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Biochemistry

Peptides de pénétration cellulaire biotinylé pour étudier les Interactions protéine-protéine intracellulaire

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56457
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

Summary

Il s’agit d’un protocole pour l’étude des interactions protéine-protéine intracellulaire basées sur le système de menu déroulant biotine-avidine avec la nouveauté de la combinaison de séquences de pénétration cellulaire. Le principal avantage est que la séquence cible est incubée avec les cellules vivantes au lieu de lysats cellulaires et par conséquent les interactions auront lieu dans le contexte cellulaire.

Abstract

Nous présentons ici un protocole pour l’étude des interactions protéine-protéine intracellulaire qui est basé sur le système de menu déroulant biotine-avidine largement utilisé. La modification présentée comprend la combinaison de cette technique avec des séquences de pénétration cellulaire. Nous vous proposons de concevoir des appâts de pénétration cellulaire qui peuvent être incubées avec des cellules vivantes au lieu de lysats cellulaires et donc les interactions trouvées reflètent celles qui se produisent au niveau intracellulaire. Connexin43 (Cx43), une protéine qui forme des canaux de jonction gap et hémicanaux est diminuées dans les gliomes de haut grade. La région de Cx43 comprenant les acides aminés 266-283 est responsable de l’inhibition de l’activité oncogénique de c-Src dans les cellules de gliome. Ici, nous utilisons TAT comme la séquence de pénétration cellulaire, de la biotine comme la balise menu déroulant et dans la région de Cx43 comprise entre acides aminés 266-283 comme cible pour trouver des interactions intracellulaires dans les cellules de tige de dur-à-transfecter un gliome humain. Une des limites de la méthode proposée est que la molécule utilisée comme appât pourrait ne pas plier correctement et, par conséquent, les interactions trouvées pas peut-être associées avec l’effet. Cependant, cette méthode peut être particulièrement intéressante pour les interactions impliquées dans les voies de transduction de signal, parce qu’elles sont habituellement effectuées par régions intrinsèquement désordonnées et, par conséquent, ils ne nécessitent pas un pliage ordonnée. En outre, l’un des avantages de la méthode proposée est que la pertinence de chaque résidu sur l’interaction peut être facilement étudiée. Il s’agit d’un système modulaire ; par conséquent, les autres séquences de pénétration cellulaire, autres balises et autres cibles intracellulaires peuvent être employées. Enfin, le champ d’application du présent protocole dépasse de loin l’interaction protéine-protéine parce que ce système peut être appliqué aux autres cargaisons bioactifs tels que RNA séquences, nanoparticules, virus ou n’importe quelle molécule qui peut être transduite avec séquences de pénétration cellulaire et fondue aux balises de liste déroulante afin d’étudier leur mécanisme intracellulaire d’action.

Introduction

Interactions protéines-protéines sont essentielles pour une grande variété de processus cellulaires. Pour bien comprendre ces processus, les méthodes d’identification des interactions de protéine dans l’environnement complexe intracellulaire sont nécessaires. Une des méthodes plus utilisées pour identifier les partenaires d’interaction d’une protéine est d’utiliser cette protéine ou un peptide mimétique d’une partie de cette protéine comme appât dans des expériences de menu déroulant affinité suivies par détection de protéines de liaison. Le système avidine-biotine est fréquemment utilisé en raison de la forte affinité, la spécificité et l’interaction stable entre l’avidine et biotine1,2. Habituellement, biotine est lié par covalence à l’appât (protéique ou peptidique) et après une période d’incubation avec des lysats de cellules pour permettre la mise en place des interactions, l’appât biotinylé lié à ses partenaires intracellulaires est tiré vers le bas avec l’avidine ou avidine dérivés conjugués avec des perles de soutien. Puis, interactions protéine-appâts sont détectées après lavage, élution et l’analyse par électrophorèse suivie par Western blot en présence. Un des problèmes de cette technique est que les interactions entre la protéine d’intérêt et ses partenaires intracellulaires se déroulent en dehors du contexte cellulaire. Ceci est particulièrement important pour les interactions impliquées dans les voies de transduction de signal parce qu’elles ont lieu dans des endroits intracellulaires spécifiques, ils sont transitoires et elles sont généralement effectuées par les protéines pas abondantes. Par conséquent, dans les lysats cellulaires ces interactions peuvent être masquées par d’autres protéines plus abondantes ou par des protéines qui ne sont généralement pas à proximité.

Peptides de pénétration cellulaire (CPPs) sont des peptides courts (≤40 aminoacides), composés principalement par des acides aminés cationiques qui sont capables de transporter une large gamme de molécules dans presque n’importe quelle cellule3. Des marchandises comme les protéines, l’ADN plasmidique, siRNA, virus, agents d’imagerie et nanoparticules divers ont été conjugués à PPC et efficacement intériorisée4,5. En raison de cette capacité de transport, ils sont également connu sous le nom domaines protéiques de transduction (DTP), séquences de translocation de la membrane (MTSs) et des peptides de Trojan. Entre le PPC, le TAT peptide de la protéine de transactivateur VIH TAT6 a été l’un du plus largement étudié 7,8,9. TAT est un nonapeptide contenant 6 arginine et 2 résidus de lysine et est par conséquent très cationiques. Études de substitution ont démontré que la charge positive nette de TAT est nécessaire pour les interactions électrostatiques avec les membranes plasmiques des cellules eucaryotes et son internalisation subséquente de10. De la même façon aux autres PPC, TAT chargé positivement fortement lie électrostatiquement aux divers charge négative espèces présentes à la surface extracellulaire des membranes cellulaires, y compris les groupes de tête de lipides, de glycoprotéines et de protéoglycanes3 , 10. bioactifs cargaisons transportées par TAT deviennent immédiatement libres dans le cytosol pour rejoindre leurs partenaires intracellulaires.

Nous présentons ici une méthode qui combine le CPP TAT avec de la biotine pour étudier les interactions intracellulaires. Le but est de concevoir des appâts de pénétration cellulaire en fusionnant la biomolécule cible de TAT et de biotine. Le principal avantage de cette proposition est que les interactions entre l’hameçon et ses partenaires aura lieu dans son contexte cellulaire. Pour montrer l’efficacité de cette méthode, nous avons utilisé comme appât une petite séquence de la protéine Cx43 qui a été rapporté d’interagir dans les cellules avec le proto-oncogène c-Src11,12,13. Cx43 est une protéine intégrale de membrane qui est largement exprimée dans les astrocytes14et diminuées dans les gliomes de haut grade, une tumeur maligne la plus courante du système nerveux central15,16,17 ,,18. Il a été précédemment montré que la région de Cx43 qui interagit avec c-Src (acides aminés 266-283 dans Cx43 humaine ; PubMed : P17302) fondu à TAT (TAT-Cx43266-283) inhibe l’activité oncogénique des cellules de gliome de c-Srcin et les cellules souches de gliomes (CSS)19,20,21. Pour concevoir l’appât intracellulaire, Cx43266-283 a été fusionnée à TAT à l’extrémité N-terminale (TAT-Cx43266-283) et à la biotine à l’extrémité C-terminale (TAT-Cx43266-283- B). Cette stratégie a été utilisée avec succès dans les gliomes de rat lignée cellulaire C6 pour identifier c-Src, c-terminal kinase Src (CSK) et la phosphatase et tensine homologue (PTEN) en tant que partenaires intracellulaires de cette région de Cx4320. Nous décrivons ici, cette méthode d’évaluation de son efficacité dans humaines CSS, qui sont très pertinentes pour le traitement des gliomes, mais beaucoup plus difficile à transfecter que les cellules souches non gliome.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées à l’Université de Salamanque.

1. les cellules

  1. Deux jours avant le début de la procédure, la plaque des cellules à la densité requise pour être confluentes le jour de l’expérience. Plaque de cellules dans des fioles ou des plaques. Toutefois, l’extraction de protéines sera plus facile de plaques. Il convient de préparer au moins 4 assiettes de 78 cm2 ou 2 flacons de 150 cm2 par État, par expérience, pour être sûr que les résultats sont cohérents.
  2. Dans cette étude, plaque humain G166 CSS en 4 flacons de 150 cm2, cultivées dans les cellules souches RHB-A additionné de 2 % B27, 1 % N2, 20 ng/mL EGF et b-FGF tel que décrit par Pollard et al.22. Processus lorsque confluent a été atteint. Par exemple, lorsque les cellules de 5 x 106 G166 ont été cultivées dans une fiole de2 150 cm, elles ont été traitées 2 jours après l’ensemencement.

2. biotinylé CPPs

  1. Faites tourner les flacons contenant le lyophilisés biotinylé CPPs (BCPPs) à 8200 x g pendant 30 s, d’éviter la poudre restante sur le couvercle. Inclure un contrôle BCPP pour s’assurer que les interactions trouvées sont spécifiques de la séquence cible. Dans cette étude, le contrôle PPCA était TAT-biotine (TAT-B) et le traitement PPCA TAT-Cx43266-283- B. Autres contrôles pourraient être utilisées, comme TAT fragments fusionnés brouillés ou muté bond à la biotine.
  2. Dissoudre les BCPPs dans le milieu de culture correspondant à la solution indiquée par le fabricant ; par exemple, pour obtenir une solution mère de 2 mg/mL BCPP pour traiter les CGV ajouter 0,5 mL de milieu de culture de GSC dans un flacon contenant 1 mg du PPCA. Vortex et assurez-vous que le peptide est bien dissous.

3. tubes

NOTE : Préparez au moins douze tubes de 1,5 mL par condition exigée à l’article 7.

  1. Marquer les 3 premiers tubes par État. Ils auront le volume total de lysats cellulaires obtenues à l’étape 6.4.
  2. Marquer un A dans 3 tubes par État. Ces tubes aura les premiers surnageants obtenus après lyse et filer les lysats cellulaires, l’étape 7.2.
  3. Marquer un B à 3 tubes par État. Ces tubes auront une petite aliquote de surnageants premières. Ces lysats servira les échantillons de Western blot à l’étape 7.3.
  4. Marquer un C dans 3 tubes par État. Ces tubes auront les surnageants obtenus après le menu déroulant avec neutravidine, étape 7,7.
    NOTE : Ceci est important dans le cas où le Western blot a montré aucun signal pour les protéines, ce qui signifie que les protéines n’ont pas tirés vers le bas ou ont été perdus à quelques pas de la procédure. Si c’était la situation, répétez le processus pour tirer vers le bas les protéines.

4. cellulaire traitement avec les BCPPs

  1. Aspirez le milieu de culture.
  2. Remplacez le volume correspondant de milieu frais pour Incuber les BCPPs dans le plus petit volume possible de support selon les temps d’incubation. Il est très important que dans tous les cas, le support couvre complètement toute la surface de la plaque/cuve afin que les cellules ne pas sèchent, par exemple, 6 mL par 150 cm2 pour une période d’incubation de 30 min.
  3. Ajouter le volume de la solution mère de PPCA pour les cultures de cellules pour atteindre la concentration qui a fait ses preuves pour être efficace. Dans cette étude 50 µM TAT-Cx43266-283- B a été prouvé pour réduire la prolifération de la GSC.
    1. Par conséquent, ajouter 92.8 µL de 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) par mL de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Si le volume à ajouter est différent pour les peptides de contrôle, avec le milieu de culture jusqu’au volume final même. Par exemple, 49,1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) et 43,7 µL de milieu de GSC ont été ajoutés par mL de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 50 µM TAT-B.
  4. Placer les cellules dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 30 min pour s’assurer que les interactions entre le PPCA et ses partenaires intracellulaires ont lieu. Si l’interaction prend plus de temps, incuber pendant plus longs ou régler l’heure dans le cas où l’expérience consistait en un temps. En outre, l’interaction des intérêts peut être promue ou empêchée par stimulants différentes voies de signalisation intracellulaire.

5. tampons et solutions.

  1. Préparer le tampon au phosphate pH 7.4 : 136 mM NaCl ; 2,7 mM KCl ; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1,7 mM KH2PO4.
  2. Préparer le tampon de lyse des protéines : 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1 % IGEPAL, avant d’utiliser, ajouter ce qui suit : 1/100 (v/v) protéase inhibiteur Cocktail, 1 mM de fluorure de Sodium, fluorure de phénylméthanesulfonyle 1 mM (PMSF) et orthovanadate de Sodium 0,1 mM.
  3. Préparer le tampon de Laemmli : (4 x : 0,18 M Tris-HCl pH 6,8 ; 5 M glycérol ; SDS de 3,7 % (p/v) ; 0,6 M β-mercaptoéthanol ou 9 mM TNT ; bleu de bromophénol de 0,04 % (v/v) (BB)).

6. extraction de protéine

NOTE : Extraction de protéine a été réalisée comme décrite précédemment20,23. Réaliser cette section entière de la procédure à 4 ° C.

  1. Aspirer complètement le milieu de culture.
  2. Lavage 3 x 10 mL de phosphate glacee tampon saline (PBS) par 150 cm2 très soigneusement pour éviter le détachement cellulaire.
  3. Pour obtenir le lysat cellulaire, ajouter 3 mL de tampon de lyse par 150 cm2 et gratter soigneusement la surface à l’aide d’un grattoir de cellules. Inclinaison de la plaque/fiole à environ 45 degrés rendra plus facile de rassembler les lysats cellulaires dans leurs tubes correspondants.
  4. Verser 1 mL de lysat par tube cellulaire dans trois tubes de 1,5 mL. Ces tubes seront marqués avec l’État et le reproduire comme il est indiqué à l’étape 3.1.

7. liste déroulante

  1. Centrifuger les tubes de 1,5 mL à 11 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  2. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes (A).
  3. Prélever une partie aliquote de cette surnageant par État aux différents tubes (B), c'est-à-dire 50 µL par tube. Ajouter 4 x Laemmli tampon (16,6 µL pour 50 µL de lysat) et congeler à-20 ° C. Ces lysats servira comme d’habitude Western blot des échantillons.
  4. Homogénéiser parfaitement l’Agarose neutravidine, en agitant doucement. Couper les pointes des pointes de pipette pour augmenter leur diamètre et améliorer le pipetage des perles.
Ajouter 50 µL d’Agarose neutravidine / mL de cellule lysat dans les tubes (A).
  • Incuber à 4 ° C durant la nuit avec une agitation très doux pour permettre neutravidine d’interagir avec les BCPPs liés à leurs partenaires intracellulaires.
  • Centrifuger à 3 000 x g pendant 1 min à 4 ° C, pour recueillir le complexe de neutravidine avec les protéines.
  • Retirer les surnageants soigneusement et transférez-les sur tubes propres (C). Gardez-les pour les utiliser dans le cas où le menu déroulant n’est pas réussi.
  • Étapes de lavage : tampon de lyse fraîche s’ajoute les pellets (tubes A), remettre en suspension par inversion et répétez les étapes 7,6) et 7,7) pour 5 fois plus. Tous ces surnageants puissent être annulées.
  • Retirer les surnageants et ajouter 2 x Laemmli tampon jusqu’au volume final souhaité (40 µL par tube de 1,5 mL pour les granulés obtenus à partir des flacons de2 150 cm des cellules confluentes).
  • Éluer à 100 ° C pendant 5 min dissocier les interactions entre protéines et centrifuger pendant 30 s à 8 200 g pour granuler neutravidine perles.
  • Prendre les surnageants, contenant les protéines dissociés, avec des conseils capillaires dans de nouveaux tubes (D). Les perles peuvent être conservés en cas de répéter les étapes d’élution est nécessaire.
    NOTE : Les surnageants (tubes D) sont maintenant prêts à être chargés en Western blot ou à congeler à-20 ° C.

    • 8. Western Blot

    NOTE : Éponger occidental a été réalisée comme décrite précédemment24.

    1. Charger un volume équivalent de chaque échantillon par voie sur midigels Bis-Tris (4-12 %) dans un système d’électrophorèse de Midi-cellule.
    2. Transblot protéines utilisant un système de transfert sec dans un empilement régulier de nitrocellulose.
    3. Colorer la membrane avec 10 % Ponceau pendant 10 min.
    4. Laver les membranes 3 x 5 min avec 5 mL de TTBS.
    5. Bloquer les membranes avec 7 % de lait en TTBS pendant 1 h avec agitant doucement dans des tubes ou des petites boîtes. Assurez-vous que le volume utilisé est suffisante pour couvrir les membranes et qu’ils ne séchez pas, c'est-à-dire 40 mL par membrane midi ensemble.
    6. Laver 3 x 5 min avec 5 mL de TTBS.
    7. Incuber une nuit à 4 ° C avec l’anticorps primaire contre la protéine d’intérêt avec agitant doucement.
    8. Laver 3 x 5 min avec 5 mL de TTBS.
    9. Incuber la membrane à température ambiante avec le correspondant couplé à la peroxydase anticorps secondaire dans TTBS pendant 1 h.
    10. Laver 3 x 5 min avec 5 mL de TTBS.
    11. Développer avec un substrat chimioluminescent dans un système de chimiluminescence.

    9. résolution de problèmes

    1. Si après avoir développé le Western blot aucun des échantillons a montré aucun signal du tout pour les protéines, vérifiez le Ponceau.
      Remarque : La membrane au Ponceau devrait montrer indéfinie et chargement de nombreuses bandes le long des voies. Si les bandes ne sont pas très visibles, la quantité de protéines chargées ne suffira peut-être pas, ou le transfert aurait pu mal. Envisager de répéter le Western blot.
    2. S’il n’y a aucune tache à tous dans la membrane de Ponceau dans toute voie, répétez l’ensemble de la procédure de l’étape 7,4 dans les tubes (C).
    3. Si après avoir développé le Western blot, un signal de protéine est très faible mais le Ponceau a montré protéines, incuber à nouveau la membrane avec l’anticorps primaire pendant plus longtemps. Si le signal est encore assez faible, incuber encore une fois à température ambiante.

    10. autre Techniques utilisé (s) dans cet Article

    1. Immunocytochimie de BCPPs
      1. Fixer les cellules à 4 % de paraformaldéhyde (0,2 mL / cm2) pendant 20 min.
      2. Laver 3 x 5 min avec du PBS (0,2 mL / cm2).
      3. Appliquer l’anticorps correspondant (au moins 0,15 mL / cm2) dilué dans une solution d’anticorps à la concentration indiquée par le fabricant contre votre protéine d’intérêt durant la nuit à 4 ° C.
      4. Incubez avec un anticorps secondaire conjugué fluorophore (0,15 mL / cm2) pendant 2 h à température ambiante.
      5. Répétez les étapes 10.1.2-10.1.4 avec d’autres anticorps contre vos protéines d’intérêt. Veillez à ne pas se servir de la même espèce pour différents anticorps primaires ou de la même longueur d’onde fluorophores des anticorps secondaires.
      6. Monter les cellules avec le réactif antifade (0,005 mL / cm2).
      7. Analyser sur un microscope à fluorescence relié à une caméra numérique.
    2. Analyse de MTT
      1. La culture des cellules à 37 ° C en plaques 24 puits.
      2. Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 75 min avec 0,15 mL de milieu de culture par cm2 contenant 0,5 mg/mL MTT.
      3. Aspirer le milieu et incuber les cellules pendant 10 min dans le noir avec le diméthylsulfoxyde (0,25 mL / cm2) avec agitation douce.
      4. Mesurer l’absorbance à une longueur d’onde de 570 nm en utilisant un lecteur de microplaques.

    Representative Results

    Avant d’utiliser BCPPs pour étudier l’interaction intracellulaire, il est essentiel de comparer les effets du PPCA vs RPC pour valider les résultats obtenus avec le PPCA. Par conséquent, afin d’étudier si l’inclusion de la biotine modifie l’activité de la séquence cible, nous avons d’abord analysé l’effet de TAT-Cx43266-283- B par rapport à TAT-Cx43266-283 sur la morphologie G166 CSS. Pour ce faire, nous avons effectué des analyses d’immunofluorescence des deux protéines cytosquelettiques, F-actine et la tubuline α après 24 h de traitement. La figure 1 montre que G166 CSS en présence de 50 µM TAT-Cx43266-283 ou TAT-Cx43266-283- B acquérir une forme plus arrondie par rapport aux prolongements cellulaires allongés et élargis montrés chez les témoins (TAT ou TAT-B). En fait, la Figure 1 b montre que filaments d’actine sont assemblés pour la plupart comme des réseaux de l’actine lorsque les cellules ont été traitées avec TAT-Cx43266-283 ou TAT-Cx43266-283- B alors qu’ils forment plusieurs faisceaux d’actine dans les cellules de contrôle (traités avec TAT ou TAT-B)25. En revanche, la distribution α-tubuline ne varie pas entre les différentes conditions. Ces résultats ont montré que la présence de biotine n’a pas modifié l’effet de la séquence cible sur la morphologie des G166 CSS. Dans les précédentes études20,21, nous avons montré que TAT-Cx43266-283 réduit la prolifération G166 CSS. Dans cette étude, nous avons examiné si TAT-Cx43266-283- B exerce les mêmes effets dans la croissance comme TAT-Cx43266-283. Pour ce faire, nous avons analysé la prolifération G166 CSS par test MTT après 72 h de traitement. Le test MTT est un dosage colorimétrique pour évaluer l’activité métabolique des cellules. MTT est métabolisé par les enzymes oxydoréductase NAD (P) H dans les mitochondries, reflétant le nombre de cellules viables présents. La figure 2 montre que la réduction de la viabilité des cellules G166 CSS n’est pas significativement différente lorsque les cellules ont été traitées avec 50 µM TAT-Cx43266-283 ou 50 µM TAT-Cx43266-283- B. En effet, les deux significativement diminués prolifération G166 CSS par rapport à la commande, TAT ou TAT-B.

    Une fois que nous avons confirmé que l’effet de notre ordre de cible en G166 CSS (TAT-Cx43266-283) n’était pas modifié par l’inclusion de la biotine à l’extrémité C-terminale (TAT-Cx43266-283- B), nous avons étudié les partenaires intracellulaires de cette séquence suivant le protocole décrit dans cette étude (Figure 3). Parce que les cavéoles ont été impliqués dans le mécanisme de TAT internalisation26, nous avons analysé la présence de la cavéoline-1 (Cav-1) dans le pull-down. Analyse par transfert Western (Figure 4) a montré que TAT-B et TAT-Cx43266-283- B interagir avec Cav-1. Toutefois, la capacité de TAT-Cx43266-283- B pour recruter c-Src, PTEN et CSK est plus forte que celle observée avec TAT-B. Kinase d’adhérence focale (FAK) est un substrat de c-Src, ce qui n’a pas été démontré d’interagir avec les Cx43. En effet, FAK n’ont montré aucune interaction significative avec TAT-B ou TAT-Cx43266-283- B.

    Pour confirmer l’interaction entre TAT-Cx43266-283- B et c-Src, G166 CSS ont été incubées avec 50 µM TAT-Cx43266-283- B pour 30 min et leur localisation a été suivie avec la Streptavidine fluorescente par microscopie confocale (Figure 5 ). Nos résultats ont montré que la distribution intracellulaire de TAT-Cx43266-283- B se trouve à proximité de la membrane plasmique (illustrée par coloration de phosphatidylsérine) et correspond à celle du c-Src. En fait, les analyses de co-localisation ont révélé certains points de co-localisation (blanc) entre TAT-Cx43266-283- B et c-Src dans l’image de la fusion. Par conséquent, la microscopie confocale études confirment les résultats obtenus avec le protocole de menu déroulant PPCA décrit dans la présente étude.

    Figure 1
    Figure 1 : Effet du PPCA et RPC sur la morphologie de la GSC.
    G166 CSS ont été cultivées à une faible densité (2 x 104 cellules / cm2) et après 24 h, ils ont été incubés avec contrôle µM 50 CPP (TAT), contrôler le PPCA (TAT-B), traitement RPC (TAT-Cx43266-283) ou PPCA (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-actine (rouge), α-tubuline (vert) et fusionnée + DAPI immunomarquage du même champ montrant la morphologie G166 CSS. Barres = 50 µm. b) F-actine immunostaining montrant la répartition différente de l’actine F en CSS G166 après incubation pendant 24 h avec 50 µM RPC (TAT) de contrôle ou le contrôle PPCA (TAT-B) par rapport au traitement de µM 50 CPP (TAT-Cx43266-283) ou PPCA (TAT-Cx43 266-283-B). Barres = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2 : Effet du PPCA et RPC sur la viabilité de GSC.
    G166 CSS ont été plaqués à 5500 cellules/cm2 à 24-multiwell plaques et incubées avec 50 µM contrôle des peptides, RPC (TAT) ou PPCA (TAT-B), ou 50 µM traitement des peptides, RPC (TAT-Cx43266-283) ou PPCA (TAT-Cx43266-283- B). La viabilité cellulaire a été analysée à l’aide d’un test MTT après 72 h. Les résultats sont exprimés sous forme d’absorbances MTT et sont le s.e.m. moyenne ± au moins 3 expériences (++ p˂0.01 contrôle vs. ** p˂0.01, *** p˂0.001 vs TAT ou TAT-B ; aller simple ANOVA withTukey après le test). Notez qu’il n’y a pas de différence significative entre les effets de CPPs vs BCPPs. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3 : Schéma de protocole.
    Étape par étape schéma explicatif de la procédure tel que décrit dans la section « Protocole », de l’incubation des BCPPs jusqu'à les BCPPs éluées et leurs interactions protéines étaient obtenus.1) Incuber les cellules en culture avec BCPPs à la concentration désirée pour la temps requis. 2) durant l’incubation, les BCPPs sont internalisés et ils interagissent avec leurs partenaires intracellulaires. 3) laver les cellules trois fois sur la glace avec du PBS glacée. 4) lyser les cellules pour en extraire des protéines. 5) transférer les lysats cellulaires à tubes.6) tournent à 11000 g pendant 10 min à 4 ° C. 7) transfert les surnageants à tubes neufs (A) et de garder une petite aliquote des lysats de traiter comme régulière Western blot des échantillons dans le tube (B). 8) remettre en suspension les perles neutravidine Agarose et ajouter 50 µL dans chaque tube une utilisant une coupé de la pipette. 9) Incuber en agitant doucement pendant 12 h à 4 ° C pour permettre les neutravidine d’agarose perles d’interagir avec les BCPPs et leurs partenaires. 10) spin PDT 1 min à 3000 x g pour granuler les billes avec la biotinylé appâts et leurs interactions protéines liées à eux. 11) transfert de surnageants dans de nouveaux tubes (C) et conservez-les à utiliser dans le cas où le menu déroulant doivent être répétées. 12) laver le culot cinq fois avec le tampon de lyse frais, remettre en suspension par inversion, essorage pendant 1 min à 3000 x g et éliminer le surnageant. 13) Retirez tous le surnageant avec soin. 14) ajouter le volume souhaité de 4 x tampon de Laemmli et éluer les protéines à 100 ° C pendant 5 min. 15) tournent à 8200 x g pendant 30 s pour granuler les perles. 16) transférez les protéines éluées trouvés dans le surnageant avec conseils capillaires dans de nouveaux tubes (D). 17) charger sur gels pour analyse par Western blot. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4 : Étude des interactions intracellulaires de TAT-Cx43266-283- B à G166 CSS par menu déroulant suivi par Western blot.
    G166 CSS ont été incubées avec 50 µM TAT-B ou TAT-Cx43266-283- B. Après 30 min, les cellules ont été lysées et TAT-B ou TAT-Cx43266-283- B attachée à leurs partenaires intracellulaires ont été démolis avec les perles de neutravidine. Les protéines éluées ont été chargés et analysés par Western blot pour étudier les niveaux de la FAK, c-Src, CSK, PTEN et Cav-1. Remarque que Cav-1 interagit avec les deux TAT-B et TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN et CSK interagit préférentiellement avec TAT-Cx43266-283- B et FAK n’ont montré aucune interaction avec TAT-B ou TAT-Cx43266-283-B. s’il vous plaît Cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5 : Confirmation du TAT-Cx43266-283- B intracellulaire des interactions dans G166 CSS par microscopie confocale.
    G166 CSS ont été incubées avec 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Après 30 min, les cellules ont été fixés et traitées pour localiser TAT-Cx43266-283- B avec la Streptavidine-Cy2 (vert), c-Src par immunofluorescence (rouge) et la phosphatidylsérine à l’annexine V (bleu). Notez quelques points de co-localisation (blanc) entre TAT-Cx43266-283- B et c-Src, à proximité de la membrane plasmique dans les images de fusion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Discussion

    Il existe de nombreuses méthodes pour étudier les interactions protéine-protéine. La méthode présentée dans cette étude est basée sur le système de menu déroulant biotine-avidine largement utilisé dans lequel un appât biotinylé est incubé avec des lysats de cellules pour permettre la mise en place des interactions. Les modifications présentées dans cette étude comprennent la combinaison de cette technique avec des séquences de pénétration cellulaire. Nous vous proposons de concevoir des appâts de pénétration cellulaire qui peuvent être incubées avec des cellules vivantes au lieu de lysats cellulaires et par conséquent les interactions trouvées reflétera ceux qui ont eu lieu dans le contexte cellulaire.

    Ici, nous utilisons TAT comme la séquence de pénétration cellulaire, de la biotine comme la balise menu déroulant et dans la région de Cx43 comprise entre acides aminés 266-283 comme cible pour trouver des interactions intracellulaires dans CSS humaines. La base structurale de l’interaction entre Cx43 et c-Src est bien connu11,12. Il s’agit d’une interaction importante car elle inhibe l’activité oncogénique du c-Src dans les cellules de gliome24,13. En fait, la CPPs contenant cette région (TAT-Cx43266-283) imitent les propriétés antioncogenic de Cx43 sur cellules de gliome19,20,21. Dans les cellules de rats gliome C6, le mécanisme par lequel le TAT-Cx43266-283 inhibe c-Src comprend le recrutement de c-Src, ainsi que ses inhibiteurs endogènes CSK et PTEN20. Il convient de mentionner que les CGV est très intéressants comme une cible dans le traitement des gliomes, parce qu’elles constituent une sous-population qui résiste aux traitements conventionnels et par conséquent responsable de la réapparition de cette de tumeurs cérébrales malignes27. En outre, ils sont durs à transfecter de cellules et par conséquent, l’étude des interactions intracellulaires devienne plus difficile. CPPs sont internalisées rapidement et efficacement dans la CSS19 favorisant leur utilisation pour l’étude des interactions intracellulaires. Dans cette étude, à l’aide de CPPs fusionnées à la biotine, nous confirmons l’interaction de la séquence de266-283 Cx43 avec c-Src, ainsi que ses inhibiteurs endogènes CSK et PTEN dans CSS humaines.

    Cette méthode est très puissante pour étudier le mécanisme intracellulaire de composés bioactifs. Toutefois, il est très important de confirmer que l’effet biologique de l’appât de pénétration cellulaire biotinylé n’est pas différent de celui obtenu avec la non-biotinylé un. Cette étape est requise pour associer les interactions trouvées l’effet des composés bioactifs. En outre, la stabilité de l’enceinte, sa possible dégradation par des protéases ainsi que sa possible toxicité, devrait être soigneusement testée et prise en compte avant l’expérience de la planification. Dans l’exemple présenté, l’effet antiproliférative de TAT-Cx43266-283 sur G166 CSS humaines a été précédemment documenté20. Dans cette étude, nous confirmons que l’effet anti-proliferative de TAT-Cx43266-283- B et du TAT-Cx43266-283 est très similaire. En outre, l’analyse de la morphologie cellulaire a révélé que la α-tubuline et distribution F-actine est très similaire au CSS G166 traités avec TAT-Cx43266-283- B ou avec TAT-Cx43266-283. Au total, ces résultats indiquent que l’inclusion de la biotine à l’extrémité c-terminale de TAT-Cx43266-283 n’a pas modifié les effets de ce composé sur CSS humaines. Toutefois, si biotine modifierait les effets de la molécule bioactive, autres balises pour la purification de la protéine peuvent être testés, comme le drapeau octapeptide (DYKDDDDK)28, la balise grippe humaine dérivée de hémagglutinine HA (YPYDVPDYA) ou le glutathion S-transférase (GST)29. De même, si TAT ne vise pas la population de cellules d’intérêt, autre cellulaire des séquences pénétrantes, telles que pénétratine, MPG (pour une revue, voir30) ou des séquences spécifiques de cellules peuvent être utilisé31.

    En plus de l’étude des protéines qui interagissent spécifiquement avec la séquence cible, idéalement, la présence de protéines qui n’interagissent pas avec eux, en tant que témoins positifs et négatifs et les protéines qui interagissent avec le contrôle et de la séquence cible doit être adressée. En ce sens, nous avons trouvé Cav-1 dans le contrôle et traités situation, suggérant que les cavéoles ont été impliqués dans le mécanisme de l’internalisation, comme il a été démontré précédemment26. En outre, FAK, qui interagit avec c-Src, mais est censé ne pas pour interagir avec le c-terminal Cx43, était absent dans le contrôle et la situation traitée. Ces résultats renforcent la spécificité de l’interaction entre TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK et PTEN. Pour confirmer les résultats obtenus avec ce protocole, la microscopie confocale permet de visualiser la répartition des protéines qui interagissent et d’étudier leur co-localisation. Ainsi, nous avons trouvé TAT-Cx43266-283- B et c-Src la pièce une distribution intracellulaire similaire avec quelques pointes de co-localisation confirmant les résultats obtenue avec les expériences de la liste déroulante. En fait, TAT-Cx43266-283- B est distribué à proximité de la membrane plasmique, suggérant que la cargaison, dans cette étude Cx43266-283, dirige la molécule à ses partenaires intracellulaires.

    Une des limites de la méthode proposée est que la molécule utilisé comme appât pourrait ne pas plier correctement et les effets attendus ne seraient pas trouvées. Dans ce cas, les interactions trouvées ne saurait associées à l’effet. Cependant, cette méthode peut être particulièrement intéressante pour les interactions impliquées dans les voies de transduction de signal, parce qu’elles sont habituellement effectuées par régions intrinsèquement désordonnés32 et par conséquent, ils ne nécessitent pas un pliage ordonnée. En outre, l’un des avantages de la méthode proposée est que l’évolution temporelle de l’interaction peut être suivie, ce qui est particulièrement pertinent pour les interactions transitoires. En outre, la pertinence de chaque résidu sur l’interaction peut être facilement étudiée. En effet, il est possible d’étudier la pertinence des modifications post-traductionnelles sur les interactions protéine-protéine, par exemple, par la substitution de phosphomimetic de glutamate pour sérine ou thréonine. De même, la substitution de la sérine ou la thréonine pour alanine ou tyrosine pour la phénylalanine permet de tester l’effet de la non-phosphorylable sérine, thréonine ou tyrosine.Pour imiter la phospho-tyrosine, la manière la plus précise est la substitution de Tyr pour p-Tyr33.

    Enfin, le champ d’application du présent protocole dépasse de loin l’interaction protéine-protéine parce que ce système peut être appliqué aux autres cargaisons bioactifs tels que séquences RNA, de nanoparticules, de virus ou d’autres molécules qui peuvent être fusionnées à la biotine et transduites avec RPC pour étudier leur mécanisme intracellulaire d’action.

    Disclosures

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Acknowledgments

    Nous remercions M. Morales et J. Bravo pour leur aide à la conception du PPC et J.C. Arévalo pour son aide avec la liste déroulante protocole. Nous sommes reconnaissants pour l’assistance technique de T. del Rey. Ce travail a été soutenu par le Ministerio de Economía y Competitividad (Espagne) ; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León (Espagne) ; SA026U16 FEDER et Fundación Ramon Areces. M. Jaraíz Rodríguez et A. González-Sánchez sont lauréats d’une bourse de la Junta de Castilla y León et le Fonds Social européen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    G166 GSC line BioRep
    RHB-A stem cell medium Takara Y40001
    Laminin Mouse Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 23017-015 10 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17504-044 2%
    N-2 Supplement (100x) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17502-048 1%
    Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15 20 ng/ml
    Recombinant Human b-FGF Peprotech AF-100-18B 20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    Accutase Sigma A6964
    Cryostor CS10 cryopreservation medium StemCell Technologies 7930
    TAT GenScript - Custom made
    TAT-B GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283 GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283-B GenScript - Custom made
    Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737 1/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibody Sigma-Aldrich T9026 1/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose ThermoFisher Scientific 29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free Calbiochem, Bionova 539134 1/100 (v/v)
    Sodium Fluoride PanReac AppliChem 141675 1 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 1 mM
    Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 0.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . 1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System Life Technologies, ThermoFisher Scientific WR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% Life Technologies, ThermoFisher Scientific WG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0001 1X
    NuPAGE Transfer Buffer 20x Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0006 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water Sigma P7170
    FAK polyclonal rabbit antibody Life Technologies, ThermoFisher Scientific AHO0502 1/500
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Csk polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 4980 1/500
    PTEN polyclonal mouse antibody Cell Signalling (WERFEN) 9552 1/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody Abcam ab2910 1/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 1/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology SC-2030 1/5000
    Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A11029 1/1000
    Cy2-conjugated streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-220-089 1/500
    MicroChemi Luminescence system DNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific V13241 1/500
    SlowFade Gold antifade reagent Life Technologies, ThermoFisher Scientific S36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) Honeywell 41641-1L
    Appliskan 2001 Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

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    References

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    Biochimie numéro 130 TAT biotine-avidine peptides de pénétration cellulaire Pull-down intracellulaire des interactions interactions protéine-protéine Western blot
    Peptides de pénétration cellulaire biotinylé pour étudier les Interactions protéine-protéine intracellulaire
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    Jaraíz-Rodríguez, M., González-Sánchez, A., García-Vicente, L., Medina, J. M., Tabernero, A. Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (130), e56457, doi:10.3791/56457 (2017).

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