Summary
Makrofag ekstracellulære fælder er en nyligt beskrevne enhed. Denne artikel vil koncentrere sig om Konfokal mikroskopi metoder og hvordan de er visualiseret i vitro og vivo fra lunge prøver.
Abstract
En primære metode bruges til at definere tilstedeværelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) er Konfokal mikroskopi. Vi har ændret etablerede Konfokal mikroskopi metoder til at visualisere makrofag ekstracellulære fælder (METs). Disse ekstracellulære fælder er defineret ved tilstedeværelsen af ekstracellulære kromatin med co udtryk for andre komponenter såsom granulet proteaser, citrullinated histoner og peptidyl arginase deiminase (PAD). METs udtryk er generelt målt efter udsættelse for en stimulus og i forhold til un-stimuleret prøver. Prøverne er også inkluderet for baggrund og isotype kontrol. Cellerne analyseres ved hjælp af veldefinerede billede analyse software. Konfokal mikroskopi kan bruges til at definere tilstedeværelsen af METs både in vitro- og vivo i lungevæv.
Introduction
Neutrofile ekstracellulære fælder (net), blev første gang beskrevet af Brinkmann et al. 1 de er overvejende produceret som reaktion på infektion (især for bakterier) og har en vigtig rolle i vært forsvar1,2. De er også blevet beskrevet til at opstå som reaktion på ikke-smitsomme sygdomme, herunder vaskulitis og systemisk lupus erythematosus (SLE); og at den mitogen phorbol 12-myrisate 13-acetat (PMA)2,3. Det er for nylig blevet anerkendt, at andre celletyper kan også producere ekstracellulære fælder, herunder makrofager. Makrofag ekstracellulære fælder (METs) er endnu ikke en veldefineret enhed i litteratur4,5. Vi har for nylig etableret metoder til paavisning af METs både in vitro- og i vivo6,7. I denne artikel beskrives måling af METs bruger Konfokal mikroskopi.
Nøglen egenskaber i NETosis, som adskiller det fra andre cellulære veje (såsom apoptose8) er ekstrudering af kromatin i forbindelse med: (1) citrullinering histoner (H3Cit)9, (2) fælles udtryk af granulet proteaser10 , og (3) inddragelse af peptidyl arginin deiminase (PAD) 411,12. Makrofager også udtrykke H3Cit, granulet proteaser og PAD, og disse funktioner kan bruges til at definere tilstedeværelsen af METs.
METs kan have en særlig vigtig rolle i lungen, som makrofager er den dominerende celle i alveolerne og luftvejene i lungerne og har den oprindelige rolle i ledelsen af det cellulære immunrespons til infektion/inflammation. Desuden, mens meget af lungen er tomme rum (f.eks.inden for alveolerne), er METs potentielt kunne udvide i den plads, i modsætning til fast organer.
Den mest udbredte metode til at definere tilstedeværelsen af net er af Konfokal mikroskopi. Der er endnu ikke klart defineret måde at måle METs. Teknik til måling af redskaber er blevet tilpasset til at måle tilstedeværelsen af METs i denne protokol. De vigtigste krav for denne metode er adgang til Konfokal mikroskopi og passende imaging software til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denne protokol følger eksperimenter i godkendt: (1) mennesker af etiske udvalg af Monash Medical Center, og (2) dyr af den etiske komité i University of Melbourne.
1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) makrofager
- Brug BAL at få lungekræft makrofager i: (1) menneskelige forsøgspersoner ved bronkoskopi 6, og (2) mus ved hjælp af intra-trakeal aspiration 13 .
Bemærk: Erhvervelse af makrofager generelt forårsager nogle aktivering af disse celler. Makrofager er fremstillet af patienter, der kræver en bronkoskopi at undersøge en potentiel medicinsk problem og ikke alle fag kan være egnet til analyse af METs (dette skal bestemmes for hvert enkelt projekt).- Tage BAL opklaring og spin-ned (500 x g i 10 min.) til at danne en pellet, vaskes to gange med næringssubstratet (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) med 5% føtalt kalveserum og 1% L-glutamin) ved stuetemperatur, og derefter fortyndes celler i 4 mL af kultur medi Umm.
- Om nødvendigt anmode om en formel differential tæller, de fleste af cellerne (generelt > 80%) vil være makrofager 6.
Bemærk: Dette vil generelt udføres af en klinisk histologi service ved hjælp af morfologiske udseendet af forskellige celler typer 6. - Udføre en levedygtig makrofag celle regne BAL opklaring benytter Trypan blå udstødelse og en hemocytometer.
Bemærk: BAL opklaring er fremstillet af mennesker og mus som nævnt i trin 1.1. - Tilføj 1-4 x 10 5 makrofager til 24-godt plader på coverslips i 500 µL af næringssubstratet pr. brønd og efterlade natten over ved 37 ° C; celler vil tiltræde coverslips. For menneskelige prøver, tilføje antibiotika (fx, penicillin og streptomycin, 10 4 U/mL) at forhindre bakteriel forurening.
2. Immunfluorescens mærkningsbestemmelserne/mikroskopi af BAL makrofager
Bemærk: celler bliver overholdt på coverslips, som nævnt ovenfor.
- Fjerne næringssubstratet og vaske cellerne en gang med fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Fix celler i 2% PARAFORMALDEHYD/periodate/lysin (PLP) fiksativ i 10 min.
- Vaske cellerne kort i PBS, og derefter permeabilize i 0,2% Tween 20 i PBS for 20 min.
- Blok celler med 10% kylling sera i 5% bovint serumalbumin (BSA) fortyndes i PBS for 30 min.
- Incubate med primære og isotype kontrol antistoffer i 1 time ved stuetemperatur i 1: 100 koncentrationer (mere specifikke detaljer er angivet i Tabel af materialer) på 37 ° C.
Bemærk: Til BAL prøver, en specifik markør af makrofager kræves normalt ikke. - Efter tilføjelse af primære antistoffer, vaske cellerne i PBS, og yderligere inkuberes med de tilsvarende sekundære antistoffer i 40 min ved stuetemperatur.
- Vaske sektioner i PBS og mount med DAPI-baserede montering medium for visualisering ved hjælp af en Konfokal mikroskop (som nævnt ovenfor) på laser excitationer 405, 488, 561 og 647 nm og en 40 X, 1,0 NA olie mål.
3. Lunge vævsprøver
Bemærk: For i vivo studier af lungevæv, studere prøverne efter den relevante eksponeringsvej (f.eks. som beskrevet af O ' Sullivan et al. 7). den eksponering, der er mest relevante for dette eksperiment er smitsomme mikroorganismer, specielt bakterier. Musen stammer, der kunne bruges til denne metode er C57BL/6 eller BALB/c mus, 10-12 uger gamle, vægt 25-30 g og mandlige.
- Aflive mus, via en intraperitoneal injektion af ketamin (400 mg/kg) og xylazin (40 mg/kg). Åbn brysthulen og udsætte lungerne og hjertet ved hjælp af kirurgiske pincet og saks.
- Indgyde varm PBS ved hjælp af en 21-gauge kanyle ind i højre hjertekammer udviske blodet fra fartøjer til 30 s, derefter indgyde 10 mL 2% PLP fixativ for 30 s (i højre hjertekammer).
- Bruge varme PBS (42 ° C) til lavage åben brysthulen. Intubate luftrør med en 21-gauge kanyle og et stykke af 0,8 mm slange klippe til størrelse, og injicere 800 µL af pre varmede (til 42 ° C), lav-smeltende punkt 3% Agarosen løsning.
- Tie off luftrøret med flettet silke (4.0 USP). Læg tråden omkring luftrøret lige under indsætningspunktet af kanylen, og Fastgør det via en simpel overhånd knude. For at befæste agarosegelelektroforese, administrere iskold PBS omkring lungerne. Fjerne lungerne og hjertet som en blok fra brysthulen ved hjælp af saks og stumpe dissektion. Fjern hver lunge individuelt og derefter rette dem til 16 h i 2% PLP eller formalin ved 4 ° C.
- Gemme enhederne i PBS ved 4 ° C indtil væv skæring. Disse metoder for at opnå lungevæv har været tidligere beskrevet 13.
- For at forberede lungevæv prøver bruge følgende trin.
- Fix lungevæv væv (resektion taktfast 3.1) i 10% naturlige-buffered formalin i 24 timer ved stuetemperatur. Overføre til 75% ethanol og sat i et væv processor på en 12-timers cyklus, (2,5 h i 75% EtOH, 3 h i absolut EtOH, 3,5 timer i opløsningsmiddel 3B og 3 h i paraffin).
- Embed i standard paraffin oprette formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) blokke, som opbevares ved stuetemperatur.
Bemærk: På dette stadium, det er generelt nem at skære lunge sektioner for standard dias. - Skær FFPE lunge sektioner på 4-5 µm tykkelse ved hjælp af en mikrotom og montere på opladet, belagt dias som tidligere beskrevet af O ' Sullivan et al. 7
- til at montere dias, lægge 3 dråber af montering medium på 60 mm x 24 mm coverslips (størrelse 1,5), vend diaset på coverslip og skubbe ud overskydende medium. Hermetisk forsegling med neglelak og opbevares ved stuetemperatur.
4. Forberedelse/mikroskopi af lunge vævsprøver
- til de voks, rehydrere og forbehandle FFPE lunge vævsprøve med antigen hentning løsning.
- Ovnen tørre FFPE dias for 60 min. ved 60 ° C. Derefter sætte dias i xylen løsning for 30 min og overførsel til 70% ethanol løsning for 5 min ved stuetemperatur. Skyl i postevand.
- Sted i ildfast plastikfolie og HIER-antigen hentning i en trykkoger i 10 min i 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Køligt i 20 min. Skyl to gange i vand fra hanen i 5 min på en rocker, derefter en gang med PBS på rocker.
- Blok med 10% kylling serum i 5% BSA/PBS i 30 min. ved stuetemperatur.
- Pletten væv.
- Til at definere METs i makrofager, tilføje primære antistoffer (MMP-9, H3Cit og F4/80) i 1% BSA/PBS for 16 h ved 4 ° C i 1/100 fortynding (specifikke detaljer om antistof beløb er angivet i Tabel af materialer). Vaskes to gange med PBS for 5 min på en rocker.
- Opnå fluorescerende påvisning ved inkubering med tilsvarende sekundære antistoffer i 1% BSA/PBS for 40 min ved stuetemperatur. Antistoffer er: (1) kylling anti-musen 488 (grøn), (2) kylling anti-ged 594 (rød), og (3) æsel anti-647 (meget røde).
- Vaske sektioner i PBS og mount med DAPI-holdige montering medium for kromatin farvning.
- Få fluorescerende billeder ved hjælp af en Konfokal laser scanning hoved fastgjort til en inverteret mikroskop.
- Excite forberedelse med 405, 488, 561 og 647 nm lasere. Fange enkelt fly 512 x 512 pixel billeder ved at klikke på linje-sekventielle, nivellering knap (2 linje gennemsnit) ved hjælp af 20 X 0,1 NA luft og 40 X 1,0 NA olie mål.
- Opnå mindst ti felter Se pr. sektion for analyse og data for hvert resultat (dvs. 10 high-power felter synspunkt (HFOV) for kontrolelementet, 10 for stimuleret prøve, osv., for hver mus).
Bemærk: For at opnå et repræsentativt udsnit af hele området, en matrix system kan anvendes i som feltet er opdelt i forskellige sektioner og for hver anden prøve det samme matrix bruges til at vælge felter i visningen (f.eks. feltet kan være opdelt i 9 afsnit, og fra centrum og de 4 hjørner, to HFOV træffes).
5. Tre-dimensionel (3-D) Imaging af METs
NOTE: som METs 3D-strukturer, ved at tage flere z-stak billeder, som er rekonstitueret, kan give værdifulde oplysninger.
- Afsnit lunge prøver fra paraffinblokke på 200 µm ved hjælp af en vibratome med en amplitude på 1,8 mm og hastighed af 0,1-0,5 mm/s.
- Blokere lungevæv med 20% af de respektive serum (10% føtalt kalveserum og 10% kylling serum) og derefter permeabilize i PBS suppleret og 3,75% Triton-X 100 i 7 timer ved stuetemperatur under blid agitation.
- Pletten sektioner i 16 timer ved 4 ° C med de relevante primære antistoffer (MMP-9, H3Cit og F4/80) 200 µL mængder i microcentrifuge rør (antistof koncentrationer er angivet i Tabel of Materials).
- Vaske sektioner i PBS, 3 gange i 10 min. før inkubere med relevante sekundære antistoffer ved stuetemperatur for 1 h.
- Pletten lunge sektioner for DAPI (1:5, 000) i opløsningen i 20 min., før tilføje dæksel glider til mikroskop slides i PBS.
- Få fluorescens billeder ved hjælp af en omvendt Konfokal mikroskop (40 x 1,3 NA) udstyret med 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm og 635 nm lasere.
- Optage 3D-z-stakke af 0,54 µm tykkelse med optimal z-skæring for 40 x 1,3 NA olieobjektiv.
Bemærk: Den anvendte software vil variere afhængigt af den enkelte mikroskop. Et eksempel på, hvordan software kan bruges til et mikroskop er fastsat i supplerende fil 1.
6. Billede analyse
Bemærk: analyse af prøver kræver brug af specifik software til billedbehandling analyse og eksempler er anført i Tabel af materialer. Mens analysen af resultaterne vil afhænge af den specifikke program, der bruges, de anførte punkter nedenfor er vigtige.
- Analyse af BAL prøver
- Definer antallet af makrofager ved at vælge den blå kanal for DAPI og tildele en mindstestørrelse for cellerne (f.eks. > 18 µm i diameter). Med den relevante software, måle det samlede antal af makrofager pr. felt.
- Tæller antallet af celler, der har funktionerne af en markedsøkonomisk behandling ved tilstedeværelsen af ekstracellulære kromatin opdaget af DAPI med co udtryk for andre markører (f.eks. MMP12, PAD2 og H3Cit).
Bemærk: Antallet af mærker, der kan analyseres afhænger af antallet af lasere tilgængelige, men ideelt ud over DAPI, mindst to andre markører skal være inkluderet. Andre mindre specifikke parametre for markedsøkonomisk udtryk (fx, antallet af celler med ekstracellulære kromatin og en udvidet kerne) kan bruges. - Til at sammenligne udtrykket MET i BAL prøver (mellem kontrol, røg, og røg/DNase behandlede grupper), analysere mindst 100 BAL makrofager pr. sample.
- Til at måle sekundær antistof og isotype styre niveauer af fluorescens, måle mindst 100 celler i hver prøve for deres fluorescens. Måler den gennemsnitlige niveau af baggrunden fluorescens for hver markør (f.eks. H3Cit) ved hjælp af standardsoftware.
- Til at definere MET udtryk, tælle celler med typisk fænotype (fx, ekstracellulære kromatin med co udtryk af H3Cit og MMP9) og for hver MET, måle niveauet af fluorescens af markører (f.eks. H3Cit og MMP9). Udelukke celler producerer METs, hvis deres farvning ikke var over baggrunden og isotype kontrol.
- For menneskelige BAL prøver, analysere mindst 100 celler for hver prøve for procentdelen af makrofager at gøre METs. For murine prøver, som cellerne er mindre og METs er sværere at definere, analysere et større antal celler for hver prøve (fx, 200 makrofager).
- Analyse af lunge vævsprøver
- for at fastslå tilstedeværelsen af METs i lungevæv, bruge specifikke makrofag markør som F4/80.
- Definerer tilstedeværelsen af METs i lungevæv ved hjælp af fælles lokalisering af F4/80 i celler, der udtrykker ekstracellulære kromatin med andre parametre, som anført i punkt 6.1.
- Bestemme niveauet af baggrunden fluorescens i prøver med sekundær antistof og isotype kontrol. Udelukke METs fra analyse, der ikke er over baggrunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
METs kan visualiseres fra BAL prøver, i lungevæv og tykkere lunge sektioner med 3D-billeder. Et eksempel på METs visualiseres i et BAL udsnit er vist i figur 1. Morfologi af METs vil variere alt efter deres fase af modning. Den første påviselige funktion på mikroskopi er bevægelsen af kernen til cellens kant. Dette er efterfulgt af ekstracellulære kromatin med andre Co udtrykt mæglere, såsom H3Cit og granulet proteaser. I de tidligere faser har cellen stadig en nogenlunde kugleform med ekstracellulære fælden udtrykt. I senere faser, er MET dannelsen karakteriseret ved strækning af kroppen af cellen.
Lungevæv METs er vist i figur 2. Da lungerne er oppustet med væske til at definere den lunge arkitektur, skubbes METs generelt mod alveolær væggene. Morfologi af METs vil også variere, afhængigt af hvilket fly væv blev skåret i. De standard sektioner bruges til lunge vævsprøver er 4-5 µm i tykkelse. Tykkere væv sektioner aktiverer flere billeder skal tages og METs derefter kan ses i 3D. Antistofferne vil kun trænge så langt ind i lungevæv og en snittykkelse på 25-50 µm er optimal. Et eksempel på en 3D-billede er vist i figur 3 og Video 1.
Figur 1: BAL METs. Menneskelige BAL METs dannet efter stimulation på forskellige stadier af udvikling. METs var kendetegnet af ekstracellulære kromatin med co udtryk af H3Cit og MMP9. Farvning for (A) kromatin, (B) H3Cit, (C) MMP9 og (D) det flettede billede. Panel skær er isotype kontrol. Skalere barer = 10 µm (15 µm for isotypen). Et tidligere stadium markedsøkonomisk behandling er vist i øverste højre hjørne og har en nogenlunde kugleform. En mere moden MET er vist midt i feltet. Billeder blev taget ved hjælp af en laser scanning Konfokal mikroskop og en 40 x 1,0 NA olie mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: lungevæv METs. Murine METs i lungevævet efter stimulation. METs har været præget af ekstracellulære kromatin med co udtryk for H3Cit, MMP9 og F4/80 (som makrofag markør). Panelet (A) viser en typisk high-power synsfelt bruges til at måle antallet af METs; Paneler (B-F) viser den stiplede firkantet område under højere forstørrelse. Farvning (B) kromatin, (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80 og (F) det flettede billede. Indsæt panel er isotype kontrol. Skalere barer = 20 µm (20 µm for isotypen). METs er generelt skubbet mod alveolær væggene. Billeder blev taget ved hjælp af en laser scanning Konfokal mikroskop og en 40 x 1,3 NA olie mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tre-dimensionel visning af lunge afsnit. Musen lungevæv var fast og skåret i 25-35 µm tykt sektioner. Væv blev mærket med markører for METs og afbildet med sektioner på 1 µm tykkelse. Billeder blev kombineret med en z-stakken til at skabe en 3-dimensionel billede af en markedsøkonomisk behandling. Billeder blev taget ved hjælp af en laser scanning Konfokal mikroskop og en 40 x 1,3 NA olie mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: tre-dimensionel visning af lunge afsnit. Video svarer til prøver præsenteret i figur 3. Akse flåter = 5 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden i denne undersøgelse er baseret på, bruges til at definere tilstedeværelsen af NETs14. Makrofager er langt den dominerende celletype i BAL prøver og denne metode til indsamling er særligt velegnet til at studere METs. Hvis røde blodlegemer er til stede i BAL, bør disse celler mængden ved hjælp af ammoniumklorid. BAL procedure vil generelt aktivere makrofager og det forventes derfor at der vil være METs stede i un-stimuleret prøver. BAL makrofager er normalt meget klæbende. BAL makrofager vil generelt ikke behøver et bestemt mærke som disse celler er den dominerende celletype og kan også skelnes på deres morfologi. Normalt i et BAL, mere end 80% af cellerne er makrofager (og neutrofile er mindre end 5%), og efter flere vask, generelt forbliver kun de vedhængende leukocytter (dvs., makrofager)6. Hvis der er tvivl om evnen til at skelne mellem makrofager neutrofiler i mennesker, kan neutrofile markør såsom neutrofile elastase anvendes. I lungevæv er specifikke makrofag markør (fxF4/80) krævede nemlig makrofager er vanskelige at skelne fra andre celletyper. Makrofager har auto-fluorescens, så brugen af baggrund og isotype kontrol er vigtig; Dette er især tilfældet med stimuleret prøver.
Den bedste måde at definere tilstedeværelsen af METs forbliver skal fastlægges. Særlige veje/processer, der er fælles for både neutrofile og makrofager er: (1) kornede proteaser, (2) citrullinering histoner, og (3) PAD. PAD4 er mere specifikke for neutrofiler, mens PAD2 er mere fremtrædende i monocytter/makrofager. Brugen af F4/80 er godt accepteret markør for murine makrofager, men menneskelige makrofager har ikke sådanne veldefinerede markører og dette kan stille spørgsmål ved vurderingen af menneskelige lungevæv for markedsøkonomisk udtryk. Analysere MET udtryk i lungevæv kan være vanskeligere, som der er mange andre celletyper og METs tendens til at blive skubbet på de alveolære vægge. Når du analyserer væv sektioner, visualiseret METs bedst, når de er flad i tværsnit; Hvis METs er i et andet fly, kan det være svært at afgøre, om en markedsøkonomisk er til stede. Dette problem kan løses til en vis grad ved at gøre z-stakke at give dybere væv (3-D) fly for at undersøge METs og potentiale til at visualisere METs i forskellige aspekter.
Der er ikke et godt accepteret metode til fastlæggelse af tilstedeværelsen af METs i lunge prøver. De beskrevne metoder er baseret på dem, der anvendes til at visualisere net. Chow et al. beskrevet at mitogen PMA induceret METs i en makrofag cellelinie, som vurderet af tilstedeværelsen af ekstracellulære kromatin15. En efterfølgende undersøgelse viste, at Mycobacterium tuberculosis induceret METs in vitro som defineret ved tilstedeværelsen af ekstracellulære kromatin og H3Cit16. Vi har vist i vivo i en model af glomerulonephritis, at METs er til stede i nyrerne som defineret af co lokaliserede kromatin, Histon og myeloperoxidase7. Endelig har vi påvist tilstedeværelse i METs- in vitro- humane lunge makrofag ved kombination af ekstracellulære kromatin og MMP126. Vores metode kan anvendes af andre efterforskere til forskning dette vigtige aspekt af det inflammatoriske respons.
Det er sandsynligt, at METs vil anerkendes at have en større rolle i kronisk inflammatorisk sygdom. De processer, der fører til NETosis er stadig ikke veldefineret. Studiet af METs kan give betydelig indsigt i mekanismerne i trap dannelse. Udviklingen af protokoller med flere markører og funktionelle studier af METs vil yderligere definere METs rolle i sygdom.
Der er vigtige skridt, som vi har identificeret i denne protokol. De menneskelige BAL prøver er tilbøjelige til at have sekundær bakteriel forurening og anvendelse af antibiotika i dyrkningsmediet er vigtige for at begrænse forurening. De primære og sekundære antistoffer kan variere i deres fluorescens, selv med den samme producent. Endelig analyse af lunge vævsprøver er mere komplekse end BAL prøver og kræver tid til at udvikle en standardiseret tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger at gøre i forbindelse med dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Monash University, National Health og Medical Research Council, og Monash lunge og søvn Institute. Forfatterne vil gerne takke personalet i klinisk immunologi ved Monash sundhed, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass og Camden Lo af Monash Micro Imaging (MMI) for at få hjælp med konfokalmikroskopi imaging, og forfatterne anerkender MMI faciliteter af Monash Universitet. Forfatterne anerkender faciliteter og videnskabelig og teknisk bistand af Monash histologi Platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
