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Biochemistry

Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56457
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

Summary

Si tratta di un protocollo per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare basate sul sistema avidina-biotina menu a tendina con la novità di combinare sequenze cellula-penetrante. Il vantaggio principale è che la sequenza di destinazione viene incubata con le cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto si verificherà le interazioni all'interno del contesto cellulare.

Abstract

Qui presentiamo un protocollo per lo studio di interazioni proteina-proteina intracellulare che si basa il sistema di menu a tendina ampiamente usato biotina-avidina. La modifica presentata comprende la combinazione di questa tecnica con sequenze di cellula-penetrante. Ci proponiamo di progettare esche cellula-penetrante che possono essere incubati con cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto le interazioni trovate rifletterà quelli che si verificano all'interno del contesto intracellulare. Connexin43 (Cx43), una proteina che forma canali di gap junction e adenosina è down-regolato in gliomas di prima scelta. La regione di Cx43 composto da aminoacidi 266-283 è responsabile dell'inibizione dell'attività oncogena del c-Src in cellule del glioma. Qui usiamo TAT come la sequenza di cellula-penetrante, biotina, come il tag di discesa e la regione di Cx43 compresa tra aminoacidi 266-283 come destinazione per trovare interazioni intracellulari nelle cellule staminali duro transfect glioma umano. Uno dei limiti del metodo proposto è che la molecola utilizzata come esca potrebbe non riuscire a piegare correttamente e, di conseguenza, le interazioni trovate potrebbero non essere associate con l'effetto. Tuttavia, questo metodo può essere particolarmente interessante per le interazioni coinvolte nella trasduzione del segnale, perché esse sono di solito effettuate da regioni intrinsecamente disordinate e, pertanto, non richiedono un ripiegamento ordinato. Inoltre, uno dei vantaggi del metodo proposto è che la rilevanza di ogni residuo sull'interazione possa essere studiata facilmente. Si tratta di un sistema modulare; di conseguenza, possono essere impiegate altre sequenze di cellula-penetrante, altri tag e altri bersagli intracellulari. Infine, il campo di applicazione del presente protocollo è ben di là di interazione proteina-proteina, perché questo sistema può essere applicato a altri carichi bioattivi come sequenze di RNA, nanoparticelle, virus o qualsiasi molecola che può essere trasdotte con sequenze di cellula-penetrante e fuso a discesa Tag per studiare il loro meccanismo d'azione intracellulare.

Introduction

Interazioni proteina-proteina sono essenziali per una grande varietà di processi cellulari. Per comprendere appieno questi processi, metodi per l'identificazione di interazioni della proteina all'interno dell'ambiente intracellulare complessa sono necessari. Uno dei metodi più utilizzati per identificare partners di interazione di una proteina consiste nell'utilizzare quella proteina o un peptide mimetico di una parte di quella proteina come esca in esperimenti di discesa di affinità seguiti da rilevamento delle proteine leganti. Il sistema avidina-biotina è frequente a causa dell'elevata affinità, specificità e stabile interazione tra avidina e la biotina1,2. Solitamente, la biotina è legame covalente con l'esca (proteina o peptide) e dopo un periodo di incubazione con i lisati cellulari per consentire la creazione di interazioni, l'esca biotinilato associato ai suoi partner intracellulare è tirato con avidina o avidina derivati coniugati con perline di supporto. Quindi, interazioni esca-proteina sono rilevate dopo lavaggio, eluizione e l'analisi di denaturare elettroforesi seguita mediante Western blot. Uno dei problemi di questa tecnica è che le interazioni fra la proteina di interesse e i suoi partner intracellulare si svolgono di fuori del contesto cellulare. Questo è particolarmente importante per le interazioni coinvolte nella trasduzione del segnale perché si svolgono in luoghi intracellulari specifici, essi sono transitori e si svolgono in genere di proteine non abbondanti. Di conseguenza, all'interno i lisati cellulari queste interazioni possono essere mascherate da altre proteine più abbondanti o di proteine che di solito non sono nelle immediate vicinanze.

Cellula-penetrante peptidi (CPPs) sono brevi peptidi (≤ 40 aminoacidi), composti principalmente da aminoacidi cationici che sono in grado di trasportare una vasta gamma di molecole in quasi qualsiasi cella3. Carichi come proteine, DNA del plasmide, siRNA, virus, agenti imaging e varie nanoparticelle stati coniugati alla CPPs e in modo efficiente interiorizzato4,5. A causa di questa capacità di trasporta sono noto anche come settori di trasduzione della proteina (PTDs), membrana dispostamento sequenze (MTSs) e peptidi Trojan. Tra la CPPs, il peptide TAT dalla proteina HIV transactivator TAT6 è stato uno dei più ampiamente studiato 7,8,9. TAT è un nonapeptide contenente 6 arginina e 2 residui di lisina e di conseguenza è altamente cationici. Sostituzione studi hanno dimostrato che la carica positiva netta di TAT è necessaria per interazioni elettrostatiche con le membrane plasmatiche delle cellule eucariotiche e sua successiva internalizzazione10. Allo stesso modo a altri CPPs, TAT caricato positivamente fortemente lega elettrostaticamente alle varie caricati negativamente specie presenti sulla superficie extracellulare delle membrane cellulari, tra cui gruppi di testa del lipido, glicoproteine e proteoglicani3 , 10. i bioattivi carichi trasportati da TAT diventano immediatamente liberi nel citosol per raggiungere loro partner intracellulare.

Qui presentiamo un metodo che combina il TAT CPP con biotina per studiare le interazioni intracellulari. L'obiettivo è quello di progettare esche cellula-penetrante fondendo la biomolecola bersaglio di TAT e di biotina. Il vantaggio principale di questa proposta è che le interazioni tra l'esca e i suoi partner si svolgerà all'interno del contesto cellulare. Per mostrare l'efficacia di questo metodo che abbiamo usato come esca una piccola sequenza della proteina Cx43 che è stato segnalato per interagire intracellulare con il proto-oncogene c-Src11,12,13. Cx43 è una proteina integrale di membrana che è ampiamente espresso in astrocytes14ed è down-regolato in gliomas di prima scelta, il più comune tumore maligno del sistema nervoso centrale15,16,17 ,18. È stato precedentemente dimostrato che la regione di Cx43 che interagisce con c-Src (aminoacidi 266-283 in Cx43 umana; PubMed: P17302) fuse a TAT (TAT-Cx43266-283) inibisce l'attività oncogena di cellule di glioma c-Srcin e cellule staminali di glioma (artigiano)19,20,21. Per progettare l'esca intracellulare, è stata fusa Cx43266-283 di TAT al N-terminale (TAT-Cx43266-283) e di biotina al C-terminale (TAT-Cx43266-283- B). Questa strategia è stata utilizzata con successo nel glioma di ratto linea cellulare C6 per identificare c-Src, c-terminale della chinasi Src (CSK) e fosfatasi e tensin homolog (PTEN) come partner intracellulare di questa regione di Cx4320. Qui, Descriviamo questo metodo di prova la sua efficacia in artigiano umano, che è molto rilevanti per la terapia di glioma, ma molto più difficile a transfect che le cellule staminali non glioma.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso l'Università di Salamanca.

1. cellule

  1. Due giorni prima di iniziare la procedura, piastra le cellule presso la densità necessaria per essere confluenti il giorno dell'esperimento. Piastra le cellule in boccette o piastre. Tuttavia, l'estrazione di proteine sarà più facile dalle piastre. È conveniente da preparare almeno 4 piatti di 78cm2 o 2 boccette di 150 cm2 per condizione per esperimento, per essere sicuri che i risultati sono coerenti.
  2. In questo studio, piastra umano G166 artigiano in 4 boccette di 150 cm2, coltivate in cellule staminali RHB-A supplementato con 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF e b-FGF come descritto da Pollard et al.22. Processo quando è stato raggiunto la confluenza. Per esempio, quando 5 x 106 G166 cellule erano placcate in un pallone da2 di 150 cm, sono state elaborate 2 giorni dopo il placcaggio.

2. biotinilati CPPs

  1. Girare le fiale contenenti il liofilizzato biotinilati CPPs (BCPPs) a 8200 x g per 30 s, per evitare alcune delle polvere rimanente sul coperchio. Includere un controllo BCPP per essere sicuri che le interazioni che si trovano sono specifiche della sequenza di destinazione. In questo studio, il controllo BCPP era TAT-biotina (TAT-B) e il trattamento BCPP era TAT-Cx43266-283- B. Altri controlli potrebbero essere utilizzati, quale TAT frammenti fusi a uova strapazzate o mutato bond a biotina.
  2. Sciogliere il BCPPs nel terreno di coltura corrispondente per la soluzione di riserva indicata dal fabbricante; per esempio, per ottenere una soluzione madre di 2 mg/mL BCPP per trattare artigiano aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura di GSC un flaconcino contenente 1 mg del BCPP. Vortice e assicurarsi che il peptide è ben sciolto.

3. tubi

Nota: Preparare almeno dodici provette da 1,5 mL a condizione necessaria nella sezione 7.

  1. Contrassegnare i primi 3 tubi a condizione. Essi avranno il volume totale dei lisati cellulari ottenuti al punto 6.4.
  2. Contrassegnare una A in 3 provette per condizione. Questi tubi avrà i primi surnatanti ottenuti dopo lisi e filatura lisati cellulari, punto 7.2.
  3. Contrassegnare un B in 3 provette per condizione. Questi tubi avrà una piccola aliquota di surnatanti primi. Questi lisati servirà come i campioni di Western blot al punto 7.3.
  4. Contrassegnare un C a 3 tubi a condizione. Questi tubi sono i surnatanti ottenuti dopo il pull-down con NeutrAvidin, passo 7,7.
    Nota: Questo è importante nel caso in cui il Western blot ha mostrato nessun segnale per le proteine, vale a dire le proteine non sono state tirate o sono stati perse in qualche fase della procedura. Se questa fosse la situazione, ripetere il processo per tirare giù le proteine.

4. cellulare trattamento con il BCPPs

  1. Aspirare il terreno di coltura.
  2. Sostituire il corrispondente volume di terreno nuovo per incubare il BCPPs nel più piccolo volume possibile di mezzo secondo i tempi di incubazione necessaria. È molto importante che in ogni caso, il mezzo copre completamente l'intera superficie del piatto/pallone di modo che le cellule non seccano, per esempio, 6 mL / 150 cm2 per un'incubazione di 30 min.
  3. Aggiungere il volume della soluzione stock di BCPP colture cellulari per raggiungere la concentrazione che ha dimostrata di essere efficace. In questo studio 50 µM TAT-Cx43266-283- B è stato dimostrato per ridurre la proliferazione di GSC.
    1. Di conseguenza, 92,8 µ l di 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) per mL di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Se il volume da aggiungere è diverso per i peptidi di controllo, corredato da terreno di coltura fino allo stesso volume finale. Per esempio, 49,1 µ l TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) plus 43,7 medio di GSC µ l sono stati aggiunti per mL di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 50 µM TAT-B.
  4. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% di CO2 per 30 min per assicurarsi che le interazioni tra il BCPP e i suoi partner intracellulare si svolgono. Se l'interazione richiede più tempo, incubare per tempi più lunghi o regolare i tempi nel caso in cui l'esperimento consisteva di un corso a tempo. Inoltre, l'interazione di interesse può essere promosso o impedita da stimolante diverse vie di segnalazione intracellulare.

5. tamponi e soluzioni.

  1. Preparare PBS pH 7.4: 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.
  2. Preparare il tampone di lisi di proteina: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, prima di utilizzare, aggiungere quanto segue: 1/100 (v/v) Cocktail inibitore di proteasi, 1mm fluoruro di sodio, 1 mM fenilmetanosolfonil fluoruro (PMSF) e 0,1 mM sodio ortovanadato.
  3. Preparare il tampone di Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6.8; 5m glicerolo; 3,7% SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoetanolo o 9 mM DTT; 0,04% (v/v) bromofenolo (BB)).

6. estrazione di proteine

Nota: Estrazione della proteina è stata eseguita come descritto in precedenza20,23. Svolgere questa intera sezione della procedura a 4 ° C.

  1. Aspirare il terreno di coltura completamente.
  2. Lavare 3 x 10 mL di con gelido fosfato tampone salino (PBS) a 150 cm2 con molta attenzione per evitare il distacco delle cellule.
  3. Per ottenere il lysate delle cellule, aggiungere 3 mL di tampone di lisi per 150 cm2 e raschiare accuratamente la superficie utilizzando un raschietto di cella. Inclinazione della piastra/muffola a circa 45 gradi renderà più facile per raccogliere i lisati cellulari in loro provette corrispondenti.
  4. Versare 1 mL di cellulare lisato per tubo in tre provette da 1,5 mL. Questi tubi possono essere evidenziati con la condizione e la replica come indicato al punto 3.1.

7. pull-down

  1. Centrifugare le provette da 1,5 mL a 11.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  2. Trasferire i surnatanti in nuove provette (A).
  3. Prendere una parte aliquota di questo supernatante a condizione per tubi diversi (B), cioè 50 µ l per provetta. Aggiungere 4 x Laemmli tampone (16,6 µ l 50 µ l di lisato) e congelare a-20 ° C. Questi lisati servirà come al solito Western blot campioni.
  4. Omogeneizzare bene NeutrAvidin Agarose mediante agitazione delicata. Tagliare le punte dei puntali per aumentare il loro diametro e migliorare il pipettaggio di perline.
Aggiungere 50 µ l di NeutrAvidin Agarose di lysate nei tubi (A) delle cellule per mL.
  • Incubare a 4 ° C durante la notte con agitazione molto delicata per consentire NeutrAvidin interagire con BCPPs associato ai loro partner intracellulare.
  • Centrifugare a 3.000 x g per 1 min a 4 ° C per raccogliere il complesso di NeutrAvidin con proteine.
  • Rimuovere i surnatanti delicatamente e trasferirli al pulito tubi (C). Tenerli per utilizzarli nel caso in cui il pull-down non è riuscito.
  • Fasi di lavaggio: aggiungere tampone di lisi fresco per i pellet (tubi A), risospendere capovolgendo e ripetere i passaggi 7,6) e 7,7) per altre 5 volte. Tutti questi surnatanti possono essere scartati.
  • Rimuovere i surnatanti e aggiungere 2 x Laemmli tampone al volume finale desiderato (40 µ l in ogni provetta da 1,5 mL per pellets ottenuti da 150 cm2 fiaschi di cellule confluenti).
  • Eluire a 100 ° C per 5 min dissociare le interazioni tra proteine e centrifugare per 30 s a 8.200 x g a pellet NeutrAvidin perline.
  • Prendere i surnatanti, contenenti le proteine dissociate, con punte di capillare in nuove provette (D). Le perline possono essere tenute in caso di ripetuti passaggi di eluizione è richiesto.
    Nota: I surnatanti (tubi D) sono ora pronti per essere caricati in Western blot o per congelare a-20 ° C.

    • 8. Western Blot

    Nota: Macchiare occidentale è stato effettuato come descritto in precedenza24.

    1. Volume equivalente di ogni campione per corsia il Bis-Tris (4-12%) midigels in un sistema di elettroforesi di Midi-cella di carico.
    2. Transblot proteine usando un sistema assorbente asciutto in una pila di regolari di nitrocellulosa.
    3. Macchia la membrana con 10% Ponceau per 10 min.
    4. Lavare le membrane 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.
    5. Bloccare le membrane con 7% latte in Immunotyping per 1 h con agitazione delicata in tubi o piccole scatole. Assicurarsi che il volume utilizzato è sufficiente a coprire le membrane e che essi non a secco, cioè 40 mL / membrana intera midi.
    6. Lavare 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.
    7. Incubare per una notte a 4 ° C con l'anticorpo primario contro la proteina di interesse con agitazione delicata.
    8. Lavare 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.
    9. Incubare la membrana a temperatura ambiente con il corrispondente anticorpo coniugato perossidasi secondario in Immunotyping per 1 h.
    10. Lavare 3 x 5 min con 5 mL di Immunotyping.
    11. Sviluppare con un substrato chemiluminescente in un sistema di chemiluminescenza.

    9. risoluzione dei problemi

    1. Se dopo aver sviluppato il Western blot uno qualsiasi dei campioni ha mostrati nessun segnale a tutti per le proteine, controllare il Ponceau.
      Nota: La membrana in Ponceau dovrebbe mostrare indefinita e numerose bande musicali lungo le corsie caricato. Se le fasce non sono molto evidenti, la quantità di proteine caricato potrebbe non essere sufficiente o il trasferimento potrebbe essere andato in modo non corretto. Considera ripetendo il Western blot.
    2. Se non c'è nessuna macchia affatto nella membrana Ponceau in qualsiasi corsia, ripetere l'intera procedura dal passo 7.4 nei tubi (C).
    3. Se dopo aver sviluppato il Western blot un segnale di proteina è molto debole ma il Ponceau ha mostrato proteine, incubare nuovamente la membrana con l'anticorpo primario per più tempo. Se il segnale è ancora piuttosto debole, incubare nuovamente a temperatura ambiente.

    10. altre tecniche usate in questo articolo

    1. Immunocitochimica di BCPPs
      1. Difficoltà cellule in paraformaldeide al 4% (0,2 mL / cm2) per 20 min.
      2. Lavare 3 x 5 min con PBS (0,2 mL / cm2).
      3. Applicare l'anticorpo corrispondente (almeno 0,15 mL / cm2) diluito in soluzione di anticorpo alla concentrazione indicata dal produttore contro la proteina di interesse durante la notte a 4 ° C.
      4. Incubare con un anticorpo secondario coniugato fluoroforo (0,15 mL / cm2) per 2 h a temperatura ambiente.
      5. Ripetere i passaggi 10.1.2-10.1.4 con altri anticorpi contro vostre proteine di interesse. Fare attenzione a non utilizzare la stessa specie per diversi anticorpi primari o stessa lunghezza d'onda fluorofori per anticorpi secondari.
      6. Montare le celle utilizzando il reagente antifade (0,005 mL / cm2).
      7. Analizzare il microscopio a fluorescenza collegato a una fotocamera digitale.
    2. Analisi di MTT
      1. Coltura le cellule a 37 ° C nelle piastre da 24 pozzetti.
      2. Incubare le cellule al buio per 75 min con 0,15 mL di terreno di coltura per cm2 contenente 0,5 mg/mL MTT.
      3. Aspirare il mezzo e incubare le cellule per 10 min al buio con solfossido dimetilico (0,25 mL / cm2) con lieve agitazione.
      4. Misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

    Representative Results

    Prima di utilizzare BCPPs per studiare l'interazione intracellulare, è fondamentale per confrontare gli effetti di BCPP vs CPP per convalidare i risultati ottenuti con BCPP. Di conseguenza, per studiare se l'inclusione di biotina modifica l'attività della sequenza dell'obiettivo, abbiamo prima analizzato l'effetto di TAT-Cx43266-283- B rispetto con TAT-Cx43266-283 sulla morfologia G166 artigiano. A tale scopo, abbiamo effettuato alcune analisi di immunofluorescenza di due proteine del citoscheletro, F-actina e α-tubulina dopo 24 h di trattamento. La figura 1 Mostra che G166 artigiano in presenza di 50 µM TAT-Cx43266-283 o TAT-Cx43266-283- B acquisire una forma più arrotondata rispetto ai prolungamenti cellulari allungati ed espansi mostrati nei controlli (TAT o TAT-B). Infatti, la Figura 1b Mostra che i filamenti dell'actina sono principalmente assemblati come reti di actina quando le cellule sono state trattate con TAT-Cx43266-283 o TAT-Cx43266-283- B mentre formano più fasci di actina nelle cellule di controllo (trattati con TAT o TAT-B)25. Al contrario, la distribuzione di α-tubulina non variare tra le diverse condizioni. Questi risultati hanno mostrato che la presenza di biotina non ha modificato l'effetto della sequenza dell'obiettivo sulla morfologia del G166 artigiano. In precedenti studi20,21, abbiamo mostrato che TAT-Cx43266-283 ridotta proliferazione G166 artigiano. In questo studio, abbiamo studiato se TAT-Cx43266-283- B esercita gli stessi effetti della crescita come TAT-Cx43266-283. A tale scopo, abbiamo analizzato la proliferazione di G166 artigiano dall'analisi di MTT dopo 72 h del trattamento. L'analisi di MTT è un saggio colorimetrico per valutare l'attività metabolica delle cellule. MTT è metabolizzato dagli enzimi ossidoriduttasi di NAD (P) H in mitocondri che riflette il numero di cellule vitali presenti. La figura 2 Mostra che la riduzione l'attuabilità delle cellule G166 artigiano non è significativamente diversa quando le cellule sono state trattate con 50 µM TAT-Cx43266-283 o 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Infatti, entrambi significativamente diminuita proliferazione G166 artigiano rispetto al controllo, TAT o TAT-B.

    Una volta abbiamo confermato che l'effetto della nostra sequenza di destinazione in G166 artigiano (TAT-Cx43266-283) non è stato modificato tramite l'inclusione di biotina al C-terminale (TAT-Cx43266-283- B), abbiamo studiato i partner intracellulari di questa sequenza seguendo il protocollo descritto in questo studio (Figura 3). Perché caveolae sono stati coinvolti nel meccanismo di TAT interiorizzazione26, abbiamo analizzato la presenza di caveolin-1 (Cav-1) nel pull-down. L'analisi Western blot (Figura 4) ha mostrato che TAT-B e TAT-Cx43266-283- B interagire con Cav-1. Tuttavia, la capacità di TAT-Cx43266-283- B per l'assunzione di c-Src, PTEN e CSK è più forte di quello trovato con TAT-B. Chinasi focale di adesione (FAK) è un substrato del c-Src che non è stato dimostrato interagire con Cx43. Infatti, FAK non ha mostrato alcuna significativa interazione con TAT-B o TAT-Cx43266-283- B.

    Per confermare l'interazione tra TAT-Cx43266-283- B e c-Src, artigiano G166 sono state incubate con 50 µM TAT-Cx43266-283- B per 30 min e la loro localizzazione è stata seguita con streptavidina fluorescente mediante microscopia confocale (Figura 5 ). I nostri risultati hanno mostrato che la distribuzione intracellulare di TAT-Cx43266-283- B è vicino alla membrana plasmatica (mostrata dalla macchiatura fosfatidilserina) e corrisponde a quella di c-Src. Infatti, le analisi di co-localizzazione hanno rivelato alcuni punti di co-localizzazione (bianco) tra TAT-Cx43266-283- B e c-Src dell'immagine di tipo merge. Di conseguenza, gli studi di microscopia confocale confermano i risultati ottenuti con il protocollo di discesa BCPP descritto in questo studio.

    Figure 1
    Figura 1: Effetto di BCPP e CPP sulla morfologia di GSC.
    G166 artigiano erano cromate a una bassa densità (2 x 104 cellule / cm2) e dopo 24 ore che sono state incubate con controllo di 50 µM CPP (TAT), controllo BCPP (TAT-B), trattamento CPP (TAT-Cx43266-283) o trattamento BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-actina (rosso), α-tubulina (verde) e unite + DAPI immunostaining del campo stesso, mostrando G166 artigiano morfologia. Bar = 50 µm. b)-F-actina immunostaining mostrando la diversa distribuzione di F-actina in G166 artigiano dopo incubazione per 24 h con 50 µM CPP (TAT) di controllo o controllo BCPP (TAT-B) rispetto al trattamento di 50 µM CPP (TAT-Cx43266-283) o BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). Bar = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 2
    Figura 2: Effetto di BCPP e CPP sulla vitalità di GSC.
    G166 artigiano erano placcato a 5500 cellule/cm2 a 24 pozzetti piastre e incubati con peptidi controllo a 50 µM, CPP (TAT) o BCPP (TAT-B), o 50 µM trattamento peptidi, CPP (TAT-Cx43266-283) o BCPP (TAT-Cx43266-283- B). L'attuabilità delle cellule è stata analizzata usando un'analisi MTT dopo 72 h. I risultati vengono espressi come assorbanza MTT e sono la media ± s.e.m. di almeno 3 esperimenti (+ + p˂0.01 vs controllo. * * p˂0.01, * * * p˂0.001 contro TAT o TAT-B; post-test withTukey di One-way ANOVA). Si noti che non ci sono differenze significative tra gli effetti di CPPs vs BCPPs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 3
    Figura 3: Schema di protocollo.
    Descrizione passo per passo grafica della procedura come descritto nella sezione "Protocollo", dall'incubazione di BCPPs fino a quando il BCPPs eluiti e le loro proteine interagenti erano obtained.1) Incubare le cellule di cultura con BCPPs alla concentrazione desiderata per il tempo richiesto. 2) durante l'incubazione, i BCPPs sono interiorizzati e interagiscono con i loro partner intracellulare. 3) lavare le cellule tre volte sul ghiaccio con PBS ghiacciata. 4) lisare le cellule per estrarre le proteine. 5) trasferimento lisati cellulari ai tubi.6) girare a 11000 x g per 10 min a 4 ° C. 7) trasferimento i surnatanti di nuovi tubi (A) e mantenere una piccola aliquota dei lisati per elaborare come regolare Western blot campioni in tubo (B). 8) Risospendere le perline di NeutrAvidin Agarose e aggiungere 50 µ l in ogni provetta un'utilizzando un puntale di taglio. 9) Incubare con delicatamente agitazione per 12 h a 4 ° C per consentire le perline di agarosio NeutrAvidin per interagire con gli BCPPs e i loro partner. 10) spin per 1 min a 3000 x g per appallottolare le perline con il biotinilati esche e le loro proteine interagenti ad essi associati. 11) trasferire i surnatanti in nuove provette (C) e tenerli da utilizzare nel caso in cui il pull-down devono essere ripetute. 12) lavare la pallina cinque volte con tampone di lisi fresco, risospendere capovolgendo, spin per 1 min a 3000 x g e scartare il surnatante. 13) rimuovere con attenzione tutto il supernatante. 14) aggiungere il volume desiderato di 4x Laemmli buffer ed eluire le proteine a 100 ° C per 5 min 15) Spin a 8200 x g per 30 s a pellet le perline. 16) trasferire le proteine eluite trovate nel surnatante con capillare suggerimenti per nuovi tubi (D). 17) caricare sul gel per l'analisi Western blot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 4
    Figura 4: Studio delle interazioni intracellulari di TAT-Cx43266-283- B in G166 artigiano di discesa seguita mediante Western blot.
    G166 artigiano sono stati incubati con 50 µM TAT-B o TAT-Cx43266-283- B. Dopo 30 min, le cellule sono state lisate e TAT-B o TAT-Cx43266-283- B allegata ai loro partner intracellulare sono stati tirati con perline NeutrAvidin. Le proteine eluite sono state caricate e analizzate mediante Western blot per studiare i livelli di FAK, c-Src, CSK, PTEN e Cav-1. Nota che Cav-1 interagisce con entrambi TAT-B e TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN e CSK interagire preferenzialmente con TAT-Cx43266-283- B e FAK non ha mostrato alcuna interazione con TAT-B o TAT-Cx43266-283-B. per favore Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 5
    Figura 5: Conferma delle interazioni intracellulari -B266-283TAT-Cx43 in G166 artigiano mediante microscopia confocale.
    G166 artigiano sono stati incubati con 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Dopo 30 min, le cellule erano fissi e trattate per localizzare TAT-Cx43266-283- B con Cy2-streptavidina (verde), c-Src di immunofluorescenza (rosso) e fosfatidilserina con Annessina V (blu). Nota: alcuni punti di co-localizzazione (bianco) tra TAT-Cx43266-283- B e c-Src vicino alla membrana del plasma delle immagini di tipo merge. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Discussion

    Ci sono molti metodi per studiare le interazioni proteina-proteina. Il metodo presentato in questo studio si basa sul sistema ampiamente usato biotina-avidina menu a tendina in cui un'esca biotinilati viene incubata con lisati cellulari per consentire la creazione di interazioni. La modifica ha presentata in questo studio include la combinazione di questa tecnica con sequenze di cellula-penetrante. Ci proponiamo di progettare esche cellula-penetrante che possono essere incubati con cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto le interazioni trovate rifletterà coloro che si sono verificati all'interno del contesto cellulare.

    Qui usiamo TAT come la sequenza di cellula-penetrante, biotina, come il tag di discesa e la regione di Cx43 compresa tra aminoacidi 266-283 come destinazione per trovare interazioni intracellulari in artigiano umano. La base strutturale per l'interazione tra Cx43 e c-Src è ben noto11,12. Si tratta di un'importante interazione perché inibisce l'attività oncogena di c-Src in cellule glioma24,13. Infatti, CPPs contenente questa regione (TAT-Cx43266-283) imitano le proprietà antioncogenic di Cx43 il glioma cellule19,20,21. In cellule C6 glioma di ratto, il meccanismo da cui TAT-Cx43266-283 inibisce c-Src include l'assunzione di c-Src insieme ai relativi inibitori endogeni CSK e PTEN20. Va ricordato che artigiano è molto interessante come destinazione in terapia glioma, perché costituiscono una sottopopolazione resistente ai trattamenti convenzionali e pertanto responsabile per la ricorrenza di questo di tumori cerebrali maligni27. Inoltre, essi sono difficili a transfect cellule e pertanto lo studio delle interazioni intracellulari diventa più difficile. CPPs sono interiorizzati rapidamente ed efficientemente all'artigiano19 favorendo il loro uso per lo studio delle interazioni intracellulari. In questo studio, utilizzando CPPs fusa alla biotina confermiamo l'interazione della sequenza266-283 Cx43 con c-Src insieme ai suoi inibitori endogeni CSK e PTEN in artigiano umano.

    Questo metodo è molto potente per studiare il meccanismo intracellulare di molecole bioattive. Tuttavia, è molto importante confermare che l'effetto biologico dell'esca penetrante biotinilati cella non è diverso da quello ottenuto con la non-biotinylated uno. Questo passaggio è necessario per associare le interazioni trovate con l'effetto del composto bioattivo. Inoltre, la stabilità del composto, sua eventuale degradazione da proteasi, come pure la sua tossicità possibile, dovrebbe essere attentamente testata e presa in considerazione prima di pianificare l'esperimento. Nell'esempio presentato, l'effetto anti-proliferativo di TAT-Cx43266-283 su G166 artigiano umano è stato precedentemente documentati20. In questo studio, confermiamo che l'effetto anti-proliferativo di TAT-Cx43266-283- B e di TAT-Cx43266-283 è molto simile. Inoltre, l'analisi della morfologia cellulare ha rivelato quello α-tubulina e la distribuzione di F-actina è molto simile a artigiano G166 trattati con TAT-Cx43266-283- B o con TAT-Cx43266-283. Complessivamente, questi risultati indicano che l'inclusione di biotina al c-terminale di TAT-Cx43266-283 non ha modificato gli effetti di questo composto su artigiano umano. Tuttavia, se biotina sarebbe modificare gli effetti della molecola bioattiva, altri tag per la purificazione della proteina può essere testato, come la bandiera octapeptide (DYKDDDDK)28, il tag di emoagglutinina-derivato influenza umana HA (YPYDVPDYA) o glutatione S-transferasi (GST)29. Allo stesso modo, se TAT non come target la popolazione delle cellule di interesse, altri cellulari sequenze penetrante, come penetratin, MPG (per una rassegna, Vedi30) o delle cellule specifiche sequenze possono essere usate31.

    Oltre a studio di proteine che interagiscono specificamente con la sequenza di destinazione, idealmente, dovrebbe essere la presenza di proteine che interagiscono con il controllo e la sequenza di destinazione e proteine che non interagire con essi, come controlli positivi e negativi, indirizzata. In questo senso, abbiamo trovato Cav-1 nel controllo e trattato la situazione, suggerendo che le caveole sono stati coinvolti nel meccanismo di internalizzazione, come è stato precedentemente dimostrato26. Inoltre, FAK, che interagisce con c-Src, ma si suppone di non per interagire con il c-terminale di Cx43, era assente in situazione trattata sia il controllo. Questi risultati rinforzano la specificità dell'interazione tra TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK e PTEN. Per confermare i risultati ottenuti con questo protocollo, la microscopia confocal può essere utilizzata per visualizzare la distribuzione delle proteine interagenti e per studiare la loro co-localizzazione. Quindi, abbiamo trovato quella TAT-Cx43266-283- B e c-Src Mostra una distribuzione intracellulare simile con alcuni punti di co-localizzazione confermando i risultati ottenuta con gli esperimenti di pull-down. In effetti, TAT-Cx43266-283- B è distribuito vicino alla membrana del plasma, suggerendo che il carico, in questo studio Cx43266-283, dirige la molecola ai suoi partner intracellulare.

    Uno dei limiti del metodo proposto è che la molecola utilizzata come esca potrebbe non riuscire a piegare correttamente e gli effetti attesi non sarebbero stati trovati. In questo caso, le interazioni trovate non potevano essere associate all'effetto. Tuttavia, questo metodo può essere particolarmente interessante per le interazioni coinvolte nella trasduzione del segnale, perché esse sono di solito effettuate da regioni intrinsecamente disordinati32 e pertanto non richiedono un ripiegamento ordinato. Inoltre, uno dei vantaggi del metodo proposto è che può essere seguito il corso di tempo dell'interazione, che è particolarmente rilevante per le interazioni transienti. Inoltre, la rilevanza di ogni residuo sull'interazione possa essere facilmente studiata. Infatti, è possibile studiare la rilevanza delle modifiche di posttranslational su interazione proteina-proteina, per esempio, dalla sostituzione di phosphomimetic di glutammato per serina o treonina. Allo stesso modo, la sostituzione di serina o treonina per l'alanina o tirosina per fenilalanina consente di testare l'effetto di non fosforilabile serina, treonina o tirosina.Per simulare la fosfo-tirosina, il modo più accurato è la sostituzione di Tyr per p-Tyr33.

    Infine, il campo di applicazione del presente protocollo è ben di là di interazione proteina-proteina, perché questo sistema può essere applicato a altri carichi bioattivi come sequenze di RNA, nanoparticelle, virus o altre molecole che possono essere fuse alla biotina e trasdotte con CPP per studiare il loro meccanismo intracellulare di azione.

    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Acknowledgments

    Ringraziamo M. Morales e J. Bravo per il loro aiuto con il design della CPPs e J.C. Arévalo per il suo aiuto con il protocollo di discesa. Siamo grati per l'assistenza tecnica di T. del Rey. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economía y Competitividad, Spagna; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spagna; SA026U16 FEDER e Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez e A. González-Sánchez sono destinatari di una borsa di studio dalla Junta de Castilla y León e il Fondo sociale europeo.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    G166 GSC line BioRep
    RHB-A stem cell medium Takara Y40001
    Laminin Mouse Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 23017-015 10 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17504-044 2%
    N-2 Supplement (100x) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17502-048 1%
    Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15 20 ng/ml
    Recombinant Human b-FGF Peprotech AF-100-18B 20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    Accutase Sigma A6964
    Cryostor CS10 cryopreservation medium StemCell Technologies 7930
    TAT GenScript - Custom made
    TAT-B GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283 GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283-B GenScript - Custom made
    Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737 1/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibody Sigma-Aldrich T9026 1/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose ThermoFisher Scientific 29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free Calbiochem, Bionova 539134 1/100 (v/v)
    Sodium Fluoride PanReac AppliChem 141675 1 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 1 mM
    Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 0.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . 1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System Life Technologies, ThermoFisher Scientific WR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% Life Technologies, ThermoFisher Scientific WG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0001 1X
    NuPAGE Transfer Buffer 20x Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0006 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water Sigma P7170
    FAK polyclonal rabbit antibody Life Technologies, ThermoFisher Scientific AHO0502 1/500
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Csk polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 4980 1/500
    PTEN polyclonal mouse antibody Cell Signalling (WERFEN) 9552 1/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody Abcam ab2910 1/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 1/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology SC-2030 1/5000
    Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A11029 1/1000
    Cy2-conjugated streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-220-089 1/500
    MicroChemi Luminescence system DNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific V13241 1/500
    SlowFade Gold antifade reagent Life Technologies, ThermoFisher Scientific S36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) Honeywell 41641-1L
    Appliskan 2001 Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

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    References

    1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
    2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
    3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
    4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
    5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
    6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
    7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
    8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
    9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
    10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
    11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
    12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
    13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
    14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
    15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
    16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
    17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
    18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
    19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
    20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
    21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).
    22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
    23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
    24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
    25. Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).
    26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
    27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
    28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
    29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
    30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
    31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
    32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
    33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

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    Jaraíz-Rodríguez, M., González-Sánchez, A., García-Vicente, L., Medina, J. M., Tabernero, A. Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (130), e56457, doi:10.3791/56457 (2017).

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