Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56457
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

Summary

Detta är ett protokoll att studera intracellulära protein-protein interaktioner baserat på biotin-metoden nedrullningsbara systemet med nyheten att kombinera cell-penetrerande sekvenser. Den största fördelen är att sekvensen mål inkuberas med levande celler istället för cell lysates och därför interaktioner sker inom ramen för cellulära.

Abstract

Här presenterar vi ett protokoll för att studera intracellulära protein-protein interaktioner som baseras på allmänt använda biotin-metoden nedrullningsbara systemet. Den ändring som presenteras omfattar kombinationen av denna teknik med cell-penetrerande sekvenser. Vi föreslår att utforma cell-penetrerande beten som kan inkuberas med levande celler istället för cell lysates och därför de interaktioner som hittade kommer att återspegla de som uppstår inom ramen för intracellulära. Connexin43 (Cx43), ett protein som bildar gap junction kanaler och hemichannels är ned-reglerade i höggradigt gliom. Regionen Cx43 bestående av aminosyror 266-283 ansvarar för hämning av onkogena aktiviteten av c-Src i glioma celler. Här använder vi TAT som cell-penetrerande sekvens, biotin som taggen nedrullningsbara och regionen av Cx43 mellan aminosyror 266-283 som mål att hitta intracellulära interaktioner i hård-till-transfect mänskliga glioma stamcellerna. En av begränsningarna i den föreslagna metoden är att molekylen används som bete kan misslyckas att vika ordentligt och, följaktligen, de interaktioner som hittade inte kunde associeras med effekten. Dock kan denna metod vara särskilt intressant för interaktionerna som är inblandade i cellsmedierade reaktioner eftersom de utförs oftast av egensäkra oordnade regioner och, därför de inte kräver en ordnad vikning. En av fördelarna med den föreslagna metoden är dessutom att relevansen av varje rester på interaktionen kan studeras enkelt. Detta är ett modulärt system; Därför kan andra cell-penetrerande sekvenser, andra taggar och andra intracellulära mål vara anställd. Slutligen, omfattningen av detta protokoll är långt bortom protein-protein interaktioner eftersom detta system kan tillämpas på andra bioaktiva laster såsom RNA sekvenser, nanopartiklar, virus eller någon molekyl som kan vara sensorik med cell-penetrerande sekvenser och smält till pull-down-taggar för att studera deras intracellulära verkningsmekanism.

Introduction

Protein-protein interaktioner är väsentliga för en stor variation av cellulära processer. För att fullt förstå dessa processer, krävs metoder för att identifiera proteininteraktioner inom komplexa intracellulära miljön. En av de mest använda metoderna att identifiera interaktion partner av ett protein är att använda det proteinet eller en mimetisk peptid av en del av det proteinet som bete i affinitet nedrullningsbara experiment följt av upptäckt av bindande proteiner. Avidinen-biotin systemet används ofta på grund av hög affinitet, specificitet och stabil samverkan mellan avidinen och biotin1,2. Vanligtvis, biotin är kovalent bundna till betet (protein eller peptid) och efter en inkubation med den cell lysates att möjliggöra upprättandet av interaktioner, biotinylerade betet bunden till dess intracellulära partner dras ned med avidinen eller avidinen derivat konjugerat med stöd pärlor. Sedan, bete-protein interaktioner upptäcks efter tvätt, eluering och analys av denaturering elektrofores följt av Western blot. Ett av problemen med denna teknik är att samspelet mellan proteinet av intresse och dess intracellulära partner pågår utanför ramen för cellulära. Detta är särskilt viktigt för interaktionerna som är inblandade i cellsmedierade reaktioner eftersom de sker i specifika intracellulära platser, de är övergående och de utförs vanligtvis av inte riklig proteiner. Därför, inom den cell lysates dessa interaktioner kan maskeras av andra mer riklig proteiner eller av proteiner som vanligen inte är i närheten.

Cell-penetrerande peptider (CPPs) är kort peptider (≤40 aminosyror), består mestadels av katjoniska aminosyror som klarar av att transportera ett brett utbud av molekyler i nästan varje cell3. Laster såsom proteiner, plasmid DNA, siRNA, virus, imaging ombud och olika nanopartiklar har varit konjugerat till CPPs och effektivt internaliserade4,5. På grund av detta transporterar förmåga är de även känd som protein transduktion domäner (PTDs), membran translocating sekvenser (MTSs) och Trojan peptider. Bland CPPs, TAT peptiden från proteinet HIV transactivator TAT6 har varit en av de mest studerade 7,8,9. TAT är en nonapeptide som innehåller 6 Arginin och 2 lysin rester och är följaktligen mycket katjoniska. Substitution studier har visat att den positiva nettoladdningen av TAT är nödvändigt för elektrostatisk interaktioner med plasma membran av eukaryota celler och dess efterföljande internalisering10. Likaså till andra CPPs binder positivt laddade TAT starkt elektrostatiskt till olika negativt laddade arten som finns på extracellulära ytan av cellmembran, inklusive lipid huvud grupper, glykoproteiner och proteoglykaner3 , 10. de bioaktiva laster som transporteras av TAT bli omedelbart gratis i cytosolen att nå deras intracellulära partners.

Här presenterar vi en metod som kombinerar TAT CPP med biotin att studera intracellulära interaktioner. Syftet är att utforma cell-penetrerande beten av fusing den målet biomolecule TAT och biotin. Den största fördelen med detta förslag är att samspelet mellan betet och dess partners kommer att äga rum inom dess cellulära sammanhang. Att visa effekten av denna metod som vi använt som AGN en liten sekvens av proteinet Cx43 som har rapporterats interagera intracellulärt med proto-onkogener c-Src11,12,13. Cx43 är en integrerad membranprotein som uttrycks ofta i astrocyterna14och är ned-reglerade i höggradigt gliom, den vanligaste maligna tumören av centrala nervsystemet15,16,17 ,18. Har man tidigare visat att regionen Cx43 som samverkar med c-Src (aminosyror 266-283 i mänskliga Cx43; PubMed: P17302) smält till TAT (TAT-Cx43266-283) hämmar onkogena aktiviteten av c-Srcin glioma celler och gliom stamceller (GSCs)19,20,21. För att designa den intracellulära beten, Cx43266-283 har smält till TAT vid N-terminalen (TAT-Cx43266-283) och biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283- B). Denna strategi har använts framgångsrikt i den råtta gliom C6 cellinje för att identifiera c-Src, c-terminal-Src kinase (CSK) och fosfatas och Tenzin homolog (PT) som intracellulära partner i denna region i Cx4320. Här, beskriver vi denna metod testar dess effektivitet i mänskliga GSCs, som är mycket relevanta för gliom terapi men mycket svårare att transfect än icke-stammen glioma celler.

Protocol

Alla experimentella rutiner genomfördes på universitetet i Salamanca.

1. celler

  1. Två dagar innan du startar proceduren, tallrik cellerna på att krävs densitet är konfluenta dagen av experimentet. Platta celler i kolvar eller plattor. Men blir protein utvinning lättare från plattorna. Det är bekvämt att förbereda minst 4 plattor av 78 cm2 eller 2 kolvar 150 cm2 per tillstånd per experiment, vara säker på att resultaten är konsekventa.
  2. I denna studie tallrik mänskliga G166 GSCs i 4 kolvar 150 cm2, odlade i RHB-A stamceller medium kompletteras med 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF och b-FGF som beskrivs av Pollard et al.22. Processen när sammanflödet nåddes. Exempelvis när 5 x 106 G166 celler var klädd i en 150 cm2 kolv, bearbetades de 2 dagar efter bordläggningen.

2. biotinylerade CPPs

  1. Snurra de injektionsflaskor innehållande den frystorkade biotinylerade CPPs (BCPPs) vid 8200 x g i 30 s, att undvika några av pulvret kvar på locket. Inkludera en kontroll BCPP att vara säker på att de interaktioner som hittade är specifika för sekvensen mål. I denna studie var kontrollen BCPP TAT-biotin (TAT-B) och behandling BCPP TAT-Cx43266-283- B. Andra kontroller kan användas, såsom TAT smält till äggröra eller muterade fragment bond att biotin.
  2. Lös upp BCPPs på motsvarande kultur medellång stamlösning anges av tillverkaren. exempelvis för att få en stamlösning av 2 mg/mL BCPP att behandla GSCs lägga till 0,5 mL av GSC odlingsmedium i en injektionsflaska innehåller 1 mg av BCPP. Vortex och kontrollera peptiden är väl upplöst.

3. rör

Obs: Förbered minst tolv 1,5 mL tuber per tillstånd som krävs i avsnitt 7.

  1. Markera de första 3 tuberna per tillstånd. De kommer att ha den totala volymen av cellulära lysates erhölls i steg 6,4.
  2. Markera ett A i 3 tuber per tillstånd. Dessa rör måste första supernatanterna erhållits efter lyseringslösning och spinning den cellulära lysates, steg 7,2.
  3. Markera ett B i 3 tuber per tillstånd. Dessa rör kommer att ha en liten alikvot av första supernatanterna. Dessa lysates kommer att fungera som Western blot proverna i steg 7,3.
  4. Markera en C i 3 tuber per tillstånd. Dessa rör måste supernatanterna erhålls efter den pull-down med NeutrAvidin, steg 7,7.
    Obs: Detta är viktigt i fall Western blot visade ingen signal för proteiner, som betyder proteinerna revs inte eller försvann på några steg i proceduren. Om detta vore situationen, upprepa processen att dra ner proteiner.

4. cellulära behandling med BCPPs

  1. Aspirera odlingssubstratet.
  2. Ersätta motsvarande volym av färskt medium krävs att ruva på BCPPs i den minsta möjliga mängden medium enligt inkubationstider. Det är mycket viktigt att i varje fall medium täcker helt hela ytan av plattan/kolven så att cellerna inte torkar ut, exempelvis 6 mL per 150 cm2 för en 30 minuters inkubation.
  3. Lägga till volymen stamlösning bcpp cellkulturer till koncentration som har visat sig vara effektiva. I denna studie 50 µM TAT-Cx43266-283har -B visat sig minska GSC spridning.
    1. Därför lägga till 92,8 µL av 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) per mL odlingsmedium att erhålla en slutlig koncentration på 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Om volymen som ska läggas till är olika för kontroll peptider, komplett med odlingsmedium upp till samma slutliga volym. Exempelvis 49,1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) plus 43,7 µL GSC medium lades per mL odlingsmedium att erhålla en slutlig koncentration på 50 µM TAT-B.
  4. Placera cellerna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för 30 min för att se till att samspelet mellan BCPP och dess intracellulära partner tar plats. Om samspelet tar längre tid, Inkubera under längre tider eller justera gånger ifall experimentet bestod av en tid-kurs. Växelverkan av intresse kan dessutom främjas eller förhindras genom att stimulera olika intracellulära signalsystem.

5. buffertar och lösningar.

  1. Förbereda fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4: 136 mM NaCl. 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.
  2. Förbereda protein lyseringsbuffert: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, Prior för att använda, Lägg till följande: 1/100 (v/v) proteas hämmare Cocktail, 1 mM natriumfluorid, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) och 0,1 mM natrium orthovanadate.
  3. Förbereda Laemmli buffert: (4 x: 0.18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glycerol; 3,7% SDS (p/v), 0,6 M β-merkaptoetanol eller 9 mM DTT; 0,04% (v/v) bromofenolblått (BB)).

6. protein utvinning

Obs: Protein extraktionen utfördes som tidigare beskrivits20,23. Genomföra detta hela avsnitt av förfarandet vid 4 ° C.

  1. Aspirera odlingssubstratet helt.
  2. Tvätta 3 x 10 mL med iskall fosfat buffrad saltlösning (PBS) per 150 cm2 mycket noggrant för att undvika cell avlossning.
  3. För att få en cell lysate, tillsätt 3 mL lyseringsbuffert per 150 cm2 och grundligt skrapa ytan genom att använda en cell-skrapa. Luta plattan/kolven till ca 45 grader blir lättare att samla den cellen lysates i deras motsvarande rör.
  4. Häll 1 mL av cellulära lysate per rör i tre 1,5 mL rör. Dessa rör markeras med skick och replikera som anges i steg 3.1.

7. pull-down

  1. Centrifugera 1,5 mL tuberna på 11 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
  2. Överföra supernatanterna till nya rör (A).
  3. Ta en alikvot av denna supernatanten per tillstånd till olika tuber (B), dvs 50 µL per rör. Lägga till 4 x Laemmli buffert (16,6 µL för 50 µL av lysate) och frysa vid-20 ° C. Dessa lysates kommer att fungera som vanligt Western blot prover.
  4. Homogenisera mycket väl NeutrAvidin Agarose genom mild omskakning. Skär tips av de pipett-tips för att öka deras diameter och förbättra den pipettering av pärlor.
Tillsätt 50 µL av NeutrAvidin agarosen per mL cell lysate i (A) rören.
  • Inkubera vid 4 ° C över natten med mycket mild skakar för att tillåta NeutrAvidin att interagera med BCPPs bundna till sina intracellulära partners.
  • Centrifugera vid 3 000 x g för 1 minuter vid 4 ° C att samla in komplexet av NeutrAvidin med proteiner.
  • Försiktigt bort supernatanterna och överföra dem till rena rör (C). Hålla dem för att använda dem om nedrullningsbara inte är framgångsrika.
  • Tvätt steg: lägga till färska lyseringsbuffert till pellets (rör A), Omsuspendera genom inversion och upprepa steg 7,6) och 7,7) för 5 gånger. Alla dessa supernatanterna kan kasseras.
  • Ta bort supernatanterna och lägga till 2 x Laemmli buffert till önskad slutlig volym (40 µL per 1,5 mL rör för pellets från 150 cm2 kolvar konfluenta celler).
  • Eluera vid 100 ° C för 5 min att sära på interaktioner mellan proteiner och Centrifugera i 30 s vid 8 200 x g till pellet NeutrAvidin pärlor.
  • Ta supernatanterna, som innehåller de separerade proteinerna, med kapillär tips till nya rör (D). Pärlorna kan hållas ifall upprepande eluering steg krävs.
    Obs: Supernatanterna (rör D) är nu redo att lastas i Western blot eller att frysa vid-20 ° C.

    • 8. Western Blot

    Obs: Western blotting utfördes som tidigare beskrivits24.

    1. Ladda motsvarande volym av varje prov per körfält på Bis-Tris (4-12%) midigels i en Midi-Cell Electrophoresis System.
    2. Transblot proteiner med hjälp av en torr blotting system till en nitrocellulosa regelbundna stack.
    3. Fläcken membranet med 10% Ponceau i 10 min.
    4. Tvätta membranen 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    5. Blockera membran med 7% mjölk i TTBS för 1 h med milda skakningar i rören eller små lådor. Kontrollera volymen används är tillräckligt för att täcka membran och att de inte torkar, dvs 40 mL per hela midi membran.
    6. Tvätta 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    7. Inkubera över natten vid 4 ° C med den primär antikroppen mot proteinet av intresse med milda skakningar.
    8. Tvätta 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    9. Inkubera membranet i rumstemperatur med korrespondent peroxidaskonjugerat sekundära antikroppen i TTBS för 1 h.
    10. Tvätta 3 x 5 min med 5 mL av TTBS.
    11. Utveckla med Kemiluminiscens substrat i en chemiluminescence-systemet.

    9. problemlösning

    1. Om efter att utveckla Western blot någon av proverna visade ingen signal alls för proteiner, kontrollera nykockin.
      Obs: Membranet i Ponceau bör Visa odefinierad och många band längs gränderna laddad. Om banden inte mycket märkbar, mängden proteiner laddas kanske inte är tillräckligt eller överföringen kan ha gått felaktigt. Överväga upprepande Western blot.
    2. Om det finns inga fläckar alls i Ponceau membranet i alla körfält, upprepa hela proceduren från steg 7,4 i (C) rören.
    3. Om efter att utveckla Western blot en protein-signal är mycket svag men Ponceau visade proteiner, inkubera igen membranet med primära antikroppen för längre tid. Om signalen är fortfarande ganska svag, odla igen i rumstemperatur.

    10. andra tekniker som används i denna artikel

    1. Immuncytokemi av BCPPs
      1. Fixa celler i 4% PARAFORMALDEHYD (0,2 mL per cm2) i 20 min.
      2. Tvätta 3 x 5 min med PBS (0,2 mL per cm2).
      3. Tillämpa den korresponderande antikroppen (minst 0,15 mL per cm2) utspätt i antikropp lösning på tillverkarens visade koncentrationen mot ditt protein av intresse över natten vid 4 ° C.
      4. Inkubera med en fluorophore-konjugerad sekundär antikropp (0,15 mL per cm2) för 2 h i rumstemperatur.
      5. Upprepa steg 10.1.2-10.1.4 med andra antikroppar mot din proteiner av intresse. Var noga med att inte använda samma art för olika primära antikroppar eller samma våglängd fluorophores för sekundära antikroppar.
      6. Montera de celler som använder antifade reagens (0,005 mL per cm2).
      7. Analysera på fluorescens Mikroskop anslutet till en digitalkamera.
    2. MTT assay
      1. Odla cellerna vid 37 ° C i 24 brunnar.
      2. Inkubera cellerna i mörkret för 75 min med 0,15 mL av odlingsmedium per cm2 innehållande 0,5 mg/mL MTT.
      3. Aspirera på medellång och inkubera cellerna för 10 min i mörker med dimetyl sulfoxid (0,25 mL per cm2) med milda skakningar.
      4. Mät absorbansen vid en våglängd på 570 nm med en microplate reader.

    Representative Results

    Innan du använder BCPPs för att studera intracellulär, är det viktigt att jämföra effekterna av BCPP vs CPP att validera resultaten med BCPP. Följaktligen, för att studera huruvida införandet av biotin modifierar aktiviteten av sekvensen mål, vi först analyserade effekten av TAT-Cx43266-283- B jämfört med TAT-Cx43266-283 på G166 GSCs morfologi. Det gör utfört vi vissa immunofluorescens analyser av två cytoskeletal proteiner, F-aktin och α-tubulin efter 24 h behandling. Figur 1 visar att G166 GSCs i närvaro av 50 µM TAT-Cx43266-283 eller TAT-Cx43266-283- B förvärva en mer rundad form jämfört med de långsträckta och utökad cellulära förlängningar visas i kontroller (TAT eller TAT-B). I själva verket figur 1b visar att aktin filament monteras oftast som aktin nätverk när cellerna behandlades med TAT-Cx43266-283 eller TAT-Cx43266-283- B medan de bildar mer aktin buntar i kontroll cellerna (behandlade med TAT eller TAT-B)25. Däremot varierar α-tubulin distribution inte mellan de olika villkor. Dessa resultat visade att förekomsten av biotin inte ändra effekten av sekvensen mål på morfologin av G166 GSCs. I tidigare studier20,21visade vi att TAT-Cx43266-283 minskas G166 GSCs spridning. I denna studie undersökte vi om TAT-Cx43266-283- B utövar samma effekter i tillväxten som TAT-Cx43266-283. Till gör så, analyserade vi G166 GSCs spridning av MTT-analysen efter 72 h behandling. MTT analysen är en kolorimetrisk test för att bedöma cellernas metaboliska aktivitet. MTT metaboliseras av NAD (P) H mitokondriskt enzymer i mitokondrierna som återspeglar antalet livskraftiga celler närvarande. Figur 2 visar att minskningen i den G166 GSCs cellviabiliteten inte väsentligt annorlunda när celler behandlades med 50 µM TAT-Cx43266-283 eller 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Faktiskt minskade både betydligt G166 GSCs spridning jämfört med kontroll, TAT eller TAT-B.

    När vi bekräftat att effekten av våra mål sekvens i G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) inte har ändrats av införandet av biotin på C-terminus (TAT-Cx43266-283- B), vi undersökte den intracellulära partners denna sekvens efter protokollet beskrivs i denna studie (figur 3). Eftersom caveolae har varit inblandade i mekanismen för TAT internalisering26, analyserat vi förekomsten av caveolin-1 (Cav-1) i pull-downs. Western blot analys (figur 4) visade att TAT-Cx43 och TAT-B266-283- B interagera med Cav-1. Dock möjligheten för TAT-Cx43266-283- B att rekrytera c-Src, PTEN och CSK är starkare än med TAT-B. Focal vidhäftning kinase (FAK) är ett substrat för c-Src som inte har visats att interagera med Cx43. Faktiskt, FAK visade inte någon signifikant interaktion med antingen TAT-B eller TAT-Cx43266-283- B.

    Att bekräfta interaktionen mellan TAT-Cx43266-283- B och c-Src, G166 GSCs inkuberades med 50 µM TAT-Cx43266-283- B för 30 min och deras localization följdes med fluorescerande streptividin av konfokalmikroskopi (figur 5 ). Våra resultat visade att den intracellulära fördelningen av TAT-Cx43266-283- B ligger nära plasmamembranet (visas av fosfatidylserin färgning) och matchar med c-Src. I själva verket samtidig lokalisering analyser visade några punkter av samtidig localization (vit) mellan TAT-Cx43266-283- B och c-Src i sammanfoga bilden. Följaktligen, konfokalmikroskopi studier bekräftar de resultat som erhålls med BCPP nedrullningsbara protokollet beskrivs i denna studie.

    Figure 1
    Figur 1: Effekten av BCPP och CPP på GSC morfologi.
    G166 GSCs var klädd med en låg täthet (2 x 104 celler / cm2) och efter 24 h de inkuberades med 50 µM kontroll CPP (TAT), styra BCPP (TAT-B), CPP (TAT-Cx43266-283) eller behandling BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . (a) F-aktin (röd), α-tubulin (grön) och sammanslagna + DAPI immunfärgning av samma fält visar G166 GSCs morfologi. Barer = 50 µm. b) F-aktin immunfärgning visar olika fördelningen av F-aktin i G166 GSCs efter inkubation i 24 h vid 50 µM styra CPP (TAT) eller styr BCPP (TAT-B) jämfört med 50 µM behandling CPP (TAT-Cx43266-283) eller BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). Barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2: Effekt av BCPP och CPP på GSC livskraft.
    G166 GSCs var klädd på 5500 celler/cm2 i 24-multiwell plattorna och inkuberas med 50 µM kontroll peptider, CPP (TAT) eller BCPP (TAT-B), eller 50 µM behandling peptider, CPP (TAT-Cx43266-283) eller BCPP (TAT-Cx43266-283- B). Cellviabiliteten analyserades med en MTT-analys efter 72 h. Resultaten uttrycks som MTT absorbanserna och är det medelvärde ± s.e.m. av minst 3 experiment (++ p˂0.01 vs kontroll. ** p˂0.01, *** p˂0.001 vs TAT eller TAT-B; envägs ANOVA withTukey efter provningen). Observera att det inte finns betydande skillnader mellan effekterna av CPPs vs BCPPs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3: Protokoll diagram.
    Steg för steg grafisk skildring av förfarandet som beskrivs i avsnittet ”Protocol”, från inkubering i BCPPs tills de eluerade BCPPs och deras samverkande proteiner var obtained.1) Inkubera kultur celler med BCPPs på önskad koncentration för den krävs tid. (2) under ruvningen, BCPPs är internaliseras och de interagerar med deras intracellulära partners. (3) tvätta cellerna tre gånger på isen med iskall PBS. (4) lysera celler för att extrahera proteiner. (5) överföra cell lysates rör.(6) snurra vid 11000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. (7) överföring supernatanterna nya rör (A) och hålla en liten delmängd av lysates att bearbeta som regelbundna Western blot prover i röret (B). (8) Omsuspendera NeutrAvidin agarosen pärlorna och tillsätt 50 µL till varje rör ett använder en skär pipettspetsen. 9) Inkubera med försiktigt skaka för 12 timmar vid 4 ° C att tillåta NeutrAvidin agaros pärlor för att interagera med BCPPs och deras partner. 10) spin för 1 min på 3000 x g till pellet pärlorna med biotinylerade beten och deras samverkande proteiner bundna till dem. 11) överföra supernatanterna till nya rör (C) och hålla dem att använda nedrullningsbara behöver upprepas. 12) tvätta pelleten fem gånger med färska lyseringsbuffert, Omsuspendera genom inversion, snurra för 1 min på 3000 x g och kasta bort supernatanten. 13) ta bort alla supernatanten försiktigt. 14) tillsätt önskad mängd 4 x Laemmli buffert och eluera proteinerna vid 100 ° C för 5 min. 15) snurra vid 8200 x g i 30 s till pellet pärlorna. 16) överföra de eluerade proteiner som finns i supernatanten med kapillär tips till nya rör (D). 17) lasta på geler för Western blot analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4: Studie av intracellulära interaktioner av TAT-Cx43266-283- B i G166 GSCs av nedrullningsbara följt av Western blot.
    G166 GSCs inkuberades med 50 µM TAT-B eller TAT-Cx43266-283- B. Efter 30 min cellerna var lyserat och TAT-B eller TAT-Cx43266-283drogs -B bifogas deras intracellulära partners med NeutrAvidin pärlor. De eluerade proteinerna var laddad och analyseras av Western blot att studera nivåerna av FAK, c-Src, CSK, PTEN och Cav-1. Observera att Cav-1 samverkar med både TAT-B och Src-TAT-Cx43266-283- B, c, PTEN och CSK interagera företrädesvis med TAT-Cx43266-283- B och FAK visade inte någon interaktion med antingen TAT-B eller TAT-Cx43266-283-B. snälla Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5: Bekräftelse av TAT-Cx43266-283- B intracellulära interaktioner i G166 GSCs av konfokalmikroskopi.
    G166 GSCs inkuberades med 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Efter 30 min, celler var fast och bearbetas för att lokalisera TAT-Cx43266-283- B med Cy2-streptividin (grön), c-Src genom immunofluorescens (röd) och fosfatidylserin med annexin V (blå). Observera några punkter av samtidig localization (vit) mellan TAT-Cx43266-283- B och c-Src nära plasmamembranet i sammanfoga bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Discussion

    Det finns många metoder för att studera protein-protein interaktioner. Metoden presenteras i denna studie bygger på den utbredda biotin-metoden pull-down system där ett biotinylerade bete inkuberas med cell lysates att möjliggöra upprättandet av interaktioner. Ändringen i denna studie innehåller kombinationen av denna teknik med cell-penetrerande sekvenser. Vi föreslår att utforma cell-penetrerande beten som kan inkuberas med levande celler istället för cell lysates och därför de interaktioner som hittade kommer att återspegla de som inträffade inom ramen för cellulära.

    Här använder vi TAT som cell-penetrerande sekvens, biotin som taggen nedrullningsbara och regionen av Cx43 mellan aminosyror 266-283 som mål att hitta intracellulära interaktioner i mänskliga GSCs. Den strukturella grunden för samspelet mellan Cx43 och c-Src är välkända11,12. Detta är en viktig interaktion eftersom det hämmar onkogena aktiviteten av c-Src i glioma celler24,13. I själva verket härma CPPs som innehåller denna region (TAT-Cx43266-283) antioncogenic egenskaperna för Cx43 på glioma celler19,20,21. I råtta gliom C6 celler innehåller den mekanism genom vilken hämmar TAT-Cx43266-283 c-Src rekrytering av c-Src tillsammans med dess endogen hämmare CSK och PTEN20. Det bör nämnas att GSCs är mycket intressant som ett mål i gliom terapi, eftersom de utgör en subpopulation som är resistenta mot konventionella behandlingar och därför ansvarig för en upprepning av denna elakartade hjärnan tumörer27. Dessutom de är hård-till-transfect celler och därför studien av intracellulära interaktioner blir svårare. CPPs är snabbt och effektivt internaliseras i GSCs19 gynnar deras användning för studien av intracellulära interaktioner. I denna studie, använder CPPs smält till biotin vi bekräftar samspelet mellan Cx43266-283 sekvensen med c-Src tillsammans med dess endogen hämmare CSK och PTEN i mänskliga GSCs.

    Denna metod är mycket kraftfullt att studera den intracellulära verkningsmekanismen bioaktiva föreningar. Det är dock mycket viktigt att bekräfta att den biologiska effekten av biotinylerade cell genomträngande betet inte är annorlunda från som erhålls med den icke-biotinylerade en. Det här steget krävs att associera de interaktioner som hittade med effekten av den bioaktiva föreningen. Dessutom bör stabiliteten i föreningen, dess eventuell nedbrytning av proteaser samt dess möjliga toxicitet, noggrant testade och beaktas innan du planerar experiment. I exemplet presenteras, har anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283 på G166 mänskliga GSCs tidigare dokumenterat20. I denna studie bekräftar vi att anti-proliferativ effekten av TAT-Cx43266-283- B och av TAT-Cx43266-283 är mycket lik. Dessutom analysen av cellulära morfologi visade att α-tubulin och F-aktin distribution är mycket likartad i G166 GSCs behandlade med TAT-Cx43266-283- B eller med TAT-Cx43266-283. Sammantaget indikerar dessa resultat att införandet av biotin på c-terminus av TAT-Cx43266-283 inte ändra effekterna av denna förening på mänskliga GSCs. Dock om biotin skulle ändra effekterna av bioaktiva molekylen, kan andra taggar för protein rening testas, såsom den flagga octapeptide (DYKDDDDK)28, mänsklig influensa hemagglutinin-derived etiketten HA (YPYDVPDYA) eller glutation S-transferas (GST)29. Likaså om TAT inte är inriktat på cell befolkningen av intresse, andra cell genomträngande sekvenser, såsom penetratin, MPG (för en genomgång, se30) eller cell specifika sekvenser kan vara begagnade31.

    Förutom studien proteiner som specifikt samverkar med sekvensen mål, helst bör förekomsten av proteiner som samverkar med både kontrollen och det målet sekvens och proteiner som inte interagerar med dem, som positiva och negativa kontroller, vara upp. I denna mening, Vi hittade Cav-1 i kontrollen och behandlade situationen, vilket tyder på att caveolae har varit inblandade i mekanismen av internalisering, som det har tidigare visats26. Dessutom FAK, som samverkar med c-Src men inte förväntas interagera med Cx43 c-terminalen, var frånvarande i både kontroll och behandlade situationen. Dessa resultat förstärka samspelet mellan TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK och PTEN specificitet. För att bekräfta de resultat som erhålls med detta protokoll, kan konfokalmikroskopi användas för att visualisera fördelningen av de samverkande proteinerna och studera deras samtidig localization. Således, Vi hittade att TAT-Cx43266-283- B och c-Src uppvisar en liknande intracellulär distribution med några punkter av samtidig localization bekräftar resultaten erhålls med den nedrullningsbara experimenten. I själva verket TAT-Cx43266-283- B sprids nära plasmamembranet vilket tyder på att lastens i denna studie Cx43266-283, dirigerar molekylen till dess intracellulära partner.

    En av begränsningarna i den föreslagna metoden är att molekylen används som bete kan misslyckas att vika ordentligt och de förväntade effekterna inte skulle hittas. I den här situationen kunde de interaktioner som hittade inte associeras till effekten. Dock kan denna metod vara särskilt intressant för interaktionerna som är inblandade i cellsmedierade reaktioner eftersom de utförs oftast av egensäkra oordnade regioner32 och därför inte kräver en ordnad vikning. En av fördelarna med den föreslagna metoden är dessutom att tidsförloppet för interaktionen kan följas, vilket är särskilt relevant för övergående interaktioner. Relevansen av varje rester på interaktionen kan dessutom studeras enkelt. Det är faktiskt möjligt att studera betydelsen av posttranslationell modifieringar på protein-protein interaktioner, till exempel genom phosphomimetic substitution av glutamat för serine eller treonin. På samma sätt tillåter substitution av serine eller treonin för alanin eller tyrosin för fenylalanin testa effekten av icke-phosphorylatable serine, treonin eller tyrosin.För att efterlikna phospho-tyrosin, är det mest exakta sättet substitution av Tyr för p-Tyr33.

    Slutligen, omfattningen av detta protokoll är långt bortom protein-protein interaktioner eftersom detta system kan tillämpas på andra bioaktiva laster såsom RNA sekvenser, nanopartiklar, virus eller andra molekyler som kan smält till biotin och sensorik med CPP att studera deras intracellulära verkningsmekanism.

    Disclosures

    Författarna har något att avslöja.

    Acknowledgments

    Vi tackar M. Morales och J. Bravo för deras hjälp med utformningen av CPPs och J.C. Arévalo för hans hjälp med protokollet nedrullningsbara. Vi är tacksamma för tekniskt bistånd av T. del Rey. Detta arbete stöds av Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spanien; FEDER SA026U16 och Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez och A. González-Sánchez är mottagare av ett stipendium från Junta de Castilla y León och Europeiskasocialfonden.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    G166 GSC line BioRep
    RHB-A stem cell medium Takara Y40001
    Laminin Mouse Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 23017-015 10 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17504-044 2%
    N-2 Supplement (100x) Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 17502-048 1%
    Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15 20 ng/ml
    Recombinant Human b-FGF Peprotech AF-100-18B 20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    Accutase Sigma A6964
    Cryostor CS10 cryopreservation medium StemCell Technologies 7930
    TAT GenScript - Custom made
    TAT-B GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283 GenScript - Custom made
    TAT-Cx43266-283-B GenScript - Custom made
    Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A1275737 1/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibody Sigma-Aldrich T9026 1/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific 1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ Agarose ThermoFisher Scientific 29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free Calbiochem, Bionova 539134 1/100 (v/v)
    Sodium Fluoride PanReac AppliChem 141675 1 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 1 mM
    Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 0.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) . 1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System Life Technologies, ThermoFisher Scientific WR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12% Life Technologies, ThermoFisher Scientific WG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0001 1X
    NuPAGE Transfer Buffer 20x Life Technologies, ThermoFisher Scientific NP0006 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes) Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device Life Technologies, ThermoFisher Scientific IB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water Sigma P7170
    FAK polyclonal rabbit antibody Life Technologies, ThermoFisher Scientific AHO0502 1/500
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Csk polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 4980 1/500
    PTEN polyclonal mouse antibody Cell Signalling (WERFEN) 9552 1/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody Abcam ab2910 1/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 1/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody Quimigen, Santa Cruz Biotechnology SC-2030 1/5000
    Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048
    Src polyclonal rabbit antibody Cell Signalling (WERFEN) 2108S 1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific A11029 1/1000
    Cy2-conjugated streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-220-089 1/500
    MicroChemi Luminescence system DNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI) Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific V13241 1/500
    SlowFade Gold antifade reagent Life Technologies, ThermoFisher Scientific S36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC) Honeywell 41641-1L
    Appliskan 2001 Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
    2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
    3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
    4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
    5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
    6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
    7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
    8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
    9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
    10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
    11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
    12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
    13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
    14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
    15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
    16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
    17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
    18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
    19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
    20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
    21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).
    22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
    23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
    24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
    25. Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).
    26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
    27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
    28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
    29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
    30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
    31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
    32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
    33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

    Tags

    Biokemi fråga 130 TAT Biotin-metoden Cell-penetrerande peptider Pull-down intracellulära interaktioner Protein-protein interaktioner Western blot
    Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Jaraíz-Rodríguez, M.,… More

    Jaraíz-Rodríguez, M., González-Sánchez, A., García-Vicente, L., Medina, J. M., Tabernero, A. Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (130), e56457, doi:10.3791/56457 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter