Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En enkel metode til at fremkalde eksperimentelle Autoimmune Neuritis i C57BL/6 mus for funktionelle og neuropatologiske vurderinger

doi: 10.3791/56455 Published: November 9, 2017

Summary

Denne betænkning skitserer en enkel tilgang for at med held fremkalde eksperimentelle autoimmune neuritis (EAN) ved hjælp af myelin protein nul (P0)180-199 peptid i kombination med Freunds komplet adjuvans og pertussis toksin. Vi præsenterer en sofistikeret paradigme i stand til præcist at vurdere omfanget af funktionelle mangler og neuropatologiske, der forekommer i denne EAN.

Abstract

Eksperimentelle autoimmune neuritis (EAN) er et godt værdsat eksperimentel model af autoimmune perifere demyeliniserende sygdomme. EAN sygdom er fremkaldt af immuniserende mus med neurogen peptider til direkte en inflammatorisk angreb mod komponenter i det perifere nervesystem (PNS). De seneste fremskridt har aktiveret induktion af EAN i den relativt resistente C57BL/6 mus linje ved hjælp af myelin protein nul (P0)106-125 eller P0180-199 peptider leveret i adjuverende kombineret med injektion af kighoste toksin. Evnen til at fremkalde EAN i C57BL/6 stamme giver mulighed for brug af de mange genetiske værktøjer, der findes på denne mus baggrund, og dermed giver mulighed for avancerede studier af sygdommen patogenese og forhør af handlingen mekanistiske af roman therapeutics i kombination med transgene tilgange. I denne undersøgelse viser vi en enkel tilgang for at kunne fremkalde EAN bruger P0180-199 peptid i C57BL/6 mus. Vi skitsere også en protokol for vurdering af funktionelle mangler, der opstår i denne model, ledsaget af en række Neuropatologisk funktioner. Således, denne model er en kraftfuld eksperimentelle model til at studere patogenesen af menneskelige perifere demyeliniserende neuropatier, og at fastslå effekten af potentielle behandlingsformer, der har til formål at fremme myelin reparation og beskytte mod nerveskader i autoimmune neuritis.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Perifer neuropati kan være genetisk oprindelse eller erhvervede, med erhvervede neuropatier har enten metaboliske, kar, inflammatoriske, eller giftige precipitants. Disse sygdomme er også nyttigt klassificeret som enten cytoskeletale eller demyelinative oprindelse. De mest almindelige erhvervet demyeliniserende perifere neuropatier er akut inflammatorisk demyeliniserende polyneuropati (AIDP, også kendt som Guillain-Barré syndrom, GBS) og kronisk inflammatorisk demyeliniserende polyneuropati (CIDP)1, 2 , 3 , 4; begge er pathogenetically karakteriseret ved en autoimmun reaktion mod myelinskeden, forårsager demyelinering af de perifere nerver. I disse sygdomme, aktiverede T celler krydse blod nerve barriere og generere en immunreaktion i PNS. Aktiveringen af makrofager i nerve derefter forårsager demyelinering enten direkte via fagocyterende angreb, eller indirekte via udskilles inflammatoriske mediatorer, hvilket resulterer i klinisk handicap såsom lammelse og sensorisk dysfunktion5. Mens demyelinated axoner bevarer evnen til at være remyelinated efter demyelinering, remyelination er ofte forsinket eller ufuldstændig, resulterer i modtagelighed af de nøgne axoner til uoprettelige skader, som er den største årsag til permanent kliniske handicap. I øjeblikket de mest effektive behandlinger er immunmodulerende, men trods deres effektivitet, i mange tilfælde opsvinget er ofte langsomme og ~ 25% patienter vil opleve resterende funktionelle mangler, der væsentligt reducerer deres livskvalitet6, 7.

EAN er en udbredt dyremodel af demyeliniserende perifer neuropati, der har givet værdifulde indsigt i patogenese og et middel til at vurdere nye terapeutiske agenter4. Denne model kan være fremkaldt i forskellige arter som kaniner, rotter, mus, og marsvin, og er foranlediget af immunisering med neurogen antigener. Men i sidste ende vellykket EAN induktion afhænger af en passende immunrespons for sygdom opstår. Givet de arter (og Inter-Diesel-dyr/stamme) variationer i immunforsvaret, er flere kombinationer af antigener og adjuvanser, der udviklet til at kunne fremkalde EAN. Med hensyn til murine genetiske værktøjer er C57BL/6 den mest udbredte; men den traditionelle P2 protein peptid 57-81 (P257-81), der resulterer i sygdom i den modtagelige SJL mus stamme8 er afskåret fra ulovlige patogenese fører til funktionelle mangler i C57BL/6 stamme. Heldigvis, sensibilisering paradigmer ved hjælp af P0106-125 eller P0180-199 peptider, leveret i adjuverende kombineret med injektion af kighoste toksin kan overvinde denne barriere, at aktivere avancerede genetiske værktøjer til at blive udnyttet i den murine EAN model.

Her er en simpel metode til induktion af EAN i C57BL/6 mus præsenteret. Derudover tilbydes en omfattende detaljerede tilgang til at vurdere de funktionelle og neuropatologiske underskud forbundet med sygdommen. P0180-199 peptid9 blev valgt frem for P057-81 alternativ10. P0180-199 model er blevet beskrevet til at producere mindre alvorlige kliniske symptomer sammenlignet med P057-81 alternative10, og derfor er tilbøjelige til at modstå indførelsen af potentielt skadelige genetiske forstyrrelser, tilbagesøge kirurgiske procedurer (såsom osmotisk pumpe implantation), og er indstillet til løbebånd gangart funktion test4. Men løbebånd gangart funktion tests og histologiske protokoller er beskrevet her kan nemt anvendes når man studerer sygdom i en P057-81 induceret variant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alle procedurer, der beskrives her blev godkendt af Florey Institut for neurovidenskab og Mental sundhed (Melbourne hjernen centrum) dyr etiske komité og følger den australske adfærdskodeksen for brug af dyr til videnskabelige Formål.

1. EAN induktion

Bemærk: EAN kan induceres med succes i mandlige C57BL/6 mus i alderen mellem 6-8 uger. Induktion protokollen tager 9 dage i alt. Dag 0 refererer til dag i den første vaccination. For denne protokol, injektioner blev udført under bedøvelse (Se trin 1.1.2 nedenfor).

  1. På dag -1:
    1. forberede Pertussis toksin (Se Tabel af materialer) løsning på 1,6 µg/mL ved hjælp af den sterile 0,1 M mus-isotonisk fosfat bufferet saltvand (MT-PBS).
    2. Anesthetization med isofluran:
      1. placere musen (C57BL/6, mand, 6-8 uger) i anesthetization afdeling og justere ilt flow til 1 L/min.
      2. Tænd isofluran vaporizer, justere det til 2,5% for anesthetization, og overvåge vejrtrækning og vente 2 min, eller indtil primære reflekser (cornea og bagben lemmer) er ikke længere lydhør
    3. Fjerne musen fra anesthetization kammer og administrere 250 µL af ovenstående Pertussis toksin løsning via en intraperitoneal (i.p.) injektion bruger en 0,5 mL sprøjte med en 30 1/2 G kanyle.
    4. Forbereder den injicerbare inokulum for immunisering:
      1. Forbered opløsning A ved hjælp af 2 mg/mL opløsning af P0 180-199 peptid (med > 98% renhed, sekvens S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) i 0,9% saltvand.
      2. Forbered Løsning B ved hjælp af 20 mg/mL opløsning af Mycobacterium tuberculosis (Se Tabel af materialer) i Freund ' s komplet adjuvans (FCA, bestående af: 15% mannide monoolate + 85% af paraffinolie og 0,5 mg/mL af udtørret dræbt og tørrede M Mycobacterium butyricum).
      3. Til at foretage den endelige inokulum for indsprøjtning, kombinere lige saa stort volumen dele af løsninger A og B i en perle tæppebanker og bland dem med en maksimal hastighed i 1 minut ved stuetemperatur.
        Bemærk: Løsninger A og B kan være holdt som lager og opbevares ved 4 ° C i højst en måned men den kombinerede endelige inokulum skal være frisk fremstillede på dagen for musen injektion.
  2. På dag 0, administrere 50 µL af inokulum (forberedelse beskrevet taktfast 1.1.4) i en mus via en subkutan injektion ved hjælp af en 23 G nål.
    Bemærk: Injektion kan placeres mellem skulderbladene, eller mellem hind lemmer og hale over caudale dorsum.
  3. På dag 1, gøre Pertussis toksin løsning af 1,2 µg/mL (i MT-PBS) og administrere 250 µL i en mus via i.p. injektion bruger en 0,5 mL sprøjte med en 30 1/2 G kanyle.
  4. På dag 3, Gentag trin 1.3 ovenfor.
    Bemærk: Lager løsninger A og B kan gjort og gemt på 4 ˚C i højst en måned. Men den endelige injicerbare inokulum, fremstillet ved at kombinere stamopløsninger A og B, skal ske på dagen for injektion.
  5. På dag 8, administrere 50 µL af inokulum (forberedelse beskrevet taktfast 1.1.4) i en mus via en subkutan injektion (Se trin 1.2 ovenfor), på det samme injektionsstedet som i trin 1.2 (for hvert dyr)

2. klinisk Scoring

  1. udføre klinisk scoring ud dagligt starter på dag 0.
  2. Give hver musen en score på 0, 1, 2, 3 eller 4 ifølge de offentliggjorte kriterier 4. Se tabel 1 for EAN klinisk scoring.
    Bemærk: For konsistens, gøres en indsats bør at score mus på samme tid dagligt af den samme forsker.

3. Motor funktion vurdering

NOTE: den motorisk præstation vurderes parallelt med klinisk scoring for den samme kohorte af dyr. Motorik vurdering apparater skal forbindes til en computer at har en gangart funktion imaging system (Se Tabel af materialer) installeret. Det anbefales også, at alle mus vurderes bør vænnes til at køre opgaven før EAN induktion. For at gøre dette, praksis kører (2 prøvekørsler pr. mus) udføres tre dage før sygdommen induktion (dag -3).

  1. Tænd for motorik vurdering apparater og switch på knappen lys.
  2. Harmoniske musen fast og blæk sine fødder ved at sænke det en container fyldt med rødt blæk mens du holder halen.
    Bemærk: Dette trin er nødvendige for C57BL/6 stamme, men kan springes over, hvis der bruges en mus stamme med en hvid pelsfarve.
  3. Placer musen til den omvandrende rum og indstille løbebånd hastighed på 15 cm/s.
  4. Tænder på løbebånd, og klik på " post " knappen for at fange den kørende bevægelse af musen ved hjælp af funktionen gangart imaging system (Se Tabel af materialer).
  5. Bruge en timer og måle hvert løb for 36 s. Efter 36 s, stop optagelse og stoppe løbebåndet.
    Bemærk: Mus, der ikke kan fuldføre opgaven kører for denne 36 s interval anses for at have undladt.
  6. Gemme videofilen i den angivne mappe.
  7. Gentag ovenstående trin for hver musen skal vurderes. Teste mus med samme kører opgaven hver 3 dag.
  8. Analysere de redigerede video filer ved hjælp af software til gangart funktionsparametre (Se Tabel of Materials).
    Bemærk: Oplysninger om, hvordan man analysere forskellige motor parametre varierer blandt software så henvises til producenten ' s instruktion før analyse. At få histologiske tegn på cytoskeletale og myelin skader via enten Immunhistokemi eller elektronmikroskopi, animalsk væv kan træffes på enhver fase post motorik vurderingen afhængigt af de specifikke mål for forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

P0180-199 peptid induceret EAN i C57BL/6 mus fører til en monofasiske sygdom med kliniske score debut fra 6 dage post første vaccination (dpi), og maksimal score sværhedsgraden er observeret fra 25 dpi efterfulgt af nogle kliniske score forbedring fra 40 dpi varighed (figur 1)4,9. Gangart funktion, mus begynder at svigte på en simpel kører opgaven så tidligt som 6 dpi, og af 35 dpi mus har lille kapacitet til at gennemføre en enkel løbebånd kører opgave og forbedrer ikke i kører evne selv på 55 dpi4 (figur 1). Mus induceret med EAN gradvist faldt i deres evne til at udføre opgaven kører over tid. Kører opgave fiasko er observeret i 80% af mus, men udover dette, hind lemmer gangart udvidelse i løbebånd kører er en nøglen funktionelle underskud, der ikke løser over varigheden af sygdom4.

Der er flere Neuropatologisk nøglefunktioner i P0180-199 induceret EAN: skader på myelinskeden; Axon stress; og øget node bredde og skader på paranodal strukturer. Undersøgelse af semi-tynde sektioner taget fra ischiadicus nerver viser områder med demyelinering (figur 2B, pile) i forhold til ischiadicus nerver fra alder-matchede raske kontrolpersoner (figur 2A). Vigtigere, er det muligt at opnå G-nøgletal fra billeder taget fra semi-tynd iskiasnerven sektioner afbildet ved høj effekt med lysmikroskopi4. Men høj effekt transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) billeder er nødvendige for at identificere specifikke Neuropatologisk funktioner såsom dysmyelinaton, skader myelin lamel, og tegn på axon stress som mitokondrier hævelse (disarrangement og forvrængning af cristae og hel eller delvis cristolysis) (figur 2 c-2D). Overensstemmelse med ultrastrukturelle beviser for axon stress (figur 2 c-2D), P0180-199 induceret EAN model viser også akut cytoskeletale skader, fremgår af markant forhøjet β-amyloid forløber protein (APP) udtryk i ischiadicus nerver (figur 3A). Dette er ikke observeret i de alder-matchede raske kontrol væv (figur 3A). Neuropatologiske ændringer på noder og paranodes har været veldokumenteret i GBS; i særdeleshed, AMAN variant11,12. I vores murine EAN model, vi identificerer, at udvidelse af noder og forstyrrelse af paranode er yderligere Neuropatologisk funktioner af P0180-199 induceret EAN (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af EAN induktion paradigme, kliniske score vurdering og kører kapacitet under EAN. (A) oversigt over EAN induktion protokol i C57BL/6 mus, begyndende fra 6-8 ugens i alder, med skemaer (B) forventede kliniske scoringer og (C) kører gange under sygdom kursus (Se reference4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: mus med EAN vise myelin tab, myelin skader og tegn på axoner stress. (A) A lysfelt billede (under 100 X forstørrelse) taget fra semi-tynde sektioner af ischiadicus nerver fra alder-matchede raske kontrol. (B) en lysfelt billede (under 100 X forstørrelse) taget fra semi-tynde sektioner af ischiadicus nerver fra mus induceret med EAN på 55 dage post første vaccination (dpi). Områder mangler myelin omgivet af tyndt myelinerede axoner (pilespidser) angiver remyelination; Dette blev ikke observeret i væv fremstillet af alderen-matchede raske kontrolpersoner (Se A). (C) en repræsentativ Elektron Mikroskopi billede (under 5.000 X forstørrelse) taget fromsciatic nerver fra panelet B demonstrerer myelin patologi (åben pil) og axon stress (bindende square med angivelse af hævede mitokondrier på 55 dpi). (D) en høj effekt TEM billede (afgrænsningsramme i C) demonstrerer hævede mitokondrier, der er vejledende for axon understrege (pilespidser), men dette er fraværende fra alder-matchede raske kontrolpersoner (data ikke vist). Skalere barer = 10 µm (A, B), og 500 nm (C, D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Axon stress og nodal patologi er en funktion af P0180-199 induceret EAN. (A) enkelt fly Konfokal billeder (under 40 X forstørrelse) taget gennem ischiadicus nerver på 55 dpi. Væv fra EAN mus vis dramatisk forhøjede APP udtryk Co lokaliseret med β-III tubulin (en markør af neuroner) der viser tegn på cytoskeletale stress. (B) høj effekt Z-fremskrivninger (100 X forstørrelse) af paranodes farves med et antistof mod s i iskiasnerven sektioner. I noder fra EAN mus er der en øget afstand mellem tilstødende paranodes med angivelse af node udvidelse. Derudover nodal patologi såsom afbrydelse af paranode struktur kan observeres i EAN mus men er fraværende fra alder-matchede raske kontrolpersoner. Skalere barer = 10 µm (A), og 5 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Score Kriterier Noter og kommentarer af vurderingskriterier
0 Normal mus
1 Mindre livlig eller lathery Dette vurderes som svar på normal håndtering, mus typisk først viser tegn på nedsat aktivitet på fra dag 5 indlæg immunisering
2 Hale parese eller Hale parese er vurderet af hale slagtilfælde test (flicking halens).
Mild lemmer parese Mild lemmer parese refererer til mus træk deres mave på jorden, når du går på en flad overflade
3 Hale parese + Mild lemmer parese eller Mild ataksi er vurderet som problemer i normal walking
Hale parese + Mild ataksi eller
Mild lemmer parese + Mild ataksi
4 Svær ataksi Svær ataksi er identificeret af atypiske baglæns walking, kombineret med enten lemmer parese, mild lemmer parese eller hale parese

Tabel 1: EAN kliniske score paradigme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne betænkning skitserer en enkel metode til at fremkalde EAN bruger P0180-199 peptid i C57BL/6 mus, gør det muligt for kvantificering af centrale Neuropatologisk og funktionelle underskud i mus induceret med EAN. Særskilte EAN induktion protokollen beskrevet her er brugen af anæstesi mens de udfører immunisering injektioner. Brugen af isofluran anæstesi forbedrer i høj grad evnen til at sikre, at den samlede mængde af inokulum injiceres subkutant i den ønskede placering med minimale fejl og stress for dyrene.

Mus vil begynde at vise kliniske tegn på sygdom fra 6 dpi4 ved hjælp af denne metode af EAN induktion. Dog er sygdom debut som målt ved klinisk score tidligere blevet rapporteret at forekomme fra ~ 10 dpi9,10. Mens denne forskel i sygdom debut som fastsat af kliniske score kan delvis skyldes forskellige klinisk scoring kriterier, er det mere sandsynligt forklaret ved brug af forskellige adjuvans i inokulat for EAN induktion. Denne protokol bruger en Freund komplet adjuvans indeholdende M. butyricum, som er suppleret med M. tuberkulose. Andre undersøgelser bruger Freund's adjuverende suppleret kun med M. tuberkulose i den injicerede inokulum indeholdende P0180-199 peptid9,10 for immunisering.

I denne protokol, levere pertussis toksin via i.p. indsprøjtning anbefales frem for intravenøs (IV) hale vene injektion. Det har vist sig at pertussis leveringsmåden ændrer ikke væsentligt sygdom udbrud eller progression4, men valget mellem at levere via i.p. rute, i modsætning til i.v. hale vene, er motiveret af risikoreduktion og et forsøg på at reducere den chance for drift fejl. Ofte, er hale vene i.v. injektioner teknisk mere udfordrende sammenlignet med indsprøjtninger af en tilsvarende mængde. Det har været tidligere vist, at brugen af kighoste giftstof som en adjuvant er nødvendig for at fremkalde EAN, når du bruger P0180-199 peptid9. Interessant, har tidligere arbejde vist, at halvere dosis af kighoste skitseret i denne metode, er tilstrækkelige til ulovlig EAN målt ved klinisk score, neuropatologiske og gangart udvidelse under løbebånd kører4. Dog faldende dosis af kighoste toksin bruges i under EAN induktion væsentligt påvirker kører kapacitet, og mus udføre betydeligt bedre på løbebånd kører opgave når EAN er induceret med halv pertussis dosis er beskrevet i denne metode 4.

De motor underskud observeret i denne P0180-199 peptid induceret EAN model er ledsages og støttes af stærke Neuropatologisk beviser. Det er tidligere påvist, at kvantificere omfanget af myelin skader er følsom nok til at registrere ændringer i sygdommens sværhedsgrad, der førte fra halvere dosis af kighoste toksin under EAN induktion. Her, andre kendetegnende for EAN cytoskeletale stress og forstyrrelser af node/paranodal strukturer er identificeret, hvilket resulterer i en suite af kvantitative Neuropatologisk markører for P0180-199 induceret EAN. Dette gør det muligt for mere forsigtig undersøgelser af neuropatologiske ved evaluering af sygdomsprocesser, eller effekten af nye terapeutiske agenter. Spændende, kan disse Neuropatologisk vurderinger være korreleret til funktionelle udlæsninger i et forsøg på at give dybere indsigt og en bedre forståelse af forholdet mellem neuropatologiske og funktion underskud, der er kendetegnende for denne model af EAN. Ud over Neuropatologisk analyser og gangart funktionstest ansat i denne undersøgelse, er andre funktionelle vurderinger som nerve varmeledning hastighed måling foreslået for at fuldt ud fange funktion resultater af terapeutiske indgreb ved hjælp af denne model.

EAN er en kraftfuld og almindeligt anvendte eksperimentelle model til at undersøge perifere demyelinering og remyelination, med ischiadicus nerver og cauda equina er mest hyppigt undersøgt perifere nerver. Den største fordel ved EAN er, at det resulterer i en reproducerbar og kvantificerbare motor underskud, således at analyserne af neuroprotection og myelin reparation fra et klinisk perspektiv. Yderligere, myelin-skader er akut og reproducerbare således detaljerede analyser af myelin og cytoskeletale skader fra et histopatologisk synspunkt.

Mens EAN model repræsenterer en spændende eksperimenterende betyder at undersøge demyeliniserende perifer neuropati, er der potentielle begrænsninger samt tekniske udfordringer. Det er vigtigt at forstå heterogenitet art demyeliniserende perifer neuropati hos mennesker, der indebærer et komplekst samspil mellem immunsystemet og PNS. Den aktuelle udfordring er, at ikke én EAN dyremodel trofast kan efterligne alle dens aspekter. Desuden er der betydelige indbyrdes arter og Inter stamme variationer vedrørende sygdommens sværhedsgrad og progression af EAN-model. For eksempel, fandt vi, at overordnet set EAN induceret i C67/B6 mus er mindre alvorlig end EAN induceret i Lewis rotter (ikke-offentliggjorte data). Inden for den samme stamme er der også kønsforskelle. Vores ikke-offentliggjorte data viser, at modellens EAN induceret i mandlige C57/B6 mus er mere reproducerbare end den inducerede i hunmus, men den præcise årsag bag denne kønsforskelle er uklart.

Afslutningsvis, rapporterede vi en protokol, der giver en robust og hurtig induktion EAN model i mandlige C57/B6 mus. Kombinere klinisk scoring og motorik vurdering med Neuropatologisk undersøgelser giver et strategisk redskab til at studere demyeliniserende perifer neuropati fra både klinisk og patologisk perspektiver. Vigtigere er, fremmer det fremtidige undersøgelser på terapier, der er rettet mod perifere nerve myelin reparation ved hjælp af Transgene mus tilgange mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter vedrørende dette arbejde.

Acknowledgments

DGG er en NHMRC Peter Doherty og multipel sklerose forskning Australien (MSRA) tidlige karriere kolleger. JLF understøttes af et MSRA postdoc stipendium. Dette arbejde blev støttet af den australske National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) projekt give JX #APP1058647.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69, (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126, (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87, (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76, (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10, (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18, (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39, (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8, (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62, (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64, (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40, (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25, (1), 33-51 (1996).
En enkel metode til at fremkalde eksperimentelle Autoimmune Neuritis i C57BL/6 mus for funktionelle og neuropatologiske vurderinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter