerven sektioner avbildas på hög effekt med ljusmikroskopi4G-förhållanden. Dock hög effekt överföring elektronmikroskopi (TEM) bilder krävs för att identifiera specifika neuropatologiska funktioner såsom dysmyelinaton, skador på myelin lamellerna, och tecken på axon stress såsom mitokondriell svullnad (oreda och snedvridning av cristae och partiell eller total cristolysis) (figur 2 c–2D). Konsekvent med ultrastructural bevis av axon stress (figur 2 c-2D), P0180-199 inducerad EAN modellen visar också akut axonal skada, visade kraftigt förhöjda β-amyloid prekursor (APP)-proteinuttryck i höftnerver (figur 3A). Detta beaktas inte i åldersmatchade friska kontroll vävnader (figur 3A). Neuropatologiska förändringar på noderna och paranodes är väldokumenterade i GBS; i synnerhet den AMAN variant11,12. Vi i vår murina EAN-modell, identifiera att breddning av noderna och avbrott i paranode är ytterligare neuropatologiska funktioner av P0180-199 inducerad EAN (figur 3B).
Figur 1: Schematisk bild av EAN induktion paradigm, kliniska Poäng bedömning och rinnande kapacitet under EAN. (A) Översikt över EAN induktion protokoll i C57BL/6 möss, påbörjas från 6-8 veckors ålder, med scheman över (B) förväntade kliniska resultat och (C) rinnande tider under sjukdom kurs (se referens4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: möss med EAN Visa myelin förlust, myelin skada och tecken på axoner stress. (A) A ljusa fältet bild (under 100 X förstoring) tagen från semi tunna snitt av höftnerver från åldersmatchade friska kontroll. (B) en ljusa fältet bild (under 100 X förstoring) tagen från semi tunna snitt av höftnerver från möss inducerad med EAN på 55 dagar efter första immunisering (dpi). Områden som saknar myelin omgiven av tunt myeliniserade axoner (pilspetsar) anger remyelination; Detta observerades inte i vävnad som erhållits från åldern-matchade friska kontroller (se A). (C), en representativ elektronmikroskopi bild (under 5.000 X förstoring) tagen fromsciatic nerver från panel B demonstrerande myelin patologi (öppen pil) och axon stress (bindande square som anger svullna mitokondrier 55 dpi). (D) en hög effekt TEM bild (markeringsramen i C) demonstrerande svullna mitokondrier som är vägledande för axon stress (pilen huvuden), men detta är frånvarande från åldersmatchade friska kontroller (inga data anges). Skala barer = 10 µm (A, B), och 500 nm (C, D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Axon stress och nodal patologi är en funktion av P0180-199 inducerad EAN. (A) confocal enda plan bilder (under 40 X förstoring) tagna genom höftnerver 55 dpi. Vävnad från EAN möss visar dramatiskt förhöjt APP uttryck Co lokaliserade med β-III tubulin (en markör för nervceller) visar tecken på axonal stress. (B) High power Z-projektioner (100 X förstoring) av paranodes färgas med en antikropp mot Cecilia i ischiasnerven sektioner. I noder från EAN möss finns det ett ökat avstånd mellan intilliggande paranodes som anger noden breddning. Dessutom nodal patologi såsom störningar i paranode-strukturen kan observeras i EAN möss men är frånvarande från åldersmatchade friska kontroller. Skala barer = 10 µm (A) och 5 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Poäng | Kriterier | Anteckningar och kommentarer av bedömningskriterier |
| 0 | Normal mus | |
| 1 | Mindre livliga eller lathery | Detta bedöms som svar på normal hantering, möss visar vanligtvis först tecken på minskad aktivitet på från dag 5 inlägg immunisering |
| 2 | Svans pares eller | Svans pares bedöms av svans stroke testet (snärta svansen). |
| Mild lem pares | Mild lem pares refererar till möss dra sin mage på marken när man går på en plan yta | |
| 3 | Svans pares + milda lem pares eller | Mild ataxi bedöms vara några svårigheter att normala promenader |
| Svans pares + milda ataxi eller | ||
| Mild lem pares + milda ataxi | ||
| 4 | Svår ataxi | Svår ataxi identifieras av atypiska bakåt promenader, kombinerat med antingen lem pares, mild lem pares eller svans pares |
Tabell 1: EAN kliniska Poäng paradigm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport beskriver en enkel metod för att framkalla EAN använder P0180-199 peptiden i C57BL/6 möss, vilket möjliggör kvantifiering av viktiga neuropatologiska och funktionella underskott hos möss inducerad med EAN. Distinkta i EAN induktion-protokollet som beskrivs här är användning av anestesi medan du utför immunisering injektionerna. Användning av isofluran anestesi förbättrar förmågan att säkerställa att den totala volymen av inokulatet injiceras subkutant på önskad plats med minimal fel och stress för djuren.
Möss kommer att börja Visa kliniska tecken på sjukdom från 6 dpi4 använder denna metod för EAN induktion. Dock har sjukdomsdebuten mätt som kliniska Poäng tidigare rapporterats från ~ 10 dpi9,10. Medan denna skillnad i sjukdomsdebuten som bestäms av kliniska Poäng kan delvis bero på olika kliniska poängkriterier, är det mer sannolikt förklaras av användningen av olika tillsatser i inokulatet för EAN induktion. Detta protokoll används en Freunds kompletta adjuvans som innehåller M. butyricum, som kompletteras med M. tuberkulos. Andra studier använda Freund's adjuvant endast ämbetsbevis M. tuberkulos i den injicerade inokulum som innehåller de P0180-199 peptid9,10 för immunisering.
I detta protokoll, leverera kikhosta toxin via i.p.-injektion rekommenderas istället för intravenös (i.v.) svans ven injektion. Det har visats att kikhosta leveranssättet inte väsentligt ändrar sjukdom uppkomsten eller progression4, men valet att leverera via i.p. rutten, i motsats till i.v. svans venen, motiveras av riskreducering och ett försök att minska den chans att driftsfel. Ofta, är svans ven i.v. injektioner tekniskt mer utmanande jämfört med injektioner av en lika stor volym. Det har tidigare visat att användningen av kikhosta toxin som ett adjuvans är nödvändigt att inducera EAN när med P0180-199 peptid9. Intressant, har tidigare arbete visat att halvera dosen av kikhosta som beskrivs i denna metod, är tillräckligt att olaglig EAN mätt med klinisk score, neuropatologi och gånganalys breddning under löpband kör4. Dock minskar dosen av kikhosta toxin används i under EAN induktion avsevärt påverkar rinnande kapacitet och möss utföra betydligt bättre på löpbandet aktiviteten körs när EAN induceras med hälften av kikhosta dosen som beskrivs för denna metod 4.
Motoriska brister observerades i denna P0180-199 peptid inducerad EAN modell är tillsammans och stöds av starka neuropatologiska bevis. Det har tidigare visats att kvantifiera omfattningen av myelin skada är tillräckligt känslig för att upptäcka förändringar i sjukdomens svårighetsgrad som resulterade från halvera dosen av kikhosta toxin under EAN induktion. Här, andra kännetecken för EAN såsom axonal stress och störningar i nod/paranodal strukturer har identifierats, vilket resulterar i en svit av kvantitativa neuropatologiska markörer för P0180-199 inducerad EAN. Detta möjliggör för försiktigare undersökningar av neuropatologi när utvärdera sjukdomsprocesser eller effekten av nya terapeutiska medel. Excitingly, kan dessa neuropatologiska bedömningar vara korrelerade till funktionsavläsningar i ett försök att ge djupare insikter och en bättre förståelse av förhållandet mellan neuropatologi och funktion underskotten som är en funktion i denna modell av EAN. Utöver den neuropatologiska analyser och gånganalys funktionstest anställd i denna studie, föreslås andra funktionella bedömningar som nerv överledning hastighet mätning för att fullständigt fånga funktion utfall av terapeutiska interventioner med hjälp Denna modell.
EAN är en kraftfull och vanliga experimentell modell att undersöka perifera demyelinisering och remyelination, med höftnerver och cauda equina är mest undersökt ofta perifera nerver. Den stora fördelen med EAN är att det resulterar i en reproducerbar och kvantifierbara motor underskott, vilket möjliggör analyser av neuroprotektion och myelin reparation från ett kliniskt perspektiv. Vidare, myelin skadan är akut och reproducerbara vilket möjliggör detaljerade analyser av myelin och axonal skada från en histopatologisk perspektiv.
Medan EAN modell representerar ett spännande experimentellt medelvärde att undersöka demyeliniserande neuropati, finns det potentiella begränsningar samt tekniska utmaningar. Det är viktigt att uppskatta den heterogenitet naturen av demyeliniserande neuropati hos människor, som inbegriper ett komplext samspel mellan immunsystemet och PNS. Utmaningen är att inga en EAN djurmodeller troget kan härma alla dess aspekter. Dessutom finns det betydande mellan arter och Inter stam variationer om sjukdomens svårighetsgrad och progression av EAN-modellen. Vi hittade till exempel att overallen EAN inducerad i C67/B6 möss är mindre allvarliga än EAN inducerad Lewis råttor (opublicerade data). Inom samma stam finns det också skillnad mellan könen. Våra opublicerade data visar att EAN modellen inducerad hos hanmöss C57/B6 är mer reproducerbar än den inducerade hos honmöss, men den exakta orsaken till grund för denna könsskillnad är oklart.
Sammanfattningsvis, rapporterade vi ett protokoll som möjliggör en stabil och snabb induktion av EAN-modellen i C57/B6 hanmöss. Att kombinera klinisk scoring och motorik bedömning med neuropatologiska studier ger ett strategiskt verktyg för att studera demyeliniserande neuropati från både kliniska och patologiska perspektiv. Ännu viktigare, främjar det framtida studier på mekanismer för behandlingar som är inriktade på perifer nerv myelin reparation med hjälp av transgena möss metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter kring detta.
Acknowledgments
DGG är en NHMRC Peter Doherty och multipelskleros forskning Australien (MSRA) tidiga karriär Fellow. JLF stöds av en MSRA postdoktorsstipendium. Detta arbete stöds av Australian National Health och medicinsk forskning rådet (NHMRC) projektet bevilja JX #APP1058647.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
