Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En enkel tilnærming til å indusere eksperimentelle Autoimmune nevritt i C57BL/6 mus for funksjonell og Neuropathological vurderinger

doi: 10.3791/56455 Published: November 9, 2017

Summary

Denne rapporten skisserer en enkel tilnærming til vellykket indusere eksperimentelle autoimmune nevritt (EAN) bruker myelin protein null (P0)180-199 peptid sammen med Freunds komplett adjuvant og kikhoste gift. Vi presenterer et sofistikert paradigme i stand til nøyaktig å vurdere omfanget av funksjonelle underskudd og neuropathology som forekommer i denne EAN.

Abstract

Eksperimentell autoimmune nevritt (EAN) er godt verdsatt eksperimentell modell av autoimmune eksterne demyeliniserende sykdommer. EAN sykdom er indusert av immunisere mus med neurogenic peptider å direkte inflammatorisk angrep mot komponenter i perifere nervesystemet (PNS). Nylige fremskritt har aktivert induksjon av EAN i relativt motstandsdyktig C57BL/6 musen linjen med myelin protein null (P0)106-125 eller P0180-199 peptider levert i adjuvant kombinert med injeksjon av kikhoste gift. Evnen til å indusere EAN i C57BL/6 belastningen tillater bruk av mange genetiske verktøy som finnes på denne musen bakgrunn, og dermed tillater avanserte studier av sykdom patogenesen og avhør av mekanistisk handlingen i romanen legemiddelselskap i kombinasjon med transgene tilnærminger. I denne studien viser vi en enkel tilnærming for å indusere vellykket EAN bruker P0180-199 peptid i C57BL/6 mus. Vi har også skissere en protokoll for vurdering av funksjonelle underskudd som oppstår i denne modellen, ledsaget av en rekke neuropathological funksjoner. Derfor, denne modellen er en kraftig eksperimentell modell å studere patogenesen av menneskelig eksterne demyeliniserende neuropathies, og å bestemme effekten av potensielle terapier som mål å fremme myelin reparasjon og beskytte mot nerveskader i autoimmune nevritt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksterne neuropathies kan være genetiske opprinnelse eller ervervet, med ervervet neuropathies har enten stoffskifte, iskemisk, inflammatorisk eller giftig precipitants. Disse sykdommene er også nyttig klassifisert som enten axonal eller demyelinative opprinnelse. De vanligste ervervet demyeliniserende eksterne neuropathies er akutt inflammatorisk demyeliniserende Polynevropati (AIDP, også kjent som Guillain-Barrés syndrom, GBS) og kronisk inflammatorisk demyeliniserende Polynevropati (CIDP)1, 2 , 3 , 4; begge er pathogenetically preget av en autoimmun reaksjon rettet mot myelin-skjeden, forårsaker demyelinisering av eksterne nerver. Disse sykdommer, aktivert T celler krysse blod nerve barrieren og generere en immun reaksjon i PNS. Aktivering av makrofager i nerve deretter forårsaker demyelinisering enten direkte via phagocytic angrep, eller indirekte via utskilles inflammatoriske mediatorer, resulterer i klinisk funksjonshemninger som lammelse og sensoriske dysfunksjon5. Mens demyelinated axons beholde muligheten til å bli remyelinated etter demyelinisering, remyelination er ofte forsinket eller ufullstendig, noe som resulterer i mottakelighet av nakne axons å irreversibel skade, som er den viktigste årsaken til permanent klinisk funksjonshemming. For tiden er de mest effektive behandlingene er immunmodulerende, men til tross for deres effekt, i mange tilfeller utvinning ofte langsom og ~ 25% pasienter vil oppleve restoljen funksjonelle underskudd som reduserer deres livskvalitet6, 7.

EAN er en mye brukt dyr modell av demyeliniserende perifere neuropathy som har gitt verdifull innsikt i patogenesen og å vurdere romanen terapeutiske agenter4. Denne modellen kan bli indusert i forskjellige arter som kaniner, rotter, mus og marsvin, og er indusert av immunisering med neurogenic antigener. Men avhenger vellykket EAN induksjon av en passende immunrespons for sykdom oppstår. Gitt arter (og inter-species/belastning) variasjoner i immunforsvar, er flere kombinasjoner av antigener og adjuvans utviklet for å indusere vellykket EAN. Når det gjelder murine genetisk verktøy er C57BL/6 den mest brukte; men er den tradisjonelle P2 protein peptid 57-81 (P257-81) som resulterer i sykdom i utsatt SJL musen belastning8 ikke ulovlig patogenesen fører til funksjonelle underskudd i C57BL/6 belastningen. Heldigvis sensibilisering paradigmer P0106-125 eller P0180-199 peptider, levert i adjuvant kombinert med injeksjon av kikhoste gift kan overvinne denne barrieren, aktivere avanserte genetisk verktøy som skal benyttes i den murine EAN modell.

Her er en enkel metode for induksjon av EAN i C57BL/6 mus presentert. I tillegg tilbys et omfattende detaljert tilnærming til å evaluere funksjonelle og neuropathological underskuddene knyttet til sykdommen. P0180-199 peptid9 ble valgt fremfor P057-81 alternativ10. P0180-199 modellen har blitt beskrevet for å produsere mindre alvorlig klinisk underskriver sammenlignet med P057-81 alternativ10, og er derfor sannsynlig å tåle innføring av potensielt skadelige genetisk forstyrrelser, gjenopprette fra kirurgiske prosedyrer (for eksempel osmotisk pumpe implantasjon), og passer til tredemølle gangart funksjon testing4. Imidlertid kan tredemølle gangart funksjon tester og histologiske protokoller beskrevet her enkelt brukes når studere sykdommen i en P057-81 indusert variant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alle prosedyrene som er beskrevet her ble godkjent av Florey Institute for nevrovitenskap og psykiske (Melbourne hjernen Centre) dyr etikk og følge australske anbefalingen for bruk av dyrene for vitenskapelig Formål.

1. EAN induksjon

Merk: EAN kan bli vellykket indusert i mannlige C57BL/6 mus alderen 6-8 ukens. Induksjon protokollen tar 9 dager totalt. Dag 0 refererer til dagen i den første immunisering. For denne protokollen, injeksjoner ble utført under narkose (se trinn 1.1.2 nedenfor).

  1. På dag -1:
    1. forberede Pertussis giften (se Tabell for materiale) løsning av 1.6 µg/mL bruker den sterile 0.1 M mus-isotonic fosfat bufret saltvann (MT-PBS).
    2. Anesthetization med isoflurane:
      1. plasserer musen (C57BL/6, male, 6-8 ukens) i det anesthetization kammeret og justere oksygen til 1 L/min.
      2. Slå på isoflurane vaporizer, justere den til 2,5% anesthetization, og skjermen puste og vent i 2 minutter, eller til primære reflekser (hornhinnen og bakben limb) er ikke lenger mottakelig
    3. Fjerne musen fra anesthetization kammeret og administrere 250 µL av ovenstående Pertussis gift løsning via en intraperitoneal (IP) injeksjon 0,5 mL sprøyte med en 30 1/2 G nål.
    4. Forberede den injiserbare inoculum immunisering:
      1. forberede løsning A bruke 2 mg/mL løsning av P0 180-199 peptid (med > 98% renhet, sekvens S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) i 0,9% saltløsning.
      2. Klar Løsning B bruker 20 mg/mL løsning av Mycobacterium tuberculosis (se Tabell for materiale) i Freund ' s komplett adjuvant (FCA bestående av: 15% mannide monoolate + 85% av parafinolje og 0,5 mg/mL av desiccated drept og tørket M Mycobacterium butyricum).
      3. å gjøre den endelige inoculum for sprøytebruk, kombinere like volum deler av løsninger A og B i en perle beater og bland dem med en maksimal hastighet i 1 min i romtemperatur.
        Merk: Løsninger A og B kan holdes som lager og lagret ved 4 ° C i opptil en måned, men den kombinerte endelige inoculum må være nylagde ved musen injeksjon.
  2. På dag 0, administrere 50 µL av inoculum (forberedelse i trinn 1.1.4) i en mus via en subcutaneous injeksjon bruker en 23 G nål.
    Merk: Injeksjon kan plasseres mellom skulderbladene eller mellom baklem og halen over caudal dorsum.
  3. På dag 1, Pertussis gift løsning av 1,2 µg/mL (i MT-PBS) og administrere 250 µL i en mus via IP injeksjon 0,5 mL sprøyte med en 30 1/2 G nål.
  4. På dag 3, Gjenta trinn 1.3 ovenfor.
    Merk: Lager løsninger A og B kan gjøres og lagret på 4 grader for maksimalt én måned. Men den siste injiserbare inoculum, produsert av kombinere lager løsninger A og B, må gjøres ved injeksjon.
  5. På dag 8, administrere 50 µL av inoculum (forberedelse i trinn 1.1.4) i en mus via en subcutaneous injeksjon (se trinn 1.2 ovenfor), på samme injeksjonsstedet som i trinn 1.2 (for hvert dyr)

2. kliniske Scoring

  1. utfører kliniske scoring ut daglig fra dag 0.
  2. Gi hver musen en score på 0, 1, 2, 3 eller 4 i henhold til det publiserte kriterier 4. Se tabell 1 for EAN klinisk scoring.
    Merk: Konsistens, et forsøk bør gjøres å score mus samtidig daglig av samme forskeren.

3. Motor funksjonen vurdering

Merk: motor ytelse vurderes parallelt med klinisk scoret for samme kohort av dyr. Motorikk vurdering apparatet må være koblet til en datamaskin som har (se Tabell for materiale) en gang funksjonen tenkelig system installert. Det anbefales også at alle mus skal vurderes bør bli habituated til kjører oppgaven før EAN induksjon. Dette gjør øvelsen går (2 test tekster per mus) utføres tre dager før sykdom induksjon (dag -3).

  1. Slå på motorikk vurdering apparater og slå på lys-knappen.
  2. Scruff musen fast og blekk føttene av senke den på en container fylt med rødt blekk mens du holder halen.
    Merk: Dette trinnet er nødvendig for C57BL/6 belastning, men kan hoppet hvis en mus stamme med en hvit pels farge brukes.
  3. Plasser musen i gangavstand rommet og stille tredemølle på 15 cm/s.
  4. Slår på tredemølle og klikk den " post " knapp å fange kjører bevegelse av musen funksjonen gangart tenkelig system (se Tabell av materialer).
  5. Bruker en tidtaker og måle hver gang for 36 s. Etter 36 s, stopp innspillingen og stopp tredemølle.
    Merk: Mus som ikke kan fullføre aktiviteten kjører for denne 36 s er vurdert å ha mislyktes.
  6. Lagre videofilen i den valgte mappen.
  7. Gjenta trinnene ovenfor for hver musen skal vurderes. Teste mus med samme kjører aktivitet hver tredje dag.
  8. Analysere redigert video-filer ved hjelp av programvare for gangart Funksjonsparametere (se Tabell av materialer).
    Merk: Detaljer om hvordan å analysere ulike motor parametere variere blant programvare så vennligst kontakt produsenten ' s instruksjonen tidligere analyse. Å få histologiske bevis på axonal og myelin skade via immunohistochemistry eller elektronmikroskop, dyr vev kan tas på noen scene post funksjon vurderingen avhengig av de konkrete mål forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

P0180-199 peptid indusert EAN i C57BL/6 mus fører til en monophasic sykdom med klinisk score utbruddet fra 6 dager innlegget første immunisering (PPT) og maksimal poengsum alvorlighetsgraden er observert fra 25 PPT etterfulgt av noen klinisk score forbedring fra 40 PPT varighet (figur 1)4,9. I gangart funksjon, mus begynne å mislykkes på en enkel oppgave som kjører så tidlig som 6 dpi, og 35 dpi mus har liten kapasitet til å fullføre en enkel tredemølle kjører oppgave og bedre ikke kjører muligheten til selv ved 55 PPT4 (figur 1). Mus indusert med EAN gradvis avvist i å utføre aktiviteten kjører over tid. Kjører oppgaven svikt er observert i 80% av mus, men i tillegg til dette, baklem gangart utvidelse i tredemølle kjører er viktige funksjonelle underskudd som ikke løses over varigheten av sykdommen4.

Det er flere viktige neuropathological funksjoner i P0180-199 indusert EAN: skade myelin-skjeden; axon stress; og økt noden bredde og skade paranodal strukturer. Undersøkelse av semi tynne snitt fra sciatic nerver avslører områder av demyelinisering (figur 2B, piler) i forhold til sciatic nerver fra alder-matchet sunn kontroller (figur 2A). Viktigere er det mulig å få G-prosenter fra bilder tatt fra semi tynn ischias nerven deler fotografert på høy effekt med * lys4. Imidlertid høy effekt overføring elektronmikroskop (TEM) bilder er nødvendig for å identifisere bestemte neuropathological funksjoner som dysmyelinaton, skade myelin lameller, og tegn på axon stress som mitokondrie hevelse (disarrangement og forvrengning av cristae og delvis eller totalt cristolysis) (figur 2C-2D). Samsvar med ultrastructural bevis axon stress (figur 2C-2D), P0180-199 indusert EAN modellen viser også akutt axonal skade, demonstrert av dramatisk forhøyet β-amyloid forløper protein (APP) uttrykk i sciatic nerver (figur 3A). Dette er ikke observert i alder-matchet sunn kontroll vev (figur 3A). Neuropathological endringer på nodene og paranodes har blitt godt dokumentert i GBS; spesielt, de AMAN variant11,12. I murine EAN modellen, vi identifisere at utvidelse av noder og avbrudd i paranode er neuropathological av P0180-199 indusert EAN (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av EAN induksjon paradigmet, klinisk score vurdering og kjører kapasitet under EAN. (A) oversikt over EAN induksjon protokollen i C57BL/6 mus, begynner fra 6-8 ukens av alderen, med skjemaer i (B) forventet kliniske resultater og (C) kjører ganger under sykdom kurs (se referanse4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: mus med EAN vise myelin tap og myelin skade av axons trykk. (A) A lyse feltet bilde (under 100 X forstørrelse) tatt fra semi tynne snitt av sciatic nerver fra alder-matchet sunn kontroll. (B) en lysende felt bilde (under 100 X forstørrelse) tatt fra semi tynne snitt av sciatic nerver fra mus indusert med EAN 55 dager legge første immunisering (PPT). Områdene mangler myelin omgitt av tynt myelinated axons (pilspisser) angir remyelination; Dette var ikke observert i vev innhentes fra alderen-matchet sunn kontroller (se A). (C) en representant elektronmikroskop bilde (under 5000 X forstørrelse) tatt fromsciatic nerver fra panelet B demonstrere myelin patologi (åpne pil) og axon stress (bindende firkanten angir hovne mitokondrier med 55 PPT). (D) en høy makt TEM bilde (markeringsramme i C) demonstrere hovne mitokondrier som axon stress (pilespisser), men dette er fraværende fra alder-matchet sunn kontroller (data ikke vist). Skalere barer = 10 µm (A, B), og 500 nm (C, D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Axon stress og knutepunktet patologi er en funksjon i P0180-199 indusert EAN. (A) enkelt flyet AC confocal bilder (under 40 X forstørrelse) tatt gjennom sciatic nerver på 55 dpi. Vev fra EAN mus viser dramatisk forhøyet APP uttrykk Co lokalisert β-III tubulin (en markør av neurons) som viser tegn til axonal stress. (B) høy effekt Z-anslag (100 X forstørrelse) av paranodes med et antistoff mot Caspr i sciatic nerve deler. I noder fra EAN mus er det en økt avstand mellom tilstøtende paranodes som angir noden utvidelse. I tillegg knutepunktet patologi som avbrudd i paranode-strukturen kan observeres i EAN mus men mangler fra alder-matchet sunn kontroller. Skalere barer = 10 µm (A) og 5 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Poengsum Vilkår Notater og kommentarer av vurdering kriterier
0 Normal mus
1 Mindre livlige eller lathery Dette vurderes som svar på normale håndtering, mus vanligvis først viser tegn til redusert aktivitet på fra dag 5 innlegg immunisering
2 Hale vc6 eller Hale vc6 vurderes av halen slag testen (flicking halen).
Mild lem vc6 Mild lem vc6 refererer til mus dra magen på bakken når du går på en flat overflate
3 Hale vc6 + Mild lem vc6 eller Mild ataksi vurderes som problemer i normal gange
Hale vc6 + Mild ataksi eller
Mild lem vc6 + Mild ataksi
4 Alvorlig ataksi Alvorlig ataksi identifiseres av atypisk bakover walking, kombinert med enten lem vc6, mild lem vc6 eller hale vc6

Tabell 1: EAN klinisk resultat paradigme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne rapporten skisserer en enkel metode for å indusere EAN bruker P0180-199 peptid i C57BL/6 mus, aktivere kvantifisering av viktige neuropathological og funksjonelle underskudd i mus indusert med EAN. Forskjellige EAN induksjon protokollen beskrevet her er bruk av anestesi ved utføring immunisering injeksjoner. Bruk av isoflurane anestesi forbedrer muligheten til å sikre at det totale volumet av inoculum injiseres subcutaneously på ønsket sted med minimal feil og stress til dyrene.

Mus begynner å vise klinisk underskriver av 6 dpi4 denne metoden for EAN induksjon. Men er sykdommen utbruddet målt ved klinisk resultat tidligere rapportert oppstår fra ~ 10 PPT9,10. Mens denne forskjellen i sykdommen utbruddet som bestemmes ved klinisk resultat kan være delvis forskjellige kliniske kriteriene, er det mer sannsynlig skyldes bruk av ulike adjuvans i inoculum for EAN induksjon. Denne protokollen bruker en Freund komplett adjuvant inneholder M. butyricum, som er supplert med M. tuberkulose. Andre studier bruker Freund's adjuvant bare med M. tuberkulose i det injiserte inoculum som inneholder P0180-199 peptid9,10 for immunisering.

Denne protokollen, levere kikhoste gift via IP injeksjon anbefales fremfor intravenøs (IV) hale blodåre injeksjon. Det har vist at kikhoste leveringsmåten ikke vesentlig endrer sykdommen utbruddet eller fremdrift4, men valget å levere via IP rute, i motsetning til IV hale stemning, er motivert av risikoreduserende og et forsøk på å redusere den sjanse for drift. Ofte er hale blodåre IV injeksjoner teknisk mer utfordrende sammenlignet med injeksjoner av en like volum. Det har tidligere vist at bruken av kikhoste gift som en adjuvans er nødvendig å indusere EAN ved P0180-199 peptid9. Interessant, har forrige arbeid vist at halvere dosen av kikhoste i denne metoden er tilstrekkelig til illegale EAN målt ved klinisk score, neuropathology og gangart utvide i tredemølle kjører4. Men redusere dosen av kikhoste gift brukes under EAN induksjon betydelig påvirker kjører kapasitet, og mus utføre betydelig bedre på tredemølle kjører oppgaven når EAN er indusert med halv kikhoste dosen beskrevet i denne metoden 4.

Motor underskuddene observert i denne P0180-199 peptid indusert EAN modellen er sammen og støttet av sterke bevis på neuropathological. Tidligere har det vært vist at kvantifisere omfanget av myelin skade er følsom nok å oppdage endringer i sykdommens alvorlighetsgrad som resulterte fra halvere dosen av kikhoste gift under EAN Innledning. Her andre kjennemerkene til EAN som axonal stress og sluttbrukerne noden/paranodal strukturer er identifisert, noe som resulterer i en rekke kvantitative neuropathological markører for P0180-199 indusert EAN. Dette gjør mer fornuftig eksamen av neuropathology når du vurderer sykdom prosesser, eller effekten av romanen terapeutiske agenter. Spennende, kan disse neuropathological vurderingene være korrelert til funksjonelle readouts i et forsøk på å gi dypere innsikt og en bedre forståelse av forholdet mellom neuropathology og funksjonen underskuddene som er en funksjon i denne modellen av EAN. I tillegg til neuropathological analyser og gangart funksjon test ansatt i denne studien, er andre funksjonelle vurderinger som nerve ledning hastighet måling foreslått å fullt fange funksjon resultatene av terapeutisk intervensjon med Denne modellen.

EAN er en kraftig og brukte eksperimentell modell å undersøke eksterne demyelinisering og remyelination, med sciatic nerver og cauda equina blir de ofte undersøkt perifere nerver. Hovedfordelen med EAN er at det gir en reproduserbare og kvantifiserbare motor underskudd, slik at analyser av neuroprotection og myelin reparer fra en klinisk perspektiv. Videre er myelin skaden akutt og reproduserbar dermed gir detaljerte analyser av myelin og axonal skade fra en histopatologisk perspektiv.

EAN modellen representerer en spennende eksperimentelle betyr å undersøke demyeliniserende Perifer nevropati, finnes det potensielle begrensninger, samt tekniske utfordringer. Det er viktig å verdsette heterogenitet natur demyeliniserende perifere neuropathy hos mennesker, med et komplekst samspill mellom immunsystemet og PNS. Gjeldende utfordringen er at ikke én EAN dyremodell trofast kan etterligne alle dets aspekter. Videre er det betydelig Inter-arter og inter press variasjoner vedrørende sykdommens alvorlighetsgrad og progresjon av EAN modellen. For eksempel fant vi at samlet EAN indusert i C67/B6 mus er mindre alvorlige enn EAN indusert i Lewis rotter (upubliserte data). Innenfor den samme stammen finnes det også kjønnsforskjeller. Våre upubliserte data viser at EAN modellen indusert i mannlige C57/B6 mus er mer reproduserbar enn den indusert i kvinnelige mus, men den nøyaktige årsaken underbygger denne kjønnsforskjeller er uklart.

Avslutningsvis rapportert vi en protokoll som tillater en robust og rapid induksjon av EAN modellen i mannlige C57/B6-mus. Klinisk scoring og motorikk vurdering neuropathological studier har et strategisk verktøy for å studere demyeliniserende perifere neuropathy fra både klinisk og patologiske perspektiver. Viktigst, fremmer det fremtidige studier på mekanismer for behandling som mål perifere nerve myelin reparasjon ved hjelp av transgene musen tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse om dette arbeidet.

Acknowledgments

DGG er en NHMRC Peter Doherty og multippel sklerose forskning Australia (MSRA) tidlig karriere Fellow. JLF støttes av en MSRA postdoktorstipend. Dette arbeidet ble støttet av Australian National Health og Medical Research Council (NHMRC) prosjektstøtte #APP1058647 til JX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69, (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126, (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87, (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76, (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10, (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18, (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39, (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8, (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62, (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64, (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40, (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25, (1), 33-51 (1996).
En enkel tilnærming til å indusere eksperimentelle Autoimmune nevritt i C57BL/6 mus for funksjonell og Neuropathological vurderinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter