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Biology

Caenorhabditis एलिगेंस में आयु के साथ अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए विधियाँ

doi: 10.3791/56464 Published: November 26, 2017

Summary

यहाँ प्रस्तुत विधि का लक्ष्य मॉडल जीव सी. एलिगेंसमें सामान्य उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाना है. प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है अत्यधिक अघुलनशील बड़े समुच्चय का अध्ययन करने के लिए कि उंर के साथ फार्म और निर्धारित करने के लिए कैसे proteostasis प्रभाव प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन ।

Abstract

पिछले दशकों में, अल्जाइमर रोग (AD) और पार्किंसंस रोग (पीडी) जैसे neurodegenerative विकारों की व्यापकता बढ़ी है । इन उंर से जुड़े विकारों इन रोगियों के दिमाग में fibrillary संरचना के साथ प्रोटीन समुच्चय की उपस्थिति की विशेषता है । बिल्कुल क्यों आम तौर पर घुलनशील प्रोटीन एक एकत्रीकरण प्रक्रिया से गुजरना खराब समझ रहता है । खोज कि प्रोटीन एकत्रीकरण रोग प्रक्रियाओं तक ही सीमित नहीं है और सामांय उंर बढ़ने की प्रक्रिया के भाग के बजाय आणविक और सेलुलर तंत्र के अध्ययन में सक्षम बनाता है कि प्रोटीन एकत्रीकरण को विनियमित, ectopically मानव का उपयोग किए बिना रोग-संबंधित प्रोटीन । यहां हम पूरक दृष्टिकोण के माध्यम से Caenorhabditis एलिगेंस में अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण की जांच के तरीके का वर्णन करते हैं । सबसे पहले, हम की जांच कैसे उंर के बड़ी संख्या में विकसित करने के लिए-सिंक्रनाइज़ सी. एलिगेंस वृद्ध पशुओं को प्राप्त करने के लिए और हम जैव रासायनिक प्रक्रियाओं को अलग करने के लिए प्रस्तुत अत्यधिक अघुलनशील-बड़े समुच्चय । एक लक्षित आनुवंशिक पछाड़ना के साथ संयोजन में, यह या तो मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री या एक के साथ एक व्यापक विश्लेषण का उपयोग करके उंर निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण को बढ़ावा देने या रोकने में ब्याज की एक जीन की भूमिका टुकड़े करने के लिए संभव है एंटीबॉडी के साथ आधारित विश्लेषण उंमीदवार । फिर इन निष्कर्षों की पुष्टि की है vivo में विश्लेषण ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ फ्लोरोसेंट-टैग एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन व्यक्त । इन तरीकों में मदद करनी चाहिए स्पष्ट क्यों कुछ प्रोटीन उंर के साथ कुल के लिए प्रवण है और अंततः कैसे इन प्रोटीन पूरी तरह कार्यात्मक रखने के लिए ।

Introduction

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प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण विज्ञापन, पीडी, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस), frontotemporal मनोभ्रंश (FTD), और कई अन्य लोगों के रूप में कई neurodegenerative रोगों की एक बानगी के रूप में पहचाना जाता है । उदाहरण के लिए, α-amyloid तंतुओं में synuclein सभाओं कि पीडी रोगियों के Lewy substantia में विशेष रूप से नाइग्रा निकायों के रूप में जमा है, जबकि एस रोगियों में टीडीपी-४३ या FUS को चूकने मोटर न्यूरॉन्स में cytoplasmic समुच्चय के रूप में प्रकट होता है. इन neurodegenerative विकारों में से प्रत्येक में, प्रोटीन homeostasis या proteostasis को बनाए रखने के तंत्र में, फलस्वरूप रोग के लिए अग्रणी प्रोटीन के संचय को रोकने के लिए असफल ।

Proteostasis सेलुलर कार्यों को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और सामान्य शर्तों के तहत इन नियामक तंत्र कसकर प्रोटीन संश्लेषण की दर को नियंत्रित, तह, और क्षरण. कई अध्ययनों से यह प्रदर्शित करता है कि उंर बढ़ने के साथ, कई कोशिकाओं और अंगों की क्षमता के लिए प्रोटीन homeostasis की रक्षा धीरे से समझौता किया है और उंर के साथ proteostasis नेटवर्क के शारीरिक गिरावट के लिए एक महत्वपूर्ण उत्तेजक कारक है neurodegenerative रोगों (सन्दर्भ में समीक्षित1,2,3). तथ्य यह है कि प्रोटीन की गुणवत्ता पर नियंत्रण और सेलुलर प्रतिक्रिया प्रगट प्रोटीन तनाव के साथ समझौता कर रहे है उंर से पता चलता है कि प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण उंर बढ़ने के एक सामांय परिणाम हो सकता है । वास्तव में, हम और दूसरों का प्रदर्शन किया है कि प्रोटीन एकत्रीकरण रोग तक ही सीमित नहीं है और proteome का हिस्सा अत्यधिक डिटर्जेंट-वृद्ध पशुओं में अघुलनशील हो जाता है4,5,6,7 ,8,9,10. अभिकलनी और vivo में विश्लेषण से पता चला है कि इन शारीरिक आयु से संबंधित समुच्चय कई पहलुओं में रोग समुच्चय5के समान है । अंतर्जात की खोज, आयु-निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण, हमें आणविक और सेलुलर तंत्र को टुकड़े करने का अवसर देता है जो प्रोटीन एकत्रीकरण को विनियमित करता है, ectopically मानव रोग-संबंधित प्रोटीन का उपयोग किए बिना । वर्तमान में, केवल सीमित जानकारी व्यापक प्रोटीन insolubility के विनियमन के बारे में और जीव के स्वास्थ्य पर इस dysregulation के प्रभाव के बारे में मौजूद है ।

निमेटोड सी एलिगेंस सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन में से एक है के रूप में इन जानवरों के एक अपेक्षाकृत कम उंर है और कई विशिष्ट उंर बढ़ने सुविधाओं उच्च जीवों में मनाया जाता है अनुसंधान उंर बढ़ने के शोध में मॉडल जीवों । प्रोटीन insolubility पर उंर बढ़ने के प्रभाव का अध्ययन किया गया है अनुक्रमिक जैव रासायनिक भिन्नीकरण द्वारा अंतर घुलनशीलता पर आधारित है, जो व्यापक रूप से neurodegeneration अनुसंधान के क्षेत्र में रोग समुच्चय निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है 11 . मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा कई सौ प्रोटीन रोग के अभाव में सी. एलिगेंस में समुच्चय-प्रवण बनने के लिए दिखाया गया5. यहां हम विस्तार में वर्णन प्रोटोकॉल तरल संस्कृति में कीड़े की बड़ी संख्या में विकसित करने के लिए और अनुक्रमिक निष्कर्षण के लिए ठहराव के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण द्वारा समग्र प्रोटीन अलग । क्योंकि reएलिगेंसed और एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन वृद्ध सी. gonads और मास्क अन्य दैहिक ऊतकों में परिवर्तन5,12,13में जमा, हम एक gonad कम उत्परिवर्ती का उपयोग करने के लिए प्रोटीन पर विश्लेषण ध्यान केंद्रित गैर-जनन ऊतकों में insolubility । प्रस्तुत विधि अत्यधिक अघुलनशील, बड़े समुच्चय है कि ०.५% एसडीएस में अघुलनशील और अपेक्षाकृत कम केंद्रापसारक गति से गोली कर रहे है के विश्लेषण में सक्षम बनाता है । वैकल्पिक रूप से, एक कम कड़े निष्कर्षण प्रोटोकॉल भी छोटे और अधिक घुलनशील समुच्चय इकट्ठा करने के लिए10कहीं और प्रकाशित किया गया है । इसके अलावा, हम सी. एलिगेंसमें vivo में एकत्रीकरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया विधि का वर्णन ।

कुल मिलाकर, आरएनए हस्तक्षेप के साथ संयोजन में इन तरीकों (RNAi) उम्र निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण मॉडुलन में ब्याज की एक जीन की भूमिका का मूल्यांकन कर सकते हैं. इसके लिए हम के साथ और RNAi का उपयोग कर ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन की पछाड़ना के बिना युवा और वृद्ध कीड़े से निष्कर्षों के विश्लेषण का वर्णन । इन विधियों proteostasis नेटवर्क के घटक जो प्रोटीन insolubility को विनियमित निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होना चाहिए । कम इंसुलिन/इंसुलिन जैसे विकास कारक (IGF) 1 सिग्नलिंग (IIS) के रूप में कई हस्तक्षेप नाटकीय रूप से एलिगेंस एजिंग14देरी करने के लिए दिखाया गया है । दीर्घायु रास्ते अक्सर प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र को प्रेरित और इस प्रकार इन रास्ते सक्रिय रूप से प्रोटीन एकत्रीकरण की दर को प्रभावित किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, हम IIS मार्ग7के निषेध पर लंबे समय से जीवित पशुओं में कम निहित प्रोटीन एकत्रीकरण का प्रदर्शन ।

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Protocol

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नोट: प्रक्रिया की एक बेहतर समझ के लिए, कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध (चित्र 1) अनुलग्न है ।

1. युवा और वृद्धों की बड़ी संख्या की वृद्धि C. एलिगेंस के अधीन RNAi को लक्षित करने के लिए ब्याज की एक जीन

नोट: C. एलिगेंस तापमान-प्रेरित बाँझ आयोजनामा-2 (q388) म्यूटेंट (CF2253) बड़ी वृद्ध-सिंक्रनाइज़ की गई आबादी को प्राप्त करने के लिए उपयोग करें । सभी चरणों के दौरान, यह एक खुली लौ के साथ अर्द्ध बाँझ शर्तों के तहत काम करने के लिए और जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोई संदूषण (उदाहरण के लिए, कवक या बैक्टीरिया के साथ) मौजूद हैं. यदि तापमान वर्णित नहीं है, तो कमरे के तापमान पर (भी केंद्रापसारक) कदम प्रदर्शन ।

  1. C. एलिगेंस आयोजनामा-2 (-) म्यूटेंट को gonad विहीन पशु प्राप्त करने की तैयारी
    नोट: बाँझ gonads कमी जानवरों को प्राप्त करने के लिए, के नुकसान-समारोह उत्परिवर्तन मातृ योगदान से बचने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के लिए पिछले लार्वा चरण (L4) में इन स्थानांतरण द्वारा जनक जानवरों में प्रेरित किया जाना चाहिए.
    1. आयोजनामा-2 का पहला विस्तार (-) पशुओं के तापमान में बदलाव के लिए अभिभावक पीढ़ी को इकट्ठा करने के लिए
      1. लकीर एक Lysogeny शोरबा (पौंड) प्लेट पर ई कोलाई OP50 तनाव और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
      2. अगले दिन एक OP50 क्लोन के साथ २०० मिलीलीटर पौंड मध्यम लगाना और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी ।
      3. अगले दिन बीज 15 उच्च वृद्धि (पारा) मध्यम प्लेटें (व्यास 9 सेमी) के साथ ०.५ मिलीलीटर OP50 और एक रंग के साथ वितरित OP50 । दो दिन के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें रखें ।
      4. चूंक आयोजनामा-२ (-) पशु (पिछली दो पीढ़ियों के लिए भूखे नहीं) 15 पारा मध्यम प्लेटों पर OP50 के साथ वरीयता प्राप्त और 20 ° c पर उंहें बनाए रखने जब तक प्लेट वयस्कों और कुछ OP50 के साथ धाराप्रवाह है अभी भी उपलब्ध है ।
      5. इस बीच, बीज ६० पारा मध्यम प्लेटें OP50 के रूप में चरण 1.1.1.3 में वर्णित है और कमरे के तापमान पर प्लेटें रखने के लिए । सावधान: बीज प्लेटें एक सप्ताह से अधिक समय के लिए नहीं रखा जाना चाहिए के रूप में आगर कमरे के तापमान पर दरार होगी ।
      6. ब्लीच धाराप्रवाह प्लेटें एक बार सबसे वयस्कों के लिए अंडे देना शुरू के रूप में पहले15वर्णित है । २ १५ मिलीलीटर-ट्यूबों में अंडे इकट्ठा और 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक nutating मिक्सर पर जगह है ।
      7. अगले दिन M9 बफर के साथ L1s रचा धोया (८५ mM NaCl, ४२ मिमी ना2HPO4· 7H2ओ, 22 मिमी KH2PO4): 30 एस के लिए ३,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक, supernatant त्यागें, और M9 के साथ 15 मिलीलीटर निशान तक भरें । केंद्रापसारक, supernatant को त्यागें, और कदम 1.1.1.6 दोहराने । M9 के साथ 15 मिलीलीटर निशान के लिए परिणामी कीड़ा छर्रों के साथ ट्यूबों भरें ।
      8. गैर वरीयता प्राप्त आगर प्लेट्स पर रखे 2 µ एल ड्रॉप्स में मौजूद L1s की गिनती करके एक विच्छेदित माइक्रोस्कोप के साथ L1s की कुल संख्या का मूल्यांकन करें । औसत से कम नौ बूंदों से प्राप्त की संख्या ।
      9. ६,५०० L1s प्रति वरीयता प्राप्त पारा प्लेट जोड़ें और कीड़े 20 डिग्री सेल्सियस पर L4 चरण तक बढ़ने दो ।
    2. आयोजनामा-2 का दूसरा विस्तार (-) पशुओं के प्रयोग के लिए gonad-विहीन पशु प्राप्त करने के लिए
      1. L4 चरण में, कदम 1.1.1.9 से 25 डिग्री सेल्सियस तक कीड़े बदलाव जब तक वे अंडे और L1s करना शुरू कर रहे है सेने ।
      2. अवसाद के द्वारा अंडे और L1s का संग्रह
        नोट: 25 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान में बदलाव के बाद, यह नाजुक अंडे और वयस्कों से L1s अलग करने के लिए एक सौंय तकनीक के रूप में अवसादन का उपयोग करने के लिए बेहतर है ।
        1. पांच प्लेट प्रति 5 मिलीलीटर M9 का प्रयोग करके प्लेटें M9 से धोएं । ५० मिलीलीटर ट्यूबों में कीड़े स्थानांतरण ।
        2. M9 के साथ ४५ मिलीलीटर निशान के लिए सभी ट्यूबों भरें, लगभग 10 मिनट के लिए वयस्कों तलछट चलो, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक supernatant इकट्ठा, और गोली के साथ इस कदम को दोहराने । supernatant कि अंडे और L1s 1 मिनट के लिए ३,००० x g में शामिल हैं, लगभग 10 मिनट के लिए L1s तलछट चलो, और 15 मिलीलीटर छोड़ दिया जाता है जब तक supernatant हटा दें ।
          नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है । supernatant को बहुत जल्दी न निकालें, जितना संभव हो उतने L1s को इकट्ठा करें ।
        3. 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक nutating मिक्सर पर अंडे और L1s युक्त ट्यूबों रखें ।
  2. gonad-कम पशुओं के तरल संस्कृति युवा और वृद्ध पशुओं को इकट्ठा करने के लिए RNAi के अधीन ब्याज की एक जीन लक्ष्यीकरण
    नोट: RNAi के लिए कुछ जीनों की प्रतिक्रिया तापमान निर्भर हो सकता है के रूप में पहले वर्णित16। RNAi के लिए एक विकल्प के रूप में, एक उत्परिवर्ती जीन को आयोजनामा-2 (-) पृष्ठभूमि में शामिल किया जा सकता है ।
    1. तरल संस्कृति के लिए बैक्टीरिया की तैयारी
      1. OP50 और RNAi बैक्टीरिया तैयार (नियंत्रण के रूप में खाली वेक्टर के साथ वांछित dsRNA और बैक्टीरिया का निर्माण बैक्टीरिया) inoculating द्वारा 4 एल पौंड मध्यम से संबंधित बैक्टीरियल संस्कृति के 12 मिलीलीटर (५० के एक अंतिम एकाग्रता जोड़ें µ जी/एमएल कार्बेनिसिलिन और 1 मिमी IPTG बैक्टीरियल संस्कृतियों) और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर में १८० rpm पर गर्मी ।
      2. अगले दिन फसल 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ६,७०० x g पर संस्कृतियों । supernatants निकालें और ६० मिलीलीटर बर्फ शीत एस बेसल मीडिया (१०० mm NaCl, ५० mm पोटेशियम फॉस्फेट पीएच 6, बर्फ पर रखा) में प्रत्येक गोली reसस्पेंड । तीन reसस्पैंड छर्रों (OP50, नियंत्रण RNAi बैक्टीरिया, और RNAi बैक्टीरिया ब्याज की जीन के लिए) 4 ° c पर कदम 1.2.2 या 1.2.3 तक रखें ।
        नोट: कीड़े L1 चरण से RNAi पर उगाया जा सकता है (चरण 1.2.3 देखें) या पिछले लार्वा चरण L4 से विकासात्मक दोषों से बचने के लिए (चरण 1.2.2 देखें).
    2. RNAi के साथ उपचार के लिए तरल संस्कृति पिछले लार्वा चरण में शुरू L4
      1. एक Fernbach कल्चर कुप्पी (क्षमता २,८०० मिलीलीटर) में २०० एमएल एस बेसल मीडिया जोड़ें । ३०० मिलीलीटर की एक अंतिम संस्कृति की मात्रा के लिए (1.2.2.4 देखें), 10 मिमी पोटेशियम साइट्रेट जोड़ें, पीएच 6, 3 मिलीलीटर ट्रेस धातुओं समाधान (5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), २.५ मिमी FeSO4, 1 मिमी MnCl2, 1 मिमी ZnSO4, ०.१ मिमी CuSO4), 3 मिमी MgSO4 , 3 मिमी CaCl2, १०० एनजी/एमएल कार्बेन्डाज़िम, और 5 µ जी/एमएल कोलेस्ट्रॉल) । एक झिल्ली पेंच टोपी के साथ कुप्पी बंद करें । बफ़र्स के व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें ।
      2. 25 डिग्री सेल्सियस (कदम 1.1.2.2.3) के बाहर L1s ले लो और उंहें 15 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण । 3 मिनट के लिए १,९०० x g पर केंद्रापसारक, supernatant हटाने के लिए, और 2 µ प्रति L1s चरण 1.1.1.8 में के रूप में गिनती । पिछले चरण में तैयार Fernbach संस्कृति कुप्पी में ५००,००० L1s जोड़ें ।
      3. OP50 (कदम 1.2.1 से) आनुपातिक कीड़े की संख्या के लिए जोड़ें । उदाहरण के लिए, के लिए ५००,००० कीड़े जोड़ें ६० एमएल OP50 ।
      4. एस बेसल के साथ पूरा कीड़ा संस्कृति ३०० मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाने के लिए । १५० rpm के साथ एक मिलाना मशीन में 25 डिग्री सेल्सियस में L4 चरण तक कीड़ा संस्कृति की मशीन ।
      5. अगले दिन, कीड़े जंगली प्रकार L4s का आकार होना चाहिए । OP50 से RNAi बैक्टीरिया को बदलने के लिए, ६ ५० मिलीलीटर-ट्यूब में पशुओं को इकट्ठा, उन्हें तलछट जाने और supernatant को हटा दें । M9 के साथ L4s धो अवशिष्ट OP50 बैक्टीरिया को दूर करने के लिए: 3 मिनट के लिए १९०० x g पर केंद्रापसारक, supernatant निकालें और १ ५० मिलीलीटर-ट्यूब में सभी L4s हस्तांतरण । L4s प्रति 5 µ l की गणना करे । दो बार ५०,००० L4s युवा कृमि संग्रह के लिए आवश्यक हैं और दो बार १००,००० L4s वृद्ध कृमि संग्रह के लिए आवश्यक हैं.
      6. 1.2.2.1 में बताए गए अनुसार चार Fernbach कल्चरल कुप्पी तैयार करें । प्रत्येक कुप्पी को ५० µ g/mL कार्बेनिसिलिन और 1 mM IPTG का अंतिम एकाग्रता भी जोड़ें ।
      7. जोड़ें नियंत्रण RNAi बैक्टीरिया और RNAi बैक्टीरिया ब्याज की जीन के लिए (कदम 1.2.1 से) आनुपातिक कीड़े की संख्या के लिए: युवा कीड़े और आयु वर्ग के कीड़े के लिए कुप्पी प्रति 14 मिलीलीटर के लिए प्रति संबंधित बैक्टीरिया के 7 मिलीलीटर जोड़ें ।
      8. युवा कीड़ा संग्रह और वृद्ध कीड़ा संग्रह के लिए कुप्पी प्रति १००,००० कीड़े के लिए कुप्पी प्रति ५०,००० कीड़े जोड़ें, और एस बेसल के साथ संस्कृतियों को पूरा करने के लिए ३०० मिलीलीटर को भरने के लिए । कीड़ा संस्कृतियों (कुल में चार) 25 डिग्री सेल्सियस और १५० rpm पर मशीन ।
    3. RNAi के साथ उपचार के लिए तरल संस्कृति L1 चरण में शुरू
      1. 1.2.2.1 में वर्णित के रूप में चार Fernbach संस्कृति कुप्पी तैयार करें और ५० µ जी/एमएल कार्बेनिसिलिन और 1 मिमी IPTG के एक अंतिम एकाग्रता जोड़ें ।
      2. 1.2.2.2 में बताए अनुसार L1s की तैयारी के साथ आगे बढ़ें । कुल में, ३००,००० कीड़े उन्हें चार कुप्पी में विभाजित करने के लिए की जरूरत है ।
      3. ब्याज के जीन के लिए नियंत्रण RNAi बैक्टीरिया और RNAi बैक्टीरिया जोड़ें (कदम 1.2.1 से) कदम 1.2.2.7 में वर्णित के रूप में कीड़े की संख्या के लिए आनुपातिक और L1 और L4 चरण के बीच भी विकास के चरण पर विचार: युवा डब्ल्यू के लिए कुप्पी प्रति संबंधित बैक्टीरिया के 13 मिलीलीटर जोड़ें वृद्ध के कीड़े के लिए orms की कुप्पी प्रति और 26 मि.
      4. चरण 1.2.2.8 में बताए अनुसार जारी रखें ।
    4. C. एलिगेंस तरल संस्कृतियों का रखरखाव
      1. आवधिक रूप से प्रत्येक तरल संस्कृति और जगह से एक गिलास स्लाइड पर एक aliquot इकट्ठा (वैकल्पिक रूप से एक आगर प्लेट पर) कि वहाँ कोई संदूषण हैं सत्यापित करने के लिए. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का प्रयोग, विशेष रूप से विकास के चरण के दौरान संस्कृति में बैक्टीरियल भोजन के स्तर की जांच करें । अग्रिम 2 एल नियंत्रण RNAi बैक्टीरिया और RNAi बैक्टीरिया ब्याज के जीन के लिए के रूप में कदम 1.2.1 में वर्णित की संस्कृतियों में तैयार । c. एलिगेंस तरल संस्कृतियों के लिए इन जोड़ें यदि आवश्यक हो और 4 डिग्री सेल्सियस पर आराम रखना ।
      2. समय पर जांच करें कि पशुओं बाँझ हैं । पशुओं के बहुमत एक gonad नहीं होगा । आयोजनामा-२ उत्परिवर्तन के penetrance के आधार पर, कुछ जननांगों संरचनाओं को निरस्त कर सकते हैं लेकिन अंडों के साथ कोई पशु नहीं देखे जाने चाहिए ।
  3. तरल संस्कृति में RNAi के अधीन युवा और वृद्ध कीड़े का संग्रह
    नोट: निंनलिखित चरणों के सभी एक तरल संस्कृति कुप्पी के लिए कर रहे हैं, लेकिन ब्याज की जीन के लिए नियंत्रण और RNAi बैक्टीरिया के साथ एक ही उंर की दोनों संस्कृतियों एक साथ संसाधित किया जाना चाहिए ।
    1. 2 दिन या 3 दिन में युवा कीड़े लीजिए प्रोटीन insolubility के बेसल स्तर को मापने के लिए । वृद्ध कीड़े (नवीनतम पर) एकत्र किया जाना चाहिए जब आबादी का आधा मर गया है । यह निर्धारित करने के लिए, मृत और जिंदा कीड़े तरल संस्कृति के कई बूंदों में गिना जाता है एक आगर प्लेट पर रखा । अनुपात में औसत से अधिक से कम नौ बूंदें हैं ।
    2. निम्नलिखित रिएजेंट तैयार करें: 1 l M9, 1 l M9 के साथ ०.०१% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9), और ४० मिलीलीटर ६०% सुक्रोज में ddH2O. बर्फ पर रिएजेंट रखें ।
    3. एक अलग कीप में एक कुप्पी से कीड़े डालो और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कीड़े तलछट चलो । टोंटी खोलें और १ ५० मिलीलीटर ट्यूब में कीड़े ड्रिप ।
    4. २ १५ मिलीलीटर-ट्यूबों में कीड़ा गोली भाजित और १,९०० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । कीड़े को धोने के लिए, supernatant को निकालें और M9 के साथ 15 मिलीलीटर तक भरें । इस केंद्रापसारक को दोहराएं । अंत में २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों के लिए कीड़े हस्तांतरण और 20 मिलीलीटर बर्फ ठंडा M9 के साथ कुल मात्रा को भरने ।
    5. बैक्टीरिया और मृत कीड़े को दूर करने के लिए, जोड़ें २ २० मिलीलीटर पतला कीड़ा छर्रों के लिए २ ५० मिलीलीटर-ट्यूबों 20 मिलीलीटर बर्फ ठंड ६०% सुक्रोज से भरा । जल्दी से कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २,७०० x g पर केंद्रापसारक, 9 त्वरण और मंदी 7 । ध्यान से एक बड़ी प्लास्टिक (25 मिलीलीटर) के साथ शीर्ष कीड़ा परत को हटा दें । 15 मिलीलीटर तक ले लो (लेकिन कम अगर वहां जाहिर है मृत कीड़े की एक बहुत कुछ कर रहे हैं) । बर्फ पर तैयार M9 + Octoxynol-9 (सुक्रोज ट्यूब प्रति 3 ट्यूबों) के ३७ मिलीलीटर में यह सीधे रखो । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए २,७०० x g पर केंद्रापसारक, 9 त्वरण और मंदी 7 ।
      नोट: दोनों को आइस-कोल्ड होना चाहिए; वरना जुदाई काम नहीं आएगी. मिश्रण नहीं है! क्योंकि सुक्रोज कीड़े के लिए विषाक्त है यह निंनलिखित कदम के लिए जल्दी होना जरूरी है ।
    6. ४ १५ मिलीलीटर-ट्यूबों में गोली विभाजित और बर्फ के साथ दो बार धो-शीत M9 + Octoxynol-9:१,९०० x g पर कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant निकालें, बर्फ के साथ 15 मिलीलीटर निशान को भरने-शीत M9 + Octoxynol-9 और दोहराने की प्रक्रिया ।
    7. बर्फ ठंडा M9 के साथ एक बार धो और दो ट्यूबों के लिए चार ट्यूबों गठबंधन । 15 मिलीलीटर-ट्यूबों में 4 मिलीलीटर की कुल मात्रा को कमरे के तापमान पर M9 के साथ भरें और ४० मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक nutating मिक्सर पर घुमाएं ।
      नोट: यह कीड़े पेट में किसी भी अवशिष्ट बैक्टीरिया को पचाने में मदद करता है । माइक्रोस्कोप के तहत कीड़े की जांच करने के लिए देखने के लिए कि कोई मृत हैं ।
    8. 1.3.5 में बताए गए अनुसार आइस-कोल्ड M9 + Octoxynol-9 के साथ दो बार कीड़े धो लें । M9 के साथ दो बार धोने और एक ट्यूब के लिए कीड़े हस्तांतरण ।
    9. एक बार पुनः विधानसभा (ऄब) उच्च नमक निष्कर्षण बफर में अवरोधकों के बिना कीड़े धो (०.१ एम 4-morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस), 1 मिमी ethyleneglycoltetraacetic एसिड (EGTA), ०.१ मिमी EDTA, ०.५ मिमी MgSO4, ०.७५ मीटर NaCl, ०.०२ एम सोडियम फ्लोराइड (NaF)) संग्रह से पहले । supernatant निकालें जब तक वहां कीड़ा गोली के शीर्ष पर कोई तरल है ।
      नोट: यह कदम और अगले एक तेजी से किया जाना चाहिए बफर में उच्च नमक एकाग्रता की वजह से कीड़े में कलाकृतियों से बचने के लिए ।
    10. कीड़ा गोली की मात्रा का अनुमान है और अवरोधकों के साथ ऄब के एक समान मात्रा में जोड़ें (2x छेड़ने अवरोधक कॉकटेल) । एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग, ऊपर कीड़े आकर्षित और धीरे से एक ५० एमएल ट्यूब आधा तरल सूखी बर्फ में रखा नाइट्रोजन से भर में ड्रिप । तरल नाइट्रोजन को लुप्त होने दें और आगे प्रसंस्करण तक-८० ° c पर जमे हुए कीड़े की दुकान ।
      चेतावनी: तरल नाइट्रोजन एक अत्यंत कम तापमान पर है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।

2. युवा और वृद्ध पशुओं के साथ अघुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण ब्याज की एक जीन लक्ष्यीकरण RNAi के अधीन

  1. पशुओं के एकत्र होने से बाधित रहा कदम १.३
    नोट: यह कीड़ा नमूने के किसी भी गल से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । तरल नाइट्रोजन के साथ मोर्टार नीचे ठंडा और सूखी बर्फ पर पूरी प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं ।
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन एक अत्यंत कम तापमान पर है; उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।
    1. पूर्व ठंडा मोर्टार करने के लिए जमे हुए कीड़े हस्तांतरण और २.५ मिनट के लिए पीसने ।
      नोट: पीस के दौरान सावधान रहें: शुरुआत में जमे हुए कीड़े छोटी गोलियों में होते हैं और इन्हें खोना आसान होता है ।
    2. पाउडर के लिए तरल नाइट्रोजन (लगभग १०० एमएल) जोड़ें इसे फिर से शांत और एक और २.५ मिनट के लिए पीसने के लिए । माइक्रोस्कोप से जांच लें कि कीड़ा शव टूट गया है । 2 मिलीलीटर ट्यूबों में पाउडर स्थानांतरण और उन पर दुकान-८० ° c ।
  2. पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए त्वरित अघुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण
    नोट: कुल प्रोटीन की तुलना करने के लिए इस विधि का उपयोग करें सामग्री और के साथ विभिंन दिनों के बीच अघुलनशील प्रोटीन का स्तर और ब्याज की जीन लक्ष्यीकरण RNAi बिना । बर्फ पर कदम 2.2.3 जब तक सभी कदम प्रदर्शन!
    1. Solubilize ५० मिलीग्राम जमीन के कीड़े के साथ कदम २.१ से १५० µ l Radioimmunoprecipitation परख (RIPA) बफर (५० मिमी Tris पीएच 8, १५० मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, ०.५% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), ०.५% सोडियम deoxycholate (एसडीओ), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 1x टीज़ अवरोधक कॉकटेल) । Homogenize एक 1 एमएल सिरिंज ग्रे सुई (27 G x ½ ", ०.४ मिमी x 13 मिमी) के साथ का उपयोग कर निलंबन; निलंबन को 10 बार ड्रा ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १८,४०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant लीजिए.
    3. १०० µ एल RIPA बफर में गोली reसस्पेंड और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १८,४०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें, शीघ्र ही स्पिन करें और बचे हुए supernatant को दूर करने के लिए सावधान रहें ।
    4. अत्यधिक अघुलनशील प्रोटीन solubilize करने के लिए, ७५ µ l यूरिया/एसडीएस बफर (8 एम यूरिया, 2% एसडीएस, ५० mm dithiothreitol (डीटीटी), ५० mm Tris, पीएच 8) और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन में गोली reसस्पेंड ।
    5. कुल प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण करने के लिए, चरण -8 से पहली RIPA supernatant गठबंधन और यूरिया/एसडीएस गोली resuspension. निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया संस्करणों के लिए खाते में, कुल अंश RIPA supernatant के दो तिहाई और यूरिया के एक तिहाई/एसडीएस गोली अंश शामिल होना चाहिए । एक छोटा 4-12% ढाल जेल पर, यूरिया/एसडीएस अंश और 4 µ l कुल संयुक्त प्रोटीन के 9 µ l को लोड करके अघुलनशील प्रोटीन के स्तरों की जांच करें । प्रोटीन के स्तर पर नजर रखने के लिए कुल प्रोटीन दाग धुंधला प्रदर्शन । पश्चिमी सोख्ता द्वारा विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रा व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए insolubility में परिवर्तन की पुष्टि (अनुभाग 3 देखें) ।
  3. अघुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण को अलग एसडीएस-जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए अघुलनशील प्रोटीन
    नोट: बर्फ पर सभी चरणों का पालन करें ।
    1. सूखी बर्फ पर बाहर दो बार ३५० मिलीग्राम समय बिंदु और प्रति RNAi जीवाणु (युवा और वृद्ध कीड़े, नियंत्रण RNAi बैक्टीरिया, और ब्याज की जीन के लिए RNAi बैक्टीरिया) प्रति 2 मिलीलीटर ट्यूबों में जमीन के कीड़े वजन ।
    2. उच्च नमक घुलनशील प्रोटीन को दूर करने के लिए, एक ट्यूब करने के लिए (७०० µ एल) अवरोधकों के साथ, 1 मिमी PMSF, २०० U/एमएल DNase मैं, और १०० µ g/एमएल RNase एक के लिए दो संस्करणों के ऄब के साथ जोड़ने और बर्फ पर पाउडर solubilize । एक 1 मिलीलीटर सिरिंज (ग्रे सुई, 27 जी एक्स ½ ", ०.४ मिमी x 13 मिमी) 15 बार में निलंबन को ड्रा और बर्फ पर 10 min. केंद्रापसारक के लिए १८,४०० x G पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन । वसा परत के माध्यम से जाओ और एक शर्त प्रति 2 मिलीलीटर ट्यूब (कुल में चार ट्यूबों) में उच्च नमक घुलनशील प्रोटीन युक्त supernatant इकट्ठा । फैट निकालें और इसे छोड़ें । Aliquot-८० ° c पर फ्रीज करने के लिए उच्च नमक घुलनशील प्रोटीन ।
    3. लिपिड को त्यागने के लिए, solubilize के साथ ७०० µ l ऄब वाले 1 M सुक्रोज (बिना DNase I और RNase A) वाले अवरोधकों के साथ गोली । एक सिरिंज में निलंबन 10 बार ड्रा और 5 मिनट के लिए बर्फ पर यह मशीन 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १८,४०० x g पर केंद्रापसारक । सभी supernatant और लिपिड को हटाने और उन्हें त्यागने के लिए सावधान रहें ।
    4. एसडीएस घुलनशील प्रोटीन को दूर करने के लिए, ७०० µ एल RIPA बफर के साथ गोली solubilize । एक सिरिंज में ऊपर निलंबन 10 बार ड्रा और बर्फ पर 10 मिनट के लिए यह मशीन । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १८,४०० x g पर केंद्रापसारक । -८० डिग्री सेल्सियस पर ठंड के लिए एसडीएस घुलनशील प्रोटीन और aliquot युक्त supernatant लीजिए ।
    5. पूल प्रत्येक हालत के दो नमूने एक साथ ५०० µ एल RIPA बफर के साथ प्रत्येक गोली solubilizing के बाद । एक सिरिंज में 10 बार निलंबन ड्रा. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १८,४०० x g पर केंद्रापसारक । सभी supernatant को दूर करने और उसे त्यागने के लिए सावधान रहें ।
      नोट: निष्कर्षण का लक्ष्य अघुलनशील प्रोटीन से घुलनशील प्रोटीन को अलग करना है । इसलिए अगले स्टेप में फॉर्मल एसिड जोड़ने से पहले सभी अवशिष्ट RIPA supernatant को दूर करना जरूरी है ।
    6. Solubilize अंतिम ४०० µ एल ७०% के साथ अत्यधिक अघुलनशील प्रोटीन युक्त गोली फार्म एसिड और एक सिरिंज में 20 बार निलंबन आकर्षित । बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन । 4 डिग्री सेल्सियस, 3 त्वरण और मंदी 5 पर 20 मिनट के लिए ५०,००० x जी में केंद्रापसारक, कीड़ा छल्ली मलबे को हटाने के लिए । supernatant है कि अत्यधिक अघुलनशील प्रोटीन होता है और यह-८० डिग्री सेल्सियस पर जमा ले लीजिए ।
    7. जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए अघुलनशील प्रोटीन अंशों की डायलिसिस
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर Dialyze ।
      1. 8 एल डायलिसिस बफर तैयार (५० mm Tris, 1 mm डीटीटी, ०.१ mm PMSF, पीएच ७.५) और यह आठ 1 एल यूरिन करने के लिए विभाजित । प्रत्येक 1 L चोंच के लिए बफर सतह पर तीन झिल्ली (झिल्ली फिल्टर = ०.०२५ µ मी) रखें ।
      2. प्रति झिल्ली, ध्यान से लोड ६५ µ एल के रूप में अघुलनशील प्रोटीन solubilized के चरण 2.3.6 में प्राप्त अम्ल. प्रत्येक शर्त छह झिल्ली पर विभाजित है ।
      3. 5 µ एल को हटाने और एक पीएच पट्टी पर इसे जोड़ने के द्वारा एक नमूने के पीएच की जांच करें । यदि पीएच 7 और 8 के बीच है (लगभग 2 घंटे के बाद), pipetting द्वारा नमूना लेने के ऊपर और धीरे से नीचे । अंत में, 10 µ एल डायलिसिस बफर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक झिल्ली बंद हाला धोने । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ्रीज ।

3. व्यापक पहचान और ब्याज की एक जीन लक्ष्यीकरण RNAi द्वारा प्रेरित उंर के साथ प्रोटीन Insolubility में परिवर्तन की ठहराव

  1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयारी
    1. ज्ञात एकाग्रता का एक संदर्भ नमूने के साथ एक 4-12% ढाल जेल पर एक aliquot लोड हो रहा द्वारा dialyzed नमूनों में अघुलनशील प्रोटीन की मात्रा का मूल्यांकन करें । एक कुल प्रोटीन जेल धुंधला प्रदर्शन और एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ प्रोटीन राशि मात्रा । इस चरण में पाचन (step 3.1.4) के लिए आवश्यक trypsin की मात्रा का अनुमान लगाना आवश्यक है ।
    2. एक केंद्रापसारक वाष्पीकरण का उपयोग कर नमूने ध्यान केंद्रित करने और 8 मीटर यूरिया की एक अंतिम एकाग्रता में अघुलनशील प्रोटीन solubilize ।
    3. Alkylation आणि कमी
      1. नमूने के लिए 4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Tris (2-carboxyethyl) phosphine हाइडरोक्लॉराइड (TCEP) जोड़ें । ३०० rpm के साथ ५७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन । नमूनों को कमरे के तापमान पर रखें ।
      2. ८.४ mM के अंतिम एकाग्रता के लिए iodoacetamide जोड़ें । यह ४५ मिनट के लिए मशीन (2 ज के लिए गर्मी कमरे के तापमान पर अंधेरे में) किया जा सकता है ।
      3. एक अंतिम 2 मीटर यूरिया एकाग्रता प्राप्त करने के लिए १५० mM अमोनियम बिकारबोनिट में नमूनों को पतला करें ।
    4. पचाने में 5% w/w के साथ प्रोटीन trypsin रातोंरात संशोधित ३७ ° c और ४०० rpm पर ।
    5. एक 12% एसडीएस जेल पर पचा प्रोटीन का एक नमूना लोड और एक कुल प्रोटीन जेल धुंधला करने के लिए विश्लेषण अगर पाचन काम किया । यदि अभी भी कुछ बैंड मौजूद हैं, तो दोहराएँ चरण 3.1.4 और 3.1.5.
    6. युवा और वृद्ध नियंत्रण और RNAi के इलाज से पेप्टाइड्स C. एलिगेंस निर्माता के निर्देशों का पालन रिश्तेदार और निरपेक्ष quantitation के लिए isobaric टैग के साथ लेबल कर रहे हैं.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, पेप्टाइड्स या प्रोटीन लेबलिंग के लिए अंय तरीकों ऐसे मिलकर जन टैग के रूप में ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      नोट: मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण: नमूना जटिलता को कम करने के लिए, पेप्टाइड्स मजबूत कटियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए विभिन्न भागों में अलग किया जाना चाहिए5. कई जन स्पेक्ट्रोमीटर सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation के लिए isobaric टैग का विश्लेषण करने में सक्षम है के रूप में17कहीं वर्णित है । प्राप्त डेटा उचित सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित किया जाना चाहिए । कुल मिलाकर इस विश्लेषण की अनुमति देता है अत्यधिक अघुलनशील प्रोटीन की पहचान और उम्र पर उनके परिवर्तन और proteostasis मॉडुलन पर.

4. Vivo में एजिंग के दौरान एकत्रीकरण पैटर्न पर ब्याज की एक जीन के प्रभाव का मूल्यांकन

  1. धारा 3 में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से, एक आयु-निर्भर एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन है कि RNAi के अधीन पशुओं में एक अलग सीमा तक जमा का चयन करें । उत्पंन ट्रांसजेनिक C. एलिगेंस लाइंस इस प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग और अपने संबंधित प्रमोटर या ऊतक के नियंत्रण के तहत विशेष प्रमोटर (एक उपयुक्त प्रमोटर के चुनाव के लिए चर्चा देखें) । निमेटोड विकास पर मानक तकनीक द्वारा 15 डिग्री सेल्सियस पर तनाव बनाए रखने (एनजी) OP50 के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटें । उदाहरण के लिए, हम एक कीड़ा व्यक्त polyadenylate-बाध्यकारी प्रोटीन (PAB-1) एन पर जुड़े-ग्रसनी मांसपेशी मोटर pmyo-2 के नियंत्रण में tagRFP करने के लिए-टर्मिनस से इनकार चुना ।
  2. vivo में ब्याज की जीन के निषेध पर उंर के साथ एकत्रीकरण में परिवर्तन के मूल्यांकन
    1. एक से दो दिन पहले, एनजी/कार्बेनिसिलिन (Carb)/IPTG प्लेटें एक नियंत्रण (खाली RNAi वेक्टर L4440) बैक्टीरिया और RNAi बैक्टीरिया के साथ ब्याज की जीन को बाधित करने के लिए तैयार करते हैं । (RNAi के बारे में एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए C. एलिगेंस में जौव विज्ञान शिक्षा डेटाबेस देखें । 1 जीव विज्ञान के अनिवार्य: खमीर, Drosophila और C. एलिगेंस. RNAi में सी. एलिगेंस. जौव, कैंब्रिज, MA, दोी: 10.3791/5105 (२०१७)) ।
    2. L1 से RNAi उपचार के लिए, जगह अंडे-कई अलग छोटे एनजी पर कीड़े बिछाने/Carb/IPTG (6 cm व्यास) प्लेट 20 डिग्री सेल्सियस पर ब्याज की जीन के लिए नियंत्रण RNAi या RNAi बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त । 2 ज के बाद वयस्कों को दूर, 20 डिग्री सेल्सियस पर संतति रखते हुए । विकासात्मक दोषों से बचने के लिए L4 लार्वा अवस्था के बाद RNAi उपचार प्रारंभ किया जा सकता है ।
    3. एक बार वंश L4 लार्वा मंच तक पहुंचता है, नए एनजी/Carb/IPTG प्लेटों पर नियंत्रण RNAi या RNAi बैक्टीरिया के साथ वरीयता के हित के जीन के लिए इन L4s हस्तांतरण । दोनों शर्तों के लिए 15 transgenics प्रत्येक के साथ नौ प्लेट सेट और 20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए । उंर बढ़ने कीड़े को अपनी संतान से दूर नई प्लेटों को हर दूसरे दिन अपने प्रजनन काल के अंत तक स्थानांतरित करने की जरूरत है ताकि उंहें अपने वंश से अलग करने में सक्षम हो ।
    4. वयस्कता के दौरान 24x आवर्धन के साथ एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो-माइक्रोस्कोप के तहत एक फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन के वितरण में परिवर्तन का मूल्यांकन करें, हर दूसरे दिन ।
      नोट: चमकीले puncta में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन के आयु-आश्रित संचय का उपयोग एकत्रीकरण के लिए एक पठन-आउट के रूप में किया जाता है. इन puncta अत्यधिक ऑटोमोबाइल संरचनाओं के रूप में समुच्चय की विशेषता होना चाहिए । यह photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए (FRAP) फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । एकीकृत प्रोटीन के लिए, कोई रिकवरी ब्लीच्ड क्षेत्र में के बाद कम से 4 मिनट5,18में मनाया जाना चाहिए । उंर के साथ परिवर्तनों को यों तो हम उंर में वितरण पैटर्न-सिंक्रनाइज़ PAB-1 दिन में 2, दिन 5, और वयस्कता के दिन 7 के रूप में निंनलिखित के रूप में व्यक्त कीड़े बनाए: कम एकत्रीकरण स्तर (0-10 tagRFP::P ab-1 पीछे ग्रसनी बल्ब में puncta), मध्यम एकत्रीकरण स्तर (पीछे ग्रसनी बल्ब में 10 से अधिक puncta), और उच्च एकत्रीकरण स्तर (पूर्वकाल ग्रसनी बल्ब में 10 से अधिक puncta) ।

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हम कम आईआईएस के साथ कैसे लंबे समय तक रहने वाले जानवरों का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत तरीकों का इस्तेमाल किया उंर पर निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण मॉडुलन । पश्चिमी दाग द्वारा (२.२ कदम, त्वरित अघुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए देखें), हम कुल और युवा (वयस्कता के दिन 3) के अघुलनशील प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण और वृद्ध (वयस्कता के दिन 18) कीड़े नियंत्रण RNAi पर और RNAi लक्ष्यीकरण पर इंसुलिन/ IGF-1-रिसेप्टर डीएएफ-2की तरह. हम उम्र या नियंत्रण और डीएएफ-2 RNAi शर्तों (चित्रा 2) के बीच के साथ कुल प्रोटीन के स्तर में कोई बड़ा परिवर्तन मनाया. के रूप में की उंमीद है, हम नियंत्रण पशुओं में अत्यधिक अघुलनशील प्रोटीन के स्तर में एक मजबूत उंर से संबंधित वृद्धि का पता लगाया (चित्रा 2बी) । डीएएफ-2 RNAi पर लंबे समय से जीवित पशुओं की तुलना में, एकत्रीकरण प्रवृत्ति बहुत कम हो गया था । अघुलनशील अर्क की पूरी प्रोटीन धुंधला उम्र मिलान नियंत्रण की तुलना में डीएएफ-2 RNAi पर 18 दिन पुराने कीड़े से अर्क में एक कम जटिल प्रोटीन बैंड पैटर्न का पता चला. मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि कम आईआईएस के साथ लंबे समय से जीवित पशुओं कुल कम उंर से जुड़े प्रोटीन एकत्रीकरण और महत्वपूर्ण बात, डीएएफ-2 अवरोध पूरी तरह से एक की उंर पर निर्भर insolubility निष्प्रभाव प्रोटीन के विशिष्ट सबसेट7। इन निष्कर्षों पर अनुवर्ती, हम इन एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन, PAB-1 में से एक पर ध्यान केंद्रित । PAB-1 एक आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन है जिसका एक अनुमान "prion-लाइक" डोमेन होता है । एंटीबॉडी धुंधला की पुष्टि की है कि लंबे समय तक जीवित पशुओं PAB-1 उंर के साथ घुलनशील (चित्रा 2सी) बनाए रखा ।

PAB-1 एकत्रीकरण के vivo में विश्लेषण के लिए, हम ग्रसनी मांसपेशियों में tagRFP::P ab-1 व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों का उत्पादन किया । युवा जानवरों में, tagRFP::P ab-1 मुख्य रूप से ग्रसनी (चित्रा 3, "कम" एकत्रीकरण स्तर) लेकिन उम्र के साथ में स्थित diffusely था, हम उज्ज्वल puncta में एक प्रगतिशील संचय देखा पीछे ग्रसनी बल्ब में शुरू ( चित्रा 3, "मध्यवर्ती" एकत्रीकरण स्तर). उंर बढ़ने के दौरान, हम भी पूर्वकाल ग्रसनी बल्ब में एकत्रीकरण मनाया (चित्रा 3, "उच्च" एकत्रीकरण स्तर) जानवरों की एक बढ़ती हुई संख्या में । इन विभिंन श्रेणियों में पशुओं को समूहीकृत करके, हमने जनसंख्या में PAB-1 एकत्रीकरण की दर को बनाए । दिन में वयस्कता के 2 कीड़े के सबसे अधिक (८८%) कोई नहीं था या बहुत कुछ puncta और उच्च एकत्रीकरण के स्तर के साथ कोई जानवर का पता लगाया गया । पहले ही दिन में 5, जनसंख्या के 19% मध्यवर्ती और 16% उच्च एकत्रीकरण का स्तर दिखाया, जबकि 7 दिन में कीड़े के ७०% से अधिक मध्यवर्ती और उच्च एकत्रीकरण के स्तर प्रस्तुत किया । tagRFP के आयु-निर्भर एकत्रीकरण पर दीर्घायु के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए: PAB-1, हम ट्रांसजेनिक tagRFP उत्पन्न::P ab-1 कीड़े एक डीएएफ-2 उत्परिवर्तन के साथ. इन जानवरों को काफी कम tagRFP: PAB-1 उम्र बढ़ने के साथ puncta गठन, भी 7 दिन में मध्यवर्ती और उच्च एकत्रीकरण स्तर का प्रदर्शन जनसंख्या के 15% से कम (चित्रा 3बी) के साथ, दिखाया.

यहाँ वर्णित विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके, हमने पाया है कि कम IIS विभिन्न सीमा तक उम्र निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकता है और लंबे समय तक रहने वाले जानवरों विशेष रूप से PAB की गतिशीलता को बहाल करने में कुशल हैं-17.

Figure 1
चित्र 1 : कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध में उम्र के साथ अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए C. एलिगेंस.  मुख्य कदम बोल्ड कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्रोटीन insolubility नियंत्रण पशुओं में उम्र के साथ बढ़ता है, लेकिन कम डीएएफ-2 सिग्नलिंग के साथ पशुओं में नहीं. () कुल अंश के दिन 3 और दिन 18 आयोजनामा-2 (-) म्यूटेंट पर नियंत्रण और डीएएफ-2 RNAi (25 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए) के अधीन योग प्रोटीन धुंधला । () कुल प्रोटीन एसडीएस-अघुलनशील अंश का दिन 3 और दिन से 18 आयोजनामा-2 (-) म्यूटेंट पर नियंत्रण और डीएएफ-2 RNAi (25 डिग्री सेल्सियस पर उगाया) के अधीन । संदर्भ7से पुनर्प्रकाशित कक्ष । () Immunoblot का पता लगाना PAB-१ में एसडीएस-अघुलनशील अंश, प्रासंगिक प्रोटीन बैंड लाल तीर द्वारा दर्शाया गया है. संदर्भ7से पुनर्प्रकाशित कक्ष । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: कम डीएएफ-2 सिग्नलिंग tagRFP के संचय को रोकता है: उम्र के साथ:P ab-1 puncta. (एक) प्रतिनिधि tagRFP के साथ कीड़े की तस्वीरें: ग्रसनी मांसपेशियों (उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोप, tagRFP डिटेक्शन सेटिंग्स: उत्तेजना ५५८ एनएम, उत्सर्जन ५८३ एनएम) में अटल बिहारी-1:P । कम के साथ पशु (0-10 tagRFP::P ab-1 puncta ग्रसनी बल्ब में), मध्यवर्ती (पीछे ग्रसनी बल्ब में 10 से अधिक puncta), या उच्च एकत्रीकरण स्तर (पूर्वकाल puncta बल्ब में 10 से अधिक ग्रसनी) दिखाया जाता है । स्केल बार = 20 µm. (B) विभिंन tagRFP की ठहराव::P ab-1 wildtype और डीएएफ-2 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में उम्र के साथ एकत्रीकरण स्तरों दृढ़ता से देरी tagRFP::P एबी-1 लंबे समय से जीवित पशुओं में उम्र के साथ एकत्रीकरण । 2 दिन, 5 दिन, और 7 दिन डीएएफ-2 (-) बनाम wildtype पृष्ठभूमि, कम मध्यवर्ती और उच्च एकत्रीकरण के स्तर की तुलना में: फिशर सटीक परीक्षण, * * * *p < 0.0001 । संदर्भ7से पुनर्प्रकाशित कक्ष । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

स्टॉक समाधान राशि अंतिम एकाग्रता टिप्पणियां/
लिक्विड कल्चर, कुल वॉल्यूम ३०० mL
एस बेसल (५०० एमएल के लिए: ५.९ ग्राम NaCl, ५० मिलीलीटर 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट पीएच 6) २०० एमएल 1 M पोटेशियम फॉस्फेट पीएच 6:1 के लिए एल: १२९ g KH2पो4 monobasic, ५२ g K2HPO4 dibasic निर्जल
1 एम पोटेशियम साइट्रेट पीएच 6 (४०० एमएल के लिए: १३.१ ग्राम साइट्रिक एसिड मोनोहाइडे, १३४.४ ग्राम त्रि-पोटेशियम साइट्रेट मोनोहाइडे) 3 मिलीलीटर 10 एमएम
ट्रेस धातुओं समाधान (1 एल के लिए: १.८६ g Ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA), ०.६९ g FeSO4 · 7 ज2o, ०.२ g MnCl2 · 4 ज2o, ०.२९ g ZnSO4 · 7 ज2हे, ०.०२५ g CuSO4 · 5 ज2o) 3 मिलीलीटर स्टोर स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में
1 M MgSO4 (५०० mL: १२३.३ g) के लिए ९०० µ l 3 मिमी
1 M CaCl2 (५०० mL के लिए: ७३.५ g) ९०० µ l 3 मिमी
२०० µ g/एमएल कार्बेन्डाज़िम (५० एमएल के लिए: मेथनॉल में 10 मिलीग्राम) १५० µ l १०० एनजी/
5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल (१०० एमएल के लिए: ०.५ इथेनॉल में जी) ३०० µ l 5 µ g/mL
पुनर्विधानसभा (ऄब) उच्च नमक निष्कर्षण बफर, 30 मिलीलीटर
1 M 4-Morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस) 3 मिलीलीटर १०० एमएम ऄब शेयर बफर घटक
०.५ एम Ethyleneglycoltetraacetic अम्ल (EGTA) ६० µ l 1 मिमी ऄब शेयर बफर घटक
०.५ एम Ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA) 6 µ l ०.१ एमएम ऄब शेयर बफर घटक
1 M MgSO4 15 µ l ०.५ एमएम ऄब शेयर बफर घटक
५ मीटर NaCl ४.५ एमएल ७५० एमएम ऄब शेयर बफर घटक
1 एम सोडियम फ्लोराइड (NaF) ६०० µ l 20 एमएम ऄब शेयर बफर घटक
ddH2O के साथ 30 मिलीलीटर कुल को पूरा करें
50x को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल * 2x * (मास स्पेक्ट्रोमेट्री 6 एमएल के लिए निष्कर्षण के लिए) की जरूरत है कि ऄब स्टॉक बफर की राशि लेने के बाद रिएजेंट जोड़ें ।
१०० मिमी Phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) isopropanol में,-20 डिग्री सेल्सियस * 1 मिमी
10 U/µ l DNaseI * २०० यू/एमएल
4 मिलीग्राम/एमएल RNaseA * १०० µ g/mL
1 मीटर सुक्रोज, 30 एमएल के साथ ऄब
2 एम सुक्रोज (५० एमएल के लिए: ३४.२ ग्राम) 15 मिलीलीटर 1 मीटर DNaseI और RNaseA के अलावा ऄब बफर रिएजेंट जोड़ें
Radioimmunoprecipitation परख (RIPA) बफर, 30 मिलीलीटर
1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 8 १.५ एमएल ५० एमएम RIPA स्टॉक बफ़र घटक
५ मीटर NaCl ०.९ एमएल १५० एमएम RIPA स्टॉक बफ़र घटक
०.५ एम EDTA ०.३ एमएल 5 मिमी RIPA स्टॉक बफ़र घटक
10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) १.५ एमएल ०.५०% RIPA स्टॉक बफ़र घटक
10% सोडियम deoxycholate (एसडीओ) १.५ एमएल ०.५०% RIPA स्टॉक बफ़र घटक
Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) ०.३ एमएल 1% RIPA स्टॉक बफ़र घटक
ddH2O के साथ 30 मिलीलीटर कुल को पूरा करें
१०० मिमी PMSF * 1 मिमी * (मास स्पेक्ट्रोमेट्री 10 एमएल के लिए निष्कर्षण के लिए) की जरूरत है कि RIPA स्टॉक बफर की राशि लेने के बाद रिएजेंट जोड़ें ।
50x को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल * 1x
यूरिया/एसडीएस बफर, 10 मिलीलीटर
यूरिया ४.८ छ 8 मीटर
10% एसडीएस 2 मिलीलीटर 2%
Dithiothreitol (डीटीटी) ७७ मिलीग्राम ५० एमएम
1 M Tris नं० 8 ०.५ एमएल ५० एमएम
ddH2ओ के साथ 10 मिलीलीटर कुल को पूरा
डायलिसिस बफर, 1 एल
tris 6 ग्राम ५० एमएम
डीटीटी १५४ मिलीग्राम 1 मिमी
१०० मिमी PMSF 1 मिलीलीटर ०.१ एमएम
समायोजित करने के लिए पीएच ७.५ और पूरा करने के लिए 1 L कुल के साथ ddH2O

तालिका 1: तरल संस्कृति, अघुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण, और डायलिसिस के लिए बफ़र्स ।

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Discussion

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यहां हम एक पद्धति की रिपोर्ट उंर बढ़ने से उच्च स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण के लिए RNAi के अधीन सी. एलिगेंस से अत्यधिक अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय अलग । हम बताते है कि IIS को कम करने से proteostasis में सुधार बहुत उंर निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण रोकता है । एलिगेंसमें व्यक्त करने के लिए विशिष्ट एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन का चयन करके, यह आगे निहित प्रोटीन एकत्रीकरण नियमन तंत्र टुकड़े करने के लिए संभव है.

अंतर्निहित आयु-निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण बनाम रोग-संबंधित प्रोटीन एकत्रीकरण
यह वर्तमान कार्य पिछले निष्कर्षों पर आधारित है कि प्रोटीन एकत्रीकरण एक रोग के संदर्भ में एकत्रीकरण विशिष्ट प्रोटीन के लिए प्रतिबंधित नहीं है । ectopically रोग से जुड़े प्रोटीन के बजाय अंतर्जात एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित करके, उम्मीद एकत्रीकरण प्रक्रिया के शारीरिक नियमन में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए है । के रूप में उंर पर निर्भर प्रोटीन समुच्चय अलग सेलुलर स्थानों में पाया जाता है5, उनके अध्ययन भी डिब्बे में अंतर्दृष्टि विशिष्ट गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र प्रदान करना चाहिए । कुल मिलाकर, निहित प्रोटीन एकत्रीकरण नियंत्रण तंत्र भी रोग प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने में प्रासंगिक हो सकता है । नोट की, यद्यपि आयु-निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण कई पहलुओं रोग प्रोटीन एकत्रीकरण में जैसा दिखता है, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि इन समुच्चय amyloid तंतुओं, कई रोग समुच्चय की एक विशेषता होते हैं ।

का चुनाव C. एलिगेंस मॉडल: लाभ और सीमाएं
एक स्तनधारी मॉडल, एक उंर बढ़ने से संबंधित विशेषता का अध्ययन करने के लिए C. एलिगेंस का उपयोग करने का सबसे बड़ा लाभ में से एक की तुलना में इसकी बहुत छोटी उम्र है । कई सौ प्रोटीन लगातार उंर बढ़ने के दौरान अत्यधिक एकत्रीकरण प्रवण हो और insolubility में इस बड़े वृद्धि आसानी से भी एक सरल जैव रासायनिक निष्कर्षण के साथ detectable है । हालांकि, आयु-निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण के अध्ययन के लिए C. एलिगेंस का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा वृद्ध पशुओं की बड़ी संख्या को अलग करने की आवश्यकता है । सी. एलिगेंस के रूप में hermaphrodites और उनके प्रजनन चरण19के दौरान लगभग २२० या अधिक संतान का उत्पादन कर रहे हैं, यह प्रजनन को रोकने के लिए या एक जनसंख्या उम्र के लिए संतति को खत्म करने के लिए आवश्यक है. कई विकल्प बांझपन पैदा करने के लिए उपलब्ध हैं: एक विकल्प के लिए रासायनिक fluorodeoxyuridine (FUdR), डीएनए संश्लेषण का एक अवरोधक का उपयोग करने के लिए है । हालांकि, FUdR proteostasis और कम प्रोटीन एकत्रीकरण20,21,22में परिवर्तन सहित कई दुष्प्रभावों की ओर जाता है । महत्वपूर्ण बात, FUdR जीनोटाइप-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं23लाती है । एक अंय विकल्प के तापमान के प्रति संवेदनशील बाँझ म्यूटेंट का उपयोग करने के लिए है । उदाहरण के लिए, एसपीई-9 (hc88), fer-15 (b26), फेम-1 (hc17), जीएलपी-1 (e2141), और आयोजनामा-2 (q388) आयु-आश्रित एकत्रीकरण स्पेक्ट्रोमेट्री5के जन proteome िरा के लिए पहले का प्रयोग किया गया है, 8.

फिर भी इन म्यूटेंट के उपयोग से जुड़ी कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, के रूप में बाँझ तापमान निर्भर है, यह 25 डिग्री सेल्सियस पर जानवरों को विकसित करने के लिए आवश्यक है, जो एक हल्के तनाव का गठन और उम्र बढ़ने के साथ ही प्रोटीन एकत्रीकरण में तेजी लाने. इसके विपरीत, हमने देखा है कि आयोजनामा-2, जीएलपी-1 और फेम-1 म्यूटेंट-25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जब जंगली प्रकार की तुलना में रह रहे हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है). दूसरा, वहां विशिष्ट प्रजनन दोष के प्रत्येक प्रकार के साथ जुड़े सीमाएं हैं । शुक्राणु दोषपूर्ण म्यूटेंट का उपयोग करने का एक नुकसान (यह भी वृद्ध जंगली प्रकार hermaphrodites में उत्पादित) निषेचित अंडाणुओं का उत्पादन होता है । इन अंडाणुओं की गुणवत्ता बहुत उंर के साथ गिरावट आती है और वे gonad24,25में जमा । मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण दर्शाता है कि शुक्राणु-दोषपूर्ण म्यूटेंट अघुलनशील प्रोटीन के कई गुना उच्च स्तर gonad-कम या germline-कमी म्यूटेंट की तुलना में उम्र के साथ जमा है । इस gonad में स्थित प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण को इंगित करता है, पिछले अध्ययन के साथ समझौते में12,13 और vivo प्रयोगों में एकीकृत प्रोटीन का खुलासा असामान्य oocyte में स्थित क्लस्टर5। इसलिए, gonad में अत्यधिक प्रोटीन एकत्रीकरण दैहिक ऊतकों में प्रोटीन एकत्रीकरण में अधिक सूक्ष्म परिवर्तन मुखौटा होगा । यह भी विचार किया जाना चाहिए जब हस्तक्षेप है कि प्रजनन और दैहिक ऊतक proteostasis पर विभिंन सीमा तक कार्य की तुलना । इसलिए, केवल दैहिक प्रोटीन एकत्रीकरण का आकलन करने के लिए, हम gonad-कम आयोजनामा-2 म्यूटेंट का उपयोग कर एहसान । एक विकल्प के लिए germline की कमी जीएलपी-1 म्यूटेंट का उपयोग होगा । हालांकि, हम ध्यान दें कि इन जानवरों को आयोजनामा-2 म्यूटेंट5की तुलना में आयु के साथ कम अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण है । यह संभावना germline-दोषपूर्ण gonad26,27,28से संकेत के कारण दैहिक ऊतकों में सुधार proteostasis का परिणाम है । एक अन्य विकल्प जंगली प्रकार के जानवरों का उपयोग करें और अवसाद से हर दिन संतान को दूर करने के लिए है । हालांकि, यह पूरी तरह से सभी संतानों को हटाने की कठिनाई के कारण समस्याग्रस्त है ।

C. एलिगेंस का उपयोग करने का एक अंय सामांय सीमा है जो विशिष्ट ऊतक निकालने चुनौतीपूर्ण बनाता है अपने छोटे आकार है । के रूप में इस तरह के पूरे जानवर निकालने प्रासंगिक जानकारी कैसे अलग स्थितियों विशिष्ट ऊतकों में प्रोटीन एकत्रीकरण मिलाना से संबंधित प्रदान नहीं करते । नोट, इस समस्या संभावित रूप से एक हाल ही में विकसित की गई विधि प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्ट करने के लिए C. एलिगेंस29से विशिष्ट कक्षों को अलग करने पर आधारित का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है । अभी तक यह निर्धारित किया जाना है कि क्या इस विधि के लिए अघुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए उपयुक्त होगा और क्या यह वृद्ध पशुओं के लिए लागू होगा रहता है । वैकल्पिक रूप से, ऊतक विशिष्ट प्रोटीन एकत्रीकरण और इसके विनियमन vivo प्रयोगों में अतिरिक्त द्वारा जांच की जा सकती है । जैसा कि ट्रांसजेनिक पशुओं को एक फ्लोरोसेंट-लेबल एकत्रीकरण-पसंद की प्रवण प्रोटीन व्यक्त तेजी से उत्पंन किया जा सकता है और के रूप में जानवरों पारदर्शी हैं, यह अपेक्षाकृत आसान है सीटू मेंप्रोटीन एकत्रीकरण की जांच ।

कुल मिलाकर, यह एक जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में vivo प्रयोगों में के साथ proteomic परिणाम का पालन करने के लिए आवश्यक है. एक जैव रासायनिक और माइक्रोस्कोपी आधारित विशेषताओं के संयोजन प्रोटीन एकत्रीकरण और ब्याज की जीन की भूमिका का एक आकलन के एक व्यापक अध्ययन में सक्षम बनाता है । बाद के माध्यम से C. एलिगेंस में सुविधा है खिला और पूरे जीनोम RNAi पुस्तकालयों की उपलब्धता के माध्यम से RNAi मध्यस्थता । इसके अलावा, RNAi द्वारा प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए या RNAi के बजाय उपयोग करने के लिए विशेषता म्यूटेंट की एक बड़ी संख्या मौजूद है ।

तरल संस्कृति और जैव रासायनिक निष्कर्षण: लाभ और सीमाएं
के रूप में उच्च एकत्रित प्रोटीन कुल प्रोटीन का केवल एक छोटा सा अंश बनाने के लिए, यह पशुओं की एक बड़ी संख्या के साथ निष्कर्षण शुरू करने के लिए आवश्यक है । अघुलनशील प्रोटीन की बड़ी मात्रा के साथ, यह तो व्यापक पेप्टाइड भिन्नीकरण करने के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना जटिलता को कम करने और इस प्रकार कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की पहचान में सुधार करने के लिए व्यवहार्य है । अगर अघुलनशील प्रोटीन की केवल थोड़ी मात्रा की आवश्यकता है, एक विकल्प के लिए प्लेटों पर कीड़े बढ़ने और उंहें सिरेमिक मोतियों के साथ homogenize है । तरल संस्कृति के नुकसान में से एक यह है कि एक संदूषण के मामले में, पूरी संस्कृति प्रभावित है और छोड़ दिया जाना चाहिए । सामांय में, C. एलिगेंस उंर बढ़ने दृढ़ता से तापमान से प्रभावित है और इस पैरामीटर कसकर तरल संस्कृति में नियंत्रित किया जाना चाहिए उंर पर निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण में बदलाव से बचें । आयोजनामा-२ (-) म्यूटेंट का प्रयोग करते समय gonad-विहीन पशुओं की समरूप जनसंख्या प्राप्त करने के लिए तापमान नियंत्रण भी आवश्यक है.

अध्ययन के लक्ष्य के आधार पर, यह अलग निष्कर्षण तरीकों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । जैव रासायनिक निष्कर्षण यहां प्रस्तुत शुरू में प्रोटोकॉल से रोग-संबद्ध समुच्चय11,30,31को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया था । हम अधिक अघुलनशील समुच्चय को अलग करने के लिए ०.५% एसडीएस जैसे डिटर्जेंट के अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता चुना है । इसके अलावा कम केंद्रापसारक गति के साथ ०.५% एसडीएस अघुलनशील समुच्चय गोली से, इस प्रोटोकॉल केवल बड़ा समुच्चय अलग होगा । वैकल्पिक रूप से, एक कम सख़्त प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित किया गया था10। इस अध्ययन में, और अधिक घुलनशील और छोटे समुच्चय भी एसडीएस लोप द्वारा निकाले गए थे और बहुत उच्च केंद्रापसारक गति का उपयोग करके ५००,००० x g पर विभिन्न प्रोटोकॉल की तुलना में कम कड़े प्रोटोकॉल7का उपयोग करते हुए एकत्रीकरण proteome में प्रोटीन की संख्या में एक सामान्य वृद्धि से पता चलता है । हम कम डीएएफ-2 संकेत कुशलता के साथ लंबे समय तक रहने वाले जानवरों gonad-कम जानवरों7में दोनों एसडीएस में घुलनशील और एसडीएस-अघुलनशील समुच्चय के संचय को रोका है कि ध्यान दें ।

Vivo में आयु-निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण का विश्लेषण
जब निम्न आयु-निर्भर प्रोटीन एकत्रीकरण के लिए ट्रांसजेनिक मॉडल का निर्माण, यह विचार करने के लिए जो ऊतक में ब्याज की एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन और जिस पर अभिव्यक्ति के स्तर पर व्यक्त करने के लिए प्रासंगिक है । हम सिर क्षेत्र में स्थित autofluorescence, जो उंर बढ़ने आंत में प्रमुख है के साथ हस्तक्षेप से बचने के ऊतकों में अभिव्यक्ति एहसान । कम वृद्धि के साथ फ्लोरोसेंट लेबल वाले समुच्चय कल्पना करने के लिए, एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन एक अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाना चाहिए । दूसरी ओर, बहुत अधिक अभिव्यक्ति एकत्रीकरण प्रवण प्रोटीन के कारण पहले से ही युवा पशुओं में समुच्चय के रूप में होगा ।

एक साथ लिया, इन तरीकों में मदद मिलेगी हमें समझ क्यों उंर के साथ proteome समुच्चय का हिस्सा है और अंततः स्वस्थ उंर बढ़ने को बढ़ावा देने के रणनीतियों के विकास के लिए सीसा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम DZNE और एक मैरी क्यूरी अंतर्राष्ट्रीय पुनर्एकीकरण अनुदान (३२२१२० से D.C.D.) से धन द्वारा समर्थित था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fernbach culture flask  Corning 4425-2XL Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap  Schott 1088655 GL45
Nutating Mixer VWR 444-0148
Separatory funnel Nalgene 4300-1000 Capacity 1,000 ml
1 ml syringe  BD Plastipak 300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm BD Microlance 3 300635
Membrane filters 0.025 µM Millipore VSWP04700
pH strip Machery-Nagel 92110 pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693132001 Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9  Applichem A1388 Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol Applichem A1694 Nonidet P40 (NP40)
DNaseI Roche 04716728001 recombinant, RNase free
RNaseA Promega A7973 solution
Total protein blot staining Thermofisher S11791 Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining Thermofisher S12001 Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) Serva 36970
Iodoacetamide Serva 26710
Ammoniumbicarbonate Sigma-Aldrich 09830
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation Sciex 4352135 iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP Beckmann Coulter 393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP Beckmann Coulter 393315
Centrifuge 5424R Eppendorf 5404000413
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702000329
Centrifuge Megafuge 40R Thermo Scientific 75004518
Concentrator Plus Eppendorf 5305000304 Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC  Leica With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope Leica  Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 Zeiss With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software ImageJ
Analysis of mass spectrometry data Protein Prospector http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50 CGC
RNAi bacteria
L4440 Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253 CGC, strain name: EJ1158  Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215 Della David's lab at DZNE Tübingen Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

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References

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<em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> में आयु के साथ अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए विधियाँ
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Groh, N., Gallotta, I., Lechler, M. C., Huang, C., Jung, R., David, D. C. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (129), e56464, doi:10.3791/56464 (2017).More

Groh, N., Gallotta, I., Lechler, M. C., Huang, C., Jung, R., David, D. C. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (129), e56464, doi:10.3791/56464 (2017).

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