Summary
Dit verslag schetst een eenvoudige benadering om succesvol experimentele autoimmune neuritis (EAN) met behulp van de myeline proteïne nul peptide180-199 (P0) in combinatie met de Freund compleet adjuvans en kinkhoest toxine. We presenteren een verfijnde paradigma staat nauwkeurig de beoordeling van de omvang van functionele tekorten en Neuropathologie die zich voordoen in deze EAN.
Abstract
Experimentele autoimmune neuritis (EAN) is een goed gewaardeerd experimentele model van perifere demyeliniserende auto-immuunziekten. EAN ziekte wordt veroorzaakt door het immuniseren van muizen met neurogene peptiden aan direct een inflammatoire aanval naar onderdelen van het perifere zenuwstelsel (PNS). Recente ontwikkelingen hebben de inductie van EAN in de relatief resistent C57BL/6 muis lijn met behulp van myeline eiwit nul (P0)106-125 of P0180-199 peptiden geleverd in adjuvans gecombineerd met de injectie van pertussis toxine ingeschakeld. De capaciteit voor het opwekken van EAN in de stam van de C57BL/6 kunt voor het gebruik van de vele genetische hulpmiddelen die bestaan op de achtergrond van deze muis en dus de geavanceerde studie van de pathogenese van de ziekte en de ondervraging van de mechanistische actie van roman therapeutics in combinatie met transgene benaderingen. In deze studie tonen we een eenvoudige benadering van EAN met behulp van de P0180-199 peptide in C57BL/6 muizen met succes te induceren. Ook schetsen wij een protocol voor de beoordeling van functionele tekorten die zich bij dit model wordt begeleid door een matrix van neuropathologische kenmerken voordoen. Dit model is dus een krachtig experimenteel model om te bestuderen van de pathogenese van menselijke perifere demyeliniserende neuropathieën en voor het bepalen van de werkzaamheid van potentiële therapieën die gericht zijn op bevordering van myeline reparatie en bescherming tegen schade aan de zenuwen in auto-immuunziekten neuritis.
Introduction
Melding gemaakt van perifere neuropathieën kunnen genetische oorsprong of verworven, met de verworven neuropathieën hebben beide metabole, ischemische, inflammatoire of giftige neerslagmiddelen. Deze ziekten zijn ook nuttig ingedeeld als axonale of demyelinative oorsprong. De meest voorkomende verworven demyeliniserende melding gemaakt van perifere neuropathieën Acute inflammatoire demyeliniserende polyneuropathie (AIDP zijn, ook bekend als het syndroom van Guillain-Barré, GBS) en chronische inflammatoire demyeliniserende polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; beide zijn pathogenetically gekenmerkt door een auto-immune reactie gericht tegen de myelineschede, waardoor demyelinisatie van de perifere zenuwen. In deze ziekten, geactiveerde T-cellen Kruis het bloed zenuw barrière en genereren een immune reactie binnen de PNS. Activering van macrofagen binnen de zenuw dan veroorzaakt demyelinisatie via fagocytische aanval direct noch indirect via secreted inflammatoire mediatoren, resulterend in klinische handicaps zoals verlamming en sensorische dysfunctie5. Terwijl demyelinated axonen de mogelijkheid om te worden remyelinated na demyelinisatie behouden, remyelination wordt vaak vertraagd of onvolledig, resulterend in de gevoeligheid van de naakte axonen tot onherstelbare schade, welke is de belangrijkste oorzaak van permanente klinische handicap. Op dit moment de meest effectieve behandelingen zijn immunomodulerende, maar ondanks hun werkzaamheid, in veel gevallen het herstel is vaak traag en ~ 25% patiënten beleeft resterende functionele tekorten die aanzienlijk hun levenskwaliteit6verminderen, 7.
EAN is een veel gebruikte diermodel van demyeliniserende perifere neuropathie die waardevolle inzichten in de pathogenese en een middelen ter beoordeling van nieuwe therapeutische agenten4heeft. Dit model kan worden opgewekt in verschillende soorten zoals konijnen, ratten, muizen en cavia's, en wordt veroorzaakt door immunisatie met neurogene antigenen. Echter, uiteindelijk de succesvolle EAN-inductie hangt af van een passende immuunrespons voor ziekte optreden. Gezien de soorten (en intersite-species/stam) variaties in immune functie, hebben meerdere combinaties van antigenen en hulpstoffen ontwikkeld om met succes het induceren van EAN. In termen van lymfkliertest genetische hulpmiddelen is de C57BL/6 de meest gebruikte; de traditionele P2 eiwit peptide 57-81 (P257-81) waardoor de ziekte in de voor de ziekte vatbare SJL muis stam8 is echter niet in staat om illegale pathogenese leidt tot functionele tekorten in de stam van de C57BL/6. Gelukkig, overgevoeligheid paradigma's met behulp van de P0106-125 of P0180-199 peptides, geleverd in adjuvans gecombineerd met de injectie van pertussis toxine kunt overwinnen deze barrière, waardoor geavanceerde genetische hulpmiddelen om te worden gebruikt in de lymfkliertest EAN model.
Hier wordt een eenvoudige methode voor de inductie van EAN in de C57BL/6 muizen gepresenteerd. Daarnaast vindt u een gedetailleerde aanpak om te evalueren van de functionele en neuropathologische tekorten die is gekoppeld aan de ziekte. De P0180-199 peptide9 werd gekozen boven de P057-81 alternatieve10. Het P0180-199 model is beschreven voor de productie van minder ernstige klinische symptomen in vergelijking met de alternatieve P057-81 10, en daarom kunnen weerstaan van de invoering van potentieel schadelijke genetische verstoringen, herstellen van chirurgische procedures (zoals osmotische pomp implantatie), en is vatbaar voor loopband gait functie4testen. Echter kunnen de loopband gait functie tests en histologische protocollen beschreven hier gemakkelijk worden toegepast bij de studie van de ziekte in een P057-81 geïnduceerde variant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedures die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het Florey-Instituut voor Neurowetenschappen en geestelijkegezondheid (Melbourne hersenen centrum) dier ethisch comité en volg de Australische gedragscode voor het gebruik van dieren voor wetenschappelijk Doeleinden.
1. EAN inductie
Opmerking: EAN kan met succes worden opgewekt bij mannelijke C57BL/6 muizen leeftijd tussen 6-8 weken. Het inductie-protocol duurt 9 dagen in totaal. Dag 0 verwijst naar de dag van de eerste immunisatie. Voor dit protocol, injecties werden uitgevoerd onder verdoving (zie stap hieronder 1.1.2).
- Op dag -1:
- bereiden de toxine Pertussis (Zie Tabel van materialen) oplossing van 1.6 µg/mL met behulp van de steriele 0,1 M muis-isotone fosfaat gebufferde zoutoplossing (MT-PBS).
- Afstomping met Isofluraan:
- plaats van de muis (C57BL/6, man, 6-8 weken) in de zaal afstomping en aanpassen van de stroom van zuurstof aan 1 L/min.
- Zet de vaporizer Isofluraan, aanpassen tot 2,5% voor afstomping, en monitor ademhaling en wacht gedurende 2 minuten, of totdat de primaire reflexen (hoornvlies en hind-limb) zijn niet meer responsieve
- De muis uit de zaal afstomping verwijderen en beheren van 250 µL van de bovenstaande Pertussis toxine oplossing via een intraperitoneaal (i.p.) injectie met een 0,5 mL injectiespuit met een naald 30 1/2 G.
- De injecteerbare entmateriaal voorbereiden immunisatie:
- voorbereiden oplossing A met 2 mg/mL oplossing van P0 180-199 peptide (met > 98% zuiverheid, volgorde S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in een zoutoplossing 0,9%.
- Voorbereiden Oplossing B met 20 mg/mL oplossing van Mycobacterium tuberculosis (Zie Tabel van materialen) in Freund ' s compleet adjuvans (FCA, bestaande uit: 15% mannide monoolate + 85% van paraffineolie en 0,5 mg/mL van gedroogde gedood en gedroogde M Mycobacterium butyricum).
- Om de laatste entmateriaal voor het injecteren, combineren van gelijk volume delen van oplossingen A en B in een kraal klopper en meng ze tegen een maximumsnelheid voor 1 minuut bij kamertemperatuur.
Opmerking: Oplossingen A en B kunnen worden gehouden als voorraad en opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal een maand maar het gecombineerde definitieve entmateriaal moet vers worden bereid op de dag van de muis injectie.
- Op dag 0, 50 µL van het entmateriaal (voorbereiding beschreven in stap 1.1.4) beheren in een muis via een subcutane injectie met behulp van een naald 23 G.
Opmerking: De injectie kan worden geplaatst tussen de schouderbladen, of tussen de hind-limb en staart over het caudal dorsum. - Op dag 1, de Pertussis toxine oplossing van 1.2 µg/mL (in MT-PBS) maken en beheren van 250 µL in een muis via i.p. injectie met een 0,5 mL injectiespuit met een naald 30 1/2 G.
- Op dag 3, herhaal stap 1.3 hierboven.
Opmerking: Voorraad oplossingen A en B kunnen worden samengesteld en opgeslagen op 4 ˚C voor een maximum van één maand. Echter, de laatste injecteerbare entmateriaal, geproduceerd door het combineren van stamoplossingen A en B, moet gebeuren op de dag van de injectie. - Beheren op dag 8, 50 µL van het entmateriaal (beschreven in stap 1.1.4 voorbereiding) in een muis via een subcutane injectie (zie stap 1.2 hierboven), op de dezelfde injectieplaats zoals in stap 1.2 (voor elk dier)
2. klinische scoren
- voeren klinische scoren uit dagelijkse beginnen op dag 0.
- Geven elke muis een score van 0, 1, 2, 3 of 4 volgens de gepubliceerde criteria 4. Zie tabel 1 voor het scoren van klinische EAN.
Opmerking: Voor consistentie, moet worden getracht te scoren muizen tegelijk dagelijks door de dezelfde onderzoeker.
3. Motor functie beoordeling
Opmerking: de prestaties van de motor in parallel met klinische scoren voor de dezelfde cohort van dieren wordt beoordeeld. Het motor functie beoordeling apparaat moet worden aangesloten op een computer dat heeft een gait functie imaging systeem (Zie Tabel van materialen) geïnstalleerd. Het is ook aanbevolen dat alle muizen worden beoordeeld moeten worden gewend aan de lopende taak vóór EAN inductie. Om dit te doen, praktijk loopt (2 test sessies per muis) worden uitgevoerd drie dagen voorafgaand aan ziekte inductie (dag -3).
- Zet de motor functie beoordeling toestellen en de switch op de lichte toets.
- Scruff de muis stevig en inkt zijn voeten door het verlagen van het op een container gevuld met rode inkt terwijl haar staart.
Opmerking: Deze stap is vereist voor de stam C57BL/6, maar kan worden overgeslagen als de stam van een muis met een witte jas-kleur wordt gebruikt. - Plaatst u de muisaanwijzer in het compartiment lopen en de snelheid van de loopband op 15 cm instellen/s.
- Draaien op de loopband en op de " record " knop vast te leggen van de draaiende beweging van de muis met behulp van de functie van de gait imaging systeem (Zie Tabel of Materials).
- Gebruiken een timer en meten van elke lopen voor 36 s. Na 36 s, opname stoppen en stop de loopband.
Opmerking: Muizen die niet met succes van de lopende taak voor dit interval s 36 voltooien worden beschouwd te hebben gefaald. - Slaat het videobestand in de aangewezen map.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor elke muis worden beoordeeld. De muizen met dezelfde lopende taak om de 3 dagen testen.
- Analyseren de bewerkte video bestanden met behulp van software voor gait functieparameters (Zie Tabel of Materials).
Opmerking: De details van hoe te analyseren verschillende motor parameters verschillen onder software zo gelieve te verwijzen naar de fabrikant ' s instructie vóór de analyse. Te krijgen van de histologische bewijs van axonale en myeline schade via immunohistochemistry of elektronenmicroscopie, dierlijke weefsels op de elke fase post motor functie beoordeling afhankelijk van de specifieke doelstellingen van het onderzoek kunnen worden genomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P0180-199 peptide geïnduceerde EAN in C57BL/6 muizen leidt tot een monofasische ziekte met klinische score begin van 6 dagen post eerste immunisatie (dpi) en maximale score ernst is waargenomen vanaf 25 dpi gevolgd door sommige klinische score verbetering van 40 dpi duur (Figuur 1)4,9. In termen van gait functie, muizen begint te falen bij een eenvoudige lopende taak zo spoedig 6 dpi, en door 35 dpi muizen weinig capaciteit om te voltooien een eenvoudige loopband taak uitvoeren en niet verbeteren in rijklare staat zelfs op 55 dpi4 (Figuur 1). Muizen geïnduceerde met EAN geleidelijk gedaald in hun vermogen om de lopende taak uitvoeren na verloop van tijd. Uitvoeren van taakmislukking wordt waargenomen in 80% van de muizen, maar naast deze, hind-limb gait verruiming van de loopband lopen is een belangrijke functionele buitensporig tekort niet is opgelost over de duur van de ziekte4.
Er zijn verschillende belangrijke neuropathologische functies in P0180-199 geïnduceerde EAN: schade aan de myelineschede; axon stress; en breedte van het verhoogde knooppunt en schade aan paranodal structuren. Onderzoek van semi-dunne secties die zijn ontleend aan de ischiadicus zenuwen blijkt gebieden van demyelinisatie (figuur 2B, pijlen) in vergelijking met ischiadicus zenuwen van leeftijd-matched gezonde controles (figuur 2A). Nog belangrijker is, is het mogelijk om beelden vanaf Nervus ischiadicus semi-dunne secties beeld op hoog vermogen met de lichte microscopie van4G-ratio's te verkrijgen. Echter hoogvermogen Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beelden zijn vereist ter aanduiding van de specifieke neuropathologische kenmerken zoals dysmyelinaton, schade aan de myeline lamel, en tekenen van axon stress zoals mitochondriale zwelling (disarrangement en verstoring van de cristae en gedeeltelijke of totale cristolysis) (figuur 2C-2D). In overeenstemming met het ultrastructurele bewijs van axon stress (figuur 2C-2D), de P0180-199 geïnduceerde EAN model toont ook acute axonale schade, blijkt uit de sterk verhoogde β-amyloid precursor eiwit (APP) expressie in de ischiadicus zenuwen (figuur 3A). Dit is niet waargenomen in de controle van leeftijd-matched gezonde weefsels (figuur 3A). Neuropathologische veranderingen op de knooppunten en de paranodes zijn goed gedocumenteerd in GBS; in het bijzonder de AMAN variant11,12. In onze lymfkliertest EAN-model, we identificeren dat het verbreden van de knooppunten en de verstoring van de paranode extra neuropathologische kenmerken zijn van P0180-199 geïnduceerde EAN (figuur 3B).
Figuur 1: schematische weergave van de EAN inductie paradigma, klinische beoordeling en lopende capaciteit gast tijdens EAN. (A) overzicht van EAN inductie protocol in C57BL/6 muizen, beginnend vanaf 6-8 weken oud, met schema van (B) verwachte klinische scores en (C) actieve momenten tijdens ziekte cursus (zie referentie4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: muizen met EAN weer myeline verlies, beschadiging van de myeline en tekenen van stress van de axonen. (A) A helder veld afbeelding (onder 100 X vergroting) semi-dunne secties van ischiadicus zenuwen van leeftijd-matched gezonde controle onttrokken. (B) een lichte veld beeld (onder 100 X vergroting) genomen uit semi-dunne lagen van de ischiadicus zenuwen van muizen geïnduceerde met EAN 55 dagen post eerste immunisatie (dpi). Gebieden ontbreken van myeline omgeven door dun myelinated axonen (pijlpunten) geven remyelination; Dit werd niet waargenomen in weefsel verkregen van leeftijd-matched gezonde controles (zie A). (C) A representatieve elektronenmicroscopie beeld (onder 5000 X vergroting) genomen fromsciatic zenuwen van paneel B demonstrerende myeline pathologie (open pijl) en stress van het axon (bindende plein die aangeeft gezwollen mitochondriën op 55 dpi). (D) een hoogvermogen TEM beeld (selectiekader in C) demonstrerende gezwollen mitochondriën die indicatief van axon zijn benadrukken (pijl hoofden), maar dit is afwezig van leeftijd-matched gezonde controles (gegevens niet worden weergegeven). Schaal bars = 10 µm (A, B), en 500 nm (C, D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Axon stress en knooppunten pathologie is een functie van P0180-199 geïnduceerde EAN. (A) één vliegtuig confocal opnamen (onder 40 X vergroting) via de zenuwen van de ischiadicus op 55 dpi. Weefsel van EAN muizen Toon dramatisch verhoogde APP expressie samen gelokaliseerd met β-III tubuline (een marker van neuronen) met de vermelding tekenen van axonale stress. (B) High power Z-projecties (100 X vergroting) van paranodes gekleurd met een antilichaam tegen Caspr in de secties van de nervus ischiadicus. In knooppunten van EAN muizen is er een grotere afstand tussen aangrenzende paranodes die aangeeft dat de verbreding van het knooppunt. Daarnaast knooppunten pathologie zoals verstoring van de paranode-structuur kan worden waargenomen in EAN muizen maar afwezig is van leeftijd-matched gezonde controles. Schaal bars = 10 µm (A), en 5 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Score | Criteria | Nota's en commentaren van beoordelingscriteria |
| 0 | Normale muis | |
| 1 | Minder levendig of lathery | Dit is beoordeeld in reactie op het afhandelen van normale muizen meestal eerst vertonen verminderde activiteit op van dag 5 post immunisatie |
| 2 | Staart parese of | Staart parese wordt beoordeeld door de staart beroerte test (flicking de staart). |
| Milde ledemaat parese | Milde ledemaat parese verwijst naar muizen slepen hun buik op de grond bij het lopen op een vlakke ondergrond | |
| 3 | Staart parese + milde ledemaat parese of | Milde ataxie is beoordeeld als elke moeilijkheid in het normale walking |
| Staart parese + milde ataxie of | ||
| Milde ledemaat parese + milde ataxie | ||
| 4 | Ernstige ataxie | Ernstige ataxie wordt aangeduid met atypische achteruit lopen, gecombineerd met ledemaat parese, milde ledemaat parese of staart parese |
Tabel 1: EAN klinische score paradigma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit verslag schetst een eenvoudige methode om te induceren EAN met behulp van de P0180-199 peptide in C57BL/6 muizen, waardoor de kwantificering van belangrijke neuropathologische en functionele tekorten in muizen geïnduceerde met EAN. Verschillende bij het protocol van de EAN-inductie hier beschreven is het gebruik van verdoving tijdens het uitvoeren van de immunisatie injecties. Het gebruik van Isofluraan verdoving verbetert sterk de mogelijkheid om ervoor te zorgen dat het totale volume van entmateriaal subcutaan geïnjecteerd in de gewenste locatie met minimale fout en stress bij de dieren.
Muizen zullen beginnen te geven van klinische symptomen van ziekte van 6 dpi4 met behulp van deze methode van EAN inductie. Begin van de ziekte zoals gemeten door klinische score is echter eerder gemeld optreden van ~ 10 dpi9,10. Terwijl dit verschil in ziekte zoals bepaald door klinische score gedeeltelijk wijten zijn aan verschillende klinische scoren criteria te kan, is het meer waarschijnlijk verklaard door het gebruik van verschillende hulpstoffen in het entmateriaal voor de EAN inductie. Dit protocol maakt gebruik van een Freund compleet adjuvans met M. butyricum, die wordt aangevuld met M. tuberculosis. Andere studies gebruik Freund van adjuvante aangevuld alleen met M. tuberculosis in de ingespoten entmateriaal met de P0180-199 peptide9,10 voor immunisatie.
In dit protocol, het leveren van pertussis toxine via i.p. injectie wordt aanbevolen boven intraveneuze (i.v.) staart veneuze injectie. Het is aangetoond dat de wijze van pertussis levering niet significant ontstaan of de progressie van de ziekte4 verandert, maar de keuze te leveren via de i.p. route, in tegenstelling tot de i.v. staart ader, is ingegeven door risicobeperking en een poging om de kans op operationele fout. Vaak zijn staart ader i.v. injecties technisch moeilijker in vergelijking met injecties van een gelijk volume. Eerder is aangetoond dat het gebruik van pertussis toxine als adjuvans noodzakelijk is voor een EAN bij het gebruik van de P0180-199 peptide9. Interessant, heeft eerdere werk aangetoond dat het halveren van de dosering van pertussis beschreven in deze methode, is voldoende om illegale EAN gemeten door klinische score, Neuropathologie en gait verbreding tijdens loopband met4. Echter, verlagen van de dosis van pertussis toxine gebruikt in tijdens EAN inductie aanzienlijk beïnvloedt lopende capaciteit en muizen uit te voeren aanzienlijk beter bij het uitvoeren van de taak wanneer EAN wordt geïnduceerd met de helft van de kinkhoest dosis beschreven in deze methode loopband 4.
De motor tekorten waargenomen in dit P0180-199 peptide geïnduceerde EAN model is begeleid en ondersteund door sterke neuropathologische aanwijzingen. Eerder, is gebleken dat het kwantificeren van de omvang van de beschadiging van de myeline gevoelig genoeg om te detecteren veranderingen in de ernst van de ziekte die het gevolg is is van het halveren van de dosering van pertussis toxine tijdens EAN inductie. Hier andere kenmerken van EAN zoals axonale stress en verstoring van knooppunt/paranodal structuren worden geïdentificeerd, wat resulteert in een reeks van kwantitatieve neuropathologische markers voor P0180-199 geïnduceerde EAN. Hierdoor voor voorzichtiger examens van Neuropathologie bij de beoordeling van ziekteprocessen, of de werkzaamheid van nieuwe therapeutische agenten. Opwindend, kunnen deze neuropathologische evaluaties worden gecorreleerd aan functionele uitlezingen in een poging om het verstrekken van diepere inzichten en een beter begrip van de relatie tussen Neuropathologie en de tekorten van de functie die een kenmerk van dit model van EAN. Naast de neuropathologische analyses en gait functietest die werkzaamheden in loondienst in deze studie, worden andere functionele evaluaties zoals zenuw geleiding snelheid meting voorgesteld om de functie resultaten van therapeutische interventies met behulp van volledig te vangen Dit model.
EAN is een krachtige en meest gebruikte experimentele model perifere demyelinisatie en remyelination, met de ischiadicus zenuwen en cauda equina wordt het meest onderzocht vaak perifere zenuwen te onderzoeken. Het grote voordeel van EAN is dat het leidt tot een reproduceerbare en kwantificeerbare motor tekort, waardoor analyses van neuroprotectie en myeline reparatie vanuit klinisch oogpunt. Verder, is de beschadiging van de myeline acute en reproduceerbare waardoor gedetailleerde analyses van de myeline en axonale schade als gevolg van een histopathologisch perspectief.
Hoewel EAN model een spannende experimentele gemiddelde vertegenwoordigt te onderzoeken demyeliniserende perifere neuropathie, zijn er mogelijke beperkingen alsmede technische uitdagingen. Het is belangrijk om de aard van de heterogeniteit van perifere neuropathie bij de mens, waarbij een complexe interactie tussen het immuunsysteem en de PNS demyeliniserende waarderen. De huidige uitdaging is dat geen één EAN-diermodel getrouw al zijn aspecten kan nabootsen. Verder zijn er aanzienlijke onderlinge soorten en inter stam variaties met betrekking tot de ernst van de ziekte en de progressie van de EAN-model. Bijvoorbeeld, vonden we dat de totale de EAN geïnduceerd in muizen C67/B6 is minder ernstig dan de EAN geïnduceerd in Lewis ratten (niet-gepubliceerde gegevens). Binnen dezelfde stam is er ook verschil van geslacht. Onze niet-gepubliceerde gegevens blijkt dat het model van de EAN geïnduceerd in mannelijke C57/B6 muizen meer reproduceerbare dan degene die zijn geïnduceerd in vrouwelijke muizen, maar de exacte reden onderbouwing van dit verschil van geslacht onduidelijk is.
Kortom, we een protocol waarmee een robuust en snelle inductie van de EAN-model in mannelijke C57/B6 muizen gemeld. Het combineren van klinische scoren en motor functie beoordeling met neuropathologische studies verstrekt een strategisch instrument voor de studie van demyeliniserende perifere neuropathie vanuit zowel klinisch en pathologisch perspectieven. Nog belangrijker is, bevordert het toekomstige studies over de mechanismen van de therapieën die gericht zijn op perifere zenuwen myeline reparatie met behulp van transgene muis benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang met betrekking tot dit werk.
Acknowledgments
DGG is een NHMRC Peter Doherty en Multiple sclerose onderzoek Australië (MSRA) vroege carrière Fellow. JLF wordt ondersteund door een MSRA Postdoctoral Fellowship. Dit werk werd gesteund door de Australian National Health en medische onderzoek Raad (NHMRC) project #APP1058647 aan JX verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
