Summary
Цель метода, представленные здесь заключается в изучении агрегации белков во время нормального старения в организме модель C. elegans. Протокол представляет собой мощный инструмент для изучения весьма нерастворимых большие компоситы, которые формируют с возрастом и определить, как изменения в proteostasis воздействия агрегации белков.
Abstract
В последние десятилетия распространенность нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD), выросла. Эти расстройства, связанные с возрастом характерно появление белка агрегатов с фибриллово структурой в мозгах у этих больных. Почему именно обычно растворимые белки проходят процесс агрегации по-прежнему осознаются. Открытие, что агрегации белков не ограничивается процессов болезни и вместо этого частью нормального процесса старения включает изучение молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выразил человека болезни связанных белков. Здесь мы описываем методологии для изучения присущих белка агрегации в Caenorhabditis elegans через взаимодополняющих подходов. Во-первых мы изучим как выращивать большое количество синхронизированы возраст C. elegans для получения возрасте животные и мы представляем биохимическими процедурами изолировать высоко нерастворимые большие компоситы. В сочетании с целенаправленной генетических нокдаун, это позволяет вскрыть роль гена интереса к содействию или предотвращения агрегации белков зависит от возраста с количественного масс-спектрометрии с помощью либо всеобъемлющий анализ или кандидат-анализа на основе с антителами. Затем эти выводы подтверждаются в естественных условиях анализа с трансгенных животных, выражая люминесцентной меткой подверженных агрегации белков. Эти методы должны помочь разъяснить, почему некоторые белки склонны к совокупности с возрастом и, в конечном итоге, как сохранить эти белки полностью функциональной.
Introduction
Сворачиванию белков и агрегации признаются в качестве отличительной чертой нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как AD, PD, боковой амиотрофический склероз (ALS), frontotemporal деменции (FTD) и многие другие. К примеру α-synuclein сборок в амилоидных фибрилл, накапливаться Леви органов, особенно в Substantia PD больных, в то время как в ALS пациентов TDP-43 или Фу misfold к форме цитоплазматических агрегатов в вырождающихся двигательных нейронов. В каждом из этих нейродегенеративных расстройств механизмы поддержания гомеостаза белка или proteostasis не сможем предотвратить накопление смятых протеинов, следовательно, приводит к болезни.
Proteostasis имеет решающее значение для обеспечения клеточных функций, и в нормальных условиях эти механизмы регулирования плотно контролировать скорость синтеза белка, складные и деградации. Несколько исследований показывают, что с возрастом, постепенно нарушается способность многих клеток и органов сохранить гомеостаз белка и физиологические ухудшение proteostasis сетей с возрастом является важным фактором, усугубляющим нейродегенеративные заболевания (Обзор ссылки1,2,3). Тот факт, что контроль качества белков и клеточного ответа на стресс развернулось белка затрудняется с возрастом свидетельствует о том, что общим следствием старения может быть сворачиванию белков и агрегации. Действительно мы и другие показали, что агрегации белков не ограничивается болезни и вместо этого частью протеома становится весьма моющих средств нерастворимые в возрасте животных4,5,6,7 ,8,9,10. Вычислительные и в естественных условиях анализ показал, что эти физиологических возрастных агрегаты напоминают болезни агрегатов в нескольких аспектах5. Открытие эндогенные, возраст зависимых белков агрегации дает нам возможность вскрыть молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выраженной человеческие белки, связанных заболеваний. В настоящее время о регулировании нерастворимость широко белка и о последствиях этой регуляции на состояние здоровья организма существует лишь ограниченная информация.
Нематоды C. elegans является одним из наиболее подробно изученных модельных организмов в процессе старения исследований, как эти животные имеют относительно короткий срок и показать многие черты характерные старения, наблюдается в высших организмов. Последствия старения на белок нерастворимость в C. elegans , изучен последовательных биохимических фракционирования, на основе дифференциальных растворимость, который широко используется для извлечения болезни агрегатов в области исследований нейродегенеративные11 . Путем количественного масс-спектрометрии стать агрегации подверженных в C. elegans в отсутствие болезни5были показаны несколько сотен белков. Здесь мы подробно описать протокол выращивать большое количество червей в жидкой культуры и последовательное извлечение изолировать агрегированных белков для количественного определения масс-спектрометрии и анализа, Западная помарка. Потому что Протеолиз и подверженных агрегации белков накапливается в возрасте C. elegans гонад и маски изменения в другие соматические ткани5,12,13, мы используем Гонада менее мутант сосредоточиться анализ на белок нерастворимость в не репродуктивных тканях. Представлен метод позволяет анализ высоко нерастворимые, крупных агрегатов, которые нерастворимы в 0,5% SDS и гранулированных относительно низкой скоростью центробежные. Кроме того, был менее строгие протокол извлечения для сбора также меньшие и более растворимые агрегатов опубликованы в другом месте10. Кроме того мы описываем метод, используемый для оценки агрегации в естественных условиях в C. elegans.
В целом эти методы в сочетании с РНК-интерференции (RNAi) можно оценить роль гена интереса к модуляции агрегации белков зависит от возраста. Для этого мы описываем анализ выдержек из молодых и пожилых червей с и без нокдаун специфического протеина интереса, с помощью РНК-интерференции. Эти методы должны быть мощным инструментом, чтобы определить, какие компоненты сети proteostasis регулировать нерастворимость белка. Несколько мероприятий таких как снижение инсулина/инсулин подобный фактор роста (IGF) 1 сигнализации (IIS) показали значительно отсрочить старение C. elegans 14. Долголетие пути часто вызывают механизмов контроля качества протеина и таким образом эти пути могут активно влияющие на уровень агрегации белков. В качестве примера мы демонстрируем снижение присущие белка агрегации в долгоживущих животных при торможении путь IIS7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Для лучшего понимания процедуры, прилагается схема рабочего процесса (рис. 1).
1. рост большого числа молодых и пожилых C. elegans подвергается RNAi ориентации гена интереса
Примечание: Использование C. elegans температуры индуцированной стерильные gon-2(q388) мутантов (CF2253) для получения больших групп населения, престарелых синхронизированы. На всех этапах важно работать в полу стерильных условиях с открытым пламенем и проверка наличия без загрязнений (например, с грибками или бактериями). Выполните шаги (также centrifugations) при комнатной температуре, если температура не описано.
- Подготовка мутантов gon-2(-) C. elegans для получения Гонада менее животных
Примечание: Для получения стерильной животных, не хватает гонад, потеря функции мутации должны быть вызваны в родительского животных, сдвигая их на последней личиночной стадии (L4) до 25 ° C во избежание материнской вклад.- Первое расширение gon-2(-) животных для сбора родительского поколения для смены температуры
- Полоска Escherichia coli ОР50 напряжение на тарелку Lysogeny бульон (LB) и проинкубируйте его на ночь в 37 ° C.
- На следующий день инокуляции 200 мл LB средний с одной ОР50 клон и проинкубируйте его на ночь в 37 ° C.
- Следующий день семян 15 высокого роста (HG) среднего пластин (диаметр 9 см) с 0,5 мл ОР50 и распространять ОР50 с помощью шпателя. Держите пластин при комнатной температуре в течение двух дней.
- Кусок gon-2(-) животных (не голодали для последних двух поколений) на 15 HG среднего пластин семенами с ОР50 и поддерживать их при 20 ° C до тех пор, пока пластины вырожденная с взрослыми и некоторые ОР50 по-прежнему доступен.
- В то же время семян 60 HG средних пластины с ОР50 как описано в разделе Шаг 1.1.1.3 и держите пластин при комнатной температуре. Осторожно: Пластины в сеяный должны не храниться для более чем одной недели как агар треснет при комнатной температуре.
- Отбеливатель вырожденная пластин после того, как большинство взрослых начинают откладывать яйца как описано15. Собирать яйца в двух 15 мл трубы и место на nutating смеситель на ночь при 20 ° C.
- Следующий день мыть вылупились Л1С с M9 буфера (85 мм NaCl, 42 мм Na2HPO4·7H2O, 22 мм х2PO4): центрифуги на 3000 x g 30 s, удалить супернатант и заполнить до отметки 15 мл с M9. Центрифуги, удалить супернатант и повторите шаг 1.1.1.6. Заполните трубы с результате червь гранул до отметки 15 мл с M9.
- Оцените общее количество Л1С с микроскопом рассечение, считая Л1С в 2 мкл капли на плиты агара-семенами. Средние цифры, полученные из по крайней мере 9 капель.
- Добавьте 6500 Л1С в сеяный HG пластины и пусть червей расти при 20 ° C до стадии L4.
- Второе расширение gon-2(-) животных для получения Гонада менее животных для эксперимента
- На стадии L4 сдвиг червей от шага 1.1.1.9 до 25 ° C до тех пор, пока они начинают откладывать яйца и Л1С вылупления.
- Сбор яиц и Л1С путем седиментации
Примечание: После смены температуры до 25 ° C, предпочтительно использовать седиментации как мягкий метод для разделения хрупкие яйца и Л1С от взрослых.- Мыть тарелки с M9, используя 5 мл M9 в пяти плит. Перевод на 50 мл трубки червей.
- Заполните все трубы до отметки 45 мл с M9, пусть взрослые осадков примерно 10 мин, собирать каждый супернатант в 50 мл трубки и повторите этот шаг с Пелле. Центрифуга супернатанта, содержащий яйца и Л1С на 3000 x г за 1 мин, пусть Л1С осадков примерно 10 минут и удалить супернатант пока остаются 15 мл.
Примечание: Это важный шаг. Не удалить супернатант слишком рано, собирать столько Л1С как можно скорее. - Место пробирки, содержащие яйца и Л1С на смесителе nutating ночь в 25 ° C.
- Первое расширение gon-2(-) животных для сбора родительского поколения для смены температуры
- Жидкий культура Гонада менее животных для сбора молодых и пожилых животных, подвергается RNAi ориентации ген интереса
Примечание: Реакция некоторых генов РНК-интерференции может быть зависит от ранее описанных16температуры. В качестве альтернативы интерференции мутантного гена могут быть включены в gon-2(-) фона.- Подготовка бактерий для жидких культуры
- Подготовка ОР50 и интерференции бактерий (производит желаемого двуцепочечной ДНК и бактерий с пустой вектор как управления) путем прививки среднего LB 4 L с 12 мл соответствующих бактериальной культуры (добавить конечная концентрация 50 мкг/мл carbenicillin и 1 мм ИПТГ RNAi бактериальных культур) и инкубировать их при 37 ° C ночь в 180 об/мин.
- Следующий день урожая культур в 6700 g x 10 мин при 4 ° C. Удаление supernatants и Ресуспензируйте каждой гранулы в 60 мл ледяной S базальной СМИ (100 мм NaCl, 50 мм калия фосфат рН 6, хранится на льду). Держите три ресуспензированы гранулы (ОР50, контролировать RNAi бактерии и бактерии RNAi для гена интереса) при 4 ° C до шага 1.2.2 или 1.2.3.
Примечание: Червей можно выращивать на интерференции от L1 стадии (см. шаг 1.2.3) или избежать дефектов развития от последней личиночной стадии L4 (см. шаг 1.2.2).
- Жидкий культура для лечения с RNAi начиная наконец личиночной стадии L4
- Добавить 200 мл S базальной СМИ в колбе Fernbach культуры (емкость 2,800 мл). Для окончательного культуры объем 300 мл (см. 1.2.2.4), добавить 10 мм цитрат калия, рН 6, 3 мл раствора металлов трассировки (5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 2,5 мм FeSO4, 1 мм НКД2, 1 мм ZnSO4, 0,1 мм CuSO4), 3 мм MgSO4 , 3 мм CaCl2, карбендазим 100 нг/мл и 5 мкг/мл холестерин). Закройте колбу с мембраной колпачок. Обратитесь к таблице 1 для рецепты буферов.
- Возьмите Л1С из 25 ° C (шаг 1.1.2.2.3) и передавать их для 15 мл пробирок. Центрифуга на 1900 x g на 3 мин, удалить супернатант и рассчитывать Л1С за 2 мкл как шаг 1.1.1.8. Добавьте 500 000 Л1С в колбу Fernbach культуры, подготовленный на предыдущем шаге.
- Добавьте ОР50 (от шаг 1.2.1) пропорционально на количество червей. Например для 500 000 червей добавьте 60 мл ОР50.
- Полный червь культуры с S базальной довести объем до 300 мл. Инкубируйте червь культуры до стадии L4 при 25 ° C в тряску инкубатор с 150 об/мин.
- Следующий день, черви должны быть размер одичал типа L4s. Чтобы изменить от ОР50 интерференции бактерий, собирать животных в шести 50 мл трубы, пусть отложений и удалить супернатант. Мыть L4s с M9 для удаления остаточных ОР50 бактерий: центрифуги на 1900 x g на 3 мин, удалить супернатант и передачи всех L4s в 50 мл. Граф L4s за 5 мкл (по крайней мере девять раз). Два раза 50000 L4s необходимы для коллекции молодого червя и два раза 100000 L4s необходимы для коллекции возрасте червя.
- Подготовка четырех Fernbach культуры колбы, как описано в 1.2.2.1. Добавьте также конечная концентрация 50 мкг/мл Carbenicillin и 1 мм ИПТГ каждый флакон.
- Добавьте элемент управления RNAi бактерии и бактерии РНК-интерференции для гена интереса (от шаг 1.2.1) пропорционально на количество червей: добавить 7 мл соответствующих бактерий за флакон для молодых глистов и 14 мл флакон для возрасте от червей.
- Добавить 50.000 червей за флакон для коллекции молодого червя и 100 000 червей за флакон для коллекции возрасте червя и завершить культур с S базального чтобы заполнить до 300 мл. Инкубируйте червь культур (четыре в общей сложности) при 25 ° C и 150 об/мин.
- Жидкий культура для лечения с интерференции, начиная на стадии L1
- Подготовка четырех Fernbach культуры колбы, как описано в 1.2.2.1 и добавить конечная концентрация 50 мкг/мл carbenicillin и 1 мм ИПТГ.
- Продолжайте подготовку Л1С как описано в 1.2.2.2. В общей сложности 300 000 червей необходимо разделить их на четыре колбы.
- Добавьте элемент управления RNAi бактерии и бактерии РНК-интерференции для гена интереса (от шаг 1.2.1) пропорциональна количество червей, как описано в разделе Шаг 1.2.2.7 и рассмотреть также фазы роста между L1 и L4 этап: добавить 13 мл соответствующих бактерий за флакон для молодых w Орма и 26 мл флакон для возрасте от червей.
- Продолжайте, как описано в шаге 1.2.2.8.
- Техническое обслуживание C. elegans жидкого культур
- Периодически собирать Алиготе от каждого жидкого культуры и место на слайде стекла (в качестве альтернативы на плите агар) чтобы убедиться, что есть без загрязнений. С помощью микроскопа рассечение, проверьте уровень бактериальной продовольствия в культуре особенно во время фазы роста. Заранее подготовить 2 L культуры управления RNAi бактерии и бактерии РНК-интерференции для гена интереса, как описано в пункте 1.2.1. При необходимости добавьте их в C. elegans жидкого культур и сохранить остальные при 4 ° C.
- Периодически проверяйте, что животные являются стерильными. Большинство животных не будет иметь гонад. В зависимости от пенетрантностью мутации ПН-2 некоторые могут прервать гонадной структур, но не животных с яйца должны соблюдаться.
- Подготовка бактерий для жидких культуры
- Коллекция молодых и пожилых червей, подвергается RNAi в жидком культуре
Примечание: Следующие шаги все для одной колбе культур в жидкой среде, но обе культуры того же возраста с контролем и интерференции бактерий для гена интереса должны обрабатываться вместе.- Собирают молодые черви на день 2 или 3 для измерения Базальные уровни белка нерастворимость. Возрасте черви должны собираться (позднее), когда половина населения умер. Чтобы определить это, живые и мертвые червей, учитываются в нескольких капель жидкого культуры размещены на плите агар. Коэффициенты усредненное по крайней мере 9 капель.
- Подготовка следующих реагентов: 1 L M9, 1 L M9 с 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) и 40 мл 60% сахарозы в ddH2O. держать реагентов на льду.
- Налейте червей из одной колбе в воронку разделения и пусть черви осадков за 10 мин при комнатной температуре. Открыть кран и капать червей в один тюбик 50 мл.
- Разделить гранулы червя на два 15 мл трубы и центрифуги на 1900 x g 5 мин при комнатной температуре. Моют червей, удалить супернатант и заполнить до 15 мл с M9. Повторите центрифугирования. Наконец передать два 50 мл трубки червей и заполнить до общего объема 20 мл с ледяной M9.
- Чтобы удалить бактерии и мертвых червей, добавить два 20 мл разбавленной червь гранулы для двух 50 мл трубы заполнены с 20 мл ледяной 60% сахарозы. Быстро центрифуги на 2700 g x 5 мин при комнатной температуре, ускорение 9 и замедления 7. Осторожно удалите слой верхней червя с большой пипетки (25 мл). Занять до 15 мл (но меньше, если есть, очевидно, много мертвых червей). Положите это прямо в 37 мл M9 + Octoxynol-9 (3 трубки на сахарозу трубки), подготовленный на льду. Центрифуга на 2700 x g 3 мин при комнатной температуре, ускорение, замедление 7 и 9.
Примечание: Оба должны быть ледяной; в противном случае разделение не будет работать. Не следует смешивать! Потому что сахароза является токсичным для червей важно быть быстрым для следующего шага. - Разделить гранулы на четыре 15 мл трубы и мыть дважды с ледяной M9 + Octoxynol-9: Центрифуги в 1900 x g 1 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант, заполнить до отметки 15 мл с ледяной M9 + Octoxynol-9 и повторите процедуру.
- Один раз мыть с ледяной M9 и объединить четыре трубы для двух труб. Заполнить с M9 при комнатной температуре до общего объема по 4 мл в 15 мл трубы и повернуть на nutating смеситель при 25 ° C для 40 мин.
Примечание: Это помогает черви дайджест любого остаточного бактерий в кишечнике. Проверьте червей под микроскопом, чтобы увидеть, что есть нет мертвых. - Моют червей дважды с ледяной M9 + Octoxynol-9, как описано в 1.3.5. Мыть дважды с M9 и передать одной трубки червей.
- Один раз мыть червей в буфере высоким соли извлечения сборка (RAB) без ингибиторы (0,1 М 4-morpholineethanesulfonic кислота (МЧС), 1 мм ethyleneglycoltetraacetic кислоты (EGTA), 0,1 мм ЭДТА, 0,5 мм MgSO4, 0,75 М NaCl, фторид натрия 0,02 М (NaF)) до коллекции. Удалите супернатант до тех пор, пока не жидкости на вершине червь Пелле.
Примечание: Этот шаг и следующий должно быть сделано быстро избежать артефактов в глистах, вызванные высокой концентрации соли в буфере. - Оценить объем червь гранул и добавить идентичные объем раб с ингибиторами (2 x коктейль ингибитор протеазы). С помощью пипетки Пастера, составить червей и медленно заливайте в 50 мл трубки, наполовину заполненный жидким азотом, помещены в сухой лед. Пусть жидкого азота испаряются и хранить замороженные червей-80 ° c до дальнейшей обработки.
Предупреждение: Жидкий азот является крайне низкой температуре; надевайте соответствующую защиту.
2. нерастворимого белка добычу с молодых и пожилых животных, подвергается RNAi ориентации ген интереса
-
Срыв животных, собранных в шаге 1.3
Примечание: Важно избежать любых оттаивания образцов червя. Охладить вниз раствор с жидким азотом и выполнить всю процедуру на сухой лед.
Предупреждение: Жидкий азот является крайне низкой температуре; надевайте соответствующую защиту.- Передача замороженных червей с предварительно охлажденным раствором и растереть для 2,5 мин.
Примечание: Будьте внимательны во время шлифования: в начале, замороженные черви находятся в небольших пуль, и это легко потерять их. - Добавьте порошок, чтобы охладить его снова и шлифуют еще 2,5 мин Check с микроскопом, что червь тела сломаны жидкого азота (около 100 мл). Передача порошка в 2 мл пробирок и хранить их при температуре-80 ° C.
- Передача замороженных червей с предварительно охлажденным раствором и растереть для 2,5 мин.
-
Быстрый нерастворимого белка добычу для Западный анализ помаркой
Примечание: Используйте этот метод для сравнения общего белка контента и нерастворимого белка уровнях между различных дней с и без интерференции, ориентация гена интереса. Выполните все шаги до шага 2.2.3 на льду!- Солюбилизировать последнего 50 мг земле червей из шаг 2.1 с 150 мкл Radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера (50 мм трис рН 8, 150 мм NaCl, 5 мм ЭДТА, 0,5% лаурилсульфат натрия (SDS), 0,5% Дезоксихолат натрия (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF), 1 x коктейль ингибитор протеазы). Однородный подвеска, используя шприц 1 мл с серым иглы (27 G x ½", 0,4 мм х 13 мм); составить подвеска 10 раз.
- Центрифуга на 18400 x g 20 мин при 4 ° C. Соберите супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле в 100 мкл Буфер RIPA и центрифуги на 18400 g x 20 мин при 4 ° C. Отменить супернатанта, вскоре спина и будьте осторожны, чтобы удалить остатки супернатант.
- Чтобы солюбилизировать последнего высоко нерастворимые белки, Ресуспензируйте гранулы в 75 мкл буфера мочевины/SDS (8 M мочевины, 2% SDS, 50 мм Дитиотреитол (DTT), 50 мм трис, рН 8) и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Чтобы проанализировать содержание общего белка, объедините первый RIPA супернатанта от шага 2.2.2 и ресуспендирования гранулы мочевины/СДП. Для учета используется для извлечения томов, Общая часть должна содержать две трети RIPA супернатанта и одна треть фракции гранулы мочевины/SDS. На небольшой 4-12% гель градиента Проверьте уровни нерастворимых белков путем загрузки 9 мкл мочевины/SDS дроби и 4 мкл всего комбинированного белка. Выполнение общего белка окраски пятно для мониторинга уровня белка. На западной blotting, с использованием специфических антител, проверить изменения в нерастворимость для индивидуальных белков, количественно по масс-спектрометрии (см. раздел 3).
-
Экстракция нерастворимого белка изолировать SDS-нерастворимые белки для масс-спектрометрия
Примечание: Выполните все шаги на льду.- Сухой лед весят в два раза 350 мг земле червей на момент времени и на RNAi бактерий (молодых и пожилых червей, управления RNAi бактерий и РНК-интерференции бактерий для гена интереса) в 2 мл пробирок.
- Чтобы удалить высоким соли растворимые белки, добавьте два тома на вес (700 мкл) раб с ингибиторами, 1 мм PMSF, 200 ед/мл DNase я и 100 мкг/мл РНКазы A каждой трубки и солюбилизировать последнего порошок на льду. Составить подвеска в 1 мл шприц (серый иглы, 27 G x ½", 0,4 мм х 13 мм) 15 раз и инкубировать на льду за 10 мин центрифуги 18400 g x 20 мин при 4 ° C. Пройти через слой жира и собирать супернатанта, с высоким содержанием соли растворимые белки в один 2-мл пробирку за состояние (четыре трубы в общей сложности). Удалить жир и выбросьте его. Аликвота высоким соли растворимые белки для замораживания при температуре-80 ° C.
- Чтобы отменить липиды, солюбилизировать последнего лепешка с 700 мкл раб с ингибиторами, содержащие 1 М сахарозы (без DNase I и РНКазы A). Составить подвеска в шприц 10 раз и инкубировать на льду на 5 мин центрифуги на 18400 g x 20 мин при 4 ° C. Будьте осторожны, чтобы удалить все супернатант и липидов и отбросить их.
- Чтобы удалить SDS-растворимые белки, солюбилизировать последнего лепешка с 700 мкл Буфер RIPA. Составить подвеска в шприц 10 раз и проинкубируйте втечение 10 мин на льду. Центрифуга на 18400 x g 20 мин при 4 ° C. Собирать супернатанта, содержащие SDS-растворимые белки и Алиготе для замораживания при температуре-80 ° C.
- Объединить два образца каждого условия вместе после растворяющие каждой лепешки с 500 мкл Буфер RIPA. Составить подвеска в шприц 10 раз. Центрифуга на 18400 x g 20 мин при 4 ° C. Будьте осторожны, чтобы удалить все супернатант и выбросьте его.
Примечание: Цель извлечения является отделить растворимые белки от нерастворимых белков. Таким образом важно удалить все остаточные RIPA супернатанта перед добавлением муравьиной кислоты в следующем шаге. - Солюбилизировать последнего окончательный гранулы, содержащие весьма нерастворимые белки с 400 мкл 70% муравьиной кислоты и составить подвеска в шприц 20 раз. Проинкубируйте втечение 20 мин на льду. Центрифуга на 50 000 x g 20 мин при 4 ° C, ускорение 3 и замедления 5, для удаления червя кутикулы мусора. Собирать супернатанта, содержащий высоко нерастворимые белки и заморозить при температуре-80 ° C.
- Диализ нерастворимых белковых фракций для масс-спектрометрия
Примечание: Dialyze на 4 ° C.- Подготовка 8 L диализа буфера (50 мм трис, 1 DTT, 0,1 мм PMSF, рН 7,5) и разделить на восемь 1 Л мензурки. Поместите три мембраны (мембранные фильтры = 0,025 мкм) на поверхности буфера для каждого стакан емкостью 1 Л.
- На мембрану тщательно нагрузки 65 мкл нерастворимого белка, солюбилизирован в муравьиной кислоты, полученный на шаге 2.3.6. Каждое условие делится на шесть мембраны.
- Проверьте рН одного образца, удалив 5 мкл и добавив его на полосы рН. Если pH между 7 и 8 (примерно через 2 ч), соберите образца, закупорить вверх и вниз осторожно. Наконец используйте 10 мкл буфера диализа для стирки осадок от каждого мембраны. Замораживание образцов-80 ° c.
3. всеобъемлющее выявление и количественная оценка изменений в нерастворимость белка с возрастом, индуцированной интерференции, ориентация ген интереса
-
Подготовка для анализа спектрометрии массы
- Оцените количество нерастворимых белков в dialyzed образцах путем загрузки Алиготе на 4-12% градиента гель вместе с эталонного образца известной концентрации. Выполнение общего белка Пятнать геля и количественно оценить объем белка с программным обеспечением анализа изображений. Этот шаг необходим для оценки объема трипсина, необходимые для пищеварения (шаг 3.1.4).
- Концентрат образцы с помощью центробежных испарителя и солюбилизировать нерастворимые белки в конечной концентрации мочевины 8 M последнего.
- Алкилирование и сокращение
- Добавить Tris(2-carboxyethyl) фосфин гидрохлорид (TCEP) до конечной концентрации 4 мм для образцов. Инкубируйте 1 час при 57 ° C с 300 об/мин. Поместите образцы до комнатной температуры.
- Добавьте iodoacetamide в конечной концентрации 8,4 мм. Проинкубируйте его 45 мин (можно инкубировали в течение 2 ч) в темноте при комнатной температуре.
- Развести образцы в бикарбонат аммония 150 мм для получения конечной концентрации мочевины 2 М.
- Дайджест белки с 5% w/w изменение трипсина на ночь при 37 ° C и 400 об/мин.
- Загрузить образец переваренной белков на 12% гель SDS и выполнения общего белка Пятнать геля для анализа если пищеварение работал. Если есть еще некоторые группы настоящее, повторите шаги 3.1.4 и 3.1.5.
- Пептиды из молодых и пожилых контроль и лечение RNAi C. elegans помечены Изобарический теги для относительной и абсолютной количественный следуя инструкциям производителя.
Примечание: в качестве альтернативы, другие методы для маркировки пептидов и белков может использоваться для количественной оценки таких массовых Теги тандем.
Примечание: Массовое спектрометрирование анализ: для уменьшения сложности образца, пептиды должны быть разделены сильный катионообмен хроматографии на различные фракции для масс-спектрометрии анализа5. Несколько масс-спектрометры способны анализировать Изобарический теги для относительной и абсолютной количественный как описано17. Полученные данные должны быть обработаны с соответствующим программным обеспечением. В целом этот анализ позволяет выявить весьма нерастворимых белков и их изменения на возраст и на proteostasis модуляции.
4. в естественных условиях оценки влияния гена интереса на шаблоне агрегации во время старения
- Из анализа масс-спектрометрии в разделе 3 Выберите возраст зависимой агрегации подверженных белок, который накапливается в разной степени в животных, подвергается RNAi. Создание трансгенных C. elegans линии, выражая этот протеин тегами с флуоресцентный белок и под контролем своих соответствующих промоутер или ткани конкретной промоутера (см. обсуждение для выбора соответствующей промоутер). Поддерживайте стандартные методы на тарелках нематода роста (НГ), семенами с ОР50 деформации при 15 ° C. Например, мы выбрали червь штамм, выражая polyadenylate связывающий белок (PAB-1) сливается в N-terminus в tagRFP под контролем promotor глоточных мышц pmyo-2.
-
В естественных условиях оценки изменений в агрегате с возрастом при торможении гена интереса
- Одного-двух дней заранее, подготовить нг/carbenicillin (Carb) / IPTG плиты с элементом управления (пустой вектор RNAi L4440) бактерии и интерференции бактерии подавляют гена интереса. (Для подробного протокола о РНК-интерференции у нематоды Caenorhabditis elegans см JoVE науки образования базы данных. Основы биологии 1: дрожжи, Дрозофилы и C. elegans. РНК-интерференции у нематоды Caenorhabditis elegans. Зевс, Кембридж, Массачусетс, doi: 10.3791/5105 (2017)).
- Для лечения RNAi от L1 место яйцекладка червей на несколько отдельных небольших пластин нг/карбюратора/IPTG (6 см в диаметре), семенами с управления RNAi или бактерии РНК-интерференции для гена интереса при 20 ° C. Удаление взрослые через 2 ч, сохраняя потомства при 20 ° C. Чтобы избежать дефектов развития, RNAi лечения может быть запущен после L4 личиночной стадии.
- Как только потомство достигает личиночной стадии L4, передача этих L4s на новые пластины нг/карбюратора/IPTG семенами с управления RNAi или бактерии РНК-интерференции для гена интереса. Установить до девяти плит с 15 мутация для обоих условий и держать их на 20 ° C. Черви старения должны быть переданы от их потомства на новые пластины каждый второй день до конца их репродуктивный период для того, чтобы иметь возможность отличать их от их потомство.
- Оцените изменения в распределении подверженных агрегации белков, помечены флуоресцентные метки под микроскопом флуоресцентный стерео с 24 крат во взрослом возрасте, каждый день.
Примечание: Возраст зависимых накопление подверженных агрегации белков в ярких puncta используется как считывания для агрегации. Эти puncta должно быть весьма неподвижной структур можно охарактеризовать, как агрегатов. Это должно определяться флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание (FRAP) с помощью конфокальной микроскопии. Для агрегированных белка не восстановления должны соблюдаться в регионе отбеленной после по крайней мере 4 мин5,18. Для количественной оценки изменения с возрастом, забили моделей распределения в возрасте синхронизированы червей, экспрессирующих PAB-1 на 2 день, день 5 и 7 день совершеннолетия следующим: низкие уровни агрегации (tagRFP::PAB-1 puncta 0-10 в задней глотки лампы), Уровни средних агрегации (более 10 puncta в задней глотки лампы) и уровни высокой агрегации (более 10 puncta в передней глоточные лампочку).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали методы, представленные здесь, чтобы оценить как долгоживущие животные с сокращением IIS модулировать агрегации белков зависит от возраста. По Западной блот (см. шаг 2,2, быстрого извлечения нерастворимых белков для Западный анализ помаркой), мы проанализировали общий и содержание нерастворимых белка молодых (3 день совершеннолетия) и возрасте (18 день совершеннолетия) червей управления RNAi и на РНК-интерференции на инсулин / IGF-1-подобных рецепторов daf-2. Мы наблюдали не большие изменения уровня общего белка с возрастом или между элементом управления и daf-2 RNAi условий (рисA). Как и ожидалось, мы обнаружили сильное увеличение связанных с возрастом в уровнях высоко нерастворимые белки контрольных животных (рис. 2B). В сравнении в долгоживущих животных на daf-2 интерференции агрегации склонность была значительно снижена. Общий белок пятнать нерастворимых экстрактов показали менее сложный узор группы белков в экстрактах из 18-дневного червей на daf-2 интерференции, по сравнению с соответствием возраст элементов управления. Количественного масс-спектрометрии анализ показал, что долгоживущие животные с сокращением IIS общую меньше возраста связанные белком агрегации и главное, ингибирование daf-2 полностью отменены возрастные нерастворимость в определенное подмножество белки7. Последующей деятельности на эти выводы мы сосредоточились на одной из этих подверженных агрегации белков, PAB-1. PAB-1 является РНК-белок с доменом предсказал «китовая птичка как». Пятнать антитела подтвердил, что долгоживущие животные сохранить PAB-1 растворимая с возрастом (рис. 2C).
Для анализа в vivo комплексирования PAB-1 мы подготовили трансгенных животных, выражая tagRFP::PAB-1 в глоточных мышц. В молодых животных tagRFP::PAB-1 был главным образом диффузно расположен на протяжении глотки (рис. 3A, уровень агрегирования «низкий»), но с возрастом, мы наблюдали постепенного накопления в ярких puncta, начиная с задней глотки лампы ( Рисунок 3A, уровень «промежуточных» агрегирования). Во время старения, мы также наблюдали агрегации в передней глоточные лампы (рис. 3A, уровень агрегирования «высокий») в возрастает количество животных. Путем группирования животных в этих различных категорий мы забили уровень агрегирования PAB-1 в популяции. На 2 день совершеннолетия большинство червей (88%) никто или очень немногих puncta и не животных с высоким агрегации уровни были обнаружены. Уже в день 5 19% населения показал промежуточных и уровней высокой агрегации 16%, в то время как в день более чем 70% 7 червей представлена агрегации среднего и высокого уровня. Чтобы проанализировать влияние долголетия на возраст зависимой агрегации tagRFP:PAB-1, мы создали червей трансгенных tagRFP::PAB-1 с мутацией daf-2 . Эти животные показали значительно более tagRFP:PAB-1 puncta образование с возрастом, с менее чем 15% населения, даже выставке агрегации среднего и высокого уровней день 7 (рис. 3B).
С помощью различных подходов, описанных здесь, мы показали, что сокращение IIS предотвращает возрастные белка агрегации в различной степени и долгоживущие животные особенно эффективны в восстановлении динамики PAB-17.
Рисунок 1 : Схема рабочего процесса для изучения изменений в агрегате присущие белка с возрастом в C. elegans. Основные шаги отображаются полужирным шрифтом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Нерастворимость белка увеличивается с возрастом животных управления, но не в животных с сигнализацией сокращено daf-2 . (A) общий белок пятнать фракции всего от 3 день и день 18 gon-2(-) мутантов подвергается контролю и daf-2 интерференции (выросла на 25 ° C). (B) общего белка окраски фракции СДП нерастворимые от 3 день и день 18 gon-2(-) мутантов подвергается контролю и daf-2 интерференции (выросла на 25 ° C). Группа повторно опубликовать их из ссылки7. Иммуноблот (C) обнаружения PAB-1 в фракции СДП нерастворимые, соответствующие белка полосы указывается красными стрелками. Группа повторно опубликовать их из ссылки7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Уменьшение daf-2 сигнализации предотвращает накопление puncta tagRFP::PAB-1 с возрастом. (A) представитель фотографии червей с tagRFP::PAB-1 гиперэкспрессия глоточных мышц (высокое увеличение микроскопа, tagRFP параметры обнаружения: возбуждения 558 Нм, выбросов 583 Нм). Животные с низкой (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta в задней глотки лампы), средний (более 10 puncta в задней глотки колбы), или показаны уровни высокой агрегации (более 10 puncta в передней глоточные лампочку). Шкалы бар = 20 мкм. Количественная оценка (B) комплексирования разных tagRFP::PAB-1 уровнях с возрастом в wildtype и daf-2 черепашки фон показывает агрегации сильно задержки tagRFP::PAB-1 с возрастом в долгоживущих животных. 2 день, день 5 и 7 день daf-2(-) против wildtype фон, низкая по сравнению с агрегации среднего и высокого уровней: точный тест Фишера, ***p < 0,0001. Группа повторно опубликовать их из ссылки7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Стоковый раствор | Сумма | Конечная концентрация | Комментарии/описание |
| Культур в жидкой среде, общий объем 300 мл | |||
| S базальную (для 500 мл: 5,9 г NaCl, 50 мл 1 M калия фосфат рН 6) | 200 мл | 1 M калия фосфат рН 6: для 1 L: 129 g KH2PO4 монокальций, 52 g K2HPO4 двуосновной безводный | |
| 1 M калия цитрат рН 6 (по 400 мл: 13,1 г лимонной кислоты моногидрат, 134.4 g tri калия цитрат моногидрат) | 3 мл | 10 мм | |
| Проследить металлов раствора (для 1 L: 1,86 г Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,69 г FeSO4 · 7 H2O, 0,2 г НКД2 · 4 H2O, 0,29 г ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 г CuSO4 · 5 H2O) | 3 мл | Стоковый раствор хранить в темноте при температуре 4 ° C | |
| 1 М MgSO4 (для 500 мл: 123.3 g) | 900 МКЛ | 3 мм | |
| 1 М CaCl2 (для 500 мл: 73,5 g) | 900 МКЛ | 3 мм | |
| Карбендазим 200 мкг/мл (для 50 мл: 10 мг в метаноле) | 150 МКЛ | 100 нг/мл | |
| 5 мг/мл холестерин (на 100 мл: 0,5 g в этанол) | 300 МКЛ | 5 мкг/мл | |
| Сборка (RAB) высоким соли извлечения буфер, 30 мл | |||
| 1 M 4-Morpholineethanesulfonic кислота (MES) | 3 мл | 100 мм | РАБ запасов буфер компонента |
| 0.5 М Ethyleneglycoltetraacetic кислоты (EGTA) | 60 МКЛ | 1 мм | РАБ запасов буфер компонента |
| 0.5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | 6 МКЛ | 0,1 мм | РАБ запасов буфер компонента |
| 1 М MgSO4 | 15 МКЛ | 0,5 мм | РАБ запасов буфер компонента |
| 5 М NaCl | 4.5 мл | 750 мм | РАБ запасов буфер компонента |
| Фторид натрия 1 М (NaF) | 600 МКЛ | 20 мм | РАБ запасов буфер компонента |
| Завершить до 30 мл с ddH2O | |||
| 50 x коктейль ингибитор протеазы | * | 2 x | * Добавить реагентов после того, как принимая количество акций буфера раб, что необходима (для извлечения для масс-спектрометрии 6 мл). |
| 100 мм Phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) в изопропаноле,-20 ° C | * | 1 мм | |
| 10 DNaseI U/мкл | * | 200 ед/мл | |
| 4 мг/мл RNaseA | * | 100 мкг/мл | |
| РАБ с 1 М сахарозы, 30 мл | |||
| 2 М сахарозы (для 50 мл: 34,2 g) | 15 мл | 1 M | Добавьте буфер реагенты раб помимо DNaseI и RNaseA |
| Буфер Radioimmunoprecipitation проба (RIPA), 30 мл | |||
| 1 М трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris) рН 8 | 1,5 мл | 50 мм | Компонент запасов Буфер RIPA |
| 5 М NaCl | 0,9 мл | 150 мм | Компонент запасов Буфер RIPA |
| 0.5 М ЭДТА | 0,3 мл | 5 мм | Компонент запасов Буфер RIPA |
| Лаурилсульфат натрия 10% (SDS) | 1,5 мл | 0,50% | Компонент запасов Буфер RIPA |
| Дезоксихолат натрия 10% (SDO) | 1,5 мл | 0,50% | Компонент запасов Буфер RIPA |
| Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) | 0,3 мл | 1% | Компонент запасов Буфер RIPA |
| Завершить до 30 мл с ddH2O | |||
| 100 мм PMSF | * | 1 мм | * Добавить реагентов после того, как принимая количество акций Буфер RIPA, необходима (для извлечения для масс-спектрометрии 10 мл). |
| 50 x коктейль ингибитор протеазы | * | 1 x | |
| Мочевина/SDS буфер, 10 мл | |||
| Мочевина | 4,8 г | 8 M | |
| 10% SDS | 2 мл | 2% | |
| Дитиотреитол (DTT) | 77 мг | 50 мм | |
| 1 М трис рН 8 | 0,5 мл | 50 мм | |
| Завершить к 10 мл с ddH2O | |||
| Диализ буфер, 1 Л | |||
| Трис | 6 g | 50 мм | |
| DTT | 154 мг | 1 мм | |
| 100 мм PMSF | 1 мл | 0,1 мм | |
| Приспособиться к рН 7,5 и полное до 1 Л всего с ddH2O | |||
Таблица 1: Буферы для жидких культуры, нерастворимого белка экстракции и диализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы приводим методологию для изоляции агрегатов высоко нерастворимого белка от старения C. elegans подвергается РНК-интерференции для анализа по масс-спектрометрии и Западный blotting. Мы покажем, что улучшение proteostasis путем уменьшения IIS значительно препятствует агрегации белков зависит от возраста. При выборе конкретных подверженных агрегации белков для overexpress в C. elegans, можно вскрыть дальнейшие механизмы, модулирует присущие белка агрегации.
Присущие возраст зависимых белков агрегации против болезни связанные белком агрегации
Это текущая работа основана на предыдущих выводах, которые агрегации белков не ограничивается специфических белков, агрегирование в контексте болезнь. Сосредоточиваясь на эндогенных подверженных агрегации белков, вместо того, чтобы ectopically выразил заболеваний связанных белков, ожидается обеспечение Роман понимания физиологической регуляции процесса агрегации. Как возраст зависимых белков агрегаты находятся в разных местах сотовой5, их исследование должно также обеспечить понимание отсек конкретных механизмов контроля качества. В целом механизмы, которые управляют присущие белка агрегации тоже могут иметь отношение в предотвращении болезни агрегации белков. Следует отметить хотя возраст зависимых белков агрегации напоминает в нескольких аспектов болезни белка агрегации, по-прежнему остается неясным ли эти агрегаты содержат амилоидных фибрилл, характерной чертой многих заболеваний агрегатов.
Выбор C. Elegans модель: преимущества и ограничения
По сравнению с моделью млекопитающих, один из самых больших преимуществ использования C. elegans для изучения связанных со старением характеристикой является его очень короткий срок. Несколько сотен белки последовательно становятся весьма агрегации склонны во время старения и это значительное увеличение нерастворимость легко обнаружить даже с упрощенным биохимических добычи. Однако одним из основных ограничений использования C. elegans для изучения агрегации белков зависит от возраста является необходимость изолировать большое число пожилых животных. C. elegans гермафродиты и производят примерно 220 или больше потомства во время их репродуктивной фазы19, крайне важно для предотвращения размножения или устранения потомства для того, чтобы возраст населения. Чтобы вызвать стерильность доступны несколько вариантов: один из вариантов заключается в использовании химических fluorodeoxyuridine (FUdR), ингибитор синтеза ДНК. Однако FUdR приводит к многочисленные побочные эффекты, включая изменения в proteostasis и снижение белка агрегации20,21,22. Важно отметить, что FUdR индуцирует генотип конкретные ответы23. Другим вариантом является использование стерильных мутантов чувствительных к температуре. Например spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141) и gon-2(q388) ранее использовались для анализа в зависимости от возраста объединения протеома5, масс-спектрометрия 8.
Тем не менее есть некоторые ограничения, связанные с использованием этих мутантов. Во-первых как бесплодие зависит от температуры, это необходимо расти животных при 25 ° C, который представляет собой мягкий стресс и ускоряет старение, а также агрегации белков. Наоборот, мы наблюдали что ПН-2, glp-1 и fem-1 мутантов повериям по сравнению с одичал тип при 25 ° c (данные не показаны). Во-вторых есть конкретные ограничения, связанные с каждым типом репродуктивного дефекта. Один из недостатков использования спермы дефектные мутантов является производство неоплодотворенных яйцеклеток (также производится в возрасте гермафродитки одичал типа). Качество этих ооцитов значительно снижается с возрастом, и они накапливаются в Гонада24,-25. Количественного масс-спектрометрии анализ показывает, что спермы дефектные мутанты имеют несколько раз более высокий уровень нерастворимых белков накапливается с возрастом по сравнению с Гонада менее или микрофлорой недостаточным мутантов. Это указывает на сворачиванию белков и агрегации, расположенный в Гонада5, по согласованию с предыдущим изучает12,13 и в естественных условиях экспериментов выявление агрегированных белки, расположенные в ненормальных ооцитов кластеры5. Таким образом чрезмерное белка агрегации в Гонада бы маска более тонкие изменения в агрегации белков в соматической тканях. Это должно также рассматриваться при сравнении вмешательств, которые действуют в различной степени на proteostasis репродуктивного и соматические ткани. Таким образом оценить только соматической белка агрегации, мы выступаем за использованием Гонада менее ПН-2 мутантов. Альтернативой было бы использовать микрофлорой недостаточным glp-1 мутантов. Однако мы отмечаем, что эти животные имеют менее присущие агрегации белков с возрастом по сравнению с ПН-2 мутантов5. Это скорее всего является следствием повышения proteostasis в соматической тканей за счет сигнализации с микрофлорой дефектные Гонада26,27,28. Другой альтернативой является использование одичал тип животных и удалить потомков каждый день, седиментации. Однако это проблематично из-за сложности полностью удалить все потомство.
Другое общее ограничение использования C. elegans является ее небольшой размер, что делает сложным конкретных тканей зубов. Как такой весь животных извлечений не предоставляют соответствующую информацию о том, как различные условия модулировать агрегации белков в определенных тканях. Следует отметить эта проблема потенциально может избежаться с помощью недавно разработанных метод, основанный на сортировки активирован флуоресценции клеток изолировать определенные ячейки от C. elegans29. Тем не менее он еще предстоит определить ли этот метод будет подходящим для получения достаточного материала для извлечения нерастворимых белков и ли она будет применяться в возрасте животных. Кроме того ткани специфического протеина агрегации и его регулирование может расследоваться дополнительных в естественных условиях экспериментов. Как трансгенных животных выражая дневно меченых подверженных агрегации белков выбора могут быть быстро созданы и как животные являются прозрачными, это относительно легко для изучения белков агрегации в situ.
В целом важно следить за proteomic результаты с экспериментов в естественных условиях в фоне дикого типа. Сочетание характеристика биохимических и на основе микроскопии позволяет всеобъемлющего исследования агрегации белков и оценку роли генов интерес. Последний облегчается в C. elegans RNAi опосредуется через питание и наличие всего генома RNAi библиотек. Кроме того большое количество характеризуется мутантов существуют для подтверждения результатов, полученных RNAi или использовать вместо RNAi.
Культур в жидкой среде и биохимических добычи: преимущества и ограничения
Как высоко агрегированы белки составляют лишь небольшую часть общего белка, необходимо начать извлечение с большим количеством животных. С большим количеством нерастворимые белки затем целесообразно выполнять обширные пептид фракционирование уменьшить сложность образца для масс-спектрометрии и таким образом улучшить определение нижнего обильные белков. Если требуется лишь небольшое количество нерастворимых белков, альтернативой является расти червей на тарелках и гомогенизации их с керамической дробью. Один из недостатков жидких культуры, что в случае загрязнения, вся культура влияет и должно быть отброшено. В целом C. elegans старения сильно зависит от температуры и этот параметр должен жестко контролироваться в жидкой культуре избежать вариации в возраст зависимых белков агрегации. Контроль температуры важно также для получения однородного населения Гонада менее животных при использовании gon-2(-) мутантов.
В зависимости от цели исследования важно рассмотреть методы различных добычи. Биохимических добычи, представленные здесь первоначально была адаптирована из протоколов изолировать связанных заболеваний агрегатов11,,3031. Мы выбрали относительно высокие концентрации моющих средств например, 0,5% SDS изолировать более нерастворимых агрегатов. Также для грануляции 0,5% SDS нерастворимых агрегатов с низкой скоростью центробежные, этот протокол будет только изолировать крупных агрегатов. Кроме того менее строгий протокол был недавно опубликованный10. В этом исследовании более растворимые и меньше агрегатов также были извлечены, опустив SDS и с помощью очень высокой скоростью центробежные в 500 000 x g. Сравнение различных протоколов показывает общее увеличение количества белков в статистической обработки протеом, используя менее строгие протокола7. Мы отмечаем, что долгоживущие животные с сокращением daf-2 сигнализации эффективно предотвратить накопление как SDS-растворимые, так и агрегатов SDS-нерастворимые в животных Гонада меньше7.
В естественных условиях Анализ агрегации белков зависит от возраста
При построении transgenic моделей для следующих агрегации белков зависит от возраста, уместно рассмотреть в котором ткани к overexpress подверженных агрегации белков интерес и в которых уровни выражения. Мы выступаем за выражение в тканях, расположенная в регионе головы, чтобы избежать вмешательства с аутофлюоресценция, которое видно в кишечнике старения. Чтобы визуализировать люминесцентные меченых агрегатов с низким увеличение, подверженных агрегации белков должен быть выражен на относительно высоком уровне. С другой стороны слишком высокое выражение вызовет подверженных агрегации белков для формы агрегатов уже в молодых животных.
Взятые вместе, эти методы помогут нам понять, почему частью протеома агрегатов с возрастом и в конечном итоге привести к разработке стратегий поощрения здорового старения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование от DZNE и Мари Кюри международной реинтеграции Грант (322120 D.C.D.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
