Summary
Bu raporu başarıyla miyelin protein kullanarak deneysel otoimmün nörite (EAN) sıfır (P0)180-199 peptid Freund'ın tam adjuvan ve boğmaca toksin ile birlikte ikna etmek için basit bir yaklaşım özetlenmektedir. Biz doğru bir şekilde işlevsel açıkları ve bu EAN meydana nevropatoloji ölçüde değerlendirirken yetenekli sofistike bir paradigma mevcut.
Abstract
Deneysel otoimmün nörite (EAN) otoimmün periferik demiyelinizan hastalıklar iyi takdir bir deneysel modeldir. EAN hastalığı inflamatuar saldırının periferik sinir sistemi (PNS) bileşenlerinin doğru yönlendirmek için fare ile Nörojenik peptidler immunizing tarafından indüklenen olduğu. Son gelişmeler EAN indüksiyon miyelin protein sıfır (P0)106-125 veya P0180-199 peptidler boğmaca toksin enjeksiyonu ile birlikte adjuvan teslim kullanarak nispeten dayanıklı C57BL/6 fare çizgi etkinleştirdiniz. EAN C57BL/6 zorlanma ikna yeteneği bu fare arka plan üzerinde mevcut çok sayıda genetik araçları kullanmak için izin verir ve böylece hastalığın patogenezinde, sofistike çalışma ve sorgulama roman therapeutics mekanik eylem sağlar transgenik yaklaşımlar ile birlikte. Bu çalışmada, EAN C57BL/6 farelerde P0180-199 peptid kullanarak başarılı bir şekilde ikna etmek için basit bir yaklaşım göstermektedir. Ayrıca bu modelde, neuropathological özellikleri dizesi ile birlikte ortaya çıkan fonksiyonel açıkları değerlendirilmesi için bir protokol anahat. Böylece, insan periferik demiyelinizan neuropathies patogenezi okumaya ve miyelin onarım teşvik ve otoimmün sinir hasarına karşı korumak amacı potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemek için güçlü bir deneme modeli bu modelidir nörite.
Introduction
Periferik neuropathies genetik kökenli veya edinsel, olabilir ya da metabolik, iskemik, enflamatuar veya toksik precipitants ile elde edilen neuropathies sahip. Bu hastalıklar da yararlı aksonal ya da demyelinative kökenli olarak sınıflandırılır. En yaygın alınan periferik neuropathies olan akut inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (AIDP, GBS Guillain-Barré Sendromu olarak da bilinir) demiyelinizan ve kronik inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (CIDP)1, 2 , 3 , 4; her ikisi de pathogenetically neden demiyelinizasyon periferik sinirlerin miyelin kılıf karşı yönettiği bir otoimmün reaksiyon ile karakterizedir. Bu hastalıklarda aktive T hücreleri kan sinir bariyerini çapraz ve PNS içinde bir bağışıklık reaksiyon oluşturur. O zaman makrofajlar içinde sinir aktivasyonu demiyelinizasyon fagositik saldırı üzerinden doğrudan veya dolaylı olarak felç ve duyusal disfonksiyon5gibi klinik Engelli sonuçlanan salgılanan inflamatuar aracılar üzerinden neden olur. Demyelinated akson demiyelinizasyon takip remyelinated yeteneği korumak, ancak remyelination kez ertelendiği veya eksik, geri dönüşümsüz hasara için çıplak aksonlar duyarlılık içinde kaynaklanan kalıcı klinik en önemli nedeni olduğu sakatlık. Şu anda, en etkili tedavi immunomodulatory, ama onların yeterlik rağmen birçok durumda kurtarma genellikle yavaş ve ~ % 25 hastaların önemli ölçüde azaltmak onların yaşam kalitesi6artık işlevsel açıkları yaşayacaksınız, 7.
EAN, değerli yorumlara Patogenez ve roman terapötik ajanlar4değerlendirmek için bir araç sağlamıştır periferik nöropati demiyelinizan yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelidir. Bu model tavşanlar gibi farklı türlerin indüklenen sıçanlar, fareler ve eskiden şiling şimdi pigs ve bağışıklama Nörojenik antijenleri ile tarafından indüklenen. Ancak, sonuçta başarılı EAN indüksiyon gerçekleşmesi hastalığı için uygun bir bağışıklık yanıtı bağlıdır. Tür (ve arası species/zorlanma) varyasyonları bağışıklık fonksiyonu göz önüne alındığında, Çoklu kombinasyonları antijenleri ve adjuvan başarıyla EAN ikna etmek için geliştirilmiştir. Fare genetik araçları açısından C57BL/6 en çok kullanılan olduğunu; Ancak, geleneksel P2 protein peptid 57-81 (P257-81) duyarlı SJL fare zorlanma8 hastalığında sonuçlanan yasadışı patogenezinde C57BL/6 gerginlik içinde işlevsel açıkları önde gelen değiştiremiyor. Neyse ki, sensitizasyon paradigmalar P0106-125 veya P0180-199 peptidler, kullanarak teslim adjuvan kombine boğmaca enjeksiyon ile toksin içinde kullanılmak üzere Gelişmiş genetik araçları etkinleştirme Bu bariyer üstesinden gelebilir fare EAN modeli.
Burada, EAN indüksiyon C57BL/6 farelerde için basit bir yöntem sunulur. Ayrıca, kapsamlı ve detaylı bir yaklaşım hastalığı ile ilişkili işlevsel ve neuropathological açıkları değerlendirileceği tarafından sağlanır. P0180-199 peptid9 P057-81 alternatif10tercih seçildi. P0180-199 modeli P057-81 alternatif10ile karşılaştırıldığında daha az şiddetli klinik belirtiler üretmek için açıklanan ve bu nedenle potansiyel olarak getirilmesi dayanacak şekilde yüksektir zararlı genetik tedirginlikler, cerrahi işlemler (örneğin, ozmotik pompa implantasyon) kurtarmak ve4test koşu bandı yürüyüş işleve mükellef. Ancak, koşu bandı yürüyüş fonksiyon testleri ve histolojik protokolleri burada açıklanan kolayca bir P0 indüklenen57-81 değişken hastalığında okurken uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
burada açıklanan tüm yordamlar Florey Enstitüsü tarafından Nörobilim ve ruh sağlığı (Melbourne beyin merkezi) hayvan Etik Komitesi için kabul edildi ve Avustralya uygulama kodu kullanımı hayvanlar için bilimsel için izleyin. Amaçlar.
1. EAN indüksiyon
Not: EAN başarıyla 6-8 hafta arasında yaşlı erkek C57BL/6 farelerde indüklenen. İndüksiyon Protokolü Toplamda 9 gün alır. Gün 0 ilk aşılama gün anlamına gelir. Bu iletişim kuralı için anestezi altında enjeksiyonları yapılmıştır (bkz. Adım 1.1.2 aşağıda).
- Üzerinde gün -1:
- boğmaca toksin hazırlamak (bakınız Tablo reçetesi) çözüm olarak 1.6 µg/mL steril 0.1 M fare izotonik fosfat kullanarak tamponlu tuz (MT-PBS).
- Anesthetization isoflurane ile:
- (C57BL/6, erkek, 6-8 hafta) fare anesthetization odasında yerleştirin ve oksijen akışı 1 L/dak için ayarlamak
- İsoflurane Buharlaştırıcı çevirmek, anesthetization ve nefes monitör için % 2.5 şekilde ayarlamak ve bekle 2 min için veya birincil refleksleri (kornea ve arka bacak) kadar artık duyarlı
- Fare anesthetization odasından kaldırın ve yukarıdaki boğmaca toksin eriyik 0.5 mL şırınga 30 1/2 G iğne ile kullanarak bir mayi (IP) enjeksiyon yolu ile 250 µL yönetmek.
- Enjekte edilebilir inoculum bağışıklama için hazırlamak:
- P0 180-199 peptid, 2 mg/mL solüsyon kullanarak hazırla Çözüm A (ile > %98 saflıkta, sıra S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) % 0,9 serum içinde.
- Hazırlama Çözüm B Mycobacterium tüberküloz 20 mg/mL solüsyon kullanarak (Tablo malzemeleri görmek) Freund içinde ' s tam adjuvan (FCA, oluşan: % 15 mannide monoolate + %85 0,5 mg/mL ve parafin yağı rendelenmiş öldürdü ve kuru M Mycobacterium butyricum),.
- Enjekte için son inoculum yapmak için eşit cilt bölgelerinde çözümleri A ve B bir boncuk çırpıcı birleştirmek ve bunları oda sıcaklığında 1 dk. için maksimum hızda karıştırın.
Not: A ve B çözümleri olabilir stok olarak devam etti ve en fazla bir ay 4 ° C'de depolanan ama kombine son inoculum fare enjeksiyon gününde taze hazırlanmalıdır.
- Günü 0, inoculum (1.1.4. adımda açıklanan hazırlık) 50 µL yönetmek içine bir fare 23 G iğne kullanarak bir Subkutan Enjeksiyon yolu ile.
Not: Enjeksiyon veya arka bacak ve kuyruk kürek kemikleri arasında Kaudal patolojisi üzerinde yerleştirilebilir. - On gün 1, boğmaca toksin çözüm olarak 1,2 µg/mL (MT-PBS) yapmak ve bir fare 0.5 mL şırınga 30 1/2 G iğne ile kullanarak IP enjeksiyon yoluyla içine 250 µL yönetmek.
- Üzerinde gün 3, tekrar 1.3 yukarıdaki adım.
Not: Stok çözümleri A ve B oluşan ve en fazla bir ay 4 ˚C depolandığı. Ancak, hisse senedi çözümleri A ve B, birleştirerek üretilen son enjekte edilebilir inoculum enjeksiyon gününde yapılmalıdır. - Gün 8, inoculum (1.1.4. adımda açıklanan hazırlık) 50 µL yönetmek içine bir fare Subkutan Enjeksiyon yolu ile (bkz. Adım 1,2 yukarıdaki) adım 1.2 (için her hayvan) olduğu gibi aynı enjeksiyon yerinde
2. klinik puanlama
- klinik günlük 0 gününden başlayarak puanlama gerçekleştirmek.
- Her fare 0, 1, 2, 3 veya 4 yayımlanmış kriterleri 4 göre bir puan vermek. EAN klinik puanlama için bkz. Tablo 1.
Not: tutarlılık sağlamak için bir çaba fareler aynı anda puan için her gün aynı araştırmacı tarafından yapılmalıdır.
3. Motor işlevi değerlendirme
Not: motor performans için hayvanların kohort aynı klinik puanlama paralel olarak değerlendirilir. Motor işlevi değerlendirme cihazları bir yürüyüş işlevi görüntüleme sistemi (Tablo malzemeleri görmek) yüklü olduğu bir bilgisayara bağlı gerekir. Ayrıca değerlendirilmek için tüm fareler EAN indüksiyon öncesinde çalışan görev habituated tavsiye edilir. Bunu yapmak için uygulama çalıştırır (2 test çalıştırmalarını fare başına) üç gün önce hastalık indüksiyon (gün -3) gerçekleştirilir.
- Motor işlevi değerlendirme cihazları ve anahtar ışık düğmesini açmak.
- Scruff fare sıkıca ve kendi ayakları kırmızı mürekkeple kuyruğunu tutarak dolu bir kap üzerine düşürerek mürekkep.
Not: Bu adımı C57BL/6 zorlanma için gereklidir, ancak bir fare yük bir Beyaz önlük renkle kullanılırsa atlanabilir. - Fareyi yürüyen bölmenin içine getirin ve koşu bandı hızını 15 cm/s.
- Koşu bandı ve tıklayın açın " Kayıt " çalışan hareket görüntüleme sistemi yürüyüş işlevini kullanarak fare yakalamak için düğmesini (Tablo malzemeleri görmek).
- Bir zamanlayıcıyı kullanın ve her çalışan için 36 ölçmek s. 36 s, stop kayıt ve stop treadmill sonra.
Not: Bu 36 s aralığı için çalışan görev başarıyla tamamlanamıyor fareler başarısız olarak kabul edilir. - Video dosyası belirtilen klasöre kaydedin.
- Her fare değerlendirilmek için yukarıdaki adımları yineleyin. Aynı çalışan görev ile fareler her 3 günde testi.
- Analiz yazılımı yürüyüş işlev parametreleri (bkz Tablo reçetesi) kullanarak düzenlenmiş video dosyalarını.
Not: Nasıl farklı motor parametreleri çözümleneceği ayrıntılarını yazılım arasında çok farklılık lütfen üreticiye başvurun ' s öğretim analiz önce. Aksonal histolojik kanıt elde etmek için ve miyelin hasar immünhistokimya veya elektron mikroskobu, hayvan dokuları herhangi bir sahne sonrası motor işlevleri değerlendirme araştırma özel amaçları bağlı olarak alınabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P0180-199 peptid C57BL/6 fareler yol açan bir monophasic hastalığı klinik skoru ile EAN indüklenen başlangıcından ilk aşılama (dpi) ve en büyük puanı önem 25 dpi gözlenen 6 gün sonrası takip bazı klinik skora göre 40 dpi gelişmeleri süre (şekil 1)4,9. Yürüyüş işlevi, açısından fare başlar basit bir görevin çalışmasını 6 dpi olarak erken başarısız ve 35 dpi fare tarafından görev çalışan basit bir koşu bandı tamamlamak için küçük kapasitesine sahip ve yeteneği bile 55 dpi4 (şekil 1) çalışan geliştirmek yapmak. Fareler giderek çalışan görev zaman içinde gerçekleştirmek için yeteneklerini reddetti EAN ile indüklenen. Görev başarısızlık çalıştıran %80 farelerin ama hastalığı4süresi boyunca gidermez anahtar bir işlev açığı çalışıyor koşu bandı genişletme bu, hind bacak yürüme ek olarak görülmektedir.
Orada birkaç anahtar neuropathological özellik P0180-199 indüklenen EAN: hasar miyelin kılıf; Axon stres; ve artan düğüm genişlik ve paranodal edecek. Siyatik sinir alınan yarı ince kesitler incelenmesi için siyatik sinirleri yaş eşlemeli sağlıklı denetimlerden (şekil 2A) göre alanları demiyelinizasyon (şekil 2B, oklar) ortaya koymaktadır. Önemlisi, ışık mikroskobu4ile yüksek güçte görüntüsü yarı ince siyatik sinir bölümlerden yakalanan görüntüleri G-oranları elde etmek mümkündür. Ancak, yüksek güç transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri dysmyelinaton, miyelin lamel hasar gibi belirli neuropathological özellikleri tanımlamak için gereklidir ve akson belirtileri stres gibi mitokondrial şişlik (düzensizlik ve cristae ve toplam veya kısmi cristolysis bozulma) (şekil 2C-2D). Axon stres (şekil 2C-2D) ultrastructural kanıtı ile tutarlı, P0 indüklenen180-199 EAN modeli de önemli ölçüde yükseltilmiş β-amiloid öncül tarafından gösterdi akut aksonal hasar görüntüler siyatik sinir (şekil 3A) protein (APP) ifade. Bu (şekil 3A) sağlıklı kontrol yaş eşlemeli dokularda görülmektedir değil. Düğümleri ve paranodes neuropathological değişiklikleri de içinde GBS dokümante edilmiş; Özellikle, AMAN varyant11,12. Bizim fare EAN modeli, düğümlerin ve bozulma paranode için genişletme ek neuropathological özellikleri şunlardır tanımlamak P0180-199 EAN (şekil 3B) indüklenen.
Şekil 1: klinik EAN indüksiyon paradigma şematik gösterimi Puan edinildi değerlendirme ve çalışan kapasite sırasında EAN. (a) genel bakış EAN indüksiyon Protokolü C57BL/6 farelerde, beklenen klinik puanları ve (C) 6-8 hafta-in yaş, (B) şemaları ile gelen başlıyor hastalığı sırasında çalışan kez ders (başvuru4bakınız). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: EAN ile fareler görüntülemek miyelin kaybı, miyelin hasar ve akson stres belirtileri. Siyatik sinir yaş eşlemeli sağlıklı denetiminden yarı ince bölümlerden alınan (A) A parlak alan görüntü (küçük 100 X büyütme). (B) A parlak alan görüntü (küçük 100 X büyütme) yarı ince kesitler siyatik sinir 55 gün EAN ile indüklenen fareler üzerinden alınan sonrası ilk aşılama (dpi). Remyelination ince myelinated akson (ok uçları) tarafından çevrili miyelin eksik alanları belirtir; Bu doku (bkz:) yaşlı eşlemeli sağlıklı kontrol elde gözlendi değil. (C) A temsilcisi elektron mikroskobu alınan görüntü (küçük 5000 X büyütme) fromsciatic sinirler Masası B gösteren miyelin patoloji (açık ok) ve akson stres (55 dpi'ye kadar şişmiş mitokondri gösteren bağlama kare). ((C sınırlayıcı) yüksek güç TEM görüntü gösteren şişmiş mitokondri akson işaret etmektedir (ok uçları) stres, ama bu yokD) sağlıklı kontrol (değil gösterilen verileri) yaş eşlemeli üzerinden. Ölçek çubukları 10 µm (A, B) = ve 500 nm (C, D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Axon stres ve nodal patoloji olduğunu bir özellik P0180-199 indüklenen EAN. 55 dpi siyatik sinir aracılığıyla(a)tek uçak confocal görüntüleri çekilen (küçük 40 X büyütme). EAN fareler dokudan β-III tübülin (nöronların bir işaretleyici) gösteren aksonal stres belirtileri ile birlikte lokalize önemli ölçüde yükseltilmiş APP ifade göster. (B) yüksek güç Z-projeksiyonlar (100 X büyütme), siyatik sinir bölümlerde Caspr karşı antikor ile lekeli paranodes. EAN fareler düğümlerden, düğümü genişletme gösteren bitişik paranodes arasında artan bir mesafe var. Buna ek olarak, paranode yapısında bozulma gibi nodal patoloji EAN farelerde görülebilir ama yoktur yaş eşlemeli sağlıklı denetimlerinden. Ölçek çubukları 10 µm (A) ve 5 mikron (B) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Puan | Ölçüt | Notlar ve Yorumlar değerlendirme kriterlerinin |
| 0 | Normal fare | |
| 1 | Daha az canlı veya köpüğünü | Bu fareler genellikle ilk gün 5 sonrası aşılama azaltılmış aktivitesinden belirtileri göstermek normal işleme yanıt olarak değerlendirilir mi |
| 2 | Kuyruk taraflidir veya | Kuyruk taraflidir (kuyruk flicking) kuyruk kontur test tarafından değerlendirilir. |
| Hafif uzuv taraflidir | Hafif uzuv taraflidir başvurduğu fareler düz bir yüzeye yürürken yere onların göbek sürükleyin | |
| 3 | Kuyruk taraflidir + hafif uzuv taraflidir veya | Hafif ataksi normal yürüme herhangi bir zorluk olarak değerlendirildi |
| Kuyruk taraflidir + hafif ataksi veya | ||
| Hafif uzuv taraflidir + hafif ataksi | ||
| 4 | Şiddetli ataksi | Şiddetli ataksi atipik tarafından tanımlanan geriye yürüme, bacak taraflidir, hafif uzuv taraflidir veya kuyruk taraflidir ile kombine |
Tablo 1: EAN klinik paradigma puan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporu C57BL/6 farelerde P0180-199 peptid kullanarak, anahtar neuropathological ve fonksiyonel açıkları EAN ile indüklenen farelerde miktar etkinleştirme EAN ikna etmek için basit bir yöntem özetliyor. Burada açıklanan EAN indüksiyon Protokolü bağışıklama enjeksiyonları gerçekleştirirken anestezi kullanımı farklıdır. İsoflurane anestezi kullanımını büyük ölçüde inoculum hacmi subkutan istenilen yere en az hata ve stres hayvanlara enjekte edilir emin olmak için yeteneğini geliştirir.
Fareler bu yöntemle EAN indüksiyon 6 dpi4 hastalığın klinik belirtiler görüntülemek başlayacak. Ancak, klinik skora göre ölçülen hastalığı başlangıçlı ~ 10 dpi9,10gerçekleşmesi için daha önce bildirilmiştir. Klinik skora göre belirlenen hastalık başlangıcı bu farklılığı kısmen nedeniyle farklı klinik puanlama ölçütünü olabilir iken, bu inoculum içinde farklı adjuvan kullanım için EAN indüksiyon açıklanabilir daha yüksektir. Bu protokol hangi M. tuberculosisile desteklenmiş M. butyricum, içeren bir Freund'ın tam adjuvan kullanır. Diğer çalışmalar Freund's sadece ile M. tuberculosis P0180-199 peptid9,10 bağışıklama içeren enjekte inoculum takıma adjuvan kullanın.
Bu protokol için boğmaca toksin ı.p. enjeksiyon yolu ile teslim Intravenous (IV) tercih önerilir kuyruk ven enjeksiyon. Boğmaca teslimat modu hastalığı başlangıcı veya ilerlemeyi4önemli ölçüde değiştirmez ama ı.p. yolun karşı damardan kuyruk ven yoluyla teslim etmek için seçim riskin azaltılması ve azaltmak için motive gösterilmiştir hata çalışma şansı. Sık sık, kuyruk ven serum enjeksiyonları teknik olarak daha eşit bir farenin enjeksiyonları ile karşılaştırıldığında zor bulunmaktadır. Daha önce boğmaca toksin kullanımının bir adjuvan olarak EAN P0180-199 peptid9kullanırken ikna etmek gerekli olduğu gösterilmiştir. İlginçtir, önceki çalışma bu yöntem, özetlenen boğmaca doz yarıya indirmek olduğunu yasadışı EAN klinik skoru, nevropatoloji ve yürüyüş sırasında koşu bandı4çalışan genişletme tarafından ölçülen için yeterli göstermiştir. Ancak, boğmaca toksin kullanılan doz azaltılması içinde EAN sırasında indüksiyon önemli ölçüde çalışan kapasite etkiler ve fareler gerçekleştirmek önemli ölçüde daha iyi EAN açıklanan Bu yöntemde yarım boğmaca doz ile indüklenen olduğu görevi çalışan koşu bandı 4.
Bu P0180-199 indüklenen peptid EAN modelde gözlenen motor açıkları eşlik etti ve güçlü neuropathological kanıt tarafından desteklenen. Daha önce miyelin hasar ölçüde miktarının boğmaca toksin doz EAN indüksiyon sırasında yarıya indirmek sonuçlandı hastalık şiddeti değişiklikleri algılamak için hassas olduğunu kanıtlanmıştır. Burada, EAN diğer işaretlerinden aksonal stres ve düğüm/paranodal yapıların bozulma gibi tanımlanır, a maiyet-in P0180-199 için nicel neuropathological işaretleri sonuçlanan EAN indüklenen. Bu hastalık işlemler veya roman terapötik ajanlar etkinliğini değerlendirirken daha ihtiyatlı imtihanlarını nevropatoloji için sağlar. Heyecan verici, bu neuropathological değerlendirmeler için bir teklif daha derin yorumlara ve nevropatoloji ve bu modeli, EAN özelliğidir işlevi açıkları arasındaki ilişkiyi daha iyi anlaşılmasını sağlamak için fonksiyonel görevle ilişkili. Neuropathological analizleri ve yürüyüş fonksiyon testi bu çalışmada istihdam ek olarak, diğer fonksiyonel değerlendirmelerin sinir iletim hızı ölçümü gibi tam olarak işlev sonuçları kullanarak terapötik müdahalelerin yakalamak için önerilmektedir Bu model.
EAN periferik demiyelinizasyon ve remyelination, siyatik sinir ve en sık periferik sinirler araştırıldı olmak Kauda equina ile incelemek için güçlü ve yaygın olarak kullanılan deneysel bir model var. Bu böylece analizleri Klinik açıdan neuroprotection ve miyelin onarım sağlayan bir tekrarlanabilir ve ölçülebilir motor bütçe açığı, sonuç EAN temel avantajlarından birisidir. Ayrıca, miyelin hasar akut ve tekrarlanabilir böylece miyelin ve histopatolojik bakış açısından aksonal hasar detaylı analizler izin var.
Periferik nöropati demiyelinizan araştırmak için heyecan verici bir deneysel demek EAN modeli temsil ederken, potansiyel sınırlamalar yanı sıra teknik sorunlar vardır. İnsanlarda bağışıklık sistemi ve PNS arasında karmaşık bir etkileşim içeren periferik nöropati demiyelinizan heterojenite doğası için teşekkür ederiz önemlidir. Geçerli bir EAN hayvan model sadakatle bütün yönleriyle taklit edebilir bir mücadeledir. Ayrıca, hastalık şiddeti ve ilerleme EAN modeli ile ilgili önemli türler arası ve arası gerginlik varyasyon vardır. Örneğin, EAN C67/B6 farelerde indüklenen bu genel olarak EAN Lewis fareler (yayınlanmamış veri) indüklenen daha az şiddetli bulduk. Aynı gerginliği içinde cinsiyet farkı da vardır. Bizim yayınlanmamış veri erkek C57/B6 farelerde indüklenen EAN modeli olan dişi fareler, ancak, bu cinsiyet farkı destek tam nedenini indüklenen belirsiz olduğundan daha tekrarlanabilir olduğunu gösteriyor.
Sonuç olarak, biz bir sağlam ve hızlı indüksiyon EAN modeli erkek C57/B6 farelerde sağlayan bir protokol bildirdi. Klinik puanlama ve motor fonksiyon değerlendirme neuropathological çalışmaları ile birleştiren bir stratejik araç klinik ve patolojik açılardan periferik nöropati demiyelinizan çalışmak için sağlar. Önemlisi, gelecek çalışmalar periferik sinirleri miyelin onarım transgenik fare yaklaşımları kullanarak hedef terapiler mekanizmaları üzerinde teşvik etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu eser ile ilgili hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
DGG bir NHMRC Peter Doherty ve Multipl skleroz araştırma Avustralya (MSRA) erken kariyer adam var. JLF bir MSRA doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. Bu eser Avustralya Ulusal Sağlık tarafından desteklenen ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) projesi hibe #APP1058647 JX için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
