Summary
وهدف الطريقة المعروضة هنا استكشاف تجميع البروتين أثناء الشيخوخة العادية في نموذج الكائن الحي C. ايليجانس. ويمثل البروتوكول أداة قوية لدراسة مجاميع كبيرة غير قابلة للذوبان العالية التي تشكل مع التقدم في السن وتحديد كيفية تأثير التغيرات في بروتيوستاسيس تجميع البروتين.
Abstract
في العقود الأخيرة، زاد انتشار اضطرابات الأعصاب، مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD). هذه الاضطرابات المرتبطة بالعمر تتميز بظهور المجاميع البروتين مع هيكل فيبريلاري في أدمغة هؤلاء المرضى. بالضبط لماذا تخضع عادة للذوبان البروتينات تظل عملية تجميع غير مفهومة. وأعرب عن اكتشاف أن تجميع البروتين لا يقتصر على عمليات المرض، وبدلاً من ذلك جزءا من عملية الشيخوخة العادية يمكن دراسة الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم تجميع البروتين، دون استخدام اكتوبيكالي البشرية البروتينات المرتبطة بالمرض. هنا يصف لنا منهجيات دراسة تجميع البروتين المتأصلة في ايليجانس كاينورهابديتيس من خلال نهج تكميلية. أولاً، علينا النظر في كيفية زراعة عدد كبير من العمر متزامنة C. ايليجانس للحصول على الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين ونقدم الإجراءات البيوكيميائية لعزل المجاميع عالية-غير قابلة للذوبان-كبيرة. في تركيبة مع ضربة قاضية وراثية مستهدفة، من الممكن تشريح دور مورثة مصلحة في تعزيز أو منع البروتين العمر تعتمد على التجميع باستخدام أما تحليل شامل مع الكمية الكتلي أو التحليل القائم على مرشح مع الأجسام المضادة. يتم ثم تأكدت هذه النتائج بتحليل في فيفو مع الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن معلم الفلورسنت البروتينات المعرضة للتجميع. هذه الأساليب ينبغي أن تساعد على توضيح السبب في بعض البروتينات المعرضة للتجميع مع التقدم في السن وكيفية الحفاظ على هذه البروتينات تعمل بكامل طاقتها في نهاية المطاف.
Introduction
ويعترف ميسفولدينج البروتين والتجميع كسمة مميزة لعدة أمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي (المرض) الإعلانية، والمشتريات، والخرف فرونتوتيمبورال (FTD) والعديد من الآخرين. على سبيل المثال، تجميعات α-سينوكلين في ييفات اميلويد التي تتراكم كهيئات ليفي خاصة في المادة الرمادية في الدماغ للمرضى PD، أثناء وجوده في المرض المرضى ميسفولد، ماساتشوستس-43 أو فوس على شكل مجاميع هيولى في تردي الخلايا العصبية الحركية. في كل من هذه الاضطرابات الأعصاب، تفشل آليات الحفاظ على التوازن بروتين أو بروتيوستاسيس لمنع تراكم تجمعات البروتينات، وبالتالي تؤدي إلى المرض.
بروتيوستاسيس أمر حاسم لضمان الوظائف الخلوية وفي ظل الظروف العادية هذه الآليات التنظيمية أحكام السيطرة على معدل تخليق البروتين وقابلة للطي، والتدهور. عدة دراسات تثبت أن مع الشيخوخة، العديد من الخلايا والأجهزة قادرة على الحفاظ على التوازن البروتين تدريجيا للخطر، وتدهور الفسيولوجية لشبكات بروتيوستاسيس مع التقدم في السن ظرفا هاما أمراض الأعصاب (إعادة النظر في المراجع1،،من23). حقيقة أن مراقبة جودة البروتين والاستجابة الخلوية على الإجهاد البروتين تكشفت هي الخطر مع التقدم في السن تشير إلى أن ميسفولدينج البروتين وتجميع يمكن أن تكون نتيجة عامة للشيخوخة. وفي الواقع، نحن وآخرون أظهرت أن تجميع البروتين لا يقتصر على الأمراض، وبدلاً من ذلك يصبح جزء من البروتين شدة المنظفات-غير قابلة للذوبان في الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين4،،من56،7 ،،من89،10. وكشف تحليل الحسابية و في فيفو أن هذه المجاميع الفسيولوجية المتعلقة بالسن يشابه المجاميع المرض في عدة جوانب5. اكتشاف تجميع البروتين الذاتية، وتعتمد على العمر يعطينا الفرصة لتشريح الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم تجميع البروتين، دون استخدام اكتوبيكالي أعرب عن البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض. وفي الوقت الحاضر، توجد سوى معلومات محدودة حول تنظيم إينسولوبيليتي البروتين على نطاق واسع وآثار هذه التقلبات على صحة الكائن الحي.
السلكية C. ايليجانس واحدة من الكائنات نموذج درس آخر على نطاق واسع في الشيخوخة البحث هذه الحيوانات عمر قصيرة نسبيا وتظهر العديد من الميزات المميزة الشيخوخة لاحظ في أعلى من الكائنات الحية. وقد درست آثار الشيخوخة على إينسولوبيليتي البروتين في C. ايليجانس بتجزئة البيوكيميائية متسلسلة استناداً إلى قابلية الذوبان التفاضلية، الذي يستخدم على نطاق واسع لاستخراج المجاميع المرض في ميدان البحوث نيوروديجينيريشن11 . حسب الكمية الكتلي، عرضت عدة مئات من البروتينات ليصبح تجميع المعرضة في C. ايليجانس في غياب المرض5. هنا نحن تصف بالتفصيل في البروتوكول أن تنمو إعداد كبيرة من الديدان في ثقافة السائل واستخراج متسلسلة لعزل البروتينات المجمعة للقياس الكمي بالطيف الكتلي والتحليل بوصمة عار الغربية. لأن تتراكم البروتينات تجمعات والمعرضة للتجميع في سن C. ايليجانس الغدد التناسلية وأقنعة التغييرات الأخرى الأنسجة الجسدية5،،من1213، نستخدم متحولة الغدد التناسلية أقل لتركيز التحليل على البروتين إينسولوبيليتي في أنسجة غير الإنجابية. طريقة عرض تمكين تحليل مجاميع كبيرة تستعصي على الحل عالية، والتي غير قابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% والأعلاف بسرعة الطرد المركزي منخفضة نسبيا. بدلاً من ذلك، تم وضع بروتوكول استخراج أقل صرامة لجمع مجاميع أصغر وأكثر قابل للذوبان أيضا نشرها في أماكن أخرى من10. وبالإضافة إلى ذلك، يصف لنا الطريقة المستخدمة لتقييم التجميع في فيفو في C. ايليجانس.
عموما، يمكن تقييم هذه الأساليب في تركيبة مع تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) دور مورثة اهتمام بتحوير تجميع البروتين تعتمد على العمر. ولهذا يصف لنا تحليل مقتطفات من الديدان الصغار والمسنين مع أو بدون ضربة قاضية من البروتين محددة تهم استخدام [رني]. هذه الأساليب ينبغي أن تكون أداة قوية لتحديد مكونات شبكة الاتصال بروتيوستاسيس تنظيم إينسولوبيليتي البروتين. مداخلات عديدة مثل خفض الأنسولين/يشبه الأنسولين عامل النمو (IGF) 1 إشارات (IIS) قد ثبت بشكل كبير تأخير C. ايليجانس الشيخوخة14. مسارات طول العمر غالباً ما يحفز آليات مراقبة نوعية البروتين وهكذا هذه المسارات يمكن أن يكون نشاط التأثير على معدل التراكم البروتين. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر التجميع انخفاض البروتين المتأصلة في الحيوانات المعمرة على تثبيط مسار IIS7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: للحصول على فهم أفضل لهذا الإجراء، هو تعلق تخطيطي لسير العمل (الشكل 1).
1-نمو "إعداد كبيرة من الشباب" والمسنين C. ايليجانس يتعرضون للاستهداف [رني] الجينات مصلحة
ملاحظة: طفرات العقيمة المستحثة بدرجة الحرارة gon-2(q388) استخدام C. ايليجانس (CF2253) للحصول على عدد كبير من السكان المسنين متزامنة. خلال جميع الخطوات، من المهم للعمل تحت ظروف شبه معقمة مع لهب المكشوف والتحقق من أن لا الملوثات (على سبيل المثال، مع الفطريات أو البكتيريا) موجودة. نفذ الخطوات (كما سينتريفوجيشنز) في درجة حرارة الغرفة إذا لم يرد وصف لدرجة الحرارة.
- إعداد طفرات gon-2(-) C. ايليجانس للحصول على الحيوانات أقل الغدد التناسلية
ملاحظة: للحصول على الحيوانات العقيمة التي تفتقر إلى الغدد التناسلية، الطفرة فقدان لوظيفة يجب أن يتسبب في الحيوانات الأصل بتحويل هذه في آخر مرحلة اليرقات (L4) إلى 25 درجة مئوية تجنبا لمساهمة الأمهات.- أول توسع للحيوانات gon-2(-) لجمع جيل الوالدين لدرجة حرارة التحول
- OP50 الإشريكيّة القولونية الانتصارات سلالة على صفيحة ليسوجيني مرق (رطل) واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- وفي اليوم التالي تطعيم متوسطة 200 مل رطل مع واحد OP50 استنساخ واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- القادم يوم البذور 15 عالية النمو (HG) متوسطة لوحات (قطرها 9 سم) مع 0.5 مل OP50 وتوزيع OP50 مع ملعقة. تبقى اللوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
- القطعة الحيوانات gon-2(-) (لا المتعطشة للأجيال الماضية اثنين) على لوحات متوسطة 15 HG المصنف مع OP50 والحفاظ عليها عند 20 درجة مئوية حتى اللوحات المتلاقية مع الكبار وبعض OP50 لا تزال متاحة.
- وفي الوقت نفسه، البذور 60 HG لوحات متوسطة مع OP50 كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.3 وتبقى اللوحات في درجة حرارة الغرفة. حذراً: لوحات المبذورة ينبغي لا أن تظل لأكثر من أسبوع واحد كما أجار سوف الكراك في درجة حرارة الغرفة.
- بليتش لوحات المتلاقية بمجرد بدء معظم البالغين لوضع البيض كما هو موضح سابقا15. جمع البيض في اثنين من 15 مل-أنابيب ومكان في خلاط نوتاتينج بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية.
- أغسل اليوم التالي فقست L1s مع المخزن المؤقت M9 (85 ملم كلوريد الصوديوم، 42 مم نا2هبو4·7H2س، 22 مم خ2ص4): أجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز 30 s وتجاهل المادة طافية، وتعبئة ما يصل إلى علامة 15 مل مع M9. الطرد المركزي وتجاهل المادة طافية، وكرر الخطوة 1.1.1.6. ملء الأنابيب مع الكريات دودة الناتجة تصل إلى علامة 15 مل مع M9.
- تقييم العدد الإجمالي ل L1s مع مجهر تشريح عن طريق العد L1s موجودة في 2 ميليلتر قطرات توضع على ألواح أجار غير المصنفة. متوسط الأرقام التي تم الحصول عليها من قطرات تسعة على الأقل.
- إضافة 6,500 L1s الواحد المبذورة لوحة زئبق وتمكنك من الديدان تنمو في 20 درجة مئوية حتى مرحلة L4.
- توسيع الحيوانات gon-2(-) للحصول على الحيوانات أقل الغدد التناسلية للتجربة الثانية
- مرحلة L4، تنتقل الديدان من خطوة 1.1.1.9 إلى 25 درجة مئوية حتى أنها تبدأ بوضع البيض وتفريخ L1s.
- جمع البيض و L1s بالترسيب
ملاحظة: بعد تحول درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية، يفضل استخدام الترسيب كأسلوب لطيف لفصل البيض هشة و L1s من الكبار.- أغسل اللوحات مع M9 باستخدام 5 مل M9 في خمس لوحات. نقل الديدان في أنابيب 50 مل.
- تملأ جميع الأنابيب للعلامة 45 مل مع M9 والسماح للرواسب الكبار لمدة حوالي 10 دقائق، وجمع كل المادة طافية في أنبوب 50 مل وكرر هذه الخطوة مع بيليه. الطرد المركزي المادة طافية الذي يحتوي على البيض و L1s في س 3,000 ز لمدة 1 دقيقة والسماح للرواسب L1s لمدة حوالي 10 دقائق، وإزالة المادة طافية حتى يتم ترك 15 مل.
ملاحظة: هذا خطوة حاسمة. لا تقم بإزالة المادة طافية في وقت مبكر جداً، لجمع L1s أكبر عدد ممكن. - وضع الأنابيب التي تحتوي على البيض و L1s في خلاط نوتاتينج بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية.
- أول توسع للحيوانات gon-2(-) لجمع جيل الوالدين لدرجة حرارة التحول
- ثقافة السائل من الحيوانات أقل الغدد التناسلية لجمع الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الحيوانات يتعرض لاستهداف جين للفائدة [رني]
ملاحظة: يمكن رد بعض الجينات على [رني] درجة الحرارة تعتمد كما هو موضح سابقا16. وكبديل لذلك إلى [رني], مورثة متحولة يمكن إدراجها في الخلفية gon-2(-) .- إعداد البكتيريا لثقافة السائل
- إعداد البكتيريا OP50 و [رني] (البكتيريا المنتجة دسرنا المرجوة والبكتيريا مع ناقل فارغ كعنصر تحكم) بتطعيم ل 4 رطل متوسطة مع 12 مل كل ثقافة البكتيرية (إضافة تركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 1 مم إيبتج إلى [رني] الثقافات البكتيرية) واحتضانها لهم عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 180 لفة في الدقيقة.
- وفي اليوم التالي حصاد الثقافات في 6,700 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة سوبيرناتانتس وريسوسبيند كل بيليه في 60 مل المثلج S الوسائط القاعدية (100 مم كلوريد الصوديوم، البوتاسيوم 50 مم فوسفات الهيدروجيني 6، أبقى على الجليد). تبقى الكريات ريسوسبينديد الثلاثة (OP50، التحكم [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة) في 4 درجات مئوية حتى الخطوة 1.2.2 أو 1.2.3.
ملاحظة: يمكن زراعة الديدان في [رني] من المرحلة L1 (راجع الخطوة 1.2.3) أو لتفادي العيوب التنموية من آخر مرحلة اليرقات L4 (راجع الخطوة 1.2.2).
- ثقافة السائل للمعاملة مع [رني] في الماضي بدأت مرحلة اليرقات L4
- إضافة وسائط 200 مل S القاعدية في قارورة ثقافة فيرنباتش (قدرة مل 2,800). حجم ثقافة نهائية من 300 مل (انظر 1.2.2.4)، إضافة سترات البوتاسيوم 10 مم، الرقم الهيدروجيني 6، 3 مل تتبع المعادن الحل (5 ملم حمض الإيثيلين (يدتا)، 2.5 مم فيسو4، 1 مم الحركة2، 1 مم زنسو4مم 0.1 CuSO4)، 3 مم MgSO4 ، 3 مم كاكل2و 100 نانوغرام/مل كاربيندازيم 5 ميكروغرام/مل الكوليسترول). إغلاق قارورة مع سداده ملولبة غشاء. الرجوع إلى الجدول 1 لوصفات من المخازن المؤقتة.
- تأخذ L1s من أصل 25 درجة مئوية (الخطوة 1.1.2.2.3) ونقلها إلى أنابيب 15 مل. الطرد المركزي في 1,900 س ز لمدة 3 دقائق وإزالة المادة طافية، وتعول L1s كل ميليلتر 2 كما هو الحال في الخطوة 1.1.1.8. إضافة 500,000 L1s في قارورة الثقافة فيرنباتش إعدادها في الخطوة السابقة.
- إضافة OP50 (من الخطوة 1.2.1) نسبيا لعدد الديدان. على سبيل المثال، للديدان 500,000 إضافة 60 مل OP50.
- الثقافة دودة كاملة مع S القاعدية لكي الحجم الإجمالي 300 مل. احتضان ثقافة دودة حتى مرحلة L4 عند 25 درجة مئوية في حاضنة هز مع 150 دورة في الدقيقة.
- وفي اليوم التالي الديدان ينبغي أن يكون حجم L4s البرية من نوع. لتغيير من OP50 البكتيريا [رني]، جمع الحيوانات في ست 50 مل-أنابيب والسماح لهم بالرواسب وإزالة المادة طافية. أغسل L4s مع M9 لإزالة بقايا البكتيريا OP50: الطرد المركزي في 1900 غ س لمدة 3 دقائق وإزالة المادة طافية ونقل جميع L4s في واحدة 50 مل-أنبوب. عد L4s الواحدة 5 ميليلتر (تسع مرات على الأقل). مرتين 50,000 L4s هناك حاجة لجمع دودة الشباب ومرتين 100,000 L4s هناك حاجة لجمع دودة أعمارهم.
- إعداد أربع قوارير الثقافة فيرنباتش كما هو موضح في 1.2.2.1. إضافة أيضا بتركيز 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 1 مم إيبتج نهائي لكل قارورة.
- إضافة عنصر تحكم [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة (من الخطوة 1.2.1) التناسب لعدد الديدان: إضافة 7 مل البكتيريا منها كل قارورة للديدان الصغار ومل 14 في قارورة للديدان أعمارهم.
- إضافة الديدان 50,000 كل قارورة لجمع دودة الشباب والديدان 100,000 كل قارورة لجمع دودة أعمارهم، وإكمال الثقافات مع S القاعدية لملء تصل إلى 300 مل. احتضان ثقافات دودة (أربعة في المجموع) في 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.
- ثقافة السائل للمعاملة مع [رني] بدءاً من المرحلة L1
- إعداد أربع قوارير الثقافة فيرنباتش كما هو موضح في 1.2.2.1 وإضافة تركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 1 مم إيبتج.
- تواصل مع إعداد L1s كما هو موضح في 1.2.2.2. وفي المجموع، هناك حاجة الديدان 300,000 لتقسيمها إلى أربع قوارير.
- إضافة عنصر تحكم [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة (من الخطوة 1.2.1) يتناسب مع العدد الديدان كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.7 والنظر أيضا في مرحلة النمو بين مرحلة المستوى 1 والمستوى 4: إضافة 13 مل البكتيريا منها كل قارورة للشباب w أورمس ومل 26 في قارورة للديدان أعمارهم.
- يستمر كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.8.
- الحفاظ على الثقافات C. ايليجانس السائلة
- جمع دورياً قاسمة من كل ثقافة السائل ومكان على شريحة زجاجية (بدلاً من ذلك على صفيحة أجار) التحقق من عدم وجود لا التلوث. استخدام مجهر تشريح، تحقق المستويات الغذائية البكتيرية في الثقافة خاصة أثناء مرحلة النمو. إعداد مقدما الثقافات ل 2 من السيطرة [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة كما هو موضح في الخطوة 1.2.1. إضافة هذه الثقافات ايليجانس جيم السائل إذا لزم الأمر، والحفاظ على ما تبقى في 4 درجات مئوية.
- فحص دوري لأن الحيوانات عقيمة. لن يكون لغالبية الحيوانات الغدد التناسلية. اعتماداً على بينيترانسي الطفرة غون--2 ، بعضها قد يكون تم إحباط هياكل جوندال لكن ينبغي أن تراعي لا الحيوانات مع البيض.
- إعداد البكتيريا لثقافة السائل
- مجموعة من الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الديدان يتعرضون إلى [رني] في ثقافة السائل
ملاحظة: جميع الخطوات التالية لقارورة السائل ثقافة واحدة ولكن كل الثقافات من نفس العمر بالتحكم والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة ينبغي معالجتها معا.- جمع الديدان الصغار في اليوم 2 أو 3 لقياس المستويات القاعدية للبروتين إينسولوبيليتي اليوم. ينبغي أن تكون الديدان الذين تتراوح أعمارهم بين المجمعة (في آخر) عندما نصف السكان قد مات. لتحديد هذا، تحسب ديدان ميتة وعلى قيد الحياة في عدة قطرات من السائل الثقافة على صفيحة أجار. يتم حساب متوسط النسب عبر قطرات تسعة على الأقل.
- إعداد الكواشف التالية: 1 L M9، 1 ل M9 مع 0.01 ٪ أوكتوكسينول-9 (M9 + أوكتوكسينول-9)، والسكروز 60% 40 مل في ddH2سين إبقاء الكواشف على الجليد.
- صب الديدان من قارورة واحدة في قمع فصل وترك الرواسب الديدان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. فتح في محبس الحنفية والتنقيط والديدان في أنبوب 50 مل واحد.
- تقسيم بيليه دودة اثنين 15 مل-أنابيب والطرد المركزي في 1,900 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ليغسل الديدان وإزالة المادة طافية وملء يصل إلى 15 مل مع M9. كرر الطرد المركزي. وأخيراً نقل الديدان إلى أنبوبين 50 مل وتملأ بإجمالي حجم 20 مل مع M9 المثلج.
- لإزالة البكتيريا والديدان الميت، إضافة 20 مل مخففة دودة الكريات اثنين على اثنين 50 مل-أنابيب مليئة السكروز 60% المثلج 20 مل. الطرد المركزي بسرعة في 2,700 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتسريع 9 وتباطؤ 7. بعناية إزالة الطبقة الأعلى الدودة مع بيبيت كبيرة (25 مل). أن يصل إلى 15 مل (ولكن أقل إذا كان من الواضح أن هناك الكثير من الديدان الميت). وضع هذا مباشرة إلى 37 مل M9 + أوكتوكسينول-9 (أنابيب 3 كل أنبوب السكروز) أعد على الجليد. الطرد المركزي في س 2,700 ز لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تسارع التباطؤ في 7 و 9.
ملاحظة: كلاهما تحتاج إلى أن تكون الجليد؛ وإلا لن يعمل الانفصال. لا تخلط! لأن السكروز السامة للديدان من المهم أن تكون سريعة للخطوة التالية. - تقسيم بيليه إلى أربعة 15 مل-أنابيب ويغسل مرتين مع المثلج M9 + أوكتوكسينول-9: أجهزة الطرد المركزي في 1,900 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية، تملأ بعلامة 15 مل مع المثلج M9 + أوكتوكسينول-9 وتكرار الإجراء.
- أغسل مرة واحدة مع M9 المثلج والجمع بين أنابيب أربعة إلى اثنين من الأنابيب. تملأ M9 في درجة حرارة الغرفة إلى إجمالي حجم 4 مل في 15 مل-الأنابيب وتدوير في خلاط نوتاتينج عند 25 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: يساعد هذا الديدان لهضم أي بكتيريا متبقية في القناة الهضمية. تحقق من الديدان تحت المجهر لمعرفة أن هناك لا ميتة أحد. - أغسل الديدان مرتين مع المثلج M9 + أوكتوكسينول-9 كما هو موضح في 1.3.5. تغسل مرتين مع M9 ونقل الديدان إلى أنبوب واحد.
- أغسل الديدان مرة واحدة في المخزن المؤقت لاستخراج الملح عالية "إعادة التجميع" (رب) دون مثبطات (حمض مورفولينيثانيسولفونيك 4 م 0.1 (MES)، وحمض اتهيلينيجليكولتيتراسيتيك 1 مم (عطا)، 0.1 مم يدتا، 0.5 مم MgSO4، 0.75 متر كلوريد الصوديوم، 0.02 م فلوريد الصوديوم (NaF)) قبل جمع. إزالة المادة طافية حتى يكون هناك لا سائل على رأس بيليه دودة.
ملاحظة: هذه الخطوة والمرحلة التالية ينبغي أن يتم سريعاً لتجنب القطع الأثرية في الديدان تسبب بارتفاع تركيز الملح في المخزن المؤقت. - تقدير حجم بيليه دودة وإضافة وحدة تخزين متطابقة من رب مع مثبطات (2 × كوكتيل مثبط البروتياز). استخدام ماصة باستور، وضع الديدان والتنقيط ببطء في أنبوب 50 مل نصف مملوءة بالنيتروجين السائل في الثلج الجاف. واسمحوا نيتروجين سائل يتبخر وتخزين الديدان المجمدة في-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
تنبيه: النتروجين السائل في درجة حرارة منخفضة للغاية؛ ملابس الحماية المناسبة.
2. استخراج البروتين غير قابلة للذوبان مع الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الحيوانات يتعرض لاستهداف جين للفائدة [رني]
-
تعطل حيوانات التي تم جمعها في الخطوة 1، 3
ملاحظة: من المهم تجنب أي ذوبان الجليد من عينات الفيروس المتنقل. يبرد الهاون مع النتروجين السائل وتنفيذ الإجراء الكامل على الثلج الجاف.
تنبيه: النتروجين السائل في درجة حرارة منخفضة للغاية؛ ملابس الحماية المناسبة.- نقل الديدان المجمدة لقذائف الهاون قبل تبريد وطحن 2.5 دقيقة.
ملاحظة: كن حذراً أثناء طحن: في البداية، من الديدان المجمدة رصاصات صغيرة ومن السهل أن تفقد لهم. - إضافة النيتروجين السائل (حوالي 100 مل) في مسحوق ليبرد مرة أخرى وطحن لآخر دقيقة 2.5 الاختيار مع المجهر أن الهيئات الدودة كسر. نقل المسحوق في أنابيب 2 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- نقل الديدان المجمدة لقذائف الهاون قبل تبريد وطحن 2.5 دقيقة.
-
استخراج البروتين غير قابلة للذوبان السريع لتحليل لطخة غربية
ملاحظة: استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مستويات البروتين المحتوى وغير قابلة للذوبان مجموع البروتين بين أيام مختلفة مع أو بدون [رني] استهداف الجين للفائدة. تنفيذ كافة الخطوات حتى الخطوة 2.2.3 على الجليد!- جعل 50 مغ ديدان الأرض من الخطوة 2.1 مع 150 ميليلتر راديويمونوبريسيبيتيشن المقايسة (ريبا) المخزن المؤقت (50 مم تريس درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم يدتا، 0.5% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5% (SDO)، 1% نونيلفينيلبوليثيلينجليكول (NP40)، 1 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف)، 1 × كوكتيل مثبط البروتياز). مجانسة تعليق استخدام المحاقن 1 مل مع إبرة الرمادي (27 × ½ "، 0.4 مم × 13 مم)؛ وضع التعليق 10 مرات.
- أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر ريبا المخزن المؤقت والطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وتدور قريبا، وأن تحرص على إزالة بقايا طافية.
- لجعل البروتينات عالية غير قابلة للذوبان، ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي ميليلتر 75 (م 8 اليوريا، 2% الحزب الديمقراطي الصربي، 50 مم ديثيوثريتول (DTT)، 50 مم تريس، درجة الحموضة 8) واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- لتحليل محتوى البروتين الكلي، الجمع بين المعهد الملكي أول طافية من الخطوة 2.2.2 واستثارة بيليه اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي. لحساب وحدات التخزين المستخدمة للاستخراج، ينبغي أن يتضمن جزء مجموع ثلثي ريبا طافية وثلث الكسر بيليه اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي. في جل تدرج صغيرة 4-12%، التحقق من مستويات بروتين غير قابل للذوبان بتحميل ميليلتر 9 في كسر اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي وميليلتر 4 مجموع البروتين مجتمعة. أداء مجموع البروتين وصمة عار تلطيخ لرصد مستويات البروتين. بالغربية النشاف باستخدام أجسام مضادة محددة، التحقق من التغييرات في إينسولوبيليتي للبروتينات الفردية كمياً بالطيف الكتلي (انظر القسم 3).
-
استخراج البروتين غير قابلة للذوبان لعزل البروتينات SDS تستعصي على الحل الكتلي
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات على الجليد.- على الثلج الجاف مرات وزنها اثنين 350 ملغ الديدان الأرضية في النقطة الزمنية ولكل البكتيريا [رني] (الديدان، الشباب والمسنين والسيطرة [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة) في أنابيب 2 مل.
- لإزالة البروتينات القابلة للذوبان الملح عالية، إضافة مجلدين من رب كل وزن (700 ميليلتر) مع مثبطات، 1 مم بمسف، 200 يو/مليلتر الدناز الأول، و 100 ميكروغرام/مل رناسي أ إلى كل أنبوب وجعل مسحوق على الجليد. وضع التعليق في محقن 1 مل (إبرة رمادي، 27 x ½ "، 0.4 مم × 13 مم) 15 مرة، واحتضان ذلك على الجليد لأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تذهب من خلال طبقة الدهون وجمع المادة طافية يحتوي على الملح عالية البروتينات القابلة للذوبان في أنبوب 2 مل واحد كل حالة (أربعة أنابيب في المجموع). إزالة الدهون وتخلص منه. الكوة الملح عالية البروتينات القابلة للذوبان لتجميد في-80 درجة مئوية.
- للتخلص من الدهون، جعل بيليه مع 700 ميليلتر رب مع مثبطات تحتوي على السكروز 1 م (دون الدناز أنا ورناسي A). وضع التعليق في محقن 10 مرات واحتضان ذلك على الجليد للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. كن حذراً لإزالة جميع المادة طافية والدهون والتخلص منها.
- لإزالة البروتينات القابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي، جعل بيليه مع 700 العازلة ريبا ميليلتر. وضع التعليق في محقن 10 مرات واحتضان عليه لمدة 10 دقائق على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية المحتوية على البروتينات القابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي وقاسمه للتجميد في-80 درجة مئوية.
- تجمع العينات اثنين لكل شرط معا بعد سولوبيليزينج كل بيليه مع 500 ميليلتر ريبا العازلة. وضع التعليق في محقن 10 مرات. أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. كن حذراً لإزالة جميع المادة طافية وتجاهل ذلك.
ملاحظة: هدف الاستخراج لفصل البروتينات القابلة للذوبان من البروتينات غير قابلة للذوبان. ولذلك، من المهم لإزالة جميع بقايا ريبا طافية قبل إضافة حمض الفورميك في الخطوة التالية. - جعل بيليه النهائية التي تحتوي على بروتينات عالية غير قابلة للذوبان مع 400 ميليلتر 70% حمض الفورميك ووضع التعليق في محقن 20 مرة. احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي في 50,000 ز x لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتسارع 3 وتباطؤ 5، لإزالة الحطام بشرة دودة. جمع المادة طافية تحتوي على بروتينات عالية غير قابلة للذوبان وتجميدها في-80 درجة مئوية.
- الغسيل الكلوي للكسور بروتين غير قابل للذوبان الكتلي
ملاحظة: دياليزي في 4 درجات مئوية.- إعداد المخزن المؤقت لغسيل الكلي ل 8 (50 مم تريس، 1 مم DTT، 0.1 مم بمسف، درجة الحموضة 7.5) وتقسم إلى ثمانية ل 1 قنينة. ضع الأغشية الثلاثة (مرشحات غشاء = 0.025 ميكرومتر) على سطح المخزن المؤقت لكل كوب 1 لتر.
- كل غشاء، بعناية تحميل ميليلتر 65 من البروتين غير قابلة للذوبان solubilized في حمض الفورميك التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.6. وينقسم كل شرط على الأغشية الستة.
- التحقق من الرقم الهيدروجيني لنموذج واحد بإزالة 5 ميليلتر وإضافته إلى شريط الأس الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني بين 7 و 8 (تقريبا بعد ح 2)، جمع العينة من بيبيتينج إلى أعلى وأسفل برفق. وأخيراً، استخدم 10 ميليلتر الغسيل الكلوي العازلة لغسل متسرعا قبالة كل الغشاء. تجميد عينات في-80 درجة مئوية.
3-شاملة تحديد وتقدير حجم التغييرات في إينسولوبيليتي البروتين مع العمر الناجمة عن استهداف جين للفائدة [رني]
-
التحضير لتحليل الطيف كتلة
- تقييم كمية البروتينات غير قابلة للذوبان في عينات دياليزيد عن طريق تحميل قاسمة على 4-12% هلام تدرج جنبا إلى جنب مع عينة مرجعية من تركيز معلوم. تؤدي تلطيخ جل مجموع البروتين وقياس كمية البروتين مع برنامج تحليل صورة. هذه الخطوة ضروري لتقدير كمية التربسين اللازمة الهضم (الخطوة 3.1.4).
- تركز العينات باستخدام مبخر الطرد مركزي وجعل البروتينات غير قابلة للذوبان في تركيز اليوريا م 8 نهائي.
- الألكلة والحد
- إضافة Tris(2-carboxyethyl) هيدروكلوريد الفوسفين (تسيب) بتركيز نهائي من 4 مم للعينات. احتضانها ح 1 في 57 درجة مئوية مع 300 دورة في الدقيقة. وضع العينات في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة إيودواسيتاميدي إلى نهائي تركز 8.4 ملم. احتضان لمدة 45 دقيقة (يمكن المحتضنة ح 2) في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع هذه العينات في بيكربونات الأمونيوم 150 مم للحصول على تركيز يوريا م 2 نهائي.
- هضم البروتينات بنسبة 5% w/w تعديل التربسين بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 400 لفة في الدقيقة.
- تحميل عينة من هضم البروتينات في جل مخزونات النشر الاستراتيجي 12% وأداء جل مجموع البروتين تلطيخ لتحليل إذا عملت الهضم. إذا كان لا يزال هناك بعض الفرق الحالي، كرر الخطوتين 3.1.4 و 3.1.5.
- تتم تسمية الببتيدات من مراقبة الصغار والمسنين و [رني] يعامل C. ايليجانس مع العلامات إيسوباريك كوانتيتيشن النسبي والمطلق اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام أساليب أخرى لوضع العلامات على الببتيدات أو البروتينات يمكن للقياس الكمي مثل العلامات الجماعية جنبا إلى جنب.
ملاحظة: كتلة تحليل الطيف: لتقليل تعقيد عينة، يجب فصل الببتيدات اللوني لتبادل الأيونات الموجبة القوية إلى كسور مختلفة ل تحليل الطيف الكتلي5. مطيافات الشامل عدة قادرة على تحليل العلامات إيسوباريك كوانتيتيشن النسبي والمطلق كما هو موضح في مكان آخر من17. ينبغي معالجة البيانات التي تم الحصول عليها مع البرامج المناسبة. عموما يسمح هذا التحليل تحديد البروتينات عالية غير قابلة للذوبان والتغييرات الخاصة بهم على سن وتعديل بروتيوستاسيس.
4. في فيفو تقييما لتأثير الجينات للفائدة على نمط التراكم خلال الشيخوخة
- من تحليل الطيف الكتلي في القسم 3، حدد بروتين معرضة لتجميع تعتمد على العمر الذي يتراكم بدرجة مختلفة في الحيوانات تتعرض إلى [رني]. إنشاء المحورة وراثيا C. ايليجانس خطوط التعبير عن هذا البروتين معلم مع بروتين فلوري وتحت سيطرة المروج لها كل منهما أو مروج الأنسجة على حدة (انظر المناقشة لاختيار المروج المناسبة). الحفاظ على الضغط عند 15 درجة مئوية باستخدام تقنيات قياسية في لوحات النمو ديدان أسطوانية (الحرس الوطني) المصنف مع OP50. على سبيل المثال، اخترنا سلالة دودة معربا عن بوليادينيلاتي-ملزمة البروتين (PAB-1) تنصهر في ن-المحطة إلى تاجرفب تحت سيطرة مروج عضلة البلعوم بميو-2-
-
في فيفو تقييم التغييرات في التجميع مع التقدم في السن على تثبيط الجينات للفائدة
- يوم أو يومين في وقت مبكر، إعداد نانوغرام/كاربينيسيلين (الكربوهيدرات)/لوحات إيبتج مع عنصر تحكم ([رني] موجه فارغ L4440) البكتيريا والبكتيريا [رني] لكبح الجين للفائدة. (بالنسبة لبروتوكول مفصلة حول [رني] في "جوف علوم التعليم قاعدة البيانات"، انظر C. ايليجانس . أساسيات علم الأحياء 1: الخميرة، المورفولوجية و C. ايليجانس. [رني] في C. ايليجانس. جوف، كامبريدج، ماجستير، دوي: 10.3791/5105 (2017)).
- [رني] العلاج من المستوى 1، فصل مكان وضع البيض الديدان على عدة لوحات صغيرة نانوغرام/الكربوهيدرات/إيبتج (قطرها 6 سم) المصنف مع التحكم [رني] أو [رني] البكتيريا للجينات للفائدة عند 20 درجة مئوية. إزالة الكبار بعد ح 2، الحفاظ الذرية في 20 درجة مئوية. لتجنب عيوب الإنمائية، يمكن أن تبدأ العلاجات [رني] بعد مرحلة اليرقات L4.
- وبمجرد الذرية تصل إلى مرحلة اليرقات L4، نقل هذه L4s على لوحات نانوغرام/الكربوهيدرات/إيبتج الجديد المصنف مع التحكم [رني] أو [رني] البكتيريا للجينات للفائدة. إعداد لوحات تسعة مع الوراثي 15 كل لكل الشروط والاحتفاظ بها في 20 درجة مئوية. الديدان الشيخوخة تحتاج إلى نقلها بعيداً عن ذريتهم إلى لوحات جديدة كل يوم الثاني حتى نهاية هذه الفترة الإنجابية ولكي تكون قادرة على التمييز بينها وبين ذريتهم.
- تقييم التغيرات في توزيع البروتين المعرضة للتجميع المسمى بعلامة نيون تحت مجهر فلوري ستيريو مع 24 x التكبير أثناء مرحلة البلوغ، كل يوم.
ملاحظة: تعتمد على العمر تراكم البروتين المعرضة للتجميع في بونكتا مشرقة كقراءة للتجميع. ينبغي أن تكون هذه بونكتا الهياكل العالية غير متحرك أن توصف بأنها المجاميع. وهذا ينبغي أن تحدده fluorescence الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. للبروتين المجمعة، ينبغي أن يراعي لا الانتعاش في منطقة المبيضة بعد دقيقة على الأقل 45،18. لقياس التغييرات مع التقدم في السن، ونحن سجل أنماط التوزيع في الديدان مزامنة العمر overexpressing PAB-1 في اليوم 2، ويوم 5، ويوم 7 من مرحلة البلوغ كالتالي: تدني مستويات التجميع (0-10 tagRFP::PAB-1 بونكتا في لمبة البلعوم الخلفي)، مستويات التجميع المتوسط (أكثر من 10 بونكتا في لمبة البلعوم الخلفي)، ومستويات التجميع عالية (أكثر من 10 بونكتا في لمبة البلعوم الأمامي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا باستخدام الأساليب التي عرضت هنا لتقييم الحيوانات كيف طويلة الأمد مع انخفاض IIS تعدل تجميع البروتين تعتمد على العمر. بالغربية لطخة (راجع الخطوة 2-2، سريعة استخراج البروتين غير قابلة للذوبان لتحليل لطخة غربية)، ونحن تحليله الإجمالي ومحتوى البروتين غير قابلة للذوبان من الشباب (اليوم 3 لسن البلوغ) والذين تتراوح أعمارهم بين (اليوم 18 سن الرشد) الديدان على التحكم [رني] وعلى [رني] استهداف الأنسولين/ منتدى إدارة الإنترنت-1-مثل مستقبلات داف-2. لاحظنا أي تغييرات كبيرة في مستويات البروتين الكلي مع التقدم في السن أو بين عنصر التحكم وداف-2 [رني] شروط (الشكل 2أ). كما هو متوقع، اكتشفنا زيادة قوية المتعلقة بالعمر في مستويات البروتينات العالية الذوبان في مراقبة الحيوانات (الشكل 2ب). وبالمقارنة بالحيوانات المعمرة في داف-2 [رني]، كان الميل التجميع تقلص إلى حد كبير. بروتين كامل تلطيخ مقتطفات غير قابلة للذوبان تكشف عن نمط فرقة بروتين أقل تعقيداً في مقتطفات من الديدان عمره 18 يوما على داف-2 [رني] مقارنة بالعمر مطابقة عناصر التحكم. أظهر التحليل الكمي الكتلي أن الحيوانات المعمرة مع انخفاض IIS عموما أقل من تجميع البروتينات المرتبطة بالعمر والأهم من ذلك تثبيط داف-2 تلغي تماما إينسولوبيليتي تعتمد على سن من مجموعة فرعية معينة من البروتينات7. لمتابعة هذه النتائج، ركزنا على واحد من هذه البروتينات المعرضة للتجميع، PAB-1. PAB-1 الجيش الملكي النيبالي-بروتين مع مجال "بريون--مثل" المتوقعة. وأكد تلطيخ جسم أن الحيوانات المعمرة الاحتفاظ PAB-1 القابلة للذوبان مع العمر (الشكل 2-ج).
في فيفو تحليل لتجميع PAB-1، ونحن إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن tagRFP::PAB-1 في عضلات البلعوم. في صغار الحيوانات، tagRFP::PAB-1 كان أساسا تصطبغ يقع في جميع أنحاء البلعوم (الشكل 3أ، مستوى التجميع "منخفض") ولكن مع التقدم في السن، لاحظنا تراكم تدريجي في مشرق بونكتا اعتبارا من المصباح البلعوم الخلفي ( الشكل 3A، مستوى التجميع "المتوسطة"). الشيخوخة، كما لاحظنا خلال التجميع في لمبة البلعوم الأمامية (الشكل 3أ، مستوى التجميع "عالية") في عدد متزايد من الحيوانات. بتجميع الحيوانات في هذه الفئات المختلفة، ونحن سجل معدل التراكم PAB-1 في عدد سكان. وكان معظم الديدان (88 في المائة) في اليوم الثاني من مرحلة البلوغ بلا أو بونكتا قليلة جداً ولم يتم اكتشاف لا الحيوانات بمستويات مرتفعة من التجميع. بالفعل في يوم 5، 19 في المائة من السكان أظهرت الوسيطة ومستويات التجميع ارتفاع نسبة 16 في المائة، بينما في يوم 7 أكثر من 70% من الديدان قدم مستويات التجميع المتوسطة والعالية. لتحليل تأثير طول العمر على تجميع تعتمد على سن tagRFP:PAB-1، نحن تولد الديدان tagRFP::PAB المعدلة وراثيا-1 مع طفرة داف-2 . وأظهرت هذه الحيوانات tagRFP:PAB انخفاضا كبيرا-1 تشكيل بونكتا مع الشيخوخة، مع أقل من 15% السكان نستعرض مستويات التجميع المتوسطة والعالية حتى في يوم 7 (الشكل 3ب).
باستخدام مختلف النهج الموصوفة هنا، نحن كشفت أن يمنع انخفاض IIS تجميع البروتين تعتمد على العمر بدرجات مختلفة والحيوانات المعمرة بكفاءة خاصة في استعادة ديناميات PAB-17.
الشكل 1 : التخطيطي لسير العمل لدراسة التغيرات في تجميع البروتين الطبيعي مع التقدم في العمر في C. ايليجانس. الخطوات الرئيسية جريئة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : إينسولوبيليتي البروتين يزيد مع التقدم في السن في مراقبة الحيوانات، ولكن ليس في الحيوانات مع مما يشير إلى انخفاض داف-2 - (أ) مجموع البروتين تلطيخ من مجموع جزء من يوم 3، ويوم 18 gon-2(-) طفرات تخضع للمراقبة و داف-2 [رني] (نمت عند 25 درجة مئوية). (ب) مجموع البروتين تلطيخ الكسر تستعصي على الحل مخزونات النشر الاستراتيجي من يوم 3، ويوم 18 gon-2(-) طفرات تخضع للمراقبة و داف-2 [رني] (نمت عند 25 درجة مئوية). لوحة نشرة من مرجع7. (ج) Immunoblot كشف PAB-1 في كسر الحزب الديمقراطي الصربي-تستعصي على الحل، وأشارت إلى نطاقات البروتين ذات الصلة بالسهم الأحمر. لوحة نشرة من مرجع7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مما يشير إلى انخفاض داف-2 يمنع تراكم بونكتا tagRFP::PAB-1 مع تقدم العمر. صور الممثل (A) من الديدان مع أوفيريكسبريسيون tagRFP::PAB-1 في عضلات البلعوم (مجهر التكبير عالية، تاجرفب الكشف عن إعدادات: الإثارة 558 شمال البحر الأبيض المتوسط، وانبعاث 583 nm). الحيوانات مع منخفضة (0-10 tagRFP::PAB-1 بونكتا في لمبة البلعوم الخلفي)، المتوسط (أكثر من 10 بونكتا في لمبة البلعوم الخلفي)، أو تظهر مستويات التجميع عالية (أكثر من 10 بونكتا في لمبة البلعوم الأمامي). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ب) التحديد الكمي لتجميع مختلف tagRFP::PAB-1 المستويات مع التقدم في السن في wildtype ويكشف خلفية متحولة داف-2 التجميع بشدة تأخر tagRFP::PAB-1 مع التقدم في السن في الحيوانات المعمرة. 2 يوم، ويوم 5، و يوم 7 daf-2(-) مقابل wildtype الخلفية، منخفضة مقارنة بمستويات التجميع متوسطة وعالية: اختبار فيشر الدقيق، * * *ف < 0.0001. لوحة نشرة من مرجع7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| حل الأسهم | المبلغ | التركيز النهائي | تعليقات/الوصف |
| ثقافة السائل، وحجم إجمالي 300 مل | |||
| S القاعدية (ل g 500 مل: 5.9 كلوريد الصوديوم، 50 مل م 1 بوتاسيوم فوسفات الهيدروجيني 6) | 200 مل | م 1 فوسفات البوتاسيوم الهيدروجيني 6: ل 1 l: 129 ز خ2ص4 مونوباسيك، 52 ز ك2هبو4 مائي لا مائي | |
| الحموضة سترات "البوتاسيوم م" 1 6 (ز 400 مل: 13.1 مونوهيدرات حامض الستريك، ز 134.4 ثلاثي بوتاسيوم سترات مونوهيدرات) | 3 مل | 10 ملم | |
| تتبع المعادن الحل (ز ل 1 l: 1.86 حمض الإيثيلين (يدتا)، 0.69 غ فيسو4 · 7 ح2س، ز 0.2 الحركة2 · 4 ح2س، ز 0.29 زنسو4 · 7 ح2س، ز 0.025 CuSO4 · 5 ح2س) | 3 مل | حل تخزين المخزون في الظلام عند 4 درجة مئوية | |
| 1 م MgSO4 (لغ 500 مل: 123.3) | ميليلتر 900 | 3 مم | |
| كاكل 1 م2 (لغ 500 مل: 73.5) | ميليلتر 900 | 3 مم | |
| 200 ميكروغرام/مل كاربيندازيم (50 مل: 10 ملغ في الميثانول) | 150 ميليلتر | 100 نانوغرام/مليلتر | |
| نسبة الكولسترول في الدم 5 ملغ/مل (على 100 مل: 0.5 ز في الإيثانول) | 300 ميليلتر | 5 ميكروغرام/مل | |
| المخزن المؤقت لاستخراج الملح عالية إعادة التجميع (رب)، 30 مل | |||
| 4-مورفولينيثانيسولفونيك م 1 حمض (MES) | 3 مل | 100 مم | RAB المخزون الاحتياطي المكون |
| 0.5 حمض اتهيلينيجليكولتيتراسيتيك متر (عطا) | 60 ميليلتر | 1 مم | RAB المخزون الاحتياطي المكون |
| 0.5 حمض م الإيثيلين (يدتا) | ميليلتر 6 | 0.1 مم | RAB المخزون الاحتياطي المكون |
| 1 م MgSO4 | 15 ميليلتر | 0.5 مم | RAB المخزون الاحتياطي المكون |
| كلوريد الصوديوم 5 م | 4.5 مل | 750 مم | RAB المخزون الاحتياطي المكون |
| 1 م فلوريد الصوديوم (NaF) | 600 ميليلتر | 20 مم | RAB المخزون الاحتياطي المكون |
| استكمال لمجموع مع ddH2س 30 مل | |||
| 50 × كوكتيل مثبط البروتياز | * | 2 x | * إضافة الكواشف بعد أخذ مقدار RAB الأسهم المخزن المؤقت التي هناك حاجة (للاستخراج الكتلي مل 6). |
| 100 مم فلوريد فينيلميثيلسولفونيل (بمسف) في الايزوبروبانول،-20 درجة مئوية | * | 1 مم | |
| 10 U/ميليلتر دناسي | * | 200 يو/مليلتر | |
| 4 مغ/مل رناسيا | * | 100 ميكروغرام/مل | |
| رب مع السكروز م 1، 30 مل | |||
| السكروز م 2 (ل 50 مل: 34.2 g) | 15 مل | م 1 | إضافة الكواشف المخزن المؤقت RAB إلى جانب دناسي ورناسيا |
| المخزن المؤقت للمقايسة (RIPA) راديويمونوبريسيبيتيشن، 30 مل | |||
| 1 م تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس) pH 8 | 1.5 مل | 50 مم | المعهد الملكي العازلة الأسهم المكون |
| كلوريد الصوديوم 5 م | مل 0.9 | 150 مم | المعهد الملكي العازلة الأسهم المكون |
| 0.5 يدتا م | 0.3 مل | 5 مم | المعهد الملكي العازلة الأسهم المكون |
| 10% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) | 1.5 مل | 0.50% | المعهد الملكي العازلة الأسهم المكون |
| ديوكسيتشولاتي الصوديوم 10% (SDO) | 1.5 مل | 0.50% | المعهد الملكي العازلة الأسهم المكون |
| نونيلفينيلبوليثيلينجليكول (NP40) | 0.3 مل | 1% | المعهد الملكي العازلة الأسهم المكون |
| استكمال لمجموع مع ddH2س 30 مل | |||
| 100 مم بمسف | * | 1 مم | * إضافة الكواشف بعد أخذ مقدار ريبا الأسهم المخزن المؤقت التي هناك حاجة (للاستخراج الكتلي 10 مل). |
| 50 × كوكتيل مثبط البروتياز | * | س 1 | |
| المخزن المؤقت لليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي، 10 مل | |||
| اليوريا | ز 4.8 | م 8 | |
| الحزب الديمقراطي الصربي 10% | 2 مل | 2% | |
| ديثيوثريتول (DTT) | 77 ملغ | 50 مم | |
| 1 م تريس pH 8 | 0.5 مل | 50 مم | |
| استكمال لمجموع مع ddH2س 10 مل | |||
| المخزن المؤقت للغسيل الكلوي، 1 لتر | |||
| تريس | ز 6 | 50 مم | |
| DTT | 154 ملغ | 1 مم | |
| 100 مم بمسف | 1 مل | 0.1 مم | |
| ضبط على درجة الحموضة 7.5 والكامل لمجموع 1 لتر مع ddH2س | |||
الجدول 1: المخازن المؤقتة لثقافة السائل واستخراج البروتين غير قابلة للذوبان والغسيل الكلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ونحن التقرير منهجية لعزل البروتين عالية الذوبان المجاميع من الشيخوخة C. ايليجانس تعرض ل [رني] لتحليل الطيف الكتلي والنشاف الغربية. ونحن تبين أن تحسين بروتيوستاسيس بخفض IIS إلى حد كبير يحول دون تجميع البروتين تعتمد على العمر. عن طريق تحديد البروتينات المعرضة لتجميع معين أوفيريكسبريس في C. ايليجانس، فمن الممكن كذلك تشريح آليات تحوير تجميع البروتين المتأصلة.
تجميع الملازمة للعمر تعتمد على البروتين مقابل تجميع البروتين المرتبط بالمرض
ويستند هذا العمل الحالي النتائج السابقة أن تجميع البروتين لا يقتصر على بروتينات محددة تجميع في سياق مرض. بالتركيز على البروتينات المعرضة لتجميع الذاتية بدلاً من اكتوبيكالي أعرب البروتينات المرتبطة بالمرض، ويتوقع تقديم رواية ثاقبة التنظيم الفسيولوجي لعملية التجميع. كما تم العثور على المجاميع البروتين تعتمد على العمر في مختلف المواقع الخلوية5، دراستهم كما ينبغي توفر نظرة ثاقبة حجرة آليات محددة لمراقبة الجودة. عموما، يمكن أيضا أن الآليات التي تتحكم في تجميع البروتين الكامنة ذات الصلة في منع المرض تجميع البروتين. من المذكرة، على الرغم من أن تجميع البروتين تعتمد على العمر يشبه في عدة جوانب المرض بروتين التجميع، لا يزال لم يتضح ما إذا كان يتضمن هذه المجاميع اميلويد ييفات، سمة من سمات العديد من الأمراض المجاميع.
اختيار ايليجانس جيم النموذجي: مزايا وقيود
بالمقارنة مع نموذج الثدييات، واحداً من أعظم مزايا استخدام C. ايليجانس لدراسة إحدى خصائص المتعلقة بالشيخوخة هو في فترة قصيرة جداً. استمرار أصبح عدة مئات من البروتينات عالية-التجميع--عرضه أثناء الشيخوخة وهذه الزيادة الكبيرة في إينسولوبيليتي يمكن كشفها بسهولة حتى مع استخراج بيوكيميائية مبسطة. بيد قيداً رئيسيا لاستخدام C. ايليجانس لدراسة البروتين العمر تعتمد على التجميع هو ضرورة عزل عدد كبير من الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين. C. ايليجانس المنحرفين، وتنتج ما يقرب من 220 أو ذرية أكثر خلال التناسلية المرحلة19، من الضروري لمنع الإنجاب أو القضاء على ذرية لعدد سكان في سن. تتوفر عدة خيارات للحث على العقم: خيار واحد استخدام فلوروديوكسيوريديني الكيميائية (فودر)، مثبط لتركيب الدنا. ومع ذلك، فودر يؤدي إلى العديد من الآثار الجانبية بما في ذلك التغيرات في بروتيوستاسيس وخفض البروتين تجميع20،،من2122. الأهم من ذلك، يدفع فودر الردود الخاصة بالنمط الوراثي23. وثمة خيار آخر استخدام طفرات العقيمة حساسة للحرارة. على سبيل المثال، spe-9(hc88)، fer-15(b26)، fem-1(hc17)، glp-1(e2141)، و gon-2(q388) قد استخدمت سابقا لتحليل الطيف الكتلي من العمر تعتمد على تجميع البروتين5، 8.
ومع ذلك هناك العديد من القيود المرتبطة باستخدام هذه المسوخ. أولاً، كما العقم تعتمد على درجة الحرارة، من الضروري أن تنمو الحيوانات عند 25 درجة مئوية، مما يشكل إجهاد معتدل ويسرع الشيخوخة، فضلا عن تجميع البروتين. على العكس من ذلك، أننا لاحظنا أن طفرات غون--2، glp-1 و fem-1 أطول عمرا مقارنة بالبرية من نوع عند الاحتفاظ عند 25 درجة مئوية (البيانات لا تظهر). ثانيا، هناك قيود محددة المرتبطة بكل نوع من عيب الإنجابية. عيب واحد من استخدام الحيوانات المنوية معيبة طفرات هو إنتاج بويضات المخصبة (تنتج أيضا في العمر البرية من نوع المنحرفين). نوعية هذه بويضات ينخفض إلى حد كبير مع التقدم في السن، وتتراكم في الغدد التناسلية24،25. يوضح التحليل الكمي الكتلي أن الحيوانات المنوية معيبة طفرات لها عدة إضعاف مستويات أعلى من البروتينات غير قابلة للذوبان تتراكم مع التقدم في السن بالمقارنة مع طفرات الغدد التناسلية-أقل أو تفتقر إلى الخط. وهذا يدل على ميسفولدينج البروتين والتجميع الموجود في الغدد التناسلية5، باﻻتفاق مع السابقة الدراسات12،13 و في فيفو تجارب الكشف عن البروتينات المجمعة تقع في البويضات غير طبيعية 5من المجموعات. ولذلك، يمكن أن يخفيها تجميع البروتين الزائد في الغدد التناسلية مزيد من التغييرات الطفيفة في تجميع البروتين في الأنسجة الجسدية. وهذا ينبغي أيضا النظر عند مقارنة التدخلات التي تتصرف بدرجات متفاوتة على بروتيوستاسيس الأنسجة الإنجابية وجسدية. ولذلك، لتقييم تجميع البروتين جسدية فقط، أننا نفضل استخدام طفرات الغدد التناسلية أقل غون-2 . سيكون بديل لاستخدام طفرات تفتقر إلى germline glp-1 . ومع ذلك، نلاحظ أن هذه الحيوانات قد تجميع البروتين الملازمة لأقل مع التقدم في السن بالمقارنة مع طفرات غون-2 5. هذا المرجح نتيجة لتحسين بروتيوستاسيس في الأنسجة الجسدية بسبب إشارات من germline-خلل الغدد التناسلية26،،من2728. وثمة بديل آخر هو استخدام الحيوانات البرية من نوع وإزالة ذرية كل يوم بالترسب. ومع ذلك، وهذه مشكلة نظراً لصعوبة إزالة تماما جميع ذرية.
حد عام آخر من استخدام C. ايليجانس هو صغر حجمها مما يجعل عمليات الاستخراج الأنسجة محددة صعبة. كما مثل الاستخراج الحيوان كله لا توفر المعلومات ذات الصلة بظروف مختلفة كيف تعدل تجميع البروتين في أنسجة محددة. من المذكرة، يمكن يحتمل أن التحايل على هذه المشكلة باستخدام أسلوب وضعت مؤخرا استناداً إلى فرز fluorescence تنشيط الخلية لعزل خلايا معينة من ايليجانس جيم-29. أنه لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت هذه الطريقة ستكون مناسبة للحصول على مواد كافية لاستخراج البروتين غير قابلة للذوبان وعما إذا كان سيكون تنطبق على الذين تتراوح أعمارهم بين الحيوانات. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يحقق تجميع البروتين محددة الأنسجة ولائحته بتجارب إضافية في فيفو . كالحيوانات المحورة وراثيا معربا عن بروتين معرضة لتجميع المسمى فلوريسسينتلي من خيار يمكن سرعة توليد وكما الحيوانات بشفافية، فمن السهل نسبيا لدراسة البروتين التجميع في الموقع.
وعموما، من الضروري لمتابعة نتائج البروتين مع تجارب في فيفو في خلفية البرية من نوع. المزيج من توصيف البيوكيميائية والقائم على الفحص المجهري تمكن دراسة شاملة لتجميع البروتين وتقييماً لدور الجينات للفائدة. يسر هذا الأخير في C. ايليجانس بوساطة من خلال تغذية وتوفر المكتبات [رني] الجينوم كله [رني]. وبالإضافة إلى ذلك، يوجد عدد كبير من طفرات تتسم لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من [رني] أو لاستخدامها بدلاً من [رني].
ثقافة السائل واستخراج البيوكيميائية: مزايا وقيود
كما مجمعة عالية البروتينات تشكل إلا نسبة ضئيلة من مجموع البروتينات، من الضروري البدء الاستخراج مع عدد كبير من الحيوانات. مع الحصول على كميات كبيرة من البروتينات غير قابلة للذوبان، ومن ثم أمكن القيام بتجزئة الببتيد واسعة النطاق تقليل تعقيد عينة الكتلي وبالتالي تحسين تحديد البروتينات وفيرة أقل. إلا إذا مطلوبة من كميات صغيرة من البروتينات غير قابلة للذوبان، هو بديل تنمو الديدان على لوحات وتجانسه لهم مع حبات السيراميك. واحدة من عيوب الثقافة السائل هو أن ثقافة كاملة في حالة تلوث، يتأثر ويجب التخلص منها. وبصفة عامة، C. ايليجانس الشيخوخة تتأثر بقوة بدرجة الحرارة وهذه المعلمة يجب أن تكون رقابة مشددة من ثقافة السائل لتجنب الاختلافات في تجميع البروتين تعتمد على العمر. التحكم في درجة الحرارة ضروري أيضا للحصول على عدد سكان متجانسة من الحيوانات الغدد التناسلية أقل عند استخدام طفرات gon-2(-) .
حسب هدف الدراسة، من المهم النظر في أساليب الاستخراج مختلفة. في البداية كان تكييف استخراج البيوكيميائية المعروضة هنا من البروتوكولات لعزل المجاميع المرتبطة بالمرض11،،من3031. لقد اخترنا تركيزات عالية نسبيا من المنظفات مثل الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% لعزل المجاميع غير قابلة للذوبان أكثر. أيضا التكوير الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% المجاميع غير قابلة للذوبان مع انخفاض سرعة الطرد المركزي، أن عزل هذا البروتوكول فقط المجاميع الكبيرة. وبدلاً من ذلك، كان بروتوكول أقل صرامة نشرت مؤخرا10. في هذه الدراسة، استخرجت أكثر من المجاميع للذوبان وأصغر أيضا بإهمال الحزب الديمقراطي الصربي واستخدام الطرد المركزي بسرعة عالية جداً في س 500,000 ز. مقارنة بين البروتوكولات المختلفة يظهر زيادة عامة في عدد البروتينات في البروتين تجميع باستخدام بروتوكول أقل صرامة7. ونلاحظ أن الحيوانات المعمرة مع انخفاض داف-2 مما يشير إلى كفاءة منع تراكم المخزونات القابلة للذوبان والمجاميع تستعصي على الحل الحزب الديمقراطي الصربي في الغدد التناسلية أقل الحيوانات7.
في فيفو تحليل لتجميع البروتين تعتمد على العمر
عند بناء نماذج معدلة وراثيا لتجميع البروتين تعتمد على العمر التالية، أنها ذات الصلة النظر في الأنسجة التي على أوفيريكسبريس البروتين المعرضة للتجميع للفائدة وعلى مستويات التعبير التي. أننا نفضل التعبير في الأنسجة الواقعة في منطقة الرأس لتجنب التداخل مع أوتوفلوريسسينسي، ودور بارز في الأمعاء الشيخوخة. تصور المسمى الفلورسنت المجاميع مع تضخم منخفض، ينبغي التعبير عن البروتين المعرضة لتجميع على مستوى عال نسبيا. من ناحية أخرى، التعبير عالية جداً سيؤدي البروتين المعرضة للتجميع بشكل مجاميع فعلا في صغار الحيوانات.
أخذت معا، هذه الأساليب سوف يساعدنا على فهم لماذا جزء من البروتين المجاميع مع التقدم في العمر، وتؤدي في نهاية المطاف إلى وضع استراتيجيات تعزيز الشيخوخة الصحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من دزني وماري كوري منحة الإدماج الدولي (322120 إلى D.C.D.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
