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Neuroscience

Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

doi: 10.3791/56455 Published: November 9, 2017

Summary

Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.

Abstract

Experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) ist ein gut geschätzt experimentellen Modell der autoimmunen peripheren demyelinisierenden Erkrankungen. EAN Krankheit wird induziert durch Immunisierung von Mäusen mit neurogenen Peptide, entzündlichen Angriff gegen Komponenten des peripheren Nervensystems (PNS) zu lenken. Die jüngsten Fortschritte konnten die Induktion von EAN in der relativ resistent C57BL/6-Maus-Linie mit Myelin Protein zero (P0)106-125 oder P0180-199 Peptide in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Pertussis-Toxin geliefert. Die Fähigkeit, EAN induzieren in den Stamm C57BL/6 ermöglicht den Einsatz der zahlreichen genetische Werkzeuge, die auf diesem Hintergrund Maus vorhanden und ermöglicht so das anspruchsvolle Studium der Pathogenese der Krankheit und Vernehmung der mechanistischen Wirkung neuer Therapeutika in Kombination mit transgene Ansätze. In der vorliegenden Studie zeigen wir einen einfachen Ansatz, um erfolgreich EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Wir skizzieren auch ein Protokoll für die Beurteilung der funktionellen Defizite, die in diesem Modell, begleitet von einer Reihe von neuropathologische Funktionen auftreten. Somit ist dieses Modell ein leistungsfähiges experimentellen Modell die Pathogenese der menschlichen peripheren demyelinisierenden Neuropathien zu studieren und die Wirksamkeit der möglichen Therapien zu bestimmen, die darauf abzielen, Myelin-Reparatur zu schützen gegen Nervenschäden in autoimmune Neuritis.

Introduction

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Periphere Neuropathien kann entweder genetisch bedingt oder erworben, mit erworbenen Neuropathien haben entweder metabolische, ischämische, entzündliche oder giftige Fällungsmitteln. Diese Krankheiten sind auch sinnvoll als axonalen oder demyelinative Ursprungs eingestuft. Die häufigsten erworbenen demyelinisierenden periphere Neuropathien akuten entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (AIDP sind, auch bekannt als Guillain-Barré-Syndrom, GBS) und chronisch entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; Beide zeichnen sich pathogenetisch durch eine Autoimmunreaktion gegen die Myelinscheide, Demyelinisierung peripherer Nerven verursacht. Bei diesen Erkrankungen aktivierte T-Zellen der Blut-Nerven-Schranke und generieren eine Immunreaktion in der PNS. Aktivierung von Makrophagen innerhalb der Nerv dann verursacht Demyelinisierung entweder direkt über phagocytic Angriff, oder indirekt über freigesetzten Entzündungsmediatoren, was in klinischen Behinderungen wie Lähmungen und sensorische Dysfunktion5. Während demyelinated Axone die Fähigkeit behalten, Remyelinated nach Demyelinisierung, Remyelinisierung ist oft verzögert oder unvollständig, wodurch Anfälligkeit der nackten Axone zu irreversiblen Schäden, das ist die wesentliche Ursache für dauerhafte klinischen Behinderung. Derzeit wirksamsten Behandlungen sind immunmodulatorische, aber trotz ihrer Wirksamkeit in vielen Fällen die Erholung ist oft langsam und ~ 25 % der Patienten erleben residual funktionelle Defizite, die ihre Lebensqualität6deutlich zu reduzieren, 7.

EAN ist eine weit verbreitete Tiermodell der demyelinisierenden peripheren Neuropathie, der wertvolle Einblicke in die Pathogenese und ein Mittel zur Beurteilung neuartiger Therapeutika4zur Verfügung gestellt hat. Dieses Modell induziert werden kann in verschiedenen Arten wie Kaninchen, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen, und wird durch Immunisierung mit neurogenen Antigene induziert. Hängt jedoch letztlich die erfolgreiche EAN Induktion eine entsprechende Immunantwort für Krankheit auftreten. Angesichts der Arten (und inter-Arten/Stamm) Variationen in Funktion des Immunsystems, wurden mehrere Kombinationen von Antigenen und Hilfsstoffe entwickelt, um erfolgreich EAN induzieren. In Bezug auf murinen genetische Werkzeuge ist der C57BL/6 die am weitesten verbreitete; Das traditionelle P2 Protein Peptid 57-81 (P257-81), die Krankheit in der anfälligen SJL Maus Belastung8 führt ist jedoch nicht in der Lage zu unerlaubten Pathogenese, funktionelle Defizite in der C57BL/6-Belastung führen. Glücklicherweise, Sensibilisierung Paradigmen mit P0106-125 oder P0180-199 Peptide, geliefert in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Keuchhusten Toxin bewältigt diese Barriere, so dass genetische Spezialtools in genutzt werden die EAN Mausmodell.

Hier ist eine einfache Methode für die Induktion von EAN in den Mäusen C57BL/6 vorgestellt. Darüber hinaus erfolgt eine detaillierte Gesamtkonzept, um die funktionelle und neuropathologische Defizite, die mit der Krankheit assoziiert zu bewerten. Die P0180199 Peptid9 wurde anstelle der P057-81 alternative10gewählt. Das P0180199 Modell produzieren weniger schwere klinische Symptome im Vergleich zu den P057-81 alternative10beschrieben worden und dürfte daher die Einführung von potenziell zu widerstehen schädliche genetische Störungen, von chirurgischen Eingriffen (z. B. osmotischen Pumpe Implantation) erholen und Laufband Gangart Funktionsprüfung4zugänglich ist. Jedoch konnte das Laufband Gangart Funktionstests und histologischen Protokolle hier beschriebenen leicht angewendet werden, wenn die Krankheit in einer P057-81 induzierte Variante zu studieren.

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Protocol

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alle hier beschriebene Verfahren wurden von Florey Instituts für Neurowissenschaften und psychische Gesundheit (Melbourne Brain Zentrum)-Tier-Ethik-Kommission genehmigt und folgen Sie der australischen Code of Practice für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke.

1. EAN Induktion

Hinweis: EAN bei männlichen C57BL/6 Mäusen im Alter zwischen 6-8 Wochen erfolgreich induziert werden kann. Die Induktion-Protokoll dauert insgesamt 9 Tage. Tag 0 bezieht sich auf den Tag der ersten Immunisierung. Für dieses Protokoll Injektionen wurden unter Narkose durchgeführt (siehe Schritt unten 1.1.2).

  1. Am Tag-1:
    1. bereiten das Pertussis-Toxin (siehe Tabelle der Materialien) Lösung von 1,6 µg/mL mit der sterilen 0,1 M Maus-isotonische Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS).
    2. Anesthetization mit Isofluran:
        ,
      1. platzieren Sie den Mauszeiger (C57BL/6, Männlich, 6-8 Wochen) in der Anesthetization Kammer und passen Sie die Sauerstoffzufuhr auf 1 L/min
      2. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane, passen Sie es auf 2,5 % für Anesthetization, und den Monitor atmen und warten Sie 2 Minuten, oder bis primäre Reflexe (Hornhaut und hinteren Gliedmaßen) reagieren nicht mehr
    3. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer Anesthetization und verwalten die obige Pertussis-Toxin-Lösung über eine intraperitoneale (i.p.) Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 1/2 G 250 µL.
    4. Immunisierung der injizierbare Inokulum vorbereiten:
      1. Prepare Lösung A mit 2 mg/mL Lösung von P0 180-199 Peptid (mit > 98 % Reinheit, Sequenz S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in 0,9 % Kochsalzlösung.
      2. Vorbereitung Lösung B mit 20 mg/mL Lösung von Mycobacterium Tuberculosis (siehe Tabelle der Materialien) in Freund ' s komplettes Adjuvans (FCA, bestehend aus: 15 % Mannide Monoolate + 85 % Paraffinöl und 0,5 mg/mL der ausgetrocknete getötet und getrockneten M Mycobacterium Butyricum).
      3. Zu das endgültige Inokulum zum Einspritzen, gleiches Volumen Teile Lösungen A und B in einem Wulst Schläger kombinieren und mischen Sie sie mit einer maximalen Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur.
        Hinweis: Lösungen A und B können als Lager gehalten und bei 4 ° C für maximal einen Monat gelagert, sondern das kombinierte endgültige Inokulum muss frisch zubereitet werden, am Tag der Injektion Maus.
  2. An Tag 0, verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion mit einer Nadel 23 G.
    Hinweis: Die Injektion kann platziert werden zwischen den Schulterblättern oder zwischen den hinteren Gliedmaßen und Rute über die Caudale Dorsum.
  3. On Tag1 machen die Pertussis-Toxin-Lösung von 1,2 µg/mL (in MT-PBS) und verwalten 250 µL in eine Maus über i.p.-Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 1/2 G.
  4. Am 3. Tag, wiederholen Sie Schritt 1.3 oben.
    Hinweis: Lager-Lösungen A und B können aus und bei 4 ° c für maximal einen Monat gelagert werden. Allerdings muss das letzte injizierbare Inokulum, produziert durch die Kombination von Stammlösungen A und B, am Tag der Injektion erfolgen.
  5. Am 8. Tag verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion (siehe Schritt 1.2 oben), an der gleichen Einstichstelle wie in Schritt 1.2 (für jedes Tier)

2. klinische Bewertung

  1. durchführen, klinische Bewertung, täglich ab am Tag 0.
  2. Geben jedem Mausklick eine Punktzahl von 0, 1, 2, 3 oder 4 nach den veröffentlichten Kriterien 4. Siehe Tabelle 1 für die EAN klinische Wertung.
    Hinweis: aus Gründen der Kohärenz eine Anstrengungen unternommen werden sollten Mäuse gleichzeitig Tor täglich von der gleichen Forscher.

3. Motor-Funktion Bewertung

Hinweis: die Motorleistung wird parallel mit klinischen erzielte bei der gleichen Altersgruppe Tiere bewertet. Der motorischen Funktion Bewertung Apparat muss an einen Computer angeschlossen werden, dass ein Gang-Funktion-imaging-System (siehe Tabelle der Materialien) installiert hat. Es wird auch empfohlen, dass alle Mäuse zu beurteilenden an die ausgeführte Aufgabe vor EAN Induktion gewöhnt werden sollten. Zu diesem Zweck werden Praxis läuft (2 Testläufe per Mausklick) drei Tage vor der Krankheit Induktion (Tag-3) durchgeführt.

  1. Zug auf das motorische Funktion Bewertung Gerät und schalten Sie die Lichttaste.
  2. Genick der Maus fest und Tinte seine Füße durch Absenken auf einen Behälter, gefüllt mit roter Tinte gedrückter Schwanzspitze.
    Hinweis: Dieser Schritt ist erforderlich für die C57BL/6-Belastung, aber kann übersprungen werden, wenn eine Maus-Sorte mit einem weißen Fellfarbe verwendet wird.
  3. Platzieren Sie den Mauszeiger in das Fach zu Fuß und stellen Sie die Laufband Geschwindigkeit 15 cm/s.
  4. Schalten Sie das Laufband und klicken Sie auf die " Rekord "-Taste, um die laufende Bewegung der Maus über die Gangart Funktion imaging-System zu erfassen (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Verwenden Sie einen Zeitgeber und messen jedes Rennen um 36 s. Nach 36 s, Aufnahme beenden und Stop der Tretmühle.
    Hinweis: Mäuse, die erfolgreich ausgeführte Aufgabe für dieses 36 s-Intervall können nicht gelten als gescheitert zu sein.
  6. Speichern die video-Datei im Ordner "benannten".
  7. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für jede Maus beurteilt werden. Testen Sie die Mäuse mit der gleichen ausgeführte Aufgabe alle 3 Tage.
  8. Analysieren die bearbeiteten video-Dateien mit Software für Gang Funktionsparameter (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Die Details der Analyse verschiedener Motorparameter variieren unter Software also entnehmen Sie bitte den Hersteller ' s Anweisung vor der Analyse. Histologischen Nachweis der axonalen zu gewinnen und Myelinschäden entweder über Immunohistochemistry oder Elektronenmikroskopie, Tier Gewebe zu den Phase Motorik Abschlusstest je nach den spezifischen Zielen der Forschung eingenommen werden können.

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Representative Results

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P0180-199 Peptid induzierten EAN C57BL/6 Mäusen führt zu eine monophasische Erkrankung mit klinischen Score Ausbruch aus 6 Tage nach ersten Immunisierung (dpi) und maximale Punktzahl Schweregrad von 25 dpi beobachtet wird gefolgt von einigen klinischen Ergebnis Verbesserung von 40 dpi Dauer (Abbildung 1)4,9. In Bezug auf die Gangart Funktion Mäuse beginnen zu versagen bei laufenden einfach so früh wie 6 dpi und durch 35 dpi Mäuse haben wenig Kapazität um ein einfaches Laufband Aufgabe abzuschließen und nicht im laufenden Fähigkeit auch bei 55 dpi4 (Abbildung 1) verbessern. Mäuse mit EAN schrittweise in ihrer Fähigkeit zur Erfüllung der laufenden Aufgaben im Laufe der Zeit sank induziert. Ausführen der Aufgabe Fehler in 80 % der Mäuse, aber neben diesem, Hind Gliedmaßen Gangart Verbreiterung im Laufband läuft eine wichtige funktionelle Defizit, die nicht über die Dauer der Krankheit4löst beobachtet.

Es gibt mehrere wichtige neuropathologische Features in P0180-199 induzierte EAN: Schäden an der Myelinscheide; Axon Stress; und erhöhte Knoten Breite und Schäden an Paranodal Strukturen. Untersuchung der semi-dünne Abschnitte entnommen Ischias Nerven zeigt Bereiche der Demyelinisierung (Abb. 2 b, Pfeile) im Vergleich zu Ischias Nerven aus Alter abgestimmt gesunden Kontrollpersonen (Abbildung 2A). Wichtig ist, ist es möglich, Bilder von semi-dünne Ischiasnerv Abschnitten abgebildet bei hoher Leistung mit Lichtmikroskopie4G-Werte einzuholen. Jedoch high-Power Transmission Elektronenmikroskopie (TEM) Bilder sind erforderlich, um bestimmte neuropathologische Features wie Dysmyelinaton, Schädigung der Myelin-Lamelle zu identifizieren und Anzeichen von Axon betonen wie mitochondriale Schwellung (Unordnung und Verzerrung der Cristae und teilweiser oder vollständiger Cristolysis) (Abbildung 22D). In Übereinstimmung mit der Ultrastrukturforschung Beweis von Axon Stress (Abbildung 2-2D), zeigt das P0180-199 induzierte EAN Modell auch akute axonale Schäden, nachgewiesen durch drastisch erhöhter β-Amyloid-Vorläufer Protein (APP)-Expression in den Ischias-Nerven (Abb. 3A). Dies ist nicht im Alter abgestimmt gesunden Kontrolle Gewebe (Abbildung 3A) beobachtet. Neuropathologische Veränderungen bei den Knoten und die Paranodes haben auch in GBS dokumentiert; vor allem die AMAN Variante11,12. In unserem Mausmodell EAN erkennen wir, dass die Ausweitung der Knoten und Störung der Paranode neuropathologische Zusatzfunktionen sind von P0180-199 induzierte EAN (Abb. 3 b).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des EAN Induktion Paradigmas, klinische score Bewertung und laufenden Kapazität während EAN. (A) Übersicht der EAN Induktion Protokoll bei C57BL/6 Mäusen, beginnend mit 6-8 Wochen alt, mit Schaltplänen (B) erwarteten klinische Scores und (C) Laufzeiten während Krankheit natürlich (siehe Hinweis4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Mäuse mit EAN Anzeige von Myelin Verlust, Myelinschäden und Anzeichen von Stress Axone. (A) A Hellfeld Bild (weniger als 100 X Vergrößerung) semi-dünne Abschnitte des Ischias-Nerven von Alter abgestimmt gesunden Kontrolle entnommen. (B) ein Hellfeld Bild (weniger als 100 X Vergrößerung) entnommen semi-dünne Abschnitte des Ischias-Nerven von Mäusen mit EAN 55 Tage induziert veröffentlichen erste Immunisierung (dpi). Bereichen fehlt Myelin umgeben von dünn Markhaltige Axone (Pfeilspitzen) zeigen Remyelinisierung; Dies wurde nicht beobachtet, im Gewebe aus Alter abgestimmt gesunden Kontrollpersonen (siehe A) gewonnen. (C) eine repräsentative Elektronenmikroskopie Aufnahme (unter 5.000 X Vergrößerung) Fromsciatic Nerven von Panel B demonstrierende Myelin Pathologie (offene Pfeil) und Axon Stress (Bindung Quadrat zeigt geschwollene Mitochondrien bei 55 dpi). (D) ein high-Power-TEM-Bild (Begrenzungsrahmen in C) demonstrierende geschwollene Mitochondrien, die bezeichnend für Axon sind stress (Pfeilspitzen), aber dies ist abwesend vom Alter abgestimmt gesunden Kontrollpersonen (Daten nicht gezeigt). Skalieren von Balken = 10 µm (A, B) und 500 nm (C, D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Axon Stress und Knotenpunkte Pathologie ist ein Feature von P0180-199 induzierte EAN. (A) einzelne Flugzeug konfokale (unter 40 X Vergrößerung) aufgenommene Bilder durch die Ischias-Nerven bei 55 dpi. Gewebe aus EAN Mäuse zeigen drastisch erhöhte APP Expression zusammen mit β-III Tubulin (ein Marker der Neuronen) zeigt Anzeichen von axonalen Stress lokalisiert. (B) High-Power-Z-Projektionen (100 X Vergrößerung) des Paranodes gebeizt mit einem Antikörper gegen Caspr in den Ischiasnerv Abschnitten. Im Knoten von EAN-Mäuse gibt es ein erhöhten Abstand zwischen angrenzenden Paranodes angibt, Knoten zu erweitern. Darüber hinaus nodal Pathologie wie z. B. Unterbrechung der Paranode Struktur bei EAN Mäusen beobachtet werden aber fehlt von gesunden Kontrollpersonen Alter abgestimmt. Skalieren von Balken = 10 µm (A) und 5 µm (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Partitur Kriterien Anmerkungen und Kommentare von Beurteilungskriterien
0 Normale Maus
1 Weniger lebhaft oder lathery Dies ist als Reaktion auf normale Handhabung bewertet Mäusen zeigen in der Regel erste Anzeichen für eine reduzierte Aktivität von Tag 5 Post Immunisierung
2 Tail-Parese oder Tail-Parese wird durch den Schweif Schlaganfall-Test (flicking die Rute) bewertet.
Milde Glied Parese Milde Extremität Lähmung bezieht sich auf Mäuse ziehen Sie ihren Bauch auf dem Boden beim gehen auf eine flache Oberfläche
3 Tail Parese + milde Glied Parese oder Milde Ataxie bemisst sich als irgendwelche Schwierigkeiten bei normalem walking
Tail Parese + milde Ataxie oder
Milde Glied Parese + milde Ataxie
4 Schwere Ataxie Schwere Ataxie wird identifiziert durch atypische rückwärts gehen, kombiniert mit Gliedmaßen Parese, milde Glied Parese oder Schweif Parese

Tabelle 1: EAN klinische score Paradigma.

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Discussion

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Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode um EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen, so dass die Quantifizierung der wichtigsten neuropathologische und funktionelle Defizite bei Mäusen mit EAN induziert induzieren. DISTINCT zu dem hier beschriebenen EAN Induktion-Protokoll ist die Verwendung der Anästhesie während der Durchführung der Impfung-Injektionen. Die Verwendung von Isofluran-Narkose verbessert erheblich die Möglichkeit, sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des Inokulums an der gewünschten Stelle mit minimalem Fehler und Stress für die Tiere subkutan injiziert wird.

Mäuse fangen an, klinische Anzeichen der Krankheit von 6 dpi4 mit dieser Methode der Induktion EAN anzuzeigen. Allerdings hat Krankheitsbeginn gemessen an klinischen Ergebnis zuvor gemeldet, von ~ 10 dpi9,10auftreten. Während dieser Unterschied in der Ausbruch der Krankheit wie von klinischen Score bestimmt teilweise durch verschiedene klinische Bewertungskriterien werden könnte, ist es wahrscheinlicher, durch die Verwendung von verschiedenen Adjuvantien in das Inokulum für EAN Induktion erklärt. Dieses Protokoll verwendet einen Freund komplettes Adjuvans mit M. Butyricum, ergänzt mit M. Tuberculosis. Andere Studien verwenden Freund der adjuvanten nur mit Mycobacterium Tuberculosis in der injizierten Inokulum, enthält den P0180-199 Peptid9,10 für die Immunisierung ergänzt.

In diesem Protokoll liefert Pertussis-Toxin über i.p. Injektion wird empfohlen, bevorzugt intravenös (i.v.) tail Vene Injektion. Es wurde nachgewiesen, dass Keuchhusten Lieferart nicht wesentlich Krankheit auftreten oder Fortschreiten4 ändert, aber die Wahl zur Bereitstellung über die i.p.-Route, im Gegensatz zu der intravenös zu verabreichenden Schweif Vene, durch Risikominimierung und einem Versuch zur Verringerung motiviert ist der Chance auf Bedienungsfehler. Tail Vene i.v. Injektionen sind oft technisch schwieriger im Vergleich mit Injektionen zum gleichen Volumen. Bisher hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Pertussis-Toxin als Adjuvans induzieren EAN bei P0180-199 Peptid9Verwendung erforderlich ist. Interessanterweise hat frühere Arbeiten gezeigt, dass Halbierung der Dosis von Keuchhusten in dieser Methode beschriebenen ist ausreichend, um illegalen EAN gemessen an klinischen Ergebnis, Neuropathologie und Verbreiterung während Laufband laufen4Gang. Jedoch verringert die Dosis von Pertussis-Toxin verwendet während EAN Induktion deutlich Einflüsse in laufenden Kapazität und Mäuse führen deutlich besser auf dem Laufband Task ausgeführt, wenn EAN mit halben Pertussis-Dosis, die in dieser Methode beschriebenen induziert wird 4.

Die motorischen Defizite in diesem P0180-199 Peptid induzierten EAN Modell beobachtet wird begleitet und unterstützt durch starke neuropathologische Beweise. Zuvor wurde nachgewiesen, dass das Ausmaß der Myelinschäden die Quantifizierung empfindlich genug ist, um Veränderungen in der Schwere der Erkrankung zu erkennen, die resultiert aus der Halbierung der Dosis Pertussis-Toxin beim EAN-Induktion. Hier andere Kennzeichen der EAN wie axonalen Stress und Störungen zu Knoten/Paranodal Strukturen identifiziert werden, was in einer Suite des quantitativen neuropathologische Marker für P0180-199 EAN induziert. Dies ermöglicht für klüger Prüfungen für Neuropathologie Krankheitsprozesse oder die Wirksamkeit neuartiger Therapeutika Bewertung. Aufregend, können diese neuropathologische Bewertungen korreliert werden, funktionelle anzeigen in tiefere Einblicke und ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen Neuropathologie und die Funktion Defizite, die ein Merkmal dieses Modells der EAN sind zu bieten. Neben dem neuropathologische Analysen und Gangart Funktionstest in dieser Studie beschäftigt sind anderen funktionalen Bewertungen wie Nerven Wärmeleitung Geschwindigkeitsmessung vorgeschlagen, um die Funktion Ergebnisse der therapeutischen Interventionen mit vollständig zu erfassen Dieses Modell.

EAN ist eine leistungsfähige und häufig verwendete experimentelles Modell zu prüfen, periphere Demyelinisierung und Remyelinisierung mit den Ischias Nerven und Cauda Equina wird am meisten häufig periphere Nerven untersucht. Der große Vorteil der EAN ist, dass es eine reproduzierbare und quantifizierbare motor Defizit, so dass Analysen der Neuroprotektion und Myelin Reparatur aus klinischer Sicht ergibt. Darüber hinaus ist die Myelinschäden akute und reproduzierbar ermöglicht detaillierte Analysen von Myelin und axonale Schäden aus Sicht der histopathologischen.

Während EAN-Modell eine spannende experimentelle Mittel zu untersuchen, demyelinisierenden Neuropathie darstellt, gibt es mögliche Einschränkungen sowie technische Herausforderungen. Es ist wichtig, die Heterogenität Natur von demyelinisierenden Neuropathie bei Menschen mit einem komplexen Zusammenspiel zwischen dem Immunsystem und PNS zu schätzen wissen. Die aktuelle Herausforderung ist, dass kein eine EAN-Tiermodell treu allen Aspekten nachahmen kann. Darüber hinaus gibt es erhebliche Inter-Spezies und Inter-Stamm Variationen über die Schwere der Erkrankung und das Fortschreiten des EAN-Modells. Zum Beispiel fanden wir, dass insgesamt die EAN in C67/B6 Mäuse induziert ist geringer als die EAN in Lewis Ratten (unveröffentlichte Daten) induziert. Innerhalb der gleichen Sorte gibt es auch Unterschied zwischen den Geschlechtern. Unsere unveröffentlichten Daten zeigen, dass bei männlichen Mäusen C57/B6 induzierte EAN-Modell mehr reproduzierbar ist als die induzierte bei weiblichen Mäusen, aber des genauen Grund für diesen Unterschied zwischen den Geschlechtern unklar ist.

Zusammenfassend haben wir ein Protokoll, eine robuste und schnelle Einarbeitung des EAN-Modells bei männlichen Mäusen C57/B6 ermöglicht, berichtet. Klinische Bewertung und Beurteilung der motorischen Funktion mit neuropathologische Studien kombiniert bietet ein strategisches Instrument für das Studium demyelinisierenden Neuropathie aus klinische und pathologische Perspektiven. Wichtig ist, fördert sie zukünftige Studien über die Mechanismen der Therapien, die peripheren Nerven Myelin Reparatur mit transgenen Maus Ansätze Zielen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte in Bezug auf diese Arbeit.

Acknowledgments

DGG ist NHMRC Peter Doherty und Multiplesklerose Forschung Australien (MSRA) frühe Karriere Fellow. JLF wird unterstützt durch eine MSRA Postdoctoral Fellowship. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Australian National Health und Medical Research Council (NHMRC) Projekt #APP1058647 gewähren, JX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

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References

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Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

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