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Neuroscience

Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

doi: 10.3791/56455 Published: November 9, 2017

Summary

Este relatório apresenta uma abordagem simples para induzir com êxito neurite auto-imune experimental (EAN) usando a proteína mielina zero peptídeo de180-199 (P0) em combinação com adjuvante completo de Freund e coqueluche toxina. Apresentamos um paradigma sofisticado capaz de avaliar com precisão a extensão dos défices funcionais e neuropatologia que ocorrem neste EAN.

Abstract

Neurite auto-imune experimental (EAN) é um modelo experimental bem apreciado de doenças desmielinizantes periféricas auto-imune. Doença EAN é induzida pela imunizar ratos com peptídeos neurogênicos para dirigir um ataque inflamatório para componentes do sistema nervoso periférico (SNP). Avanços recentes permitiram a indução de EAN na linha de rato relativamente resistente C57BL/6 usando proteína mielina zero (P0)106-125 ou P0180-199 peptídeos entregue em adjuvante, combinado com a injeção de toxina de coqueluche. A capacidade de induzir a EAN de estirpe C57BL/6 permite a utilização das inúmeras ferramentas genéticas que existem sobre este fundo de rato e assim permite que o sofisticado estudo da patogênese da doença e interrogatório da ação mecanicista da novela terapêutica em combinação com abordagens transgénicas. Neste estudo, vamos demonstrar uma abordagem simples para induzir com êxito EAN usando o peptídeo de180-199 P0 em camundongos C57BL/6. Também descrevem um protocolo para a avaliação dos défices funcionais que ocorrem neste modelo, acompanhado por um conjunto de características neuropatológicas. Assim, este modelo é um poderoso modelo experimental para estudar a patogênese das neuropatias desmielinizantes periféricas humanas e para determinar a eficácia de terapias potenciais que visam promover a reparação da mielina e proteger contra danos nos nervos em auto-imune neurite.

Introduction

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Neuropatias periféricas podem ser genético na origem ou adquiridos, com neuropatias adquiridas tendo ou metabólica, isquêmica, inflamatórias ou tóxicas precipitants. Estas doenças são também útil classificadas como axonal ou demyelinative na origem. O mais comum adquirida desmielinizantes neuropatias periféricas são aguda desmielinizante Polineuropatia inflamatória (AIDP, também conhecida como síndrome de Guillain-Barré, GBS) e crônica inflamatória desmielinizante polineuropatia (PDIC)1, 2 , 3 , 4; os dois pathogenetically são caracterizados por uma reação auto-imune contra a bainha de mielina, causando desmielinização dos nervos periféricos. Estas doenças, células T ativadas atravessam a barreira de sangue do nervo em geram uma reação imune dentro o PNS. Ativação de macrófagos dentro do nervo então causa desmielinização diretamente via fagocítica ataque ou indiretamente através de mediadores inflamatórios secretados, resultando em deficiências clínicas como paralisia e disfunção sensorial5. Enquanto axônios desmielinizados mantêm a capacidade de ser remyelinated seguindo a desmielinização, como muitas vezes é tardio ou incompleta, resultando em susceptibilidade dos axônios nus ao dano irreversível, que é a principal causa da clínica permanente Deficiência. Atualmente, os tratamentos mais eficazes são imunomodulador, mas apesar de sua eficácia, em muitos casos a recuperação é muitas vezes lenta e ~ 25% pacientes experimentarão residuais déficits funcionais que reduzem significativamente a sua qualidade de vida6, 7.

EAN é um modelo animal amplamente utilizado de desmielinizante neuropatia periférica que forneceu insights valiosos sobre patogênese e um meio para avaliar novos agentes terapêuticos4. Este modelo pode ser induzido em diferentes espécies, tais como coelhos, ratos, ratos e porquinhos da Índia e é induzida pela imunização com antígenos neurogênicos. No entanto, em última análise, a indução de EAN bem sucedida depende uma resposta imune adequada para doença ocorra. Tendo em conta as variações de espécies (e inter-species/tensão) na função imune, várias combinações de antígenos e adjuvantes foram desenvolvidas para induzir com êxito EAN. Em termos de ferramentas genéticas murino, a C57BL/6 é o mais utilizado; no entanto, o peptídeo de proteína P2 tradicional 57-81 (P257-81) que resulta em doença do suscetível SJL rato estirpe8 é incapaz de patogênese ilícito, levando a déficits funcionais na linhagem C57BL/6. Felizmente, paradigmas de sensibilização usando o P0106-125 ou P0180-199 peptídeos, entregue em adjuvante combinada com a injeção de coqueluche toxina pode superar essa barreira, permitindo que ferramentas sofisticadas de genéticas ser utilizada na modelo murino EAN.

Aqui, um método simples para a indução do EAN nos camundongos C57BL/6 é apresentado. Além disso, uma abordagem abrangente e detalhada por que avaliar os défices funcionais e neuropatológicas associados com a doença é fornecida. O P0180199 peptídeo9 foi escolhido em preferência a alternativa de57-81 P010. O modelo de199 P0180tem sido descrito para produzir sinais clínicos menos graves em comparação com a alternativa de57-81 P010e, portanto, susceptível de suportar a introdução de potencialmente perturbações genéticas deletérias, recuperar-se de procedimentos cirúrgicos (como implantação de bomba osmótica) e é passíveis de função de marcha de esteira teste4. No entanto, os testes de função da marcha de esteira e histológicos protocolos descritos aqui poderiam facilmente ser aplicados ao estudar a doença em uma variante de57-81 induzido P0.

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Protocol

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todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Instituto de Florey de neurociência e Saúde Mental (centro do cérebro de Melbourne) Comitê de ética Animal e siga a australiana código de prática para o uso de animais para científico Fins.

1. indução de EAN

Nota: EAN pode ser induzido com sucesso em camundongos C57BL/6 do sexo masculino com idade entre 6-8 semanas. O protocolo de indução leva 9 dias no total. Dia 0 refere-se ao dia da primeira imunização. Para este protocolo, injeções foram realizadas sob anestesia (consulte a etapa abaixo 1.1.2).

  1. Em dia -1:
    1. preparar a toxina Pertussis (ver Tabela de materiais) solução 1,6 µ g/ml, utilizando o fosfato de rato-isotônica estéril 0,1 M tampão salino (MT-PBS).
    2. Anesthetization com isoflurano:
      1. Coloque o mouse (C57BL/6, 6-8 semanas, do sexo masculino) na câmara de anesthetization e ajustar o fluxo de oxigênio para 1 L/min.
      2. Ligue o vaporizador de isoflurano, ajustá-la para 2,5% para anesthetization e monitor de respiração e espere por 2 min, ou até reflexos primários (membro da córnea e traseiro) são já não responsivo
    3. Remover o mouse da câmara anesthetization e administrar 250 µ l da solução de toxina Pertussis acima através de uma injeção intraperitoneal (i.p.), utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 30 1/2 G.
    4. Preparar o inóculo injetável para imunização:
      1. preparar solução A usar 2 mg/mL solução de peptídeo de 180-199 P0 (com > 98% de pureza, sequência S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) em soro fisiológico a 0,9%.
      2. Preparar Solução B usando 20 mg/mL solução de Mycobacterium tuberculosis (ver Tabela de materiais) em Freund ' adjuvante completo de s (FCA, compreendendo: monoolate 15% mannide + 85% de óleo de parafina e 0,5 mg/mL de dessecada mortos e secos Mycobacterium M butyricum).
      3. Tornar-se o inóculo final para injetar, combinar partes de igual volume de soluções A e B em um batedor do grânulo e misturá-los a uma velocidade máxima por 1 min à temperatura ambiente.
        Nota: Soluções A e B podem ser mantidas como estoque e armazenadas a 4 ° C por um período máximo de um mês, mas o inóculo final combinado deve ser preparado no dia da injeção rato.
  2. No dia 0, administrar 50 µ l de inóculo (preparação descrito no passo 1.1.4) em um rato através de uma injeção subcutânea usando uma agulha 23G.
    Nota: A injeção pode ser colocada entre as omoplatas, ou entre os membros traseiros e cauda sobre o dorso caudal.
  3. No dia 1, faça a solução de toxina Pertussis 1,2 µ g/ml (em MT-PBS) e administrar 250 µ l em um rato através da injeção i.p. utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 30 1/2 G.
  4. No dia 3, repita etapa 1.3 acima.
    Nota: Soluções Stock A e B podem ser feitas e armazenadas a 4 ˚ c por um período máximo de um mês. No entanto, o inóculo injetável final, produzido combinando as soluções A e B, deve ser feito no dia da injeção.
  5. No dia 8, administrar 50 µ l de inóculo (preparação descrito no passo 1.1.4) em um rato através de uma injeção subcutânea (consulte a etapa 1.2 supra), no local da injeção mesmo como na etapa 1.2 (para cada animal)

2. Pontuação clínica

  1. executar marcando clínica diária, começando no dia 0.
  2. Dá cada rato uma pontuação de 0, 1, 2, 3 ou 4 de acordo com os critérios publicados 4. Consulte a tabela 1 para marcar clínico do EAN.
    Nota: Para obter consistência, deve ser feito um esforço para marcar os ratos ao mesmo tempo diariamente pelo mesmo pesquisador.

3. Motor de avaliação de função

Nota: O desempenho do motor é avaliado em paralelo com marcador clínico para a mesma coorte de animais. O aparelho de avaliação de função motora deve ser conectado a um computador que tenha um sistema de imagem de função da marcha (ver Tabela de materiais) instalado. Também é recomendável que todos os ratos para ser avaliado devem ser hábito para a tarefa em execução antes da indução da EAN. Para fazer isso, a prática é executado (2 testes por rato) é realizados três dias antes da indução da doença (dia -3).

  1. Ligue o instrumento de avaliação de função motora e interruptor no botão luz.
  2. Nuca o mouse firmemente tinta seus pés por abaixá-la em um recipiente com tinta vermelha, mantendo sua cauda e.
    Nota: Este passo é necessário para a linhagem C57BL/6, mas pode ser ignorado se estiver sendo usada uma cepa de rato com uma casaco branco cor.
  3. Posicione o mouse no compartimento ambulante e definir a velocidade da esteira em 15 cm/s.
  4. Ligar a esteira e clique o " registro " botão para capturar o movimento execução do mouse usando a função de marcha, sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais).
  5. Usar um timer e medir cada corrida para 36 s. Depois de 36 s, parar gravação e parar a esteira.
    Nota: Os ratos que não podem concluir com êxito a tarefa em execução para este intervalo s 36 são considerados ter falhado.
  6. Salvar o arquivo de vídeo na pasta designada.
  7. Repita os passos acima para cada mouse para ser avaliado. Testar os ratos com a mesma tarefa em execução a cada 3 dias.
  8. Analisar os arquivos de vídeo editados usando software para parâmetros de função de marcha (ver Tabela de materiais).
    Nota: Os detalhes de como analisar os diferentes parâmetros do motor variam entre software então por favor, consulte o fabricante ' instrução s antes da análise. Para obter a evidência histológica de axonal e mielina danos através de microscopia eletrônica, animal, os tecidos podem ser tomados na qualquer fase post função motora avaliação dependendo dos objectivos específicos de pesquisa ou imuno-histoquímica.

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Representative Results

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P0180-199 peptídeo induzida EAN em pistas de camundongos C57BL/6 para uma doença monofásica com escore clínico início do post 6 dias primeira imunização (dpi) e a máxima pontuação severidade é observada de dpi 25 seguido por alguns clínicos placar melhoria de 40 dpi duração (Figura 1)4,9. Em termos de função da marcha, os ratos começam a falhar logo em 6 dpi em uma simples tarefa em execução e por 35 dpi ratos têm pouca capacidade para completar uma esteira simples tarefa em execução e não melhorarem em capacidade de marcha mesmo em dpi 554 (Figura 1). Os ratos induziram com EAN diminuído progressivamente em sua capacidade de executar a tarefa em execução ao longo do tempo. Falha de tarefa em execução é observada em 80% dos ratos, mas além deste, marcha de membro posterior alargamento na esteira correndo é um chave déficit funcional que não resolver ao longo da duração da doença4.

Existem várias características neuropatológicas chaves em P0180-199 induzido EAN: danos à bainha de mielina; estresse do axônio; e nó maior largura e danos às estruturas paranodal. Exame de cortes semi finos retirados nervos isquiático revela áreas de desmielinização (Figura 2B, setas) em comparação com os nervos ciático de controles saudáveis idade correspondente (Figura 2A). Importante, é possível obter G-rácios de imagens capturadas do ciático semi finas seções fotografadas em alta potência com microscopia de luz4. No entanto, imagens de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão de alta potência são necessários para identificar características neuropatológicas específicas tais como dysmyelinaton, danos para as lamelas de mielina, e sinais de axônio stress tais como inchaço mitocondrial (desalinhamento e distorção de cristas e cristolysis parcial ou total) (Figura 22D). Consistente com a evidência ultraestrutural de stress axônio (Figura 2-2D), o modelo EAN P0180-199 induzido também exibe dano axonal agudo, demonstrado pelo elevado dramaticamente precursor de β-amiloide expressão de proteínas (APP) no nervo ciático (Figura 3A). Isto não é observado nos tecidos combinados idade controle saudável (Figura 3A). Alterações neuropatológicas os nós e os paranodes foram bem documentadas em GBS; em particular, a AMAN variante11,12. Em nosso modelo murino de EAN, identificamos que o alargamento de nós e perturbação para o paranode é características neuropatológicas adicionais de P0180-199 induzido EAN (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: representação esquemática do paradigma de indução da EAN, clínica marcar avaliação e capacidade de execução durante EAN. (A) visão geral da indução de EAN protocolo em camundongos C57BL/6, com início a partir de 6-8 semanas de idade, com esquemas de (B) resultados clínicos esperados e (C) tempos de corrida durante a doença é claro (ver referência4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: ratos com EAN exibem perda de mielina, danos de mielina e sinais de stress de axônios. (A), A imagem de campo brilhante (abaixo dos 100 ampliação X) tirada de cortes semi finos dos nervos ciático de idade-combinados controle saudável. (B) A imagem de campo claro (abaixo dos 100 ampliação X) extraída cortes semi finos dos nervos ciático de ratos induzidos com EAN em 55 dias pós primeira imunização (dpi). Áreas sem mielina rodeada por axônios finamente mielinizados (setas) indicam como; Isto não foi observado no tecido obtido de controles saudáveis idosos-combinadas (veja A). (C) A representante microscopia eletrônica fromsciatic nervos imagem (abaixo dos 5.000 ampliação X) tomada de painel B demonstrando mielina patologia (seta aberta) e stress axônio (Praça de vinculação indicando inchadas mitocôndrias em 55 dpi). (D) uma imagem TEM de alta potência (delimitadora caixa em C) mitocôndrias inchadas demonstra que são indicativas de axônio estresse (cabeças de seta), mas isso está ausente da idade-saudáveis controles (dados não mostrados). Barras de escala = 10 µm (A, B) e 500 nm (C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Axon stress e patologia nodal é uma característica de P0180-199 induzido EAN. (A) nenhum avião confocal imagens (ampliação de 40 X) tomadas através dos nervos ciático em 55 dpi. Tecido de ratos EAN mostrar dramaticamente elevada expressão de APP co localizado com III β tubulina (um marcador de neurônios) indicando sinais de axonal stress. (B) alta potência Z-projeções (ampliação de 100 X) de paranodes manchadas com um anticorpo contra Caspr nas seções do nervo ciático. Em nós de ratos EAN, há uma maior distância entre paranodes adjacentes, indicando o nó alargamento. Além disso, patologia nodal como perturbação para a estrutura de paranode podem ser observada em ratos EAN mas está ausente da idade correspondente controles saudáveis. Barras de escala = 10 µm (A) e (B) de 5 µm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pontuação Critérios Notas e comentários de critérios de avaliação
0 Normal do rato
1 Menos animada ou espuma Isto é avaliado em resposta ao tratamento normal, ratos normalmente primeiro mostram sinais de atividade reduzida de imunização de post do dia 5
2 Paresia de cauda ou Paresia de cauda é avaliada pelo teste de golpe de cauda (sacudindo a cauda).
Paresia do Membro suave Paresia leve membro refere-se a ratos arrastam sua barriga no chão ao caminhar sobre uma superfície plana
3 Cauda de paresia + paresia leve membro ou Leve ataxia é avaliado como qualquer dificuldade em andar normal
Cauda de paresia + ataxia leve ou
Paresia do Membro suave + ataxia leve
4 Ataxia severa Ataxia severa é identificado por atípico para trás caminhando, combinado com paresia do membro, paresia do Membro suave ou paresia de cauda

Tabela 1: EAN clínica marcar paradigma.

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Discussion

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Este relatório descreve um método simples para induzir EAN usando o peptídeo de180-199 P0 em camundongos C57BL/6, permitindo a quantificação dos principais défices neuropatológicas e funcionais em ratos induzidos com EAN. Distinto para o protocolo de indução de EAN descrito aqui é o uso de anestesia durante a realização das injecções de imunização. O uso de isoflurano anestesia realça extremamente a capacidade de assegurar que o volume total de inóculo é injetado por via subcutânea no local desejado com erro mínimo e estresse aos animais.

Os ratos vão começar a exibir sinais clínicos de doença de dpi 64 usando este método de indução de EAN. No entanto, aparecimento de doença medida pelo escore clínico anteriormente foi relatado para ocorrer a partir de9,~ 10 dpi10. Enquanto essa diferença no aparecimento de doença conforme determinado pelo escore clínico pode ser parcialmente devido a diferentes critérios clínicos de pontuação, é mais provável explicado pelo uso de diferentes adjuvantes no inóculo para indução de EAN. Este protocolo usa adjuvante completo de um Freund contendo M. butyricum, que é complementado com M. tuberculosis. Outros estudos o uso adjuvante de Freund, suplementado somente com M. tuberculosis em injetado inóculo contendo o P0180-199 peptídeo9,10 para a imunização.

Neste protocolo, entregando a toxina pertussis através da injeção i.p. recomenda-se preferencialmente intravenosa (i.v.) injeção de veia da cauda. Tem sido demonstrado que o modo de entrega coqueluche não altera significativamente doença início ou progressão4, mas a escolha de entregar através da rota de i.p., em oposição a veia de cauda de i.v., é motivada pela redução de riscos e uma tentativa de reduzir o chance de erro de funcionamento. Frequentemente, cauda veia injeções de soro são tecnicamente mais difíceis comparado com injeções de um volume igual. Anteriormente mostrou que o uso da coqueluche toxina como adjuvante é necessário para induzir EAN quando usando o P0180-199 peptídeo9. Curiosamente, trabalho anterior mostrou que reduzir para metade a dose de coqueluche descrita neste método, é suficiente para EAN ilícito medido pelo escore clínico, neuropatologia e marcha alargamento durante esteira correndo4. No entanto, diminuir a dose de toxina pertussis usada em durante EAN indução significativamente influencia capacidade de execução, e ratos executam significativamente melhor em esteira executando tarefa quando EAN é induzida com metade da dose de coqueluche descrito neste método 4.

Os motor déficits observados neste modelo de EAN P0180-199 peptídeo induzido é acompanhado e apoiado por fortes evidências neuropatológicas. Anteriormente, foi demonstrado que quantificar a extensão do dano de mielina é suficientemente sensível para detectar alterações na severidade da doença que resultou da redução para metade da dose de toxina pertussis durante a indução de EAN. Aqui, são identificadas outras marcas da EAN, tais como stress axonal e o rompimento com estruturas de nó/paranodal, resultando em um conjunto de marcadores neuropatológicos ou quantitativas para P0180-199 induzido EAN. Isso permite que para exames mais prudentes de neuropatologia, ao avaliar os processos da doença, ou a eficácia de novos agentes terapêuticos. Excitantemente, estas avaliações neuropatológicas podem ser correlacionadas com leituras funcionais em uma tentativa de fornecer percepções mais profundas e um melhor entendimento da relação entre a neuropatologia e os déficits de função que são uma característica deste modelo de EAN. Além das análises neuropatológicas e teste de função da marcha utilizados neste estudo, outras avaliações funcionais tais como a medição de velocidade de condução nervosa são sugeridas a fim de capturar totalmente os resultados da função de intervenções terapêuticas usando Este modelo.

EAN é um modelo experimental poderoso e comumente utilizado para examinar a desmielinização periférica e como, com os nervos ciático e cauda equina, sendo o mais frequentemente investigados os nervos periféricos. A principal vantagem do EAN é que resulta em um déficit motor reproduzível e quantificável, permitindo análises de neuroproteção e mielina reparação do ponto de vista clínica. Além disso, o dano de mielina é aguda e reprodutível, permitindo análises detalhadas de mielina e dano axonal do ponto de vista histopatológico.

Enquanto modelo EAN representa uma excitante média experimental para investigar desmielinizantes neuropatia periférica, existem limitações potenciais, bem como os desafios técnicos. É importante apreciar a natureza de heterogeneidade de desmielinizante neuropatia periférica em seres humanos, que envolve uma complexa interação entre o sistema imune e PNS. O desafio atual é que não há um modelo animal de EAN fielmente pode imitar todos os seus aspectos. Além disso, existem substanciais variações entre espécies e tensão inter sobre a severidade da doença e a progressão do modelo EAN. Por exemplo, nós encontramos que em geral o EAN induzida em ratos C67/B6 é menos grave do que o EAN induzida em ratos Lewis (dados não publicados). Dentro da mesma estirpe, também há diferença de sexo. Nossos dados não publicados mostram que o modelo EAN induzido em camundongos C57/B6 machos é mais reprodutível do que a induzida em ratos fêmeas, no entanto, a exata razão subjacente a esta diferença de gênero é claro.

Em conclusão, nós relatamos um protocolo que permite uma indução rápida e robusta do modelo EAN em camundongos C57/B6 do sexo masculino. Combinar marcando clínico e avaliação da função motora com estudos neuropatológicos ou fornece uma ferramenta estratégica para estudar desmielinizantes neuropatia periférica perspectiva clínica e patológica. Importante, promove estudos futuros sobre os mecanismos de terapias que visam a reparação de mielina de nervos periféricos utilizando abordagens rato transgénico.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse sobre este trabalho.

Acknowledgments

DGG é um NHMRC Peter Doherty e companheiro de carreira precoce esclerose múltipla pesquisa Austrália (MSRA). JLF é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado MSRA. Este trabalho foi apoiado pelo Australian National Health e projeto de Conselho de pesquisa médica (NHMRC) conceder #APP1058647 JX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

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References

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Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

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